WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологич ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт биологии гена Российской академии наук

на правах рукописи

Долгова Анна Сергеевна

ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ,

ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ.

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

(Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика)

Научный руководитель:

академик, д.б.н., профессор П.Г. Георгиев Москва 2015 Оглавление Оглавление

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Генная инженерия растений

2.2 Методы трансформации

2.2.1 Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens

2.2.2 Биолистический метод переноса генов

2.2.3 Прямая доставка ДНК в протопласты

2.3 Репортерные гены и селективные маркеры

2.4 Вариабельность трансгенной экспрессии

2.4.1 Возможные причины вариабельности трансгенной экспрессии

2.4.2 Сайт специфическая трансформация и трансформация сдерживающая копийность...23 2.4.3 Дизайн конструкций

2.4.4 MAR-элементы

2.4.5 Вирусная супрессия сайленсинга генов

2.4.6 Растения мутантные по одной или нескольким составляющим механизма РНКсайленсинга

2.4.7 Альтернативные способы снижения вариабельности трансгенной экспрессии............37

3. Методы

3.1 Молекулярные методы

3.1.1 Электрофорез в агарозном геле

3.1.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей

3.1.3 Определение концентрации нуклеиновых кислот

3.1.4 Рестрикция

3.1.5 Фосфорилирование олигонуклеотидов

3.1.6 Лигирование

3.1.7 Тупление "липких" концов фрагментов плазмидной ДНК

3.1.8 Приготовление компетентных клеток

3.1.9 Трансформация клеток E. сoli

3.1.10 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

3.1.11 Переосаждение ДНК

3.1.12 Культивирование бактерий для выделения плазмидной ДНК

3.1.13 Проведение ПЦР-скрининга

3.1.14 Трансформация A. tumefaciens

3.2

Работа с растениями

3.2.1 Подготовка маточных растений

3.2.2 Сбор и подготовка листьев

3.2.3 Трансформация табака

3.2.4 Селекция трансгенной ткани, отбор трансформантов и элиминация агробактерий.....50 3.2.5 Мультипликация и укоренение трансформантов

3.2.6 Выделение геномной ДНК из растений (с SDS)

3.2.7 Экстракция тотального белка растений

3.2.8 Флуоресцентный анализ активности гена gfp

3.2.9 Определение количества GFP методом иммуноферментного анализа (ELISA)............53 3.2.10 Гистохимический анализ GUS-активности

3.2.11 Флюориметрический анализ GUS-активности

3.2.12 Определение концентрации общего белка

3.3. Праймеры

4. Результаты и обсуждение

4.1 Исследование возможности использования синтетических ДНК элементов, терминирующих транскрипцию

4.1.1 Генетическая трансформация растений

4.1.2 Анализ уровня экспрессии репортерных генов

4.2 Исследование возможности использования растительных ДНК элементов, терминирующих транскрипцию

4.2.1 Поиск регуляторных элементов

4.2.2 Конструирование

4.2.3 Генетическая трансформация растений

4.2.4 Анализ уровня экспрессии репортерных генов

4.3 Статистическая обработка результатов

4.3.1 Ограничения дисперсионного анализа и подготовка данных

4.3.2 ANOVA

5. Выводы

6. Список литературы

Введение 1.

Растения являются основным источником пищи для людей и кормов для сельскохозяйственных животных. Многолетние усилия селекционеров превратили растения в продовольственные культуры, которые являются основными источниками углеводов, липидов, белков, витаминов и минералов.

Методы традиционной селекции сельскохозяйственных культур к настоящему времени не могут удовлетворить растущие потребности человечества в продовольствии. Последние достижения растительной биотехнологии открывают новые возможности для улучшения урожайности, качества и для удешевления производства сельскохозяйственных культур. В настоящее время для изменения признаков ценных сельскохозяйственных культур всё чаще стала использоваться возможность непосредственного введения гетерологичных генов.

Начиная с первого удачного эксперимента в 1983 году к 2014 уже более 18 миллионов производителей по всему миру выращивали трансгенные культуры на площади более 180 миллионов гектаров (James, 2014). В последнее время генетическая инженерия растений является наиболее быстро распространяющейся технологией в сельскохозяйственном производстве (James, 2014). Эффективность использования генетически модифицированных растений напрямую зависит от возможности сохранения морфологических и физиологических характеристик культуры, а также достижения воспроизводимости результатов экспрессии измененного или привнесенного гена. Однако, даже между независимыми растительными линиями, протрансформированными одной и той же конструкцией, наблюдается значительная вариабельность трансгенной экспрессии. Более того во многих случаях происходит полное или частичное ингибирование встроенного гена. На данный момент известно несколько факторов вызывающих изменения уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях.

Это и непредсказуемое число интегрированных в геном копий, и место интеграции экспрессионной кассеты, и уровень ее метилирования (Bhattacharyya et al., 1994, Hobbs et al., 1993, Linn et al., 1990, Matzke & Matzke 1990, 1998; Kooter et al. 1999). Вариабельность экспрессии между трансформантами и эффекты сайленсинга сильно усложняют как фенотипический анализ, так и создание коммерчески выгодных линий с предсказуемыми характеристиками. Таким образом, одной из главных задач в области трансформации растений в настоящий момент является разработка конструкций и методов трансформации для получения в высоком процентном соотношении трансгенных растений с искомым стабильным фенотипом и снижение различий в уровне экспрессии гетерологичных генов между индивидуальными растениями. Существует ряд стратегий и технологий, применяемых для получения предсказуемых уровней трансгенной экспрессии в растениях, краткий обзор которых представлен ниже.

Однако, несмотря на разнообразие подходов, универсального эффективного способа все еще не найдено. В связи с этим весьма актуальным остается поиск путей решения этой проблемы. Одним из наиболее перспективных подходов видится использование для этих целей регуляторных элементов различного происхождения, препятствующих посттранскрипционному ингибированию гена (PTGS).

Одной из главных проблем получения трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии является репрессия на посттранскрипционном уровне, что связано с перекрытием транскриптов, которые инициируются в гетерологичном гене и в непосредственной близости от него в геноме. В результате становится возможным формирование двухцепочечной РНК, которая запускает ряд процессов, приводящих к репрессии гетерологичного гена. Поставленная нами цель заключалась в исследовании возможности повышения уровня экспрессии гетерологичного гена с помощью ДНК-элементов, обладающих способностью останавливать транскрипцию. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния вирусных 35S CaMV и агробактериальных nos ДНКэлементов, терминирующих транскрипцию, на уровень экспрессии репортерных генов в трансгенных линиях растений табака.

2. Изучение влияния растительных ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на уровень экспрессии репортерных генов под промоторами разной силы и происхождения в трансгенных линиях растений табака.

3. Анализ влияния расположения ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на экспрессию гетерологичных генов в трансгенных линиях растений табака.

4. Оценка влияния ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на вариабельность экспрессии репортерных генов в трансгенных линиях растений табака.

Исследование проводилось на нескольких терминирующих транскрипцию элементах различного генеза, как вирусного и бактериального, так и растительного происхождения. В результате в диссертационной работе впервые было показано, что присутствие в экспрессионной конструкции изучаемых ДНКэлементов в определенной позиции, позволяет увеличить транскрипцию репортерного гена в трансгенных растениях в несколько раз.

Так как терминаторы транскрипции имеют отличный механизм действия, то они могут быть эффективно использованы совместно с другими регуляторными элементами для синергетического усиления экспрессии репортерных генов в трансгенных растениях. Безусловно, для подтверждения этого предположения необходимо проведение дальнейших исследований, однако уже сейчас видно, что подобные элементы являются весьма перспективным методом создания более эффективных экспрессионных векторов для получения трансгенных растений.

Разработанный подход позволит увеличить производительность и ценность многих сельскохозяйственных культур, а также применяться в других областях биотехнологии, например, при экспрессии в растениях различных белков биомедицинского назначения.

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: 1) создано два синтетических и три растительных регуляторных элемента, 2) проведен дизайн и конструирование экспрессионных кассет, для изучения влияния на экспрессию трансгена ДНК-элементов, терминирующих транскрипцию, 3) проведен анализ уровня экспрессии репортерных генов и дальнейший статистический анализ полученных результатов. На их основе на защиту выносятся следующие положения:

Основные положения, выносимые на защиту 1 ДНК-элементы, содержащие последовательности терминаторов генов агробактерий nos и вирусов 35S CaMV при локализации перед промотором усиливают экспрессию гетерологичных генов в растениях под сильным вирусным промотором 35S CaMV.

2 Расположение растительных ДНК-элементов терминирующих транскрипцию (ATs), при любом расположении относительно кассеты экспрессии оказывает более сильное влияние на экспрессию генов под растительными промоторами по сравнению с вирусными.

3 Расположение ДНК-элементов как с одной, так и с обеих сторон экспрессионной кассеты усиливает экспрессию генов с сильного растительного промотора RuBisCO. ДНК-элементы, расположенные только с 5'-конца гена увеличивают уровень экспрессии с сильного вирусного промотора 35S CaMV.

–  –  –

Работа выполнена с использованием современных методов молекулярной генетики, молекулярной биологии и генетической инженерии растений. Цели, поставленные в работе, достигнуты.

Статьи в научных журналах:

A.S. Dolgova, S.V. Dolgov, N.N. Nazipova, O.G. Maksimenko, P.G. Georgiev.

«Arabidopsis termination elements increase transgene expression in tobacco plants»,

2015. Plant Cell, Tissue and Organ Culture Volume 120, Issue 3, 1107-1116. DOI 10.1007/s11240-014-0667-1

Патенты:

О.Г. Максименко, А.С. Долгова, А.Н. Бончук, М.В. Тихонов, Н.Б. Гасанов, Е.И. Зарайский, С.В. Долгов, П.Г. Георгиев. Способ создания трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии трансгенного белка. Патент 2507736.

Дата приоритета 11.01.2011.

Тезисы конференций:

Dolgova A, Zaripova D, Dolgov S, Georgiev P, Maksimenko O (2009). Artificial regulatory elements which enables stable expression of a foreign gene in a tobacco plants. In P. Gustafson (Eds.), Proceedings of the 9th International Plant Molecular

Biology Congress: Saint Louis, Missouri USA, October 25-30 (p. 190). Lancaster, Pa. :

DEStech Publications Долгова А.С., Пушин А.С., Долгов С.В., Георгиев П.Г., Максименко О.Г.

«Синтетические регуляторные элементы позволяющие стабилизировать экспрессию гетерологичных генов в растениях табака». 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция Молодых Ученых «Биология- Наука XXI Века».

Пущино, Россия, 2010 Долгова А.С., Пушин А.С., Долгов С.В., Георгиев П.Г., Максименко О.Г.

«Синтетические регуляторные элементы позволяющие стабилизировать экспрессию гетерологичных генов в растениях табака». Международная научнопрактическая конференция молодых ученых «Современнная биотехнология:

фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология».

Брянск, Россия и Киев, Украина, 2010 Максименко О.Г., Долгова А.С., Бончук А.Н., Долгов С.В., Георгиев П.Г.

«Создание генетических конструкций на основе регуляторных элементов, обеспечивающих высокоэффективную, стабильную экспрессию гетерологичных генов в растительных экспрессионных системах и поиск новых цис-регуляторных элементов растений». Всероссийская научная конференция «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в области хранения и переработки сельскохозяйственной продукции». Москва, Россия, 2010.

–  –  –

Достижения классической селекции трудно переоценить, однако, на данный момент, она не может эффективно обеспечивать растущие потребности человечества. Это связано с ограниченнностью пула генов, способных к переносу традиционными методами селекции. В последнее время при создании сельскохозяйственных культур все чаще используют методы генной инженерии, сочетающие культуру ткани in vitro и методы молекулярной биологии. Суть этого метода заключается в переносе гетерологичных генов, выделенных из различных организмов, в новое генетическое окружение. Благодаря тому, что растительные клетки остаются тотипотентными на протяжении всего жизненного цикла из одной измененной клетки можно получить целое растение. С одной стороны, такой подход позволяет привносить в растения признаки, которые невозможно получить с помощью традиционной селекции, с другой стороны, генетическая инженерия позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что снижает риск разрушения уже сложившегося генотипа. Генетическая инженерия растений начала свое стремительное развитие с появления технологии их трансформации и получения первого трансгенного растения с экспрессией чужеродного гена в начале 80-х гг (Fraley et al., 1983, Horsch et al., 1984; Zambriski et al., 1983). В след за этим последовало появление новых химерных генов (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983a,b), векторов для трансформации (Hoekema et al., 1983; Bevan, 1984), методов доставки ДНК (Hernalsteens et al., 1980; Draper et al., 1982; Krens et al., 1982; Fromm et al., 1985; Sanford et al., 1987) и систем регенерации растений (Zambryski et al., 1983; Paszkowski et al., 1984; Shimamoto et al., 1989; Gordon-Kamm et al., 1990). Было показано, что маркер устойчивости к антибиотикам можно использовать для селекции трансформированных клеток, из которых впоследствии возможно регенерировать нормальные фертильные растения (Bevan et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983). Уже в 1986 году США и Франции проводились первые полевые испытания трансгенных растений – табака с маркерным геном nptII (James and Krattiger, 1996). Табак обыкновенный (Nicotiana tabacum) был и остается ключевым модельным растением, в развитии генно-инженерных технологий. Именно для него была впервые отмечена возможность регенерации in vitro (Skoog and Miller, 1957) и разработана стандартная среда для культивирования (Murashige and Skoog, 1962). В силу простоты трансформации, регенерации и скорости последующего развития табак остается основным модельным объектом для исследований в области генетической инженерии растений.

2.2 Методы трансформации

Существует несколько разных методов доставки ДНК в клетку. В целом, все способы переноса ДНК в растения можно разделить на несколько больших групп.

Первая группа включает природные системы переноса генов – агробактериальные и вирусные векторы и способы доставки. Вторая группа – это искусственные системы переноса, которые можно разделить на две подгруппы: прямое введение ДНК путем достижения проницаемости протопластов и клеток химическими (полиэтиленгликоль), физическими (электропорация, ультразвук) или механическими способами (кристаллы карбида кремния, лазер) и использование искусственных векторных систем – микрочастиц, микроинъекций или липосом.

В третью группу можно включить различные методы, которые в отличие от первых двух не требуют культуры in vitro и их обычно называют методами трансформации in planta. Из всех этих методов наибольшее практическое применение в настоящее время получили агробактериальный метод, биолистический и прямой перенос генов в протопласты. Другие же способы по ряду причин не нашли широкого применения (Barampuram, 2011).

2.2.1 Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens

Агробактериальный метод трансформации растений – это использование в качестве векторов (переносчиков ДНК) бактерий A.tumefaciens, или, более редко, A.rhizogenes. Он основан на способности патогенного организма Agrobacterium переносить из своей Ti-плазмиды в растительные клетки определённые фрагменты ДНК. Благодаря этому, нативные штаммы Agrobacterium способны встраивать в геном растений различные гены, отвечающие за синтез эндогенных фитогормонов, опинов - производных аминокислот и сахаров. В результате экспрессии перенесенных генов формируются опухоли или разросшиеся корни, в которых синтезируются различные типы опинов, являющиеся питательной средой для Agrobacterium, не усваивающиеся растительными клетками. (Chilton et.al., 1977; Пирузян и Андрианов, 1985; Дрейпер и Скотт, 1991).

Дальнейшие исследования показали, что Ti-плазмиды могут выступать в качестве биологического вектора для переноса больших фрагментов ДНК (до 50 тыс. п.н.), поскольку обладают всеми необходимыми для этого компонентами:

- имеют набор генов вирулентности (VirA, B, C, D, E и G), координированное действие которых обеспечивает перенос и интеграцию переносимой ДНК (Т-ДНК);

- консервативные 24х нуклеотидные прямые повторы, которые фланкируют Т-ДНК и выступают в качестве сигналов узнавания системы переноса ДНК;

- район Т-ДНК, который может быть заменен на интересующий исследователей ген.

- ori-сайт отвечающий за репликацию Ti-плазмиды внутри агробактерии.

Помимо vir-генов в работе аппарата переноса Т-ДНК и в обеспечении вирулентности агробактерий принимает участие группа генов, локализованных в бактериальной хромосоме. Гены chv A, chv B, psc A и exo C необходимы для прикрепления агробактерий к стенке растительной клетки (Thomashow et.al., 1987;

Cangelosi et. al., 1989). В результате мутаций в этих локусах получаются авирулентные или дефектные по прикреплению штаммы агробактерий. Однако онкогенность и большие размеры нативной плазмиды не позволяли использовать ее для прямого клонирования и переноса чужеродных генов. Эти недостатки были преодолены в начале 80-х.

В 1983г. сразу несколько исследовательских групп - одна из Вашингтонского университета (США), вторая из Института растениеводства им.

Макса Планка (Германия) и третья из Гентского государственного Университета (Бельгия), используя традиционную технологию рекомбинации ДНК, провели удаление генов вызывающих опухоли (Fraley et.al., 1983; Zambryski et.al., 1983).

Эти гены были заменены на гены резистентности к канамицину, в результате чего трансформированные растительные клетки приобрели устойчивость к антибиотику (Bevan et.al., 1983; Fraley et.al., 1983; Herrera-Estrella et.al., 1983а).

Таким образом, открылась возможность получения фенотипически нормального фертильного растения с экспрессией чужеродных генов.

Первоначально были созданы коинтегративные системы векторов (цисвекторы), у которых большая часть Т-ДНК была заменена на участок ДНК, который имел область гомологии с клонирующими векторами, способным реплицироваться в клетках E.coli. Таким образом, в клетках агробактерии между гомологичной областью модифицированной Ti-плазмиды (vir-помощник) и гомологичной областью промежуточного вектора E.

coli происходит рекомбинация. Образуется гибридная Тi-плазмида между нативными границами Т-ДНК которой находится полный коинтегративный вектор E.coli pBR322, содержащий гены для переноса в растения. Бактериальный селективный маркер плазмиды E.coli позволяет поддерживать Тi-коинтеграт в агробактерии, т.к. вектор E.coli в ней не способен реплицироваться автономно. В результате, в штаммах Agrobacterium, содержащих эти конструкции, во время трансформации Т-ДНК переносится в геном растения в результате действия vir области в положении цис (Zambryski et.al., 1983).

Бинарная векторная система (транс-векторы) состоит из двух векторов:

обезоруженной Ti-плазмиды и вектора, автономно реплицирующегося как в E.coli, так и в агробактерии. Меньший вектор (бинарный) содержит между границами ТДНК гены для переноса в растения. Внутри его Т-ДНК находятся множественные сайты для клонирования, что позволяет осуществить вставку любой интересующей последовательности ДНК. Эта плазмида путём конъюгации переносится в штамм Agrobacterium содержащий большую плазмиду-помощника, лишенную онкогенности, что обеспечивает перенос Т-ДНК из маленькой плазмиды в клетки растения. В результате, перенос чужеродной ДНК из клонирующего вектора в растительную клетку может выполняться vir областью, функционирующей в транс-положении (Hoekama, 1983; Bevan, 1984).

Первое трансгенное растение с экспрессией чужеродного гена получили именно агробактериальным методом (Horsch et al., 1984). По сравнению с искусственными системами переноса (как, например, широко используемый биолистический метод) агробактериальный метод обладает двумя важными преимуществами. Первое – агробактерии переносят в геном растений только тот фрагмент, который расположен между двумя определенными последовательностями ДНК, тогда как при использовании искусственных систем трансформированные клетки содержат также фрагменты генов или плазмидной ДНК. Второе – агробактериальный способ обычно приводит к встраиванию только одной или, по крайней мере, ограниченного числа копий гена и при этом, видимо, в определенные локусы хромосом, а другие методы к бессистемному встраиванию множества копий, которые в большинстве случаев сцеплены друг с другом (De Block, 1993). При использовании агробактериального метода частота получения стабильных трансформантов выше по сравнению с биолистическим методом (Mehlenbacher, 1995) и не требуется регенерация из протопластов, как при прямом переносе ДНК. Долгое время основным недостатком системы агробактерий было отсутствие методики агробактериальной трансформации злаковых культур. Но впоследствии для пшеницы (Mooney et al., 1991) и риса (Chan et al., 1992) удалось регенерировать стабильно трансформированный каллус, а позднее агробактериальным способом получили трансгенные растения кукурузы (Ritchie et al., 1993) и риса (Hiei et al., 1994).

Из трех наиболее распространенных методов трансформации растений наиболее часто используется агробактериальный. В 2003г агробактериальным метод был использован в 57% всех опубликованных работ по трансформации растений. В то время как биолистическая трансформация и прямая доставка ДНК в протопласты были использованы в 25% и 14% статей соответственно (Vain, 2007).

2.2.2 Биолистический метод переноса генов

Биолистический метод заключается в том, что металлическим частицам (диаметр 1-4 мкм), покрытым ДНК, придается определённая скорость, они проникают через стенки интактных клеток и вносят в них молекулы ДНК (Klein et al., 1987; Sanford et al., 1987). Небольшие отверстия в мембранах и клеточных стенках быстро затягиваются, “проколы” существуют непродолжительное время и не нарушают целостность клеток. Частицы же настолько малы, что оставаясь в протоплазме, не мешают естественным клеточным процессам. (Klein et al., 1987;

McCabe et al., 1988).

Этот метод переноса генетической информации впервые был разработан в середине 60-х вирусологами, которые применили высокоскоростные частицы для поранения растительных клеток с целью заражения их вирусами (MacKenzie, 1966). Исследователи Корнельского университета значительно усовершенствовали методику биолистического переноса генов (Klein et al., 1987; Sanford, 1993). Они разработали ряд приспособлений для ускорения вольфрамовых частиц до скорости 250 м/с, достаточной для проникновения через клеточную стенку, что позволило транспортировать антитела, ферменты, синтетические микромолекулы и молекулы ДНК в растительные клетки. Усовершенствование, адаптация и модификация этого метода проводились многочисленными группами исследователей во всём мире (McCabe et al., 1988; Oard et al., 1990; Finer et al., 1992). Мишенями для бомбардировки ДНК были не только растения, но и водоросли, грибы, животные клетки (Sanford et al., 1993).

Ключевым преимуществом биолистического метода, или бомбардамента (переноса ДНК с помощью микрочастиц), является то, что ДНК может быть встроена практически в любую ткань независимо от генотипа. Для некоторых видов растений, в первую очередь однодольных и голосеменных, могут возникать трудности при трансформации агробактерией. В этих случаях можно использовать метод бомбардировки. Кроме того, для переноса бомбардаментом можно использовать более простые плазмидные конструкции, так как нет необходимости в сохранении последовательностей необходимых для репликации и переноса ТДНК. Также микрочастицами можно использовать для поранения тканей перед агробактериальным заражением (Bidney et al., 1992; Zuker et al., 1997). Более того, биолистическим методом можно трансформировать непосредственно меристемы растений. При этом стадия культуры ткани уменьшается до минимума и способ можно применять для видов, для которых еще не разработана методика регенерации. Однако с середины 90-х стала развиваться система трансформации таких культур посредством использования агробактерий (Hiei et al., 1994), что снизило темпы роста использования биолистичеких методов.

Основные недостатки биолистического переноса генов — высокая стоимость необходимого оборудования, низкая частота интеграции ДНК, получение химерных растений (Sanford, 1993) и множественная вставка интродуцируемого гена, следствием которой является частая нестабильность экспрессии гетерологичных генов в геноме (Pawlowski и Somers, 1996).

2.2.3 Прямая доставка ДНК в протопласты

Техника прямого переноса представляет собой инкубацию растительных протопластов с ДНК таким образом, что ДНК проникает в ядра клеток.

Растительные клетки обрабатываются ферментами, разрушающими целлюлозную стенку клетки, в результате чего становится возможным перенос чужеродной ДНК. Доставка ДНК в протопласты не представляет особых сложностей, основная проблема – это регенерация из них растений. Часто требуется разработка протокола регенерации даже для отдельных сортов, не говоря уже о видах, что ограничивает применение этого метода (Davey et al., 2005).

Прямой перенос чужеродной ДНК в растительные протопласты может производиться при использовании так называемых агентов слияния, например липосом (положительно заряженных сфер липидов, которые обволакивают трансформирующую ДНК) (Zhang и др.,1988). Более распространенным методом прямого введения ДНК в протопласты как животных, так и растений является электропорация: кратковременные электрические разряды (1-100 мкс при напряженности поля 1000-10000в/см), которые увеличивают проницаемость мембран протопластов, куда и проникает находящаяся в растворе ДНК.

Транзиентная экспрессия, полученная электропорацией растительных клеток, применяется в исследованиях различных направлений (Higo and Higo, 1996; Ecker and Davis, 1986; Fisk and Dandekar, 1998). Этот способ обладает преимуществом по сравнению с другими, так как не только способствует введению молекул ДНК, но и повышает у протопластов способность регенерировать растения, что, возможно, связано с поглощением регуляторов роста или необходимых питательных веществ через поры в плазмалемме, образующиеся при этой процедуре (Rech et al., 1987).

Эффективность электропорации довольно высока: 6.25% для зародышей и 54.6% для каллусных структур, что вполне сравнимо с наилучшими результатами, полученными в экспериментах с бомбардировкой микрочастицами (Deshayes et al., 1985). Основной недостаток этого метода – трудоемкость получения и регенерации растений из протопластов коммерчески значимых сортов. Однако в 1995 году была показана возможность трансформации методом электропорации интактных меристем (Chowrira et al. 1995). Заслуживает внимания также и возможность избежать фазы регенерации использованием трансформации этим методом пыльцы (Saunders and Matthews, 1995). Прямой перенос ДНК в протопласты особенно интересен для культур, мало чуствительных к другим методам трансформации (Rakoczy-Trojanowska, 2002).

2.3 Репортерные гены и селективные маркеры

Ни одна из методик трансформации растений не обеспечивает стопроцентного выхода трансформированных клеток, более того, этот процент обычно не велик. В связи с этим необходимым является отбор клеток со встроенной гетерологичной ДНК. Встраивание вместе с целевой конструкцией гена, обеспечивающего рост трансформированных клеток в гибельных для других условиях, позволяет проводить селективный отбор уже на первых этапах трансформации (негативная селекция). В качестве селективных маркерных генов чаще всего используются гены устойчивости к различным антибиотикам или гербицидам. Наиболее часто используется ген устойчивости к аминогликозидным антибиотикам – nptII – один из первых селективных маркерных генов для растений (Bevan et al., 1983). Этот ген придает устойчивость к таким антибиотикам, как канамицин, паромомицин, неомицин и G418 (генетицин).

Другим широко используемым селективным маркером является гигромицин Б.

Устойчивость к нему придает ген гигромицин фосфотрансферазы – hpt, выделенный из E.coli (Rao et al., 1983). Кроме резистентности к антибиотикам, селекцию трансформированных клеток проводят также с участием генов обеспечивающих устойчивость к гербицидам. Из этой группы наибольшее применение получили гены устойчивости к фосфинотрицину. Эти гены– bar (Thompson et al., 1987) и схожий ген pat (Strauch et al., 1988) были выделены из бактерий рода Streptomyces. Отработку систем трансформации, равно как и отслеживание наследования гетерологичных генов, удобно производить с помощью репортерных генов, чью экспрессию можно легко оценивать количественно. Наиболее распространенным репортерным геном на протяжении многих лет остается uidA (gus), клонированный из штамма E. coli К12, и кодирующий фермент -глюкуронидазу (GUS). Это гидролаза, катализирующая расщепление -глюкуронидов, многие из которых являются коммерческими препаратами и используются в качестве субстратов для спектрофотометрического, флюориметрического и гистохимического анализов (Jefferson и др., 1986). В настоящее время все чаще используется ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), клонированный из медузы (Aequora victoria). Экспрессия дикого типа gfp в растениях очень слаба (Niedz et al., 1995) и на данный момент используется модифицированная последовательность, в которой GFP накапливается в эндоплазматическом ретикулуме (Haseloff et al., 1997). Детекция GFP отличается высокой чувствительностью, несложной технологией применения, низкой стоимостью и уже разработанной системой применения для большинства видов растений и культур клеток. Более того, в отличии от GUS, GFP позволяет проводить детекцию в живых клетках.

2.4 Вариабельность трансгенной экспрессии

Развитие методов генетической трансформации привело к использованию трансгенных растений в различных областях, таких как улучшение важных признаков ряда сельскохозяйтвенных культур (Lanfranco, 2003), выработка растениями ценных белков (биофарминг) (Twyman et al.

, 2003; Fischer et al., 2004) и использование трансгенных растений в качестве инструмента для изучения механизмов функционирования генов (обратная генетика) (Lloyd, 2003 и Kusaba, 2004). Однако существует значительная вариация уровня экспрессии гетерологичных генов, которая всегда наблюдается в пределах популяции растений, трансформированных одной и той же конструкцией, одним и тем же методом и при одинаковых условиях (Peach and Velten, 1991; Bennet, 1993; Birch, 1997; Bhat and Srinivasan, 2002; Butaye et al., 2004). Эта вариабельность трансгенной экспрессии сильно усложняет как анализ фенотипических признаков, так и создание коммерчески выгодных культур с предсказуемыми характеристиками. Для снижения затрат, уровня прилагаемых усилий и количества ошибок при интерпретации результатов исследований было предпринято множество попыток достижения стабильной трансгенной экспрессии и предсказуемости ее уровня. На вариабельность трансгенной экспрессии влияют множество причин, это разное число встраиваемых в геном копий, сайты инсерции гетерологичного гена, РНК-сайленсинг в растении-хозяине и т.д.

Как правило, результатом генетической трансформации растений является высокая частота образования трансгенных растений с непредсказуемым уровнем экспрессии гетерологичного гена. Например, это показано для такого стандартного репортерного гена как gus (Hobbs et al. 1993; Elmayan and Vaucheret 1996; Brouwer et al. 2002; De Bolle et al. 2003). Более того, даже те растения, которые демонстрируют желательные уровни экспрессии, могут утерять эти характеристики через ряд поколений (Scheid et al. 1991; Bhat and Srinivasan 2002;

Vain et al. 2002; Butaye et al. 2004). Вариабельность трансгенной экспрессии неудобна еще и тем, что делает просто необходимым анализ большого числа трансформационных событий для нахождения индивидуальных трансформантов с приемлемыми уровнями экспрессии и желательным фенотипом, и усложняет интерпретацию результатов проводимых исследований (Birch 1997; Bhat and Srinivasan 2002; De Bolle et al. 2003).

2.4.1 Возможные причины вариабельности трансгенной экспрессии

На данный момент известно несколько факторов вызывающих вариабельность уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях. Одной из главных причин является непредсказуемое число интегрированных в геном копий.

На самом деле многократные копии чужеродной ДНК имеют тенденцию образовывать один или несколько инсерционных сайтов, что возможно, является следствием связывания фрагментов гетерологичной ДНК перед интеграцией (Pawlowski and Somers, 1998; De Buck et al., 1999). Теоретически увеличение копийности должно приводить и к увеличению уровня экспрессии. Однако многокопийные кластеры часто бывают связаны с низким уровнем экспрессии, а особенно такие комплексы как тандемные повторы (TR) (Jorgensen et al., 1996;

Sijen et al., 1996; Wang and Waterhouse, 2000) и инвертированные повторы (IR) (Hobbs et al., 1993; Depicker and VanMontagu, 1997; Stam et al., 1997; Muskens et al., 2000). По-видимому, причиной такого снижения экспрессии является взаимодействие между гомологичными последовательностями и, как следствие, гомолого-зависимое умолкание генов (homology-dependent genesilencing (HDGS)) (Meyer and Saedler 1996). Это явление обнаруживается не только в случаях многократной инсерции гена в один локус, но и при встраивании генов в разные участки ДНК. Этот феномен, поначалу приводивший ученых в замешательство, может действовать на двух уровнях: транскрипционном (transcriptional gene silencing; TGS) и пост-транскрипционном (post-transcriptional gene silencing;

PTGS). На протяжении многих лет считалось, что именно эти два явления (PTGS и TGS) являются главными определяющими факторами, влияющими на трансгенную экспрессию в растениях. Предполагается, что явление PTGS, на данный момент более известное как РНК-сайлесинг или РНК-интерференция, это консервативный эукариотический механизм растительного мониторинга вирусных частиц, защищающий геном от транспозонов и участвующий в регуляции экспрессии генов (Baulcombe, 2004).

Механизмы РНК-сайленсинга у грибов (quelling-подавление), животных (РНК-интерференция (RNAi)) и у растений (PTGS) обладают сходными необходимыми генетически опосредованными условиями и характерными биохимическими особенностями, но значительно разнятся в путях прохождения реакций, задействованных этими группами организмов, приводящих к умолканию генов. РНК сайленсинг был обнаружен почти во всех эукариотических организмах (за исключением почкующихся дрожжей S. cerevisea) (Denli and Hannon, 2003; Finnegan and Matzke, 2003; Matzke and Matzke, 2003; Pickford and Cogoni, 2003; Waterhouse and Helliwell, 2003;

Baulcombe, 2004; Susi et al., 2004). Кроме совокупности кластеров мультикопийной ДНК, таких как IRs или другие спусковые механизмы PTGS, в растениях так же могут присутствовать: дцРНК, одновременная экспрессия смысловых и антисмысловых генов, гомология между гетерологичными и родными генами, продукция аберрантной РНК (незаконченные преждевременные транскрипты, продукты распада или антисмысловые РНК), высокие уровни трансгенной экспрессии, превышающие определенную присущую растениям пороговую величину (Matzke et al., 2002). Как таковой, РНК-сайленсинг может играть ведущую роль в проявлении вариабильности трансгенной экспрессии.

TGS, как и PTGS, основывается на узнавании нуклеиновыми кислотами гомологичных последовательностей. Однако, в этом случае, узнавание идет на транскрипционном уровне и, следовательно, транскриптов просто не образуется.

Явление TGS часто связано с метилированием промоторных последовательностей гетерологичного гена и часто оказывается мейотически наследуемым (Park et al., 1996). На протяжении долгого времени предполагалось, что TGS и PTGS используют два различных механизма. Однако в настоящее время господствует гипотеза о том, что siРНК (siRNA-small interfering RNAs), которые являются ключевыми действующими единицами РНК-умолкания, так же участвуют и в регуляции экспрессии на транскрипционном уровне генов в ядре, через ремоделирование хроматина и РНК-направленного ДНК-метилирования (Aufsatz et al., 2002; Pickford and Cogoni, 2003; Matzke et al., 2004). Границы между TGS и PTGS размываются и TGS теперь воспринимается просто как РНК-сайленсинг внутри ядра.

Другой источник вариации экспрессии между индивидуальными растениями относится к эпигенетическим позиционным эффектам, т.е. то место в пределах генома, куда произошла встройка гетерологичного гена, влияет на способность гетерологичных генов экспрессироваться (Matzke and Matzke, 1998).

В отличие от прокариот и низших эукариот, таких как дрожжи, интеграция гетерологичной ДНК гомологичной рекомбинацией редка у высших эукариотических организмов, где ДНК встраивается в основном за счет соединения концов разорванных ДНК, обходящегося без гомологии, или незаконной рекомбинации (Gheysen et al., 1991; De Buck et al., 1999; Hohn and Puchta, 2003). Как следствие, встраивание чужеродной ДНК в геном растений может произойти фактически в любом участке. В результате, интеграция может происходить в регионах, как с низким, так и с высоким уровнем транскрипции.

Предполагается, что интеграция гена в конденсированный хроматин, или в области прилегающие к нему, приводит к снижению экспрессии и/или к увеличению её вариабельности. Окружение эндогенными регуляторными последовательностями, такими как энхансеры или ингибиторы транкрипции, будет так же оказывать влияние на уровень экспрессии (Matzke and Matzke, 1998, Meyer, 2000, Francis and Spiker, 2005).

Естественно, трансгенная экспрессия будет подвержена влиянию и других факторов кроме копийности, РНК-сайленсинга и влияния сайта интеграции.

Другой причиной может являться сомаклональная вариация, которая обычно определяется как генетическая и фенотипеческая изменчивость между клонально размноженными растениями одного донора. Это явление, скорее всего, связано с определенными физиологическими нарушениями, вызванными культивированием на искусственной питательной среде и в изоляции от целого организма. (Phillips et al., 1994; Duncan, 1997; Kaeppler et al., 2000).

К тому же, влияние специфических регуляторных последовательностей, главным образом промоторов и терминаторов, прямо влияющих на экспрессию, к сожалению, изучено не так широко как хотелось бы (De Bolle et al., 2003).

Подводя итог, можно сказать, что многие факторы, такие как копийность, РНКсайленсинг, позиционные эффекты, сомаклональная изменчивость и регуляторные последовательности, значительно усложняют получение подходящих стабильных уровней трансгенной экспрессии в растениях. Причем каждый отдельный фактор воздействует не независимо, а в тесной связи с остальными, и механизмы этой связи не всегда известны. Для преодоления этих проблем и достижения высоких и стабильных уровней экспрессии трансгена можно применять различные стратегии трансформации и вспомогательные регуляторные элементы.

–  –  –

С целью получения более предсказуемых результатов, для фенотипического анализа часто используют однокопийные трансформанты. Но даже этот метод не всегда дает гарантированный стабильный уровень экспрессии, и если в некоторых работах искомый уровень легко достигается, другие предоставляют более спорные результаты (Elmayan and Vaucheret, 1996; De Wilde et al., 2001; Meza et al., 2002;

De Buck et al., 2004; Shingo Nagaya et al., 2005). Широко известен тот факт, что получение трансгенных растений путем искусственного переноса генов (биолистический метод, электропорация) приводит к наличию в растении большого числа трансгенных копий (по некоторым сообщениям до 100), тогда как трансформация посредством Agrobacterium tumefaciens приводит к вставке значительно меньшего числа копий (до 10) и большого числа однокопийных трансгенных клонов (Hansen and Wright, 1999; Koprek et al., 2001; Gelvin, 2003;

Reddy et al., 2003). Таким образом, предпочтительно использовать агробактериальную трансформацию, так как мультикопийность часто вызывает понижение уровня экспрессии (Muskens et al., 2000). Однако и при искусственном переносе генов иногда можно получить некоторый процент одно-трехкопийных клонов (например, Romano et al., 2003). Тем не менее, число копий гетерологичного гена может сильно варьировать независимо от используемого метода трансформации, что, вероятно, зависти от ряда факторов, которые еще не удалось установить. Некоторые исследования позволяют предположить, что структура и сложность трансгенного локуса может зависеть от используемого штамма агробактерии (De Block и Debrouwer, 1991), вида или даже экотипа растения (Nam et al., 1997) и типа используемого экспланта растения-хозяина (Grevelding et al., 1993). Те штаммы агробактерии, которые менее эффективно переносят Т-ДНК, могут оказаться полезными для получения однокопийных инсерций. Некоторые данные позволяют предположить, что менее благоприятные условия трансформации ведут к снижению числа копий гетерологичных генов, но нет пока причин считать такую корреляцию полностью обоснованной (Butaye et al., 2005). Следовательно, необходимо более детальное исследование систем интеграции, прежде чем можно будет сделать окончательные выводы о возможностях различных стратегий доставки с контролируемой частотой гетерологичных генов в растительный геном. Для молекулярной биологии растений большое значение имеет разработка методики трансформации для получения однокопийных трансгенных растений. Однокопийные трансформанты получаются не всегда, и развитие технологий сфокусировано, в том числе, и на этой проблеме. В литературе описывается многообещающий метод создания растений с одной копией гетерологичного гена основанный на воздействии рекомбиназы на многократные инсерции (Srivastava et al., 1999). Котрансформация кукурузы двумя конструкциями одной с фланкирующими противоположно направленными lox-сайтами и другой, Cre-экспрессирующей (Cre-lox система состоит из Cre рекомбиназы размером 38кДа, которая узнает 34х нуклеотидные последовательности известные как lox), в результате привела к высокому процентному соотношению трансформантов содержащих лишь одну копию вводимого гена.

Такая система способствует так же и сайт-специфическому встраиванию чужеродной ДНК в геном (Ow, 2002). Однако, работы на табаке показали, что в этом случае предсказуемую трансгенную экспрессию можно наблюдать лишь в 50% случаев, а в остальных 50% - радикально сниженный уровень экспрессии. (Day et al. 2000). То есть интеграция идентичных трансгенных вставок в одинаковые районы генома в растениях не обеспечивает абсолютной стабильности экспрессии. Авторы предполагают, что умолкание гетерологичного гена в этих случаях является результатом метилирования чужеродной ДНК благодаря интеграции в регионы растительного генома, восприимчивые к метилированию ДНК. Так же, наблюдается и низкая эффективность применяемого метода, только около половины клонов на самом деле точно содержат лишь одну копию, интегрированную в предопределенный локус. Стратегия обратной селекции может быть направлена на получение однокопийных, сайт-специфических трансгенных линий. Более того, система сайт-специфической рекомбинации, описанная выше, все еще основана на случайной интеграции целевого сайта, такого как lox, что является неблагоприятным событием, так как инсерция Т-ДНК может разрушить транскрипционные единицы и в результате привести к мутантному фенотипу (Errampalli et al., 1991; Lindsey et al., 1993; Svabados et al., 2002).

В идеале, одна копия гена должна быть интегрирована в регион генома, обладающий высоким уровнем транскрипционной активности, без нарушения уже присутствующих там генов растения-хозяина. В теории, встраивание гена в заранее предусмотренный хромосомный сайт может происходить за счет гомологичной рекомбинации. Теоретически доставки целевого гена в предусмотренный хромосомный сайт можно добиться гомологичной рекомбинацией. Тем не менее, на данный момент растение мха Physcomitrella patens, которое является гаметофитом, - единственное растение у которого показано наличие высокого уровня гомологичной рекомбинации. Поэтому он представляет особый интерес в развитии технологий точной доставки генов (Schaefer, 2002). Интеграция трансгенной ДНК через гомологичную рекомбинацию так редка у высших растений, что делает доставку гена в определенное местно генома этим методом чрезвычайно сложной задачей.

Наблюдаемая частота гомологичной рекомбинации у высших растений не выше 10-3-10-5, независимо от вида растения или метода трансформации (Hohn and Puchta, 2003). Многие исследования посвящены преодолению проблемы низкой эффективности гомологичной рекомбинации в растениях, не столько для того, чтобы оптимизировать трансгенную экспрессию, а скорее для облегчения функционального эндогенного анализа инсерционным мутагенезом интересующего гена (Kumar and Fladung, 2001). Например, в одном из исследований (Terada et al., 2002, 2004, 2007) описывается процедура с сильной позитивно/негативной селекцией для модификации генов риса (WAXY и Adh2). И хотя наблюдаемая частота гомологичной рекомбинации все еще оставалась в тех же рамках (10-3-10-5), метод строгой селекции облегчил скрининг удачных трансформантов. Процент таковых в случае гена WAXY составил около 1%, а в 2007 году для гена алгокольдегидрогеназы частота искомых трансформантов достигла 2%. Другие попытки концентрировались на улучшении продуктивности вовлеченного ферментативного механизма гомологичной рекомбинации. Одним из путей её усиления является применение для трансформации растений гиперактивных участков ДНК с горячими точками рекомбинаци, выделенных из других видов. В Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae такие сайты были найдены в непосредственной близости к регионам, связанным с блокированием вилок ДНК репликации или с интенсивной транскрипционной активностью. Было показано, что применение таких гиперактивных участков ДНК из дрожжей (нетранскрибируемые участки и последовательности между генами рибосомной РНК) для трансформации A.

thaliana усиливают частоту гомологичной рекомбинации (Urawa et al., 2001). Другая попытка увеличить частоту гомологичной рекомбинации в растениях представляла собой индукцию двухцепочечных разрывов в ДНК. Индукция таких разрывов напрямую связана с частотой гомологичной рекомбинации (Puchta et al., 1993). Один из путей стимулирования таких разрывов лежит через использование редко встречающихся ферментов рестрикции, таких как I-SceI (Puchta et al., 1993), ICeuI (Chilton and Que, 2003) или нуклеазы домена цинковых пальцев (Lloyd et al., 2005). На табаке было показано, что когда геномные двухцепочечные разрывы индуцируются в непосредственной близости к гомологичным повторам, они в одной трети случаев могут быть восстановлены за счет гомологичной рекомбинации (Siebert and Puchta, 2002). Разработка высоко специфичных эндонуклеаз специального назначения является одним из ключевых этапов в распостранении этой технологии (Epinat et al., 2003). Таким образом, до сих пор применение технологий использующих гомологичную рекомбинацию для снижения уровня вариабельности трансгенной экспрессии не является установившейся практикой.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«БАРИНОВА Ирина Владимировна Патогенез и танатогенез плодовых потерь при антенатальной гипоксии 14.03.02 – Патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ Доктор биологических наук, доктор медицинских наук, профессор профессор САВЕЛЬЕВ...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ВОРОБЬЕВА Ольга Вадимовна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И ИСТОРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА В АЛЛЕРГОЛОГИИ: АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Борисов Станислав Юрьевич Морфологические изменения во внутренних органах крыс при воздействии нано-, микрои мезоразмерных частиц цеолитовых туфов 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Васильева Ольга Валерьевна Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Гунин А.Г. Чебоксары – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«МАХАЧЕВА ХАННА ГАДЖИЕВНА СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МОДЕРНИЗАЦИИ ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дайхес доктор медицинских наук, профессор Л.М. Асхабова...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«ПЛОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА ИНДИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ Специальность: 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук...»

«КОПИЙ ВЕРА ГЕОРГИЕВНА УДК 574.587 (252.5) СООБЩЕСТВА МАКРОЗООБЕНТОСА ПЕСЧАНОЙ ПСЕВДОЛИТОРАЛИ У ЧЕРНОМОРСКИХ БЕРЕГОВ КРЫМА Специальность 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель Заика Виктор Евгеньевич член-корреспондент НАН Украины, доктор биологических наук, профессор Севастополь 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 РАЗДЕЛ 1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕННОСТИ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.