WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ « ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

«ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА

На правах рукописи

Кофиади Илья Андреевич

ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В

БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

«03.03.03 – иммунология»

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ 8

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О РОЛИ

ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИИ

ИММУНОАССОЦИИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ 2

1.1.1 «Догеномный» период развития генетического направления в иммунологии 28 1.1.2 Иммуногенетика в постгеномную эру 3

1.2 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ

РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ЕСТЕСТВЕННОЙ

УСТОЙЧИВОСТИ К ИММУНОЗАВИСИМЫМ

ЗАБОЛЕВАНИЯМ

1.2.1 Роль HLA-генов в развитии предрасположенности к иммунозависимым заболеваниям 4 1.2.2 не-HLA гены иммунной системы в ответе на инфекции и измененные собственные антигены 46

1.3 ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ФОРМИРОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

К ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД

1.3.1 Роль HLA в формировании генетически обусловленной устойчивости и чувствительности к ВИЧ-инфекции 56 1.3.2 не-HLA гены в ответе на ВИЧ 5 1.3.3 Популяционный подход к изучению ВИЧ-инфекции/СПИД 61 1.3.4 Фармакогенетика противовирусных средств 63

1.4 ГЕНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ

КАНЦЕРОГЕНЕЗА

1.4.1 Иммунологический контроль опухолеобразования 66 1.4.2 Современная теория иммунологического надзора за опухолями

1.5 РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В ОТВЕТЕ НА

РАДИАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ 68

1.5.1 Эффекты радиационного воздействия 70 1.5.2 Контроль клеточного цикла 77 1.5.3 Репарация ДНК 1.5.4 Гены иммунного ответа в реакции организма на облучение

1.6 ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

В ИММУНОЛОГИИ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 90

2.1 СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ОБРАЗЦАХ 90

2.1.1 Установление особенностей распределения генетических маркеров, ассоциированных с устойчивостью/ чувствительностью к ВИЧ-инфекции/СПИД и препаратам АРТ: характеристика групп сравнения 90 2.1.2 Установление ассоциации генетических маркеров с вероятностью развития радиационных осложнений онкологического генеза: характеристика групп сравнения 92 2.1.3 Разработка нового подхода к мониторингу вирусной нагрузки и оценкеэффективности терапии у пациентов клиники трансплантации органов: клинический материал 93 2.1.4 Разработка лабораторного метода для оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гептита С кандидатными препаратами миРНК:

клетки и их источники

–  –  –

2.14 БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА

ГЕНОТИПИРУЮЩИХ ТЕСТ-СИСТЕМ 114 3.1.1 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности к ВИЧ-инфекции/СПИД 116 3.1.2 Генотипирующие тест-системы для определения фармакогенетических маркеров, ассоциированных с развитием гиперчувствительности у лиц, принимающих препараты АРТ 118 3.1.3 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности к развитию радиационных осложнений онкологического генеза 119

3.2 ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ 120

3.3 ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА В

ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 124

3.4 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЧАСТОТНОГО

РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАННЫХ МАРКЕРОВ В

ПОПУЛЯЦИЯХ РОССИИ И

СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ 1

3.4.1 Популяционное распределение маркера CCR5delta32 rs333 125 3.4.2 Популяционное распределение маркера CCR2-64I rs1799864 3.4.3 Популяционное распределение маркеров SDF1-3’A rs1801157, HCP5 rs2395029 и HLA-C rs9264942 128 3.4.4 Популяционное распределение маркеров HLA-B*57:01 и HLA-DRB1*01 3.4.5 Популяционное распределение маркеров ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG1 (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135), rs9642880, rs6983267, rs1447295 и rs13281615 129

3.5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ОПАСНОСТИ

РАЗВИТИЯ СПИД И СМЕРТИ В РЕЗУЛЬТАТЕ СПИД В

ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 131

3.6 АССОЦИАЦИЯ МАРКЕРОВ ГЕНОВ СИСТЕМ

РЕПАРАЦИИ ДНК И ИММУННОГО ОТВЕТА

С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ

ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА 132

3.7 РАЗРАБОТКА НОВОГО ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ

ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ВЗРОСЛЫХ РЕЦИПИЕНТОВ

ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА 134

3.8 РАЗРАБОТКА ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ

ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ АНТИСМЫСЛОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 139

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ, КАК ПОДХОД

К УСТАНЛЕНИЮ ЕСТЕСТВЕННОЙ

УСТОЙЧИВОСТИ/ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К

ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД НА ИНДИВИДУАЛЬНОМ И

ПОПУЛЯЦИОННОМ УРОВНЕ 143

4.2 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И

БЕЗОПАСНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ИМУНОГЕНОТИПИРОВАНИЯ 151

4.3 НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ВЕРОЯТНОСТИ

РАЗВИТИЯ ОНКОПАТОЛОГИЙ,

АССОЦИИРОВАННЫХ С ОБЛУЧЕНИЕМ,

В ГРУППАХ ПОВЫШЕННОГО РАДИАЦИОННОГО РИСКА 157

4.4 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МОНИТОРИНГ ВИРУСНОЙ

НАГРУЗКИ КАК СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

–  –  –

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CMV - цитомегаловирус EBV - вирус Эпштейна-Барр FDA - Федеральная администрация США по пищевым продуктам и лекарственным препаратам FISH - флуоресцентная гибридизация in situ GWAS - геномное ассоциативное исследование HHV-6 - вирус герпеса человека 6 типа HLA - антигены тканевой совместимости человека HSV - вирус простого герпеса LCMV - вирус димфоцитарного хориоменингита MCA - метилхолантрен MHC - главный комплекс гистосовместимости NCBI - Национальный центр биотехнологической информации США SNP - однонуклеотидный полиморфизм TCR - рецептор Т-клеток TTV - Transfusion Transmitted Virus или Torque teno virus АРТ - антиретровирусная терапия ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота миРНК - малые интерферирующие РНК МКРЗ - Международная комиссия по радиологической защите ООР - относительная опасность развития СПИД ООС - относительная опасность смерти в результате СПИД ОТ - обратная транскрипция ПНК - полинуклеотид киназа ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РР - коэффициент риска развития СПИД РС - коэффициент риска смерти в результате СПИД ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования Одним из крупнейших научных достижений на рубеже XX-XXI веков стала расшифровка генома человека. В качестве новой задачи на пути практического использования полученных знаний постулируется изучение молекулярных основ изменчивости, в том числе определение роли генетического полиморфизма в формировании уникальных признаков организма. Прогресс в этой области напрямую связан с внедрением методов молекулярной генетики Применение молекулярноVenter 2010).

генетических подходов к изучению механизмов реализации жизненноважных функций организма уже сегодня привело к прорыву во многих областях науки и медицины (Bell 2010, Hamburg and Collins 2010).

Наиболее ярким примером проявления полиморфизма генов является иммунная система человека, и, в частности, главный комплекс гистосовместимости. Именно с исследованием системы генов HLA (Human кодирующего молекулы главного комплекса Leukocyte Antigen), гистосовместимости, была связана одна из первых международных программ в области молекулярной генетики, результаты которой были представлены на XI Международном рабочем совещании и конференции по изучению HLA (г.

Йокогама, Япония, 1991 г.). На сегодняшний день эта система генов насчитывает более 8000 аллельных вариантов (по данным сайта www.hla.alleles.org).

Важнейшим достижением биомедицинской науки последних лет стало формирование представлений о роли генетического полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен (SNP – Single Nucleotide Polymorphism). В настоящий момент в геноме человека насчитывается более 50 миллионов уникальных вариантов последовательности генов человека, представленных SNP (по данным сайта www.ncbi.nlm.nih.gov). Многие из них расположены в так называемых не-HLA генах иммунного ответа, играющих ключевую роль в распознавании сигналов, дифференцировке и регуляции компонентов 9 клеточного и гуморального иммунитета и, как следствие, в защите человека от огромного числа внешних и измененных собственных антигенов.

Нарушение функций генов иммунного ответа и их продуктов ведет к развитию тяжелых форм иммунологической недостаточности и иммунозависимым заболеваниям. В связи с этим, одной из наиболее актуальных и перспективных задач современной биомедицинской науки является расширение теоретических знаний в области иммуногенетического контроля канцерогенеза и противоинфекционного иммунитета (Hill 2001).

Одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в биомедицине является изучение молекулярных и генетических механизмов ВИЧ-инфекции. На сегодняшний день описано лишь два случая излечения от ВИЧ и, по крайней мере, один из них связан с иммуногенетическими особенностями носителя инфекции (Allers, Hutter et al. 2011, Cohen 2013). Так в 2006 году у ВИЧ-инфицированного пациента госпиталя Charite при Берлинском университете была диагностирована лейкемия. В целях терапии заболевания больному была проведена пересадка красного костного мозга.

При этом для пересадки лечащим врачом Gero Hutter была подобрана ткань, клетки которой характеризовались гомозиготностью по делеции CCR5delta32. Ген CCR5 кодирует хемокиновый рецептор, контакт с которым необходим макрофаготропным штаммам вируса (фенотип для R5) проникновения в клетку (Feng 1996). В отличие от более распространенного полноразмерного варианта гена CCR5, ген, несущий делецию на обеих гомологичных хромосомах, не экспрессируется и рецептор CCR5 исчезает с поверхности клетки (Dean, Carrington et al. 1996). Это приводит к формированию генетически обусловленной устойчивости человека к инфицированию ВИЧ. После пересадки показатель вирусной нагрузки пациента, известного в литературе, как «берлинский пациент», понизился до недетектируемого уровня, что позволило диагностировать первый в истории исследования ВИЧ случай излечения (Hutter, Nowak et al. 2009).

Идентификация маркера CCR5delta32 и других иммуногенетических маркеров, ассоциированных с врожденной (естественной) устойчивостью к ВИЧ-инфекции, с динамикой ее прогрессии, чувствительностью к антиретровирусным препаратам может стать важным этапом при разработке эффективных стратегий превенции и терапии ВИЧ-инфекции/СПИД как на индивидуальном, так и на популяционном уровне (Cohen 2011).

Изучение меж- и внутрипопуляционного полиморфизма генов иммунного ответа имеет глубокую фундаментальную значимость.

Сохранение уровня генетического разнообразия, необходимого для выживания человека в условиях агрессивной окружающей среды, решается именно на популяционном уровне. Комбинации аллелей среди представителей тех или иных этнических групп отличаются крайне выраженным разнообразием. Это определяет адаптационный потенциал человека как вида и в целом отражает эволюционную роль мутационного процесса. В связи с этим чрезвычайную актуальность для биомедицинской науки приобретает исследования, направленные на установление популяционных особенностей распределения иммуногенетических маркеров.

В особенности это актуально для таких многонациональных государств, как Россия (Болдырева 2007).

В отличие от особенностей взаимодействия человека и инфекционных агентов, вопрос влияния на организм факторов физико-химической природы изучен в меньшей степени. Наибольшую значимость для биомедицины представляют техногенные факторы вредности, связанные с онко- и иммунопатологиями. При этом одним из наиболее актуальных вопросов, представляющих научно-практический интерес, является вопрос о действии радиации на организм человека.

Установлено, что при радиационном воздействии даже невысокой мощности тяжесть негативных последствий облучения варьирует на индивидуальном уровне (Crompton, Shi et al. 2001). На сегодняшний день детально изучены патогенез, патологическая морфология и клиника заболеваний, обусловленных патогенным действием облучения, риски их возникновения и зависимость от дозы радиации. При этом одной из важнейших, нерешенных до настоящего времени проблем, остается поиск биологических маркеров, позволяющих выявлять лиц чувствительных к радиационному воздействию (Greve, Bolling et al. 2012). Результатом этого является не прогнозируемая в настоящее время индивидуальная реакция человека на действие ионизирующего излучения, как техногенного и естественного фактора вредности.

В первую очередь это связано с отсутствием адекватной модели исследования. Эксперименты с лабораторными животными, равно как и с культурами клеток не позволяют учесть параметры индивидуальной генетической изменчивости. Поэтому для дальнейшего развития знаний и создания теоретической базы в данном направлении могут быть адаптированы современные клинико-статистические методы, позволяющие устанавливать связь индивидуальных генетических особенностей с устойчивостью или чувствительностью человека к радиационному воздействию. С фундаментальной точки зрения связь ионизирующего излучения с онкопатологиями может служить моделью при совершенствовании концепций канцерогенеза и поиске молекулярных маркеров, определяющих риск развития онкологических заболеваний (Hino, Klein-Szanto et al. 1993, Hahn, Wojnowski et al. 1998).

Генотипирование на уровне установления аллельных вариантов генов иммунного ответа, а также ряда других генетических систем, которые рассматриваются в качестве мишеней неблагоприятного воздействия, может стать перспективным подходом для оценки риска развития патологий, ассоциированных с радиационным воздействием, в том числе, в отдаленные периоды времени. Решение этой задачи позволит повысить эффективность профессионального подбора, снизить смертность и раннюю инвалидизацию персонала объектов использования атомной энергии. В то же время, поиск путей оценки риска развития осложнений радиационного воздействия, является важнейшим звеном в выборе и назначении эффективной приемлемой дозы при радиотерапии больных онкологическими заболеваниями, а также при радиодиагностике (Barnett, West et al. 2009).

Говоря о необходимости дальнейшего развития фундаментальных представлений иммуногенетики, не следует забывать и о преимуществах практического внедрения в биомедицине молекулярно-генетических подходов, которые имеют преимущества по сравнению с клеточными и гистологическими методами.

В частности, в связи с широким распространением и повышением эффективности антиретровирусной терапии остро встает вопрос об оценке риска развития осложнений, вызванных приемом некоторых препаратов. Так, например, широко известны примеры с развитием реакции гиперчувствительности у лиц, принимающих Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine) – ингибиторы протеазы ВИЧ. Наличие побочных эффектов достоверно ассоциировано с носительством аллелей HLA-B*5701 и HLA-DRB*01 (Tozzi 2010). Кроме того, с генетическим полиморфизмом связана эффективность применения антиретровирусных препаратов, препятствующих проникновению ВИЧ в клетку, в том числе основанных на блокировании рецептора CCR5. Так, препарат Маравирок (Maraviroc), одобренный в 2011 году FDA (Food and Drug Administration), оказался неэффективен для лиц, инфицированных синцитиеобразующими штаммами ВИЧ (фенотип X4) или же его субпопуляциями, сохраняющими способность использовать рецептор CCR5 для проникновения в клетку (Hirsch, Gunthard et al. 2008). Последнее может может быть объяснено, как мутациями в гене CCR5, так и генетическим полиморфизмом генома самого вируса.

Таким образом, наряду с исследованием полиморфизма генов человека, важным направлением в сфере совершенствования методов борьбы с иммуноассоциированными заболеваниями может стать диагностика самого патогена, а также использование генома вируса в качестве мишени для создания новых лекарственных препаратов.

В настоящее время все больше внимания уделяется фармакологическим подходам, основанным на понижении уровня экспрессии вирусных генов и, как следствие, подавлении ключевых стадий репликативного цикла вирусов, и в частности, вируса гепатита С (Randall, Grakoui et al. 2003). Среди них наибольшего внимания заслуживают методы, основанные на механизме интерференции РНК. Суть процесса заключается в ингибировании трансляции за счет комплементарного связывания РНКмишени с короткими молекулами РНК (миРНК) (Fire, Xu et al. 1998). Однако для отбора лекарственных средств, наиболее перспективных с точки зрения терапии, необходима точная оценка эффективности ингибирования экспрессии. Единственным методом, отвечающим условиям точности и специфичности анализа, является количественная полимеразная цепная реакция ПЦР.

ПЦР является одним из наиболее распространенных методов генодианостики и генотипирования. В подавляющем большинстве биомедицинских задач ПЦР используется либо как основной метод анализа, либо как необходимый этап многоступенчатой диагностики. На сегодняшний день сложно представить себе фундаментальную или прикладную работу в сфере исследования живых систем, результаты которой не были бы основаны на молекулярных данных, полученных с помощью ПЦР. Помимо классических областей - медицины, биотехнологии и генетики - ПЦР все чаще находит применение в промышленном процессе, в оборонном сегменте для более эффективной реализации принципов биологической безопасности, а также при тестировании и сертификации продукции, основанной на использовании геносодержащих компонентов.

Еще одной важной областью практического применения количественной ПЦР, предназначенной для специфического выявления фрагментов вирусного генома, является трансплантология. Вирусные инфекции, среди которых особое клиническое значение имеют условно патогенные вирусы, широко распространенные в человеческой популяции, относятся к первоочередным факторам риска, угрожающим здоровью реципиента. В первую очередь это вирусы, относящиеся к семейству Herpesviridae, а также вирусы BK и JC (Nickeleit, Singh et al. 2006, Tanenbaum, Alla et al. 2007). Кроме того, активно изучается роль вируса TTV (р. Anellovirus) в развитии тяжелых осложнений трансплантации (Burra, Masier et al. 2008, Piaggio, Dodi et al. 2009). Диагностика инфекций и мониторинг вирусной нагрузки у пациентов в посттрансплантационный период позволяет повысить эффективность профилактики и лечения пациентов, и, таким образом, снизить число осложнений трансплантации, в том числе летальных. Поэтому внедрение количественных методов генодиагностики в области трансплантологии может стать универсальным инструментом оценки адекватности применяемой программы ведения реципиентов органного трансплантата.

Таким образом, актуальность настоящего исследования обусловлена необходимостью обобщения накопленных и получения новых данных в фундаментальных областях иммуногенетики, а также актуальностью разработки новых молекулярно-ориентированных подходов к борьбе с иммунозависимыми нарушениями.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Цели работы:

1. Определение наиболее перспективных в настоящее время областей применения молекулярно-генетических методов в фундаментальной и прикладной иммуногенетике; разработка спектра оригинальных тест-систем для оценки полиморфизма генов на индивидуальном и популяционном уровне.

2. Получение новых данных в области установления факторов наследуемой устойчивости и чувствительности к социально-значимым заболеваниям, в том числе к ВИЧ-инфекции и онкопатологиям, с помощью методов генодиагностики и иммуногенотипирования.

3. Разработка новых подходов в области клинико-иммунологического, лабораторного и фармакогенетического использования методов детекции нуклеиновых кислот, в том числе для мониторинга эффективности противоинфекционной терапии в клинике органной трансплантации, а также для анализа безопасности и эффективности препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Задачи работы:

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Проанализировать международный опыт применения генодиагностических подходов, в том числе методов SNP- и HLAгенотипирования, в биомедицине.

2. Охарактеризовать особенности популяционного распределения аллельных вариантов генов, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД, возможность контролирования вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции и развитие осложнений терапии ВИЧ в популяциях, проживающих на территории России и сопредельных государств.

3. Исследовать возможности адаптации метода полимеразной цепной реакции в реальном времени к выявлению аллеля HLA-B*57:01, ассоциированного с развитием гиперчувствительности к препарату Абакавир, входящему в состав антиретровирусной терапии.

4. Выбрать гены-кандидаты, перспективные для поиска маркеров наследуемой устойчивости или чувствительности человека к радиационному воздействию, как фактору риска развития онкологических осложнений.

5. Разработать тест-системы для генотипирования иммуногенетических локусов и молекулярно-генетической оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гепатита С, а также для установления маркеров повышенного риска развития реакции гиперчувстительности, ассоциированной с приемом антиретровирусных препаратов.

6. Установить частоты генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

7. Охарактеризовать распределение аллелей, ассоциированных с повышенной устойчивостью или чувствительностью к радиационному воздействию, как фактору риска развития онкологических осложнений в исследованных группах сравнения, дать популяционно-генетическую характеристику обнаруженных отличий.

8. Разработать новый подход в области мониторинга противоинфекционного иммунитета реципиентов почечного трансплантата в целях профилактики развития инфекционных осложнений, в том числе ведущих к летальному исходу.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые проведен комплексный анализ распределения аллельных вариантов генов CCR5, CCR2, SDF1, HCP5, HLA-C, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД и возможность контроля вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции в выборках из 10 популяциий (аллельные варианты генов CCR5, CCR2, SDF1) и 5 популяций (аллельные варианты генов HCP5, HLA-C), проживающих на территории России и сопредельных государств; дана характеристика генетической структуры популяций. Оценена относительная опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях для носителей аллельных вариантов, ассоциированных с динамикой прогрессирования СПИД. Проведен анализ данных, позволяющий определить уровень межэтнической гетерогенности в распределении исследованных маркеров. Обсуждена значимость полученных данных с точки зрения молекулярной эпидемиологии, фундаментальной иммунологии и популяционной генетики.

Впервые продемонстрирована ассоциация иммуногенетических маркеров системы HLA класса II с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний. Проведен анализ иммунологических основ формирования индивидуальной реакции человека на радиационное воздействие. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль главного комплекса гистосовместимости в реализации защитных функций организма человека в ответ на цитотоксическое и мутагенное воздействие радиации.

Показаны достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rs1801516, rs664677), OGG1 (rs1052133), XRCC1 (rs1799782) в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

Полученные данные служат теоретической основой для создания нового подхода к оценке индивидуальной реакции на радиационное воздействие. Данные о частотах распределения клинически значимых генетических маркеров могут быть использованы при проведении клиникостатистических исследований, а также при анализе факторов онкологического риска.

С помощью ПЦР-тест-систем для экспресс-скрининга патогенов, способных вызывать реактивацию латентных вирусных инфекций у реципиентов почечного трансплантата, показана возможность контролирования уровня вирусной нагрузки в условиях посттрансплантационной терапии в отделении органной пересадки.

Охарактеризована представленность вирусных инфекций, являющихся основным фактором риска развития тяжелых инфекционных осложнений.

Показано, что из числа исследованных условно-патогенных вирусов наиболее часто встречающимся у реципиентов почечного трансплантата является вирус TTV. Такая распространенность делает его перспективным маркером, способным отражать эффективность применяемой терапевтической схемы.

На основе международного опыта использования анти-ВИЧ препаратов и модели инфекции вирусом гепатита С проанализированы возможности применения молекулярно-генетических данных в терапии вирусных заболеваний. Проведена оценка распределения аллелей HLA-B*57:01 и HLADRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧинфицированных лиц, принимающих ингибиторы протеазы ВИЧ Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine), в российской популяции (N=800) и продемонстрирована эффективность метода количественной ПЦР с обратной транскрипцией при разработке антисмысловых препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения однонуклеотидных полиморфизмов CCR5delta32 (rs333), CCR2I (rs1799864), SDF1-3’A (rs1801157), HCP5 (rs2395029), HLA-C (rs9264942) и аллельного варианта HLA-B57:01 методом ПЦР в реальном времени. Тестсистемы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в Российской Федерации оборудованию. Это создает потенциал для использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции.

Полиморфизм исследованных генов иммунной системы обеспечивает межпопуляционные различия в устойчивости к ВИЧ-инфекции.

Разработаны и внедрены в лабораторное производство генотипирующие ПЦР-тест-системы для выявления аллелей генов ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG1 (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135) и региона 8q24 (rs9642880, rs13281615, rs1447295) Данные маркеры играют важную роль в механизмах канцерогенеза, а также восстановления и адаптации организма после генотоксического воздействия и могут быть использованы при комплектации панелей молекулярно-генетических тестов в области практической иммуногенетики и онкологии.

Разработанная методика также перспективна для формирования комплексного подхода к определению риска развития отдаленных последствий радиационного воздействия. Определение таких рисков должно быть основано на учете аллелей, ассоциированных с устойчивостью к облучению либо с достоверным повышением радиочувствительности у облученных лиц. Эти параметры могут использоваться для оптимизации радиационной защиты.

Полученные данные об эффективности противовирусных препаратов дают основания для продолжения клинических исследований, как в области индивидуального мониторинга эффективности терапии в посттрансплантационный период, так и в области создания новых средств борьбы с вирусными инфекциями. В свою очередь, данные об индивидуальной непереносимости ингибиторов протеаз ВИЧ могут служить основанием при принятии решения о целесообразности внедрения и безопасности назначения препаратов на их основе в России.

Результаты исследования могут быть включены в научно-методические программы для студентов медицинских ВУЗов, а также в образовательные программы учреждений высшего профессионального и последипломного образования.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Впервые в отечественной практике проведено комплексное 1.

популяционно-гентическое исследование по установлению особенностей распределения аллельных вариантов, определяющих устойчивость человека к ВИЧ-инфекции; на основании установленных частот аллелей и генотипов оценены популяционные риски, отражающие динамику развития ВИЧинфекции.

Предложен и реализован подход к исследованию механизмов 2.

генетического контроля восстановления и адаптации организма в условиях хронического радиационного воздействия. В результате анализа частот групповых специфичностей генов системы HLA класса II установлена ассоциация группы аллелей HLA-DRB1*11 и подтверждена ассоциация SNPмаркера rs1799782 гена с формированием фенотипа, XRCC1 характеризующегося повышенной предрасположенностью к развитию онкопатологий. Установлены достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rs1801516, rs664677) и OGG1 (rs1052133) в группе лиц без онкопатологии, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, а также в группе лиц с онкопатологией и в группе популяционного контроля.

Разработан генодиагностический подход к оценке 3.

противоинфекционного иммунитета у пациентов клиники трансплантации органов и тканей, основанный на мониторинге показателей вирусной нагрузки.

Установлены частоты аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01, 4.

ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧ-инфицированных лиц, принимающих препараты Абакавир и Невирапин.

Метод ПЦР в реальном времени эффективен при отборе 5.

антисмысловых препаратов, обладающих наибольшей противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2005, Москва), XVIII и XIX зимней молодежной научной школе ИБХ РАН (2005, Москва; 2007, Москва), конференции Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine (2006, Новосибирск), Международной конференции «Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И.

Вавилова РАН» (2006, Москва), конференции Human Genome Meeting (2006, Хельсинки, Финляндия), VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (2006, Москва), на 16 европейском конгрессе по иммунологии (2006, Париж, Франция), 21 и 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместиммости (2007, Барселона, Испания; 2010, Флоренция, Италия), I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (2010, Москва, Россия), на семинаре по урегулированию радиационной безопасности и медицинскому аварийному реагированию в случае аварий при транспортировании радиоактивных веществ (2011, Сочи, Россия), на III Европейском совещании «Successful R&D in Europe» (2011, Дюссельдорф, Германия), VII Международном ядерном форуме «Безопасность ядерных технологий: транспортирование радиоактивных материалов – «Атомтранс – 2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), научно-практической конференции ФМБА России «Медицинское обеспечение работников ядерно-энергетического комплекса, химических производств, предприятий водного транспорта» (2012, Саратов, Россия), II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины» (2012, Санкт-Петербург), 16 рабочем совещании и совместной конференции Европейской федерации иммуногенетиков и британского общества гистосовместимости и иммуногенетики (2012, Ливерпуль, Британия), на 19 международном симпозиуме по вирусу гепатита С и ассоциированным заболеваниям (2012, Венеция, Италия).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 14 статей в 10 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Доклады Академии наук», «Молекулярная биология», «Генетика», «Кардиология», «Молекулярная медицина», «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Ядерная и радиационная безопасность»), 7 статей в научных журналах, 1 монография, 24 публикации в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты работы использованы в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, ЗАО «НПФ ДНК-Технология», ФГБУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 21 рисунок. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», а также два приложения.

Библиография включает 435 источников, в том числе 42 отечественных и 393 зарубежных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О РОЛИ ГЕНОВ В

ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОАССОЦИИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ

Иммунитет является важнейшим свойством многоклеточных организмов, филогенетически берущим свое начало, как двух компонентная система (включающая различные анатомические структуры для продукции T- и B-подобных клеток), еще у бесчелюстных (Bajoghli, Guo et al. 2011).

Эволюция иммунной системы, продолжавшаяся в ряду позвоночных вплоть до человека, привела к формированию многокомпонентного и, в то же время, чрезвычайно интегрированного механизма, обеспечивающего защиту организма от факторов инфекционной природы, а также от негативного влияния собственных трансформированных, или мутировавших антигенов (Хаитов 2005). Таким образом, функционирование иммунной системы обеспечивает поддержание физиологического и генетического гомеостаза, что является естественным условием существования живых организмов.

Именно значимостью иммунной системы определяется динамика развития иммунологической науки и смежных с ней биомедицинских дисциплин.

В настоящее время, благодаря исследованиям, большая часть которых выполнена с середины 20 столетия, охарактеризованы основные механизмы иммунного ответа на воздействие инфекций, заложены представления о роли иммунной системы в процессах канцерогенеза и аутоиммунной патологии, установлены ключевые компоненты клеточного и гуморального иммунитета, раскрыты механизмы формирования уникального разнообразия рецепторов и медиаторов иммунного ответа (табл. 1).

Одним из наиболее активно развивающихся направлений имунологии в наше время является иммуногенетика – наука, направленная на изучение генетически детерминированных механизмов чувствительности и резистентности к заболеваниям.

–  –  –

1.1.1 «Догеномный» период развития генетического направления в иммунологии Основы «генетического направления» в иммунологии были заложены еще на рубеже XIX-XX веков. Так в 1915 году профессором Тиззером (Tyzzer E.E.), проводившим эксперименты с инбредными линиями японских танцующих мышей (Mus bactrianus), была высказана мысль о решающей роли наследуемых факторов в формировании предрасположенности к определенным типам опухолей (Little and Tyzzer 1916, Авербах, Мороз и др.

1985). Аналогичные идеи получили развитие в ряде работ по исследованию иммуногенетической предрасположенности животных и человека к инфекционным заболеваниям. Так Heidelberger и Avery в 1923 году показали, что специфичность, а также вирулентность различных типов пневмококков определяется, по крайней мере, двумя полисахаридами, входящими в состав их оболочки (Heidelberger and Avery 1923). Таким образом, авторы исследования впервые постулировали связь между химической структурой антигенов и особенностями иммунного ответа. Уже тогда Heidelberger указывал на перспективность применения иммунологических методов в определении генетических основ развития того или иного типа реакции (Irwin 1974).

Вопрос об участии генетического фактора в формировании иммунного ответа определенного типа был более подробно обсужден в работе Schott R.G. В серии экспериментов на мышах автор показал, что устойчивость животных к Salmonella aertrycke может быть значительно повышена путем направленного скрещивания (Schott 1932). Кроме того было установлено, что признак устойчивости мышей к инфекции напрямую связан с «концентрацией наследуемых факторов» и передается в ряду поколений по доминантному принципу. Похожие результаты были описаны для крыс, кур и кроликов (Irwin 1929, Cole 1930).

Важным этапом развития концепции естественной предрасположенности к инфекциям стало открытие моногенного и полигенного наследования. Так с соавторами привел Webster экспериментальное подтверждение участия многих «генетических факторов»

(генов) в развитии устойчивости к инфекции паратифоидного энтерита у мышей (Webster and Pritchett 1924, Webster 1925, Webster 1933). Позже, исследуя устойчивость кроликов к инфекционно-индуцированному прерыванию беременности, продемонстрировал возможность Manresa участия одного гена в формировании данного признака (Manresa 1932).

Данные результаты хорошо укладывались в теорию наследования признаков сформулированную Грегором Менделем и Теодором Бовери и служили дальнейшему развитию генетического направления в иммунологии.

Следующим важным этапом развития иммуногенетики как самостоятельной дисциплины стало установление антигенов, участвующих в реакции гемагглютинации. Собственно термин «иммуногенетика» был впервые использован в работе Irwin и Cole, посвященной определению видов голубей с помощью антиглобулиновой сыворотки (Irwin 1936).

Антисыворотка была получена путем введения кроликам очищенных эритроцитов голубей. Далее путем назначения антисывороток представителям различных видов голубей и их гибридов авторами был установлен видоспецифичный характер антигенов, представленных на поверхности эритроцитов, а также сделан вывод об их наследуемости.

Затем Питером Горером (Peter A. Gorer) были опубликованы работы по результатам экспериментов, проведенных на мышах (Schutze, Gorer et al.

1936). В ходе работы он выделил три антигена, каждый из которых был специфичен определенной линии мышей. В дальнейшем при пересадке опухолей он выяснил, что один из антигенов (антиген II) достоверно ассоциирован с устойчивостью животных к развитию опухоли. В ходе дальнейших исследований антисыворотка к антигену II была использована для определения трех аллелей кодирующего антигены локуса, названного 2 локусом гистосовместимости (H2) (Gorer 1948).

Открытие в 1958 году Жаном Доссе, Йоном ван Рудом и Роуз Пейн (Jean Dausset, Jon van Rood, Rose Payne) аналогичной системы у человека привело к настоящему буму в области иммуногенетики. За последующие 20 лет были заложены основные представления о структуре и полиморфизме системы HLA. Именно в «догеномный» период изучения HLA (1960-1980 гг.) были выполнены фундаментальные исследования, посвященные функции HLA-антигенов, а также определена их роль в трансплантации тканей (Svejgaard, Hauge et al. 1975, van Rood, van Leeuwen et al. 1977). Более того, тестирование большого числа пациентов привело к пониманию критической роли HLA-фенотипа в формировании предрасположенности к определенным заболеваниям (табл. 2) (Dausset 1977).

Важность дальнейшего исследования системы главного комплекса гистосовместимости, а также связи молекул определенного фенотипа с развитием имунозависимых заболеваний была очевидна. Однако ни одной лаборатории в мире было не под силу установить все разнообразие аллельных вариантов генов, кодирующих столь полиморфную систему. Это привело к формированию совместных межлабораторных проектов по изучению данной проблемы. Консолидация работы и регулярный обмен опытом привели к быстрому накоплению сведений о широчайшем полиморфизме этой системы.

–  –  –

Важной частью, недостающей для формирования общей картины биологической роли HLA, было определение фундаментального смысла существования столь сложной в генетическом плане системы.

Одна из наиболее перспективных идей в этой области была высказана Lawrence H.W. в 1959 году (Lawrence 1959). Он предположил, что молекулы HLA формируют внутриклеточные комплексы с инфекционными агентами и стимулируют экспрессию распознающего их рецептора на поверхности лимфоцита. Таким образом, полиморфизм напрямую связан с процессом презентации антигенных детерминант. Эта идея нашла развитие в работах швейцарского иммунолога Рольфа Цинкернагеля и его австралийского коллеги Питера Доэрти. В 1974 году ими был установлен феномен «двойного распознавания» чужеродных иммуногенных пептидов. В серии цитотоксических тестов по оценке ответа на инфицирование вирусом LCMV была показана зависимость иммунного ответа от молекул MHC класса I (Zinkernagel and Doherty 1974). Было установлено, что рецепторы Т-клеток специфически взаимодействуют как с иммуногенным пептидом, так и с самой молекулой MHC.

В те же годы, благодаря работам Памелы Бьеркман. была установлена трехмерная структура белков комплекса MHC класса I (Bjorkman, Saper et al.

Это пролило свет на тонкие механизмы взаимодействия 1987).

иммуногенных пептидов и молекул главного комплекса гистосовместимости.

Стало понятно, что для развития иммунного ответа на тот или иной имунодоминантный пептид в антиген-связывающей бороздке контактирующей с ним молекулы MHC должны находиться специфические участки для связывания с этим пептидом. Именно этот феномен определяет уникальный полиморфизм генов HLA и специфичность иммунного ответа.

Параллельно с развитием представлений о роли HLA в развитии иммунного ответа на инфекционные агенты, развивалось направление, исследующее роль HLA в формировании популяционно-специфических признаков. Было установлено, что степень выраженности ассоциаций конкретных с заболеваниями заметно варьирует в HLA-антигенов зависимости от рассовой и/или этнической принадлежности обследуемой группы (Thorsby 1974, Bodmer 1975).

Эти данные стали основой для сравнительных исследований по изучению особенностей HLA-полиморфизма в различных этнических группах. Впервые результаты этих исследований были обобщены на 11 Международном рабочем совещании по гистосовместимости (г. Йокогама, Япония). В работе совещания принимали участие представители 524 лабораторий и в частности из Института иммунологии (в настоящее время ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России). За наибольший вклад в развитие направления «HLA и антропология» исследователям Института была вручена медаль.

Еще одним важным результатом 11 совещания по гистосовместимости стала широкая презентация метода полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных олигонуклеотидных проб (PCRSSOP), как нового подхода к типированию HLA. Кроме того были представлены и другие молекулярные подходы к ДНК-типрованию HLA, в том числе: обратный дот-блот, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP), формирование ПЦР-гетеродуплексов, анализ комформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). По результатам совещания было принято решение принять новую номенклатуру HLA-специфичностей, основанную на их корреляции с установленной нуклеотидной последовательностью (www.ihiwg.org). На сегодняшний день название аллеля HLA включает как минимум четыре цифры и разделяется двоеточиями. Цифры, расположенные до первого двоеточия, как правило, обозначают группу аллелей, кодирующих антиген, определяемый серологическими методами. Второй набор цифр призван отличать аллели, различающиеся несинонимичными (приводящими к замене аминокислот) заменами нуклеотидов. Аллели, отличающиеся только синонимичными (не влияющими на аминокислотную последовательность белка) заменами, определены третьим набором цифр. Четвертый набор цифр определяет аллели, различающиеся последовательностью 5’ и 3’неколирующих областей, а также интронов. Дополнительно к цифровым обозначениям часто используют буквенные суффиксы, отражающие экспрессионный статус (нуль-аллели – N или аллели, экспрессирующиеся в различных частях клетки: L – в пределах плазматической мембраны, S – за ее пределами, С – в цитоплазме). В случае возникновения сомнений в экспрессионном статусе аллели маркируют суффиксами A (aberrant) или Q (questionable).

Переход с серологических на молекулярно-генетические методы изучения системы привел к значительному прогрессу в HLA иммуногенетике. Так за последующие 30 лет, во многом благодаря внедрению молекулярно-генетических методов типирования, число вариантов HLA возросло с 260 специфичностей до 8794 аллелей (по данным сайта www.hla.alleles.org на январь 2013 года). На рисунке 1 представлена динамика накопления данных о полиморфизме системы HLA начиная с 1987 года.

Рис. 1. Динамика накопления данных о полиморфизме системы HLA (по данным сайта www.hla.alleles.org (Robinson, Mistry et al. 2011) В целом процесс формирования полиморфизма является наглядным отображением эволюционной роли мутационного процесса. Именно полиморфизм генов иммунного ответа обеспечивает выживание человека, как вида в условиях агрессивной окружающей среды (Пальцев 2009). Однако с другой стороны, принимая во внимание полигенный и мультифакториальный характер наследования большинства признаков, следует отметить, что при определенных условиях позитивный эффект, связанный с носительством определенного генотипа, может быть нивелирован или даже перекрыт негативным эффектом, сказывающимся на ином этапе биохимической реакции или в ином биологическом пути.

Так, например, гаплотип распространенный в HLA-A1-B8-DR3, настоящее время среди европеоидов, сыграл положительную роль во время средневековых пандемий. Носители этого гаплотипа имели преимущество в выживании, поскольку его наличие связано с показателями врожденного иммунитета, играющими важную роль в защите от инфекционных агентов.

Однако в изменившихся с тех пор условиях окружающей среды данный гаплотип демонстрирует достоверную ассоциацию с заболеваниями аутоиммунного генеза, включая сахарный диабет I типа и ряд других эндокринных патологий (Price 1999). Этот пример является весьма показательным для определения роли окружающей среды в развитии имуноассоциированных заболеваний. Так новые типы внешних воздействий, накрадываясь на уникальный для данной популяции набор генетически детерминированных признаков, могут стать причиной достаточно быстрого с эволюционной точки зрения распространения заболеваний среди носителей определенного генотипа.

1.1.2 Иммуногенетика в постгеномную эру Однако дальнейшее развитие фундаментальных концепций иммунологии требовало перехода на «геномный» уровень исследований с привлечением данных о генетических основах регуляции иммунных реакций, изменчивости генов иммунного ответа и способе наследования иммуноассоциированных признаков.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«УДК 591.15:575.17-576.3 БЛЕХМАН Алла Вениаминовна ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШИРОКОАРЕАЛЬНОГО ВИДА HARMONIA AXYRIDIS PALL. ПО КОМПЛЕКСУ ПОЛИМОРФНЫХ ПРИЗНАКОВ 03.00.15 генетика Диссертация на соискание ученой степени V кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«Мухачева Татьяна Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Ковалев Сергей Юрьевич,...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«НОВИЧКОВ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ Молочная продуктивность и качество молока коз русской породы в условиях техногенного загрязнения Саратовской агломерации 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Забелина Саратов 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«МАХАЧЕВА ХАННА ГАДЖИЕВНА СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МОДЕРНИЗАЦИИ ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дайхес доктор медицинских наук, профессор Л.М. Асхабова...»

«БАДМАЕВА АЛИЯ АЗАТОВНА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АДАПТОГЕНОВ НА ФОНЕ ДЕБИКИРОВАНИЯ ПТИЦ Специальность: 06.02.02ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биол. наук, профессор Р.Т. Маннапова Москва 2014 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Влияние дебикирования на организм...»

«СОЛОВЬЕВ Альберт Николаевич КЛИМАТОГЕННАЯ И АНТРОПОГЕННАЯ ДИНАМИКА БИОТЫ В МЕНЯЮЩИХСЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ ВОСТОКА РУССКОЙ РАВНИНЫ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Киров Оглавление Введение Глава 1. Обзор состояния проблемы климатогенной...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«КАРПЕНКО Анна Юрьевна Изменение трансинтестинальной проницаемости и показателей врожденного иммунитета у онкологических больных в периоперационном периоде 14.03.09 – клиническая иммунология и аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.