WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Самым многочисленным сиквенс-типом, включающим пять изолятов из Пермского края, был ST434, остальные сиквенс-типы включали от одного до трех изолятов.

Таким образом, мультилокусное сиквенс-типирование B. afzelii позволило впервые выявить российскую группу сиквенс-типов данного вида, обладающую наибольшей филогенетической близостью азиатским изолятам. Анализ географического распространения сиквенс-типов B. afzelii из разных регионов страны показал возможность перемещения изолятов между регионами.

4.3. Филогеографическая структура B. bavariensis

Изоляты B. bavariensis выделяются преимущественно на территории России и Азиатских стран. В Западной Европе B. bavariensis (ранее серотип 4 или группа NT29) встречается в клещах крайне редко [84, 96] и представлена всего двумя сиквенс-типами (ST84 и ST85), место изоляции одного из которых и дало название виду. В настоящей работе изоляты B. bavariensis были выделены на территории всех изученных регионов страны, причем анализ сиквенс-типов не выявил каких-либо географически обособленных групп внутри вида (Рисунок 15).

Так, на Рисунке 15 видно, что они входят в разные филогенетические группы внутри B. bavariensis вне зависимости от географического происхождения.

Самыми многочисленными сиквенс-типами стали ST128 (включает 19 изолятов, 9 из которых были выделены нами на территории Республики Коми, Архангельской области и Западной Сибири, остальные 10 – в Китае, Монголии и Японии) и ST328 (11 изолятов, 8 из которых были выделены нами на территории европейской части России, Урале и Западной Сибири, остальные 3 – в Монголии и Китае). Хотя для B. bavariensis, подобно B. afzelii, была показана ассоциация с мелкими млекопитающими, географической приуроченности сиквенс-типов и четкой структуры для этого вида установить не удалось. Анализ сиквенс-типов B.

bavariensis, выделенных на территории европейской и азиатской части страны, а также в Китае, Японии и Монголии, показал значительное генетическое разнообразие и неоднородное географическое распределение, т.к. один и тот же сиквенс-тип встречался на отдаленных территориях. Таким образом, можно предположить, что хотя B. bavariensis и B. afzelii обладают сходным кругом хозяев, в основе их распространения лежат разные механизмы. Особый интерес представляют причины, которые привели к распространению некоторых сиквенстипов (например, ST128 и ST328) на отдаленных территориях.

Рисунок 15 – Филогенетическое древо, построенное на основе конкатенированных последовательностей фрагментов генов домашнего хозяйства B. bavariensis. Для построения использованы сиквенс-типы из международной базы данных и полученные в настоящем исследовании. Деревья построены методом Neighbor-joining. Цветом и значками обозначены сиквенс-типы, выделенные на территории разных регионов России, а также азиатские и европейские сиквенс-типы. Сиквенс-типы, обсуждаемые в тексте, выделены жирным шрифтом.

4.4. Филогеографическая структура B. garinii

Аналогичная ситуация с отсутствием выраженной филогеографической структуры наблюдается и для B. garinii. Однако, для этого вида можно выявить четыре филогенетические линии: I – ChY13p (ST154, включает три изолята, два из которых были выделены нами в Екатеринбурге); II – азиатская линия (Китай, Япония, один ST с Урала); III – преимущественно азиатская линия (Китай, Япония, Сибирь, Урал) с небольшим количеством сиквенс-типов из европейских стран (сюда входит референсный штамм 20047); IV – преимущественно европейская линия, включающая в себя, однако, изоляты из Японии, Западной Сибири и Урала (Рисунок 16). Таким образом, популяции B. garinii также характеризовались неоднородностью географического распределения сиквенстипов между разными территориями, что может отражать экологическую ассоциацию вида с птицами, обладающими высокой подвижностью. Это предположение было высказано и другими исследователями [118, 183].

Самыми многочисленными сиквенс-типами стали: ST372 (всего 7 изолятов, 6 из них были выделены нами на территории Свердловской области, 1 – из Японии), ST431 (7 изолятов, 6 были выделены на территории Свердловской области, один – Томской области), ST364 (6 изолятов, 5 были выделены на территории Свердловской области, один – из Японии). Интересно то, что большинство уральских изолятов филогенетически оказалось ближе азиатским группам, тогда как изоляты из Западной Сибири входили в одну группу с европейскими (Рисунок 16). При этом последовательность одного изолята из Екатеринбурга (Ekb950-2014) принадлежала сиквенс-типу ST244, выявленному на территории Англии. В некоторых группах IV линии сиквенс-типы из России не встречались (Рисунок 16).

Рисунок 16 – Филогенетическое древо, построенное на основе конкатенированных последовательностей фрагментов генов домашнего хозяйства B. garinii. Для построения использованы сиквенс-типы из международной базы данных и полученные в настоящем исследовании. Деревья построены методом Neighbor-joining. Цветом и значками обозначены сиквенс-типы, выделенные на территории разных регионов России, а также азиатские и европейские сиквенс-типы. Сиквенс-типы, обсуждаемые в тексте, выделены жирным шрифтом. Овалами выделены филогенетические линии (обсуждение в тексте).

К сожалению, в рамках данной работы не удалось провести исследование МЛСТ изолятов B. garinii, выделенных на территории европейской части России и Дальнего Востока. В настоящем исследовании на данной территории были обнаружены преимущественно B. bavariensis, а немногие штаммы B. garinii обладали недостаточной для типирования концентрацией ДНК. Крайне интересным представляется исследование группы ChY13p, первоначально выделенной в Китае, а затем обнаруженной на территории России с низкой частотой встречаемости Нуклеотидные последовательности двух [127].

выявленных в настоящей работе изолятов этой группы (из Екатеринбурга) были полностью идентичны последовательнсоти изолята из Китая (ST154). Изучение группы представляет большой интерес, поскольку ранее она ChY13p рассматривалась в качестве переходного звена между B. garinii и B. afzelii [106].

4.5. Особенности и ограничения метода МЛСТ

Несмотря на высокую информативность метода МЛСТ, необходимо обратить внимание на некоторые ограничения в его использовании. Во-первых, для типирования образцов ДНК боррелий из клещей необходимо отбирать образцы с максимально возможной концентрацией ДНК (раздел 2.2.5) и проводить гнездную ПЦР вместо однораундовой (что необязательно при типировании изолятов боррелий). Во-вторых, данная методика неприменима для исследования смесей изолятов – как меж-, так и внутривидовых. Если выявление смесей нескольких видов возможно при предварительной видовой дифференцировке и исключении смешанных образцов, то смеси двух генетических вариантов одного вида можно выявить только при секвенировании. За время проведения настоящего исследования, даже при условии предварительной дифференцировки видов, было исключено из анализа 24 микст-изолята (20,3% от числа генотипированных изолятов), в том числе 2 (1,7%) – межвидовых и 22 (18,6%) – внутривидовых смесей. Проблемы зараженности одного клеща разными видами и внутривидовыми генетическими вариантами и возможности амплификации полного набора мишеней для проведения МЛСТ была отмечена и другими исследователями [158, 189]. В связи с этим в настоящей работе предлагается следующая схема амплификации фрагментов генома образцов ДНК боррелий, выделенных из клещей. На первом этапе проводится амплификация фрагментов двух генов nifS и clpA как наиболее вариабельных (Таблица 3) для проверки концентрации ДНК и возможности получения продуктов ПЦР для конкретного образца. Для выявления микст-инфекций на этом этапе, а соответственно, наименьшего расхода реактивов и времени, рекомендуется провести секвенирование данных двух генов. На втором этапе, при условии получения ПЦР-продукта и «чистых» последовательностей nifS и clpA, проводится амплификация и секвенирование генов clpX, pepX, pyrG, recG, rplB, uvrA. При этом для исследования изолятов можно использовать однораундовую ПЦР с внутренними праймерами, а для образцов ДНК боррелий из клещей – гнездную или полугнездную ПЦР согласно стандартной методике.

–  –  –

Для выявления генетической структуры B. miyamotoi были получены последовательности широко используемых генетических маркеров – фрагментов генов 16S рРНК (632 п.н.), p66 (540 п.н.), 16S-23S IGS (545 п.н.) десяти образцов B. miyamotoi и последовательности гена glpQ (688 п.н.) тринадцати образцов.

Образцы ДНК B. miyamotoi были выделены из клещей, собранных на территории Свердловской области, Пермского края и Томской области, для анализа glpQ – также Котласа (Архангельская область) и Новосибирской области. Полученные последовательности были депонированы в международную базу данных GenBank (регистрационные номера KJ933472-481 (16S рРНК), KJ950088- KJ950097 (p66), KJ950098- KJ950107 (16S-23S IGS), KJ950108-120 (glpQ)). На основе данных последовательностей, а также доступных в базе данных GenBank, был проведен филогенетический анализ и построены филогенетические деревья, отражающие внутривидовую вариабельность B. miyamotoi по выбранным генетическим маркерам.

Анализ десяти последовательностей фрагмента гена 16S рРНК показал их полную идентичность друг другу, а также последовательностям референсного штамма FR64b и изолятов, выделенных на территории России ранее [29, 135] Интересно, что отсутствие генетической изменчивости (Рисунок 17).

рассматриваемого маркера наблюдается внутри всех типов B. miyamotoi (Рисунок 17). Единственное исключение составляет последовательность штамма НТ31 NR025861 (Fukunaga M., 1995), имеющая две нуклеотидные замены по сравнению с последовательностью FR64b AY604976. При этом в GenBank доступна и другая последовательность 16S рРНК штамма HT31 – AB904793 (Takano A., 2014), полностью идентичная FR64b AY604976 (Рисунок 17).

Рисунок – Филогенетическое древо, построенное на основе 43

последовательностей 16S рРНК B. miyamotoi (длина 560 п.н.) методом Neighbor-Joining (бутстреп 500 реплик). Вставки/делеции не учитывались. Последовательности, полученные в данной работе, выделены черным кружком. Последовательности штамма HT31 выделены жирным шрифтом (обсуждение в тексте). Последовательность 16S рРНК B. lonestari использовалась в качестве внешней группы.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена р66 также показал идентичность исследуемых образцов между собой и по сравнению с последовательностями штамма FR64b CP004217, изолятов 57Nsk EU635985 и De1 GQ253923, выделенных на территории Новосибирской области (Рисунок 18).

Данная последовательность была найдена и у изолятов, выделенных в других регионах России Следует обратить внимание на тот факт, что [70].

последовательность p66 штамма HT31 AF228023 (Bunikis J., 2000 г.) имела 3 делеции/вставки и одну нуклеотидную замену по сравнению с FR64b. Вторая последовательность p66 штамма HT31 – AY363722 (Bunikis J., 2004 г.) – не отличалась от FR64b (Рисунок 18).

Рисунок – Филогенетическое древо, построенное на основе 29

последовательностей гена p66 B. miyamotoi (длина 520 п.н.) методом Neighbor-Joining (бутстреп 500 реплик). Вставки/делеции не учитывались. Последовательности, полученные в данной работе, выделены черным кружком. Последовательности штамма HT31 выделены жирным шрифтом.

Последовательности гена glpQ тринадцати исследованных в настоящей работе образцов также не отличались друг от друга и от последовательности референсного штамма B. miyamotoi FR64b CP004217, AY368276 (Рисунок 19).

При этом обе последовательности штамма HT31 (KJ003841 и AB900798) были идентичны таковым штамма FR64b. Однако, у изолятов B. miyamotoi, выделенных на территории разных регионов России Фоменко Н.В. с соавторами (СанктПетербург, Урал, Новосибирск, Иркутск, Хабаровск), была обнаружена одна нуклеотидная замена в гене glpQ, отличающая последовательности этих штаммов от типового штамма FR64b [70] (Рисунок 19). В то же время, в настоящей работе при анализе образцов B. miyamotoi с практически тех же территорий такой замены найдено не было.

–  –  –

последовательностей гена glpQ B. miyamotoi (длина 574 п.н.) методом Neighbor-Joining (бутстреп 500 реплик). Вставки/делеции не учитывались. Последовательности, полученные в данной работе, выделены черным кружком. Последовательности штамма HT31 выделены жирным шрифтом. Последовательности glpQ B. lonestari и близкой к ней некультивируемой боррелии из Японии использовали в качестве внешней группы.

Анализ десяти последовательностей межгенного спейсера 16S-23S рРНК B.

miyamotoi показал их полную идентичность друг другу, японским штаммам НТ24 (AY363704) и FR64b (CP004217) (Рисунок 20). Последовательность 16S-23S рРНК IGS штамма НТ31 AY363703 (Bunikis J., 2004 г.) на одну нуклеотидную замену отличалась от последовательности FR64b. Поскольку последовательность 16S-23S рРНК IGS для образцов из России была определена впервые, то провести сравнительный анализ с последовательностями, полученными другими исследователями, провести не удалось. Так как в GenBank также отсутствуют последовательности 16S-23S рРНК IGS требуемой длины для европейского типа, на филогенетическом древе приведены последовательности только азиатского и американского типов (Рисунок 20). Видно, что данный генетический маркер является более вариабельным, чем фрагменты кодирующих генов – хотя вариабельность внутри азиатского типа отсутствовала (кроме вышеупомянутой последовательности HT31), последовательности B. miyamotoi американского типа обладали гетерогенностью даже среди изолятов, выделенных из одного вида переносчика – клеща I. scapularis (Рисунок 20). Генетические дистанции (pdistance) между последовательностями B. miyamotoi американского типа варьировали от 0 до 0,054 (средняя дистанция 0,021).

Таким образом, анализ фрагмента гена 16S рРНК, фрагментов белоккодирующих генов р66 и glpQ, а также межгенного спейсера 16S-23S рРНК B.

miyamotoi, выделенных из клещей I. persulcatus в разных регионах России, показал их полную идентичность друг другу и последовательностям референсного штамма FR64b CP004217. Фрагменты кодирующих генов (16S рРНК, р66 и glpQ) B. miyamotoi обладали идентичными последовательностями внутри типа, за исключением изолятов из России, выделенных Фоменко Н.В. с соавторами (ген glpQ). Кроме того, для штамма HT31 было показано наличие нескольких последовательностей одного маркера, отличающихся друг от друга.

Анализ межгенного спейсера 16S-23S рРНК позволил выявить внутритиповую изменчивость изолятов B. miyamotoi, выделенных в Америке.

–  –  –

последовательностей 16S-23S межгенного спейсера B. miyamotoi (длина 447 п.н.) методом Neighbor-Joining (бутстреп 500 реплик). Вставки/делеции не учитывались.

Последовательности, полученные в данной работе, выделены черным кружком.

Последовательность штамма HT31 выделена жирным шрифтом.

Хотя широкое географическое распространение B. miyamotoi азиатского типа (от Прибалтики до Дальнего Востока) предполагает значительную генетическую изменчивость, наиболее часто используемые генетические маркеры не позволили её обнаружить. Полученные результаты стимулировали разработку и применение метода, основанного на анализе более вариабельных участков генома.

5.2. Разработка методики мультилокусного спейсер-анализа (МЛСА)

Прежде всего, был проведен анализ последовательностей межгенных спейсеров азиатского (полногеномная последовательность референсного штамма FR64b CP004217) и американского (LB-2001 CP006647) типов B. miyamotoi. Для выбора спейсеров были установлены два параметра: 1) спейсеры должны присутствовать в двух сравниваемых геномах и иметь одинаковую длину (без учета вставок/делеций внутри спейсера), 2) длина должна быть в диапазоне 350п.н. для удобства анализа. Всего было отобрано тридцать спейсеров, удовлетворяющих этим параметрам, с идентичностью последовательностей от 93 до 98%. Восемь спейсеров были выбраны для дальнейшего анализа. Исходная гипотеза состояла в том, что чем более вариабельным будет межгенный спейсер между B. miyamotoi разных типов, тем больше вероятность найти генетическую изменчивость внутри типа. Сравнение межгенных спейсеров приведено в Таблице

14. Идентичность последовательностей выбранных спейсеров составила от 93,96% (IGS4) до 97,25% (IGS7), в среднем 95,5%.

5.3. Применение методики МЛСА для анализа популяций B. miyamotoi

Поскольку была показана связь вида клеща-переносчика с определенными генетическими вариантами B. miyamotoi, мы предположили, что вероятно будет обнаружить генетическую вариабельность между образцами B. miyamotoi, выделенными из разных видов клещей. Так, для проведения мультилокусного спейсер-анализа было отобрано по одиннадцать образцов, выделенных из клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi. Образцы В. miyamotoi из I. persulcatus были получены в 2012-13 годах из разных регионов России: Европейской части (район города Котлас), Урала (Свердловская область, окрестности Екатеринбурга), Западной Сибири (Новосибирск), Дальнего Востока (Владивосток). Образцы В. miyamotoi из I. pavlovskyi были выделены в 2014 году в Западной Сибири (Томская область).

Таблица 14 – Сравнение последовательностей восьми межгенных спейсеров двух референсных штаммов B. miyamotoi FR64b и LB-2001

–  –  –

Последовательности восьми межгенных спейсеров общей длиной 3686 п.н., полученные для 22 образцов B. miyamotoi, были депонированы в базу данных GenBank под следующими регистрационными номерами: KP071739 - KP071760 (IGS1), KP071761 - KP071782 (IGS2), KP071783 - KP071804 (IGS3), KP071805 KP071826 (IGS4), KP071827 - KP071848 (IGS5), KP071849 - KP071870 (IGS6), KP071871 - KP071892 (IGS7), KP071893 - KP071914 (IGS8). Сравнение последовательностей образцов из разных регионов и переносчиков не выявило никаких различий, за исключением двух образцов из Пермского края, у которых была обнаружена одна нуклеотидная замена (транзиция G/A в позиции 238 спейсера IGS4) (Рисунок 21). Филогенетическое древо, построенное на основе анализа конкатенированных последовательностей восьми спейсеров, а также места выделения образцов B. miyamotoi представлены на Рисунке 22. За исключением указанной замены, изменчивости не было обнаружено также и по сравнению с полногеномной последовательностью штамма FR64b (CP004217).

Рисунок 21 – Изменчивость последовательностей межгенного спейсера IGS4 среди изученных образцов B. miyamotoi, а также референсных штаммов FR64b и LB-2001.

Позиции вариабельных нуклеотидов указаны относительно начала спейсера.

Крайне низкая генетическая вариабельность B. miyamotoi внутри типа, ассоциированного с определенным видом (видами) клеща рода Ixodes, давно является объектов дискуссий и до сих пор не находит своего объяснения. Как правило, вывод об отсутствии изменчивости делался на основе анализа последовательностей генов, кодирующих белки или 16S РНК. Исключением является межгенный спейсер 16S-23S рРНК [51]. В последнее время в филогении боррелий все чаще находят применение подходы, основанные на анализе нескольких локусов вместо отдельных маркеров [58, 66, 115, 172]. Однако, если метод МЛСТ, основанный на исследовании кодирующих генов, хорошо зарекомендовал себя для анализа внутривидовой изменчивости боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. [118], то для боррелий группы КВЛ, и для B.

miyamotoi в частности, его применение ограничено.

Рисунок 22 – Филогенетическое древо B. miyamotoi, построенное на основе конкатенированных последовательностей восьми межгенных спейсеров общей длиной 3686 п.н. и географическая локализация изолятов. Дерево построено алгоритмом 500 реплик), вставки/делеции не учитывались.

Neighbor-joining, (бутстреп Последовательности американского штамма LB-2001 используются в качестве внешней группы. Образцы, выделенные из разных видов клещей, показаны разными символами.

Образцы из клещей I. persulcatus, последовательности которых отличаются на одну нуклеотидную замену, отмечены разным цветом.

Изучение полногеномных последовательностей штаммов разных типов B.

miyamotoi могло бы помочь в решении вопросов внутривидовой изменчивости этого вида и его распространения. Однако, в настоящее время в базе данных GenBank доступно только два полных генома B. miyamotoi – американского штамма LB-2001 (номер доступа CP006647) и японского FR64b (CP004217). Столь малое количество полногеномных последовательностей в первую очередь объясняется сложностью культивирования данного вида и его неспособность расти на стандартных средах, подходящих для роста боррелий комплекса B.

burgdorferi s.l. Однако, в 2014 году появилось сразу три публикации, предлагающие модификации среды Barbour-Stoenner-Kelly и (BSK) модифицированной среды Kelly-Pettenkofer (MKP), поддерживающие рост штаммов Без сомнения, возможность B. miyamotoi [121, 172, 186].

культивирования данного вида позволит получить большее количество полногеномных последовательностей, в первую очередь европейских штаммов.

Разработанная в настоящей работе методика мультилокусного спейсеранализа основывалась на сравнении доступных полногеномных последовательностей B. miyamotoi. Однако, несмотря на выбор потенциально наиболее вариабельных последовательностей, тем не менее не удалось выявить внутритиповую изменчивость B. miyamotoi. Исключение составила одна нуклеотидная замена, выявленная у двух образцов с территории Урала (Рисунок 21). Следует отметить, что данная замена произошла в спейсере IGS4, отличающемся наибольшей среди выбранных спейсеров вариабельностью на уровне разных типов B. miyamotoi (Таблица 14).

Принимая во внимание полученные данные, а также результаты мультилокусного сиквенс-типирования, свидетельствующие об отсутствии генетической изменчивости штаммов B. miyamotoi на территории Японии [172], можно предположить генетическую однородность всего азиатского типа B.

miyamotoi на территории от Балтийского моря до Японских островов.

Особый интерес представляют случаи, свидетельствующие об имеющейся генетической изменчивости среди штаммов B. miyamotoi азиатского типа. Вопервых, были выявлены различия между последовательностями двух референсных штаммов B. miyamotoi FR64b и HT31. Если доступные в GenBank последовательности первого штамма идентичны полногеномной последовательности, то последовательности разных маркеров, согласно описанию принадлежащие штамму отличаются. Следует отметить, что HT31, последовательности, полученные позднее, полностью идентичны последовательностям штамма FR64b, в то время как более ранние не совпадают с ними. Аналогично, сравнительный анализ последовательностей генов домашнего хозяйства (flaB, glpQ, gyrB, clpA, clpX, nifS, pepX, pyrG, recG, rplB, и uvrA, номера AB900797–807) B. miyamotoi HT31 также не обнаружил различий по сравнению с полногеномной последовательностью FR64b. В данной ситуации возможны два варианта: 1) ранние последовательности штамма HT31 содержат ошибки секвенирования, т.е. на самом деле последовательность штамма HT31 не отличается от FR64b; 2) в разных лабораториях под названием HT31 хранятся штаммы с разными генетическими свойствами, т.е. исходная вариабельность штаммов присутствует. В настоящей статье мы принимаем первую гипотезу, считая её более вероятной с учетом крайне низкой изменчивости B. miyamotoi внутри типа. Тем не менее, для окончательного решения этого вопроса необходимо повторное секвенирование последовательностей штамма HT31 (желательно, полногеномное) с достоверной лабораторной историей.

Во-вторых, у изолятов B. miyamotoi, выделенных на территории разных регионов России Фоменко Н.В. с соавторами, была обнаружена одна нуклеотидная замена в достаточно консервативном гене glpQ, отличающая последовательности этих штаммов от типового штамма FR64b [70]. В то же время в настоящей работе при анализе образцов почти с тех же территорий такой замены найдено не было. Для проверки наличия этой мутации, по нашему мнению, необходимо провести повторное секвенирование, а также исследование этих штаммов по более вариабельным маркерам, поскольку при крайне низкой внутритиповой изменчивости B. miyamotoi обнаружение даже одной мутации может послужить поводом к более детальному изучению штаммов.

Несмотря на то, что вид переносчика, по-видимому, имеет большое значение в поддержании B. miyamotoi в природных очагах, нам не удалось найти различий между образцами, выделенными из клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi в зоне их симпатрии. До сих пор не было достоверно показано, что клещи I. pavlovskyi способны длительно поддерживать циркуляцию B. miyamotoi в природных очагах.

В 2013 году нами не было обнаружено ни одного образца B. miyamotoi в клещах I.

pavlovskyi (Таблица 12). Однако, в 2014 году, на основе анализа выборки клещей из окрестностей других населенных пунктов в районе Томска, B. miyamotoi была обнаружена с частотой около 6% (для сравнения: в I. persulcatus – около 7%). С примерно той же частотой (около 4%) B. miyamotoi была обнаружена в клещах I.

pavlovskyi и в Японии [172]. При этом последовательности восьми кодирующих генов штамма B. miyamotoi, выделенного из I. pavlovskyi, были полностью идентичны таковым из I. persulcatus. Вероятно, здесь складывается такая же ситуация, как и с B. miyamotoi на американском континенте, когда B. miyamotoi одного типа использует в качестве переносчика два разных вида клещей (для американского типа – I. scapularis/I. pacificus). Вероятно, это происходит в силу близкого родства этих видов и общности каких-либо признаков, являющихся ключевыми для поддержания и передачи B. miyamotoi. Таким образом, мы считаем, что правильнее называть типы B. miyamotoi по географическому принципу, а не по виду переносчика (например, тип “I. persulcatus” или тип “I.

ricinus”), поскольку штаммы с одними и теми же генетическими свойствами могут передаваться разными видами рода Ixodes.

Причина отсутствия генетической изменчивости не только кодирующих генов, но и межгенных спейсеров, неизвестна. Takano A. была высказана гипотеза о клональности популяции B. miyamotoi на территории Японских островов [172].

Наши данные позволяют распространить эту гипотезу на весь ареал клещей рода Ixodes, в которых может поддерживаться азиатский тип B. miyamotoi. Однако, особый интерес представляет не только клональная структура, характерная для многих бактерий, но чрезвычайно низкая генетическая изменчивость внутри типа B. miyamotoi. Подобная ситуация была описана для некоторых возбудителей болезней человека, таких как Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella enterica серовар Typhi, Treponema pallidum и др., для которых был введен термин «генетически мономорфные патогены» [32]. Однако, даже в генетической структуре этих бактерий можно выделить отдельные клональные комплексы, чего пока не удается сделать внутри типов B. miyamotoi.

Распространение одного клона B. miyamotoi по огромной территории таежной зоны Евразии без накопления нуклеотидных замен в некодирующих участках представляет собой интересную проблему. Логично предположить два варианта, которые могли бы объяснить такую ситуацию. Во-первых, отсутствие вариабельности может быть результатом недавнего возникновения азиатского типа в результате адаптации к клещам рода Ixodes, распространенными на территории Азии. Во-вторых, могло произойти быстрое распространение одного клона при наличии исходного разнообразия в месте происхождения. Выбрать одну из этих гипотез, а также предположить место происхождения B. miyamotoi будет сложно до тех пор, пока не будут обнаружены генетически отличные группы внутри типа. Однако, обе эти гипотезы в любом случае требуют объяснения механизмов быстрого распространения одного клона B. miyamotoi на тысячи километров.

Так как клещи обладают ограниченной подвижностью, распространение переносимых клещами патогенов связано, прежде всего, с распространением резервуарных хозяев (в тканях хозяина или в питающихся на них клещах) [131].

Было показано, что резервуарами B. miyamotoi являются как млекопитающие, так и птицы, хотя полный спектр хозяев B.

miyamotoi до сих пор не установлен [45, 88, 176]. Существует два механизма, которые могли бы увеличить скорость распространения B. miyamotoi в популяции клещей на новой территории по сравнению с боррелиями комплекса B. burgdorferi s.l., распространяемых, вероятно, совместно с B. miyamotoi одними видами клещей рода Ixodes. Вопервых, распространение B. miyamotoi может быть облегчено за счет более эффективного развития системной инфекции в крови позвоночных хозяев и, таким образом, более вероятного заражения клещей [45, 155]. Во-вторых, для B.

miyamotoi, в отличие от B. burgdorferi s.l., был показан дополнительный путь передачи от клеща к клещу – трансовариальный [155, 162]. Хотя данные механизмы гипотетически могут ускорять распространение боррелий, на наш взгляд, они не могут в полной мере объяснить столь высокую скорость распространения одного клона B. miyamotoi. Так как для некоторых переносимых клещами патогенов как вирусной, так и бактериальной природы, было показано быстрое распространение в результате влияния человеческой деятельности на природные очаги [101, 131, 134], мы считаем логичным предложить такой путь распространения и для B. miyamotoi. Однако, для оценки времени и направления распространения требуется получение полногеномных последовательностей нескольких штаммов B. miyamotoi азиатского типа для обнаружения генетической изменчивости, которую не удается выявить при анализе отдельных маркеров.

Подобные исследования должны быть проведены и внутри американского, и внутри европейского типа Возможно, для обнаружения B. miyamotoi.

генетической изменчивости B. miyamotoi этих типов предложенная в данной работе методика МЛСА окажется более эффективной (при условии более высокой внутритиповой изменчивости).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетической структуры и географического распространения генетических вариантов возбудителей иксодового клещевого боррелиоза на территории России было основано преимущественно на анализе отдельных генетических маркеров и с трудом поддавалось стандартизации. Разработанная в настоящей работе система дифференцировки позволяет быстро и эффективно оценить видовой состав боррелий, циркулирующих в природных очагах, частоту микст-инфекций, а также идентифицировать одиночные виды, пригодные для дальнейших исследований. В перспективе предложенная система может быть адаптирована для определения видов боррелий в клиническом материале. В условиях недоступности для многих лабораторий полногеномного секвенирования использование мультилокусного сиквенс-типирования представляется наиболее надежным и информативным методом изучения B.

Его применение уточняет и дополняет существующие burgdorferi s.l.

классификации, а унифицированная схема исследования и созданные электронные ресурсы могут послужить основой для международного сотрудничества исследовательских групп в изучении эпидемиологии боррелиозов.

Однако, разработанная схема мультилокусного анализа, основанная на исследовании вариабельных межгенных спейсеров, оказалась непригодной для выявления генетической вариабельности По-видимому, B. miyamotoi.

единственным методом обнаружения генетической изменчивости, а, следовательно, и оценки времени и направления распространения азиатского типа является получение полногеномных последовательностей B. miyamotoi, нескольких штаммов внутри типа. Подобные исследования должны быть проведены также для американского и европейского типов B. miyamotoi.

Возможно, при условии более высокой изменчивости этих типов предложенная в данной работе методика МЛСА окажется более информативной.

Поднятая в данной работе проблема несвойственного для микроорганизмов отсутствия изменчивости требует проведения дальнейших B. miyamotoi исследований как с точки зрения обнаружения внутритиповой изменчивости на уровне анализа полных геномов, так и выяснения причин вероятного быстрого распространения клонов B. miyamotoi на большие расстояния.

ВЫВОДЫ

1. В настоящей работе разработана система дифференцировки четырех встречающихся в России видов боррелий, основанная на ПЦР в реальном времени. Данная система позволила определить видовую принадлежность около 90% позитивных образцов.

2. Показано, что B. bavariensis соответствует геногруппе NT29 B. garinii и в клещах I. persulcatus встречается чаще или с той же частотой, что и B. garinii (объединяет геногруппы 20047 и ChY13p). В клещах I. pavlovskyi преобладает B.

garinii, в то время как встречаемость B. miyamotoi в обоих видах клещей статистически не отличается.

3. Установлено, что большая часть сиквенс-типов изолятов B. afzelii, выделенных в России, формирует обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

Показано высокое генетическое разнообразие и неоднородное 4.

географическое распределение сиквенс-типов B. bavariensis и B. garinii.

5. Разработана система мультилокусного спейсер-анализа B. miyamotoi, а также показана крайне низкая генетическая изменчивость азиатского типа B.

miyamotoi как на уровне кодирующих генов, так и на уровне некодирующих межгенных спейсеров. Выдвинута гипотеза о быстром клональном распространении B. miyamotoi по территории Евразии.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВКЭ – вирус клещевого энцефалита ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз КВЛ – клещевые возвратные лихорадки кДНК – комплементарная ДНК МЛСА (MLSA) – мультилокусный спейсер-анализ (multilocus spacer analysis) МЛСТ (MLST) – мультилокусное сиквенс-типирование (multilocus sequence typing) п.н. – пара нуклеотидов ПЦР (PCR) – полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction) ПЦР-ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени BSK – культуральная среда Barbour-Stoenner-Kelly cp – кольцевая плазмида (circular plasmid) Ct – пороговый цикл ПЦР-РВ (cycle threshold) dNTP – дезоксинуклеозид трифосфат (deoxynucleoside triphosphate) fla – ген флагеллина (flagellin)

– ген, кодирующий глицерофосфодиэфир-фосфодиэстеразу glpQ (glycerophosphodiester phosphodiesterase) IGS – межгенный спейсер (intergenic spacer) lp – линейная плазмида (linear plasmid) MGB – зонды для ПЦР-РВ, содержащие присадку «связыватель малой бороздки ДНК» (minor groove binder) MKP – модифицированная питательная среда Келли-Петтенкофера (Modified Kelly-Pettenkofer medium) Osp – белок внешней мембраны (outer surface protein) ST (CT) – сиквенс-тип (sequence type) Ta – температура отжига праймеров (annealing temperature)

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Арумова Е.А. Клещевой боррелиоз (болезнь Лайма) в России / Е.А.

1.

Арумова, Т.В. Воронцова // Дезинфекционное дело. – 2000. – T. 2. – С. 45-47.

Бессолицына Е.А. Анализ зараженности бактериями рода Borrelia 2.

клещей, собранных на территории Кировской области / Е.А. Бессолицына, С.А.

Волков, И.С. Бердинских, Ф.С. Столбова, И.В. Дармов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2013. – Т. 15. – № 3. – С. 1088-1091.

Горелова Н.Б. Изоляция боррелий от клеща Ixodes trianguliceps 3.

(Ixodidae) и возможное значение этого вида в эпизоотологии иксодовых клещевых боррелиозов / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, Ю.В. Ковалевский, Д. Постик, Г.

Барантон // Паразитология. – 1996. – Т. 30. – № 1. – С. 13-18.

Горелова Н.Б. Первая изоляция Borrelia burgdorferi sensu stricto в 4.

России / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, Д. Постик, Ю.В. Юничева, Т.Е. Рябова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2001. – № 4. – С. 10Горелова Н.Б. Первая изоляция патогенных для человека боррелий от 5.

клещей Ixodes pavlovskyi Pom. / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, Н.А. Филиппова, Д. Постик // ДАН. – 2001. – Т. 378. – № 4. – С. 558-559.

Горелова Н.Б. Генетическая характеристика патогенных для человека 6.

боррелий, изолированных от клещей Ixodes trianguliceps Bir. и Ixodes pavlovskyi Pоm. / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, И.А. Фадеева, В.В. Нефёдова // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 2005. – № 2. – С. 9-12.

Козлова И.В. Видовое и генетическое разнообразие возбудителей 7.

клещевых инфекций на территории Восточной Сибири / И.В. Козлова, Е.К.

Дорощенко, О.В. Лисак, Ю.П. Джиоев, М.М. Верхозина, Т.В. Демина, В.А. Рар, С.Е. Ткачев, Н.В. Фоменко, О.В. Сунцова, О.О. Черноиванова, А.И. Парамонов, А.О. Ревизор, В.И. Злобин // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2012. – Т. 84. – № 2-2. – С. 75-82.

Коренберг Э.И. Серологическое выявление болезни Лайма в СССР / 8.

Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников, Е.П. Деконенко, С.В. Щербаков, Ю.В.

Ананьина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1986. – Т. 6. – С. 111-113.

Коренберг Э.И. Резервуарные хозяева и переносчики боррелий– 9.

возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б.

Горелова, Д. Постик, Ю.В. Ковалевский, Г. Барантон, Н.Н. Воробьева // Журн.

микробиол. – 1997. – Т. 6. – С. 36-38.

Коренберг Э.И. Изучение и профилактика микстинфекций, 10.

передающихся иксодовыми клещами / Э.И. Коренберг // Вестник РАМН. – 2001. – № 11. – С. 41-45.

Коренберг Э.И. Основные черты природной очаговости иксодовых 11.

клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Ю.В.

Ковалевский // Паразитология. – 2002. – Т. 36. – № 3. – С. 177-191.

Коренберг Э.И. Основные итоги генотипирования боррелий в России / 12.

Э.И. Коренберг, В.В. Нефедова, И.А. Фадеева, Н.Б. Горелова // Бюллетень сибирской медицины. – 2006. – Приложение 1. – С. 87-92.

Коренберг Э.И. Природноочаговые инфекции, передающиеся 13.

иксодовыми клещами/ Э.И. Коренберг, В.Г. Помелова, Н.С. Осин – M.:

типография "Наука", 2013. – 463 с.

Крючечников В.Н. Идентификация боррелий, изолированных в СССР 14.

от клещей Ixodes persulcatus Schulze / В.Н. Крючечников, Э.И. Коренберг, С.В.

Щербаков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1987. – № 12. – С. 41-44.

Лесняк О.М. О классификации Лайм-боррелиоза (Лаймской 15.

болезни) / О.М. Лесняк, Е.С. Беликов // Терапевтический архив. – 1995. – № 11. – С. 49-51.

Ливанова Н.Н. Взаимоотношения компонентов паразитарных систем 16.

иксодовых клещевых боррелиозов на юге Западной Сибири / Н.Н. Ливанова, А.К.

Добротворский, В.В. Панов, О.В. Морозова // Сибирский экологический журнал.

– 2003. – Т. 10. – № 5. – С. 581-590.

Литвин В.Ю. Природная очаговость болезней: развитие концепции к 17.

исходу века / В.Ю. Литвин, Э.И. Коренберг // Паразитология. – 1999. – Т. 33. – № 3. – С. 179-191.

Лобзин Ю.В. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, 18.

лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов: Рекомендации для врачей/ Ю.В. Лобзин, А.Г. Рахманова, В.С. Антонов, А.Н. Усков, Л.П. Антыкова, Н.В. Скрипченко, Г.П. Иванова, О.В. Платошина, В.В. Иванова, В.Н. Тимченко – Санкт-Петербург, 2000. – 78 с.

Нефедова В.В. Изоляция возбудителя иксодового клещевого 19.

боррелиоза из крови больных / В.В. Нефедова, В.Ю. Тетерин, Э.И. Коренберг // Журн. микробиол. – 2009. – №. 1. – С. 63-66.

Рудакова С.А. Изучение возможной трансовариальной и трансфазовой 20.

передачи боррелий клещами Dermacentor reticulatus (Ixodidae) / С.А. Рудакова, Е.В. Матущенко, В.В. Якименко, Н.К. Токаревич, Ю.В. Андрейчук // Паразитология. – 2005. – Т. 39. – № 5. – С. 427-432.

Рудакова С.А. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как 21.

основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами / С.А. Рудакова, А.Н. Коломеец, И.Е. Самойленко, А.М.

Кузьминов, Н.В. Рудаков // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – №. 4. – С. 116-119.

Сарксян Д.С. Клинико-рентгенологическая характеристика поражения 22.

легких при боррелиозе miyamotoi / Д.С. Сарксян, И.Е. Малинин, В.И. Шахов, Е.В.

Ивонина, К.В. Гасников // Медицинский альманах. – 2012. – Т. 21. – № 2. – С. 250Скрипченко Н.В. Клинико-лабораторные особенности иксодового 23.

клещевого боррелиоза, вызванного Borrelia miyamotoi, у детей / Н.В. Скрипченко, А.А. Балинова // Журнал инфектологии. – 2010. – Т. 2. – №2 – С. 35-39.

Скрипченко Н.В. Современные представления о патогенезе 24.

иксодовых клещевых боррелиозов / Н.В. Скрипченко, А.А. Балинова // Журнал инфектологии. – 2012. – Т. 4. – № 2. – С. 5-14.

Ушакова Г.В. О видах группы Ixodes persulcatus (Parasitiformes, 25.

Ixodidae). II. К экологии Ixodes pavlovskyi Pom. в Восточном Казахстане / Г.В.

Ушакова, Н.А. Филиппова // Паразитология. – 1968. – Т. 2. – № 4. – С. 334-338.

Филиппова Н.А. Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze (Acarina, 26.

Ixodidae). Морфология, Систематика, Экология, Медицинское значение./ Н.А.

Филиппова – Ленинград: Наука, 1985. – 416 с.

Фоменко Н.В. Разнообразие Borrelia burgdorferi sensu lato в природных 27.

очагах Новосибирской области / Н.В. Фоменко, Е.В. Романова, Ю.Ю. Караваева, В.В. Панов, Н.Я. Черноусова, Н.Н. Ливанова // Бюллетень сибирской медицины. – 2006. – Приложение 1. – С. 93-98.

Фоменко Н.В. Гетерогенность структуры гена ospA у изолятов 28.

Borrelia garinii и Borrelia afzelii из Западной Сибири и Монголии / Н.В. Фоменко, О.В. Стронин, М.А. Хаснатинов, Г.А. Данчинова, Ж. Батаа, Н.А. Гольцова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2009. – № 4. – С. 18-22.

Фоменко Н.В. Генетические особенности ДНК боррелий вида Borrelia 29.

miyamotoi, выявляемых в таежных клещах / Н.В. Фоменко, В.Ю. Боргояков, В.В.

Панов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2011. – № 2. – С. 12-17.

Ястребов В.К. Трансмиссивные клещевые природно-очаговые 30.

инфекции в Российской Федерации: тенденции эпидемического процесса, актуальные вопросы профилактики / В.К. Ястребов, Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов // Сибирский медицинский журнал. – 2012. – № 4. – С. 91-93.

31. Aanensen D.M. The multilocus sequence typing network: mlst.net / D.M.

Aanensen, B.G. Spratt // Nucleic Acids Research. – 2005. – Vol. 33 (suppl. 2). – P.

W728-733.

32. Achtman M. Evolution, population structure, and phylogeography of genetically monomorphic bacterial pathogens / M. Achtman // Annu Rev Microbiol. – 2008. – Vol. 62. – P. 53-70.

33. Alekseev A.N. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks in the Baltic regions of Russia / A.N. Alekseev, H.V. Dubinina, I. Van De Pol, L.M. Schouls // J Clin Microbiol. – 2001. – Vol. 39. – № 6. – P. 2237-2242.

34. Anderson J.F. Bird-feeding ticks transstadially transmit Borrelia burgdorferi that infect Syrian hamsters / J.F. Anderson, L.A. Magnarelli, K.C. Stafford, 3rd // J Wildl Dis. – 1990. – Vol. 26. – № 1. – P. 1-10.

35. Anthonissen F.M. Evidence for the involvement of different genospecies of Borrelia in the clinical outcome of Lyme disease in Belgium / F.M. Anthonissen, M. De Kesel, P.P. Hoet, G.H. Bigaignon // Res Microbiol. – 1994. – Vol. 145. – № 4. – P. 327Assous, M.V. Western blot analysis of sera from Lyme borreliosis patients according to the genomic species of the Borrelia strains used as antigens / M.V. Assous, D. Postic, G. Paul, P. Nevot, G. Baranton // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 1993. – Vol. 12. – № 4. – P. 261-268.

37. Balmelli T. Association between different clinical manifestations of Lyme disease and different species of Borrelia burgdorferi sensu lato / T. Balmelli, J.C.

Piffaretti // Research in Microbiology. – 1995. – Vol. 146. – № 4. – P. 329-340.

38. Baranton G. Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sp. nov., and group VS461 associated with Lyme borreliosis / G. Baranton, D.

Postic, I. Saint Girons, P. Boerlin, J.C. Piffaretti, M. Assous, P.A. Grimont // Int J Syst Bacteriol. – 1992. – Vol. 42. – № 3. – P. 378-383.

39. Barbour A.G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes / A.G.

Barbour // Yale J Biol Med. – 1984. – Vol. 57. – № 4. – P. 521-525.

40. Barbour A.G. Biology of Borrelia species / A.G. Barbour, S.F. Hayes // Microbiol Rev. – 1986. – Vol. 50. – № 4. – P. 381-400.

41. Barbour A.G. Linear plasmids of the bacterium Borrelia burgdorferi have covalently closed ends / A.G. Barbour, C.F. Garon // Science. – 1987. – Vol. 237. – № 4813. – P. 409-411.

42. Barbour A.G. Plasmid analysis of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent / A.G. Barbour // J Clin Microbiol. – 1988. – Vol. 26. – № 3. – P. 475-478.

43. Barbour A.G. The biological and social phenomenon of Lyme disease / A.G. Barbour, D. Fish // Science. – 1993. – Vol. 260. – № 5114. – P. 1610-1616.

44. Barbour A.G. Identification of an uncultivable Borrelia species in the hard tick Amblyomma americanum: possible agent of a Lyme disease-like illness / A.G.

Barbour, G.O. Maupin, G.J. Teltow, C.J. Carter, J. Piesman // J Infect Dis. – 1996. – Vol. 173. – № 2. – P. 403-409.

45. Barbour A.G. Niche partitioning of Borrelia burgdorferi and Borrelia miyamotoi in the same tick vector and mammalian reservoir species / A.G. Barbour, J.

Bunikis, B. Travinsky, A.G. Hoen, M.A. Diuk-Wasser, D. Fish, J.I. Tsao // Am J Trop Med Hyg. – 2009. – Vol. 81. – № 6. – P. 1120-1131.

46. Barbour A.G. Evolution and distribution of the ospC Gene, a transferable serotype determinant of Borrelia burgdorferi / A.G. Barbour, B. Travinsky // MBio. – 2010. – Vol. 1. – № 4. – P. e00153-00110.

47. Barbour A.G. Phylogeny of a relapsing fever Borrelia species transmitted by the hard tick Ixodes scapularis / A.G. Barbour // Infect Genet Evol. – 2014. – Vol.

27. – P. 551-558.

48. Beklemishev A.B. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia / A.B. Beklemishev, A.K. Dobrotvorsky, A.V. Piterina, I.D. Ivanov, N.Y. Nomokonova, N.N. Livanova // FEMS Microbiol Lett. – 2003. – Vol. 227. – № 2. – P. 157-161.

49. Borgoyakov V.Yu. Infestation of Taiga Ticks with Borrelias in the Territory of Novosibirsk Scientific Center (Siberian Branch, Russian Academy of Sciences) / V.Y. Borgoyakov, N.V. Fomenko, V.V. Panov, E.D. Chikova // Entomological Review. – 2011. – Vol. 91. – № 3. – P. 396–404.

50. Bunikis J. Sequence typing reveals extensive strain diversity of the Lyme borreliosis agents Borrelia burgdorferi in North America and Borrelia afzelii in Europe / J. Bunikis, U. Garpmo, J. Tsao, J. Berglund, D. Fish, A.G. Barbour // Microbiology. – 2004. – Vol. 150. – № Pt 6. – P. 1741-1755.

51. Bunikis J. Typing of Borrelia relapsing fever group strains / J. Bunikis, J.

Tsao, U. Garpmo, J. Berglund, D. Fish, A.G. Barbour // Emerg Infect Dis. – 2004. – Vol. 10. – № 9. – P. 1661-1664.

52. Bunikis J. Third Borrelia species in white-footed mice / J. Bunikis, A.G.

Barbour // Emerg Infect Dis. – 2005. – Vol. 11. – № 7. – P. 1150-1151.

53. Chowdri H.R. Borrelia miyamotoi infection presenting as human granulocytic anaplasmosis: a case report / H.R. Chowdri, J.L. Gugliotta, V.P. Berardi, H.K. Goethert, P.J. Molloy, S.L. Sterling, S.R. Telford // Ann Intern Med. – 2013. – Vol. 159. – № 1. – P. 21-27.

54. Chu C.Y. Novel genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato from rodents and ticks in southwestern China / C.Y. Chu, W. Liu, B.G. Jiang, D.M. Wang, W.J. Jiang, Q.M. Zhao, P.H. Zhang, Z.X. Wang, G.P. Tang, H. Yang, W.C. Cao // J Clin Microbiol. – 2008. – Vol. 46. – № 9. – P. 3130-3133.

55. Coipan E.C. Geodemographic analysis of Borrelia burgdorferi sensu lato using the 5S-23S rDNA spacer region / E.C. Coipan, M. Fonville, E. Tijsse-Klasen, J.W. van der Giessen, W. Takken, H. Sprong, K. Takumi // Infect Genet Evol. – 2013. – Vol. 17. – P. 216-222.

56. Comstedt P. Design and development of a novel vaccine for protection against Lyme borreliosis / P. Comstedt, M. Hanner, W. Schuler, A. Meinke, U.

Lundberg // PLoS One. – 2014. – Vol. 9. – № 11. – P. e113294.

57. Cosson J.F. Genetic characterization of the human relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi in vectors and animal reservoirs of Lyme disease spirochetes in France / J.F. Cosson, L. Michelet, J. Chotte, E. Le Naour, M. Cote, E.

Devillers, M.L. Poulle, D. Huet, M. Galan, J. Geller, S. Moutailler, M. Vayssier-Taussat // Parasit Vectors. – 2014. – Vol. 7. – P. 233.

58. Crowder C.D. Prevalence of Borrelia miyamotoi in Ixodes Ticks in Europe and the United States / C.D. Crowder, H.E. Carolan, M.A. Rounds, V. Honig, B.

Mothes, H. Haag, O. Nolte, B.J. Luft, L. Grubhoffer, D.J. Ecker, S.E. Schutzer, M.W.

Eshoo // Emerg Infect Dis. – 2014. – Vol. 20. – № 10. – P. 1678-1682.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Максимова Ольга Владимировна «Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела» 03.02.03. – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Зверев Виталий Васильевич академик РАН, д.б.н., профессор Научный консультант: Гервазиева Валентина Борисовна д.м.н, профессор, заслуженный деятель науки РФ МОСКВА – 2015 Оглавление Список сокращений Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«СОЛОВЬЕВ Альберт Николаевич КЛИМАТОГЕННАЯ И АНТРОПОГЕННАЯ ДИНАМИКА БИОТЫ В МЕНЯЮЩИХСЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ ВОСТОКА РУССКОЙ РАВНИНЫ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Киров Оглавление Введение Глава 1. Обзор состояния проблемы климатогенной...»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»

«ИВАНОВ Сергей Иванович Особенности воспроизводства атлантического лосося (Salmo salar L.) в озерно-речной системе реки Шуя (Республика Карелия) Специальность 03.02.06 – ихтиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«Бабкина Ирина Борисовна ИХТИОФАУНА БАССЕЙНА НИЖНЕЙ ТОМИ: ДИНАМИКА И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Иванович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава 1....»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.