WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Особенно большое значение она приобретает при использовании одного локуса, так как в случае рекомбинации результаты могут неверно отражать филогенетические отношения между штаммами. МЛСТ позволяет свести эту проблему к минимуму за счет включения в анализ нескольких локусов, равномерно расположенных по геному. Так, в случае рекомбинации в одном-двух локусах остальные гены по-прежнему делают возможным получение правильных результатов [118].

Было показано, что боррелии обладают клональной структурой и редко осуществляют горизонтальный перенос генов Хотя случаи [63, 64].

горизонтального переноса были выявлены для многих плазмидных генов, перенос целых плазмид и хромосомных генов, вероятно, является крайне редким событием [46, 141, 182].

Для мультилокусного типирования B. burgdorferi s.l. было разработано по меньшей мере пять систем, использующих разные локусы [50, 115, 141, 151, 156].

Три из них были использованы в качестве альтернативы ДНК–ДНК гибридизации, т.е. в целях подтверждения таксономического статуса новых видов [54, 116, 117, 139, 151, 156, 157]. Однако, недостатком почти всех этих систем являлось то, что они использовали одновременно консервативные хромосомные гены, быстро накапливающие мутации плазмидные гены, а также некодирующие участки генома.

В 2008 году международной группой ученых под руководством Габриель Маргос (Gabriel Margos, Bavarian Health and Food Safety Authority, Германия) была предложена схема МЛСТ, основанная на использовании восьми хромосомных генов домашнего хозяйства (общей длиной 4785 п.н.), обладающих примерно одинаковым уровнем изменчивости и равномерно распределенных по геному [115] (Таблица 3).

Одним из важнейших преимуществ метода МЛСТ является наличие и регулярное пополнение общедоступной базы данных Borrelia MLST Database [200], которая включает в себя не только информацию о штаммах и нуклеотидные последовательности сиквенс-типов, но и удобный механизм поиска, а также программное обеспечения для проведения первичного анализа последовательностей (в том числе eBurst [68]).

Данная схема МЛСТ получила широкое применение и позволила выявить несколько новых видов боррелий, а также провести филогенетический анализ отдельных видов и групп штаммов [89, 90, 99, 118, 158, 171, 178, 183, 184].

Однако, в 2012 году из 1300 штаммов Borrelia burgdorferi s.l., чьи последовательности были представлены в базе данных, только три были выделены на территории России и депонированы японскими исследователями [171] (Рисунок 7). На конец 2014 года в базе данных зарегистрировано 627 сиквенс-типов (включая полученные в настоящей работе) и более 1600 штаммов.

–  –  –

Рисунок 7 – Карта представленности сиквенс-типов B. burgdorferi s.l. в разных странах Евразии (интенсивность окрашивания территории отражает число ST) на момент начала настоящего исследования (2012 год). Места сбора образцов из России, зарегистрированных в базе данных Borrelia MLST, обозначены черными квадратами.

Данные приведены согласно базе данных Borrelia MLST [200].

–  –  –

Помимо мультилокусного сиквенс-типирования, основанного на анализе достаточно консервативных генов и подходящего для филогенетических исследований возбудителей на всем ареале, применяется также метод мультилокусного спейсер-анализа (или спейсер-типирования), использующий последовательности вариабельных межгенных спейсеров. Из-за сходства аббревиатур описываемых методов в дальнейшем мультилокусный спейсеранализа будет обозначаться МЛСА, в отличие от МЛСТ (в литературе встречаются разные варианты аббревиатур). Впервые метод МЛСА был применен для типирования Yersinia pestis [61], а затем успешно использован для типирования таких возбудителей как Rickettsia conorii [73], R. prowazekii [199], Coxiella burnetii [85], Bartonella henselae [107], Bartonella quintana [72]. Основным преимуществом метода является анализ последовательностей межгенных спейсеров, не подверженных давлению отбора, а значит накапливающих мутации с более высокой скоростью. Метод МЛСА был разработан для анализа африканских видов боррелий группы КВЛ Borrelia crocidurae, B. duttonii and B.

recurrentis [66]. Методика включала анализ пяти межгенных спейсеров, равномерно распределенных по хромосоме, общей длиной 2306 п.н., и позволяла не только точно разделять близкие виды, но и выявлять внутривидовую изменчивость. Применение МЛСА оправдано в случае, если требуется выделить генетически различные группы среди родственных штаммов, а также в случае низкой вариабельности изучаемых возбудителей и, вследствие этого, непригодности стандартного подхода МЛСТ.

1.6. Изучение боррелий и их распространение на территории России

Идентификация первых российских изолятов B. burgdorferi s.l., полученных в 1987-1989 гг., была проведена с использованием моноклональных антител [14].

Исследование молекулярно-генетическими методами около 400 изолятов из разных регионов России и сопредельных стран, полученных к 1995-1996 гг., выявило виды B. garinii (подгруппы 20047 и NT29), B. afzelii, B. lusitaniae, B.

valaisiana и B. burgdorferi s.s. [4, 138]. Было показано, что повсеместное распространение и преимущественное эпидемическое значение в России имеют B.

garinii и B. afzelii, установлены их основные переносчики и резервуарные хозяева [12].

Основное эпидемиологическое значение на территории России имеют клещи I. persulcatus (таежный клещ) и I. ricinus (собачий клещ), характеризующиеся чрезвычайно широким кругом прокормителей. Спонтанная инфицированность боррелиями клещей вида I. ricinus составляет в среднем около 20% [147], клещей I. persulcatus – до 40-60% [1, 2, 19, 27, 105, 145]. Состав видов боррелий, переносчиками которых являются I. persulcatus и I. ricinus, несколько отличается, хотя имеются и общие виды (B. afzelii, B. garinii 20047) (Рисунок 7). Было показано, что боррелии могут эффективно поддерживаться в популяциях клещей вида I. pavlovskyi, которые обладают дизъюнктивным ареалом (алтайско-саянская и дальневосточная части) и практически повсеместно встречаются симпатрично с I. persulcatus [5, 100]. Кроме того, боррелии были обнаружены в клещах I.

trianguliceps и Dermacentor sp. [3, 6, 12, 20]. Однако, эпидемиологическое значение последних двух видов невелико.

В Таблице 4 приведены данные по встречаемости B. garinii и B. afzelii, а также их геногрупп, с указанием общей зараженности клещей боррелиями (при наличии таких данных). Хотя данные были получены в разных исследованиях и при работе с разным биологическим материалом, видно, что 1) в клещах I.

persulcatus чаще встречается геногруппа B. garinii NT29, в то время как в I.

pavlovskyi и I. ricinus – геногруппа 20047; 2) геногруппа B. afzelii NT28 встречается намного реже, чем VS461. Наиболее изученными в отношении разнообразия боррелий регионами являются Пермский край (работы НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва), Новосибирская и Томская области (работы Института систематики и экологии животных СО РАН и Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск).

Рисунок 7 – Виды комплекса B. burgdorferi s.l., переносимые клещами I. persulcatus и I. ricinus [125].

Таблица 4 – Данные по зараженности клещей боррелиями разных видов и геногрупп на территории России (согласно литературным данным)

–  –  –

Наиболее полный филогенетический анализ B. garinii, выполненный на основе 5S-23S рРНК межгенного спейсера, был проведен в работе [127]. Анализ последовательностей спейсера 227 первичных изолятов B. garinii (выделенных в 16 регионах России, а также сопредельных странах) и 71 последовательности из базы данных GenBank показал значительную генетическую гетерогенность данного вида: было выделено три кластера (геноварианта) внутри группы NT29 и 13 кластеров внутри группы 20047. Один из кластеров группы 20047 значительно отличался от остальных и относился к геногруппе ChY13p, штаммы которой были впервые выделены в Китае [106]. Связей между геновариантами B. garinii с определенным видом переносчика или резервуарного хозяина найдено не было.

Следует отметить, что при сравнении рестрикционных профилей межгенного спейсера и его последовательностей были выявлены некоторые несоответствия в определении принадлежности изолята к геногруппе [127]. Высокая генетическая гетерогенность B. garinii на территории России была выявлена и при анализе гена ospA [28].

Что касается геногрупп B. afzelii, то аналогичным образом внутри геногруппы VS461 было выделено семь, а NT28 – три геноварианта [12]. Три из семи генетических вариантов группы B. afzelii VS461, по всей видимости, широко распространены в природных очагах Евразии среди различных видов переносчиков (в том числе I. persulcatus) и резервуарных хозяев. Было высказано предположение, что остальные четыре генетических варианта боррелий этой подгруппы распространены преимущественно в Европе и связаны с клещом I.

ricinus. Распространение трех генетических вариантов группы B. afzelii NT28 нуждается в дальнейшем уточнении [12].

1.7. Особенности филогеографии и экологии B. miyamotoi B. miyamotoi была впервые выделена из клещей Ixodes persulcatus в 1995 году на острове Хоккайдо, Япония [78]. Свое название данный вид получил в честь Кэндзи Миямото (Kenji Miyamoto) - энтомолога, который впервые ее выделил. Позже этот вид был обнаружен в клещах I. pacificus [126] и I. scapularis [162] в США, I. ricinus в Европе: Швеции [74], Чехии [150], Эстонии [80], Франции и Германии [150].

Особенностью B. miyamotoi, равно как и родственных видов B. theileri и B.

lonestari, заключается в том, что этот вид генетически сходен с боррелиями группы возвратных лихорадок, но переносится иксодовыми клещами [45, 74]. Так, B. lonestari переносится клещами Amblyomma americanum [44], B. theileri – клещами рода Rhipicephalus [148], B. miyamotoi – клещами рода Ixodes (Рисунок 8). В России первые данные об обнаружении B. miyamotoi на территории Новосибирской области в клещах I. persulcatus появились в 2008 г. [69]. Сейчас известно, что этот вид распространен практически на всей территории страны: на Северо-Западе России, в Центральной части, на Северо-Кавказе, Урале, в Сибири и на Дальнем Востоке [7, 23, 29, 135].

Рисунок 8 – Филогенетическое древо Borrelia sp., построенное на основе фрагмента гена 16S рРНК, и основные переносчики B. miyamotoi. Черными кружками отмечены изоляты B. miyamotoi, выделенные на территории России [135].

В целом, зараженность клещей B. miyamotoi не территории России не превышала 5% (за исключением Удмуртии и Курганской области), что в 5-10 раз ниже таковой боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. [7, 70, 135] (Рисунок 9).

Низкая зараженность клещей B. miyamotoi была отмечена также в Европе и Америке [45, 74, 150]. Интересно, что в работе [45] экспериментально были показаны разные стратегии B. burgdorferi и B. miyamotoi при заражении мышей:

первый вид персистирует в тканях кожных покровов, развивая низкую бактериемию в крови, в том время как инфекция B. miyamotoi выражается в системной инфекции и высоких титрих патогена в крови [45]. Что касается круга резервуарных хозяев B. miyamotoi, то данный вид, как и другие виды боррелий, был обнаружен в крови грызунов (Apodemus argenteus, Хоккайдо [78]; Peromyscus leucopus, Северная Америка [45, 52]) и птиц [88]. Однако, полный круг хозяев B.

miyamotoi до сих пор не установлен.

Долгое время вопрос о патогенности B. miyamotoi оставался открытым. В 2011 году в России впервые появились данные о патогенности B. miyamotoi для человека [135], затем B. miyamotoi была выявлена в крови больных людей в США [53, 86, 102] и Европе [94]. Кроме того, экспериментально было показано, что B.

miyamotoi устойчива к действию системы комплемента человеческой сыворотки, аналогично другим патогенным видам боррелий [186]. У большинства пациентов, в крови которых была выявлена ДНК B. miyamotoi в России, заболевание сопровождалось резким повышением температуры до 39,5°С, развитием выраженного интоксикационного синдрома, а также рецидивирующими лихорадочными приступами. В месте укуса эритема чаще всего отсутствовала, как и при инфицировании боррелиями группы КВЛ [22, 135].

Как и боррелии группы КВЛ, может передаваться B. miyamotoi трансовариально (от самки к потомству) [152, 155].

Для детекции B. miyamotoi методом ПЦР часто используют уникальный ген кодирующий периплазматический фермент глицерофосфодиэфирglpQ, фосфодиэстеразу и характерный исключительно для боррелий группы возвратных лихорадок. Другими хромосомными локусами, используемыми для изучения данной группы, являются гены 16S рРНК, р66, fla и 16S-23S рРНК межгенный спейсер.

Рисунок 9 – Зараженность клещей I. persulcatus (I. p.) и I. ricinus (I. r.) B. miyamotoi в Европейской части России и на Урале. В скобках указано число проанализированных клещей. Звездочкой обозначен Екатеринбург, где был собран материал от больных, инфицированных B. miyamotoi [135].

В молекулярной эпидемиологии B. miyamotoi можно выявить два аспекта, представляющих особый интерес. Во-первых, зависимость генетических свойств B. miyamotoi от вида клеща-переносчика. В настоящее время выделяют три типа B. miyamotoi: азиатский или сибирский (переносчик – I. persulcatus), европейский (I. ricinus) и американский (I. scapularis и I. pacificus) [51, 80, 172]. Есть данные о том, что американский тип в свою очередь имеет два подтипа, переносимые I.

scapularis и I. pacificus [67, 126], однако, данное предположение было поставлено под сомнение другими исследователями [58]. Генетические дистанции между типами настолько значительны, что B. miyamotoi часто рассматривают не как единый вид, а как комплекс B. miyamotoi sensu lato [47, 51].

Во-вторых, несмотря на выше обозначенный факт, крайне низкий уровень генетической изменчивости или её отсутствие показано для изолятов B.

miyamotoi, выделенных из одного вида клещей [51, 57, 58, 71, 80, 172]. В частности, B. miyamotoi азиатского типа, выделенные на территории России от Балтийского моря до Дальнего Востока, обладают идентичными последовательностями по таким маркерам, как гены 16S рРНК, fla, p66 и glpQ [70, 71, 135]. Методика мультилокусного сиквенс-типирования, разработанная для B.

burgdorferi s.l. и адаптированная для изучения B. miyamotoi, также показала отсутствие генетической изменчивости изолятов азиатского типа, выделенных на территории Японии [172]. Таким образом, ввиду недостаточной информативности фрагментов кодирующих генов в изучении разнообразия B. miyamotoi внутри типа, требуется поиск и применение новых полиморфных генетических маркеров.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Работа была проведена на базе лаборатории молекулярной генетики Института естественных наук Уральского федерального университета (г.

Екатеринбург) при сотрудничестве с ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по Свердловской области» (Лаборатория контроля биологических факторов). В качестве материала для исследования использовались: 1) голодные взрослые особи клещей, собранные на флаг с растительности в 2010-2014 гг. (более 2800 образцов, собраны на территории Архангельской и Кировской областей, Пермского края, Республики Коми, Свердловской, Курганской, Тюменской, Омской, Новосибирской и Томской областей, Алтайского и Приморского краев, единично – в других регионах); 2) пулы клещей (от 1 до 20 клещей в образце), собранные с растительности на территории Свердловской области в 2010-2014 гг.

(2195 образцов); 3) клещи, предоставленные пострадавшими от укуса людьми в 2010-2014 гг. (Свердловская область, 882 образца); 4) 39 изолятов боррелий, полученных путем посева гомогенизированных клещей в жидкую среду BSK-H в 2011-2013 гг. Клещей родов Ixodes и Dermacentor идентифицировали по морфологическим признакам, вид клещей рода Ixodes определяли с помощью видоспецифичной ПЦР (раздел 2.2.4).

Для культивирования боррелий в качестве посадочного материала использовались клещи, собранные на флаг в разных регионах России в весеннелетние периоды 2011-2013 гг. (Таблица 5).

Подготовку клещей и инокуляцию клещевого гомогената в среду для культивирования проводили в стерильных условиях в ламинарном боксе. Клещей подвергали гомогенизации стерильными пестиками в 200 мкл физиологического раствора, после чего 100 мкл гомогената вносилось в разлитую по стерильным 5 мл пробиркам среду BSK-H (Sigma, Aldrich Chemical Co.). Культивирование проводилось в термостате при температуре 34°С. Контроль за ростом культуры боррелий осуществлялся визуально по изменению окраски среды с розоватой на желтую.

–  –  –

Клещей индивидуально замораживали в жидком азоте и гомогенизировали одноразовыми пестиками в 200 мкл физиологического раствора. Суммарную фракцию нуклеиновых кислот выделяли из 100 мкл суспензии гомогенизированных клещей либо 100 мкл жидкой культуры боррелий преципитационным методом с помощью коммерческого набора реагентов «Рибопреп» (ООО «Интерлабсервис», Москва) или сорбционным методом при помощи набора «Рибо-сорб» (ООО «Интерлабсервис»), согласно прилагаемой инструкции.

В 2013-2014 гг. выделение нуклеиновых кислот осуществлялось набором «Магносорб» (ООО «Интерлабсервис») на автоматической роботизированной станции для экстракции нуклеиновых кислот и дозирования жидкостей XIRIL (Швейцария).

2.2.2. Определение наличия ДНК боррелий в образцах

Для увеличения чувствительности реакции ПЦР предварительно была проведена реакция обратной транскрипции. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием набора «Реверта-L» (ООО «Интерлабсервис»), согласно инструкции.

Полученная кДНК была использована в качестве матрицы для проведения ПЦР-РВ на амплификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems, USA) согласно методике [130]. В качестве внутреннего контроля выделения НК и амплификации использовался ген 16S рРНК клещей рода Ixodes. Детекция нуклеиновых кислот боррелий проводилась одновременно с детекцией кДНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Последовательности праймеров и зондов, а также мишени ПЦР-РВ приведены в Таблице 6.

–  –  –

Дифференцировка четырех видов боррелий в позитивных образцах осуществлялась в два этапа (Рисунок 10). На первом из них определяли наличие B. garinii s.l. (B. garinii + B. bavariensis), B. afzelii (мишень - ген uvrA) и B.

miyamotoi (ген glpQ) с помощью набора праймеров №1 (Таблица 7, Рисунок 10).

На втором этапе B. garinii s.l. - позитивные образцы были дифференцированы на B. garinii и B. bavariensis с помощью набора праймеров №2 (мишень - ген nifS).

Последовательности праймеров приведены в Таблице 7. Дизайн праймеров осуществлялся с помощью программ Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen) и Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) на основе выравнивания последовательностей выбранных генов, полученных нами ранее (в том числе в ходе мультилокусного типирования) и имеющихся в базах данных GenBank и Borrelia MLST Database.

Специфичность праймеров и зондов была проверена на ДНК протипированных согласно методике МЛСТ [115] изолятов B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii, а также образцах ДНК B. miyamotoi. У ряда образцов определение вида было подтверждено последующим секвенированием последовательностей 5S-23S рРНК межгенного спейсера согласно методике [137]. У нетипируемых образцов были выборочно определены последовательности фрагментов генов uvrA и nifS, содержащих участки связывания праймеров и зондов.

Рисунок 10 – Схема определения видовой принадлежности четырех видов боррелий, циркулирующих на территории России.

Реакция ПЦР-РВ проводилась в объеме 25 мкл, реакционная смесь состояла из: H2O – 3,5 мкл, 5х буфер – 5,0 мкл, 25 мМ MgCl2 (конечная концентрация – 3,0 мМ) – 3,0 мкл, 10 мМ dNTPs – 1,5 мкл, праймер/зонд (5 пмоль/ мкл) – по 1,0 мкл,

TaqF (5 ед./мкл) – 0,3 мкл, проба ДНК – 5,0 мкл. Условия проведения реакции:

94С – 15 мин; 45 циклов: плавление 94С – 15 с, отжиг праймеров 60С (набор праймеров №1) или 58С (набор праймеров №2) – 20 с, синтез ДНК 60С – 40 c.

Установление наличия того или иного вида осуществлялось по нарастанию флуоресценции соответствующего красителя; микст-инфицированность клещей оценивали по наличию нескольких видов в одном образце.

Таблица 7 – Последовательности праймеров и зондов, использующихся для видовой дифференцировки боррелий и клещей. Видоспецифичные нуклеотидные замены выделены серым цветом.

–  –  –

Для клещей из Томской и Новосибирской областей, а также Приморского края (область симпатрии I. persulcatus и I. pavlovskyi) была проведена видовая дифференцировка клещей путем проведения ПЦР-РВ, в качестве мишени использовался митохондриальный ген первой субъединицы цитохром с оксидазы cox1. Праймеры и зонды приведены в Таблице 7 (набор №3). Условия проведения реакции: 94С – 15 мин; 40 циклов: плавление 94С – 15 с, отжиг праймеров 50С – 20 с, синтез ДНК 60С – 40 c.

–  –  –

Интересующие образцы кДНК, содержащие только один вид боррелий в достаточно высокой концентрации (величина порогового цикла Ct36), были отобраны для проведения мультилокусного сиквенс-типирования. Амплификация восьми фрагментов генома проводилась на амплификаторе Veriti® 60-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, США) со стандартными праймерами [115] в два этапа: сначала были амплифицированы фрагменты генов nifS и clpA, затем, при условии получения ПЦР-продукта, были амплифицированы гены clpX, pepX, pyrG, recG, rplB, uvrA. Для изолятов боррелий использовалась однораундовая ПЦР с внутренними праймерами, в то время как для выявленных в клещах образцов ДНК проводилась гнездная или полугнездная ПЦР согласно методике [115]. Реакционная смесь конечным объемом 25 мкл содержала: ПЦР смесь 1:

H2O – 7,0 мкл; 10 mM dNTPs – 1,0 мкл; прямой праймер (10 пмоль/мкл) – 1,0 мкл;

обратный праймер (10 пмоль/мкл) – 1,0 мкл; ПЦР смесь 2: H2O – 2,0 мкл, 5x буфер – 5,0 мкл, 25 мМ MgCl2 (конечная концентрация 3 мМ) – 3,0 мкл, DiaTaq полимераза (5 ед./мкл) – 0,2 мкл, проба кДНК – 5,0 мкл. Использовался «горячий старт» путем разделения ПЦР смесей 1 и 2 воском (14 мкл).

Условия проведения реакции для первого и второго раунда: 94С – 3 мин; 42 цикла: плавление 94С – 20 с, отжиг праймеров 52С – 20 с, синтез ДНК 72С – 40 c; финальная элонгация 72С – 5 мин.

Контроль накопления продукта реакции производили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Гель визуализировали с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора с использованием видеосистемы Bio-Test DVI.22 (ООО «Компания «Биоком», Москва). Для определения нуклеотидной последовательности ПЦР-продукт был очищен набором «ДНК-сорб-B» (ООО «Интерлабсервис»). Сиквенсная реакция проводилась с использованием набора реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1» (Applied Biosystems, USA), согласно рекомендациям производителя. Секвенирование проводили на ДНКанализаторе ABI PRIZM 310 (Applied Biosystems, USA). Образцы, содержащие смешанные последовательности, были исключены из дальнейшего анализа.

Для 24 образцов параллельно были получены последовательности 5S-23S рРНК межгенного спейсера, согласно общепринятой методике [137].

2.2.6. Секвенирование фрагментов кодирующих генов и 16S-23S IGS В.

miyamotoi Для образцов В. miyamotoi из клещей I. persulcatus были определены нуклеотидные последовательности фрагментов кодирующих генов: 16S рРНК, p66 (кодирует трансмембранный белок массой 66 кДа P66), glpQ, а также 16S-23S межгенного спейсера (Таблица 8). Состав реакционной смеси и условия проведения реакций аналогичны указанным выше (для амплификации генов по методике МЛСТ), за исключением температуры отжига Та (указана в Таблице 8).

–  –  –

Для разработки системы мультилокусного спейсер-анализа было проведено выравнивание полногеномных последовательностей двух штаммов B. miyamotoi:

FR64b (GenBank CP004217) и LB-2001 (CP006647) с помощью NCBI Sequence Viewer 3.4. Межгенные спейсеры были отобраны вручную, согласно аннотации последовательностей. Всего было отобрано восемь спейсеров длиной от 383 до 635 п.н. Праймеры для амплификации были разработаны с помощью программ Vector NTI Advance 11 (Invitrogen) и Primer-BLAST [197]. ПЦР проводилась с помощью амплификатора Veriti® 60-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems,

США) при следующих условиях: начальная денатурация 1 минута 94°C, 42 цикла:

20 сек 94°C, 20 сек 50°C и 40 сек 72°C, финальная элонгация 5 мин 72°C.

Названия спейсеров, их длина и положение на хромосоме (для обоих референсных штаммов), фланкирующие гены, а также последовательности праймеров представлены в Таблице 9.

2.2.8. Филогенетический анализ

Обработку полученных последовательностей проводили с помощью программы SeqScape 2.5.0 (Applied Biosystems, USA). Филогенетический анализ проводился в программе MEGA 6.0 [174], с использованием последовательностей боррелий из баз данных GenBank и Borrelia MLST Database.

2.2.9. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием Statistic Calculator v. 4.0 (StatPac Inc.). Связи между частотами зараженности клещей боррелиями и их отдельными видами в разных регионах анализировали с помощью t-критерия Стьюдента; статистически значимыми считали различия при p0,05. Доверительные интервалы, в том числе приведенные на диаграммах в виде планок погрешностей, были рассчитаны по методу Клоппера-Пирсона в программе Microsoft Office Excel.

–  –  –

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЧАСТОТ

ВСТРЕЧАЕМОСТИ ВИДОВ БОРРЕЛИЙ В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ

РАЗНЫХ РЕГИОНОВ РОССИИ

–  –  –

В настоящей работе была проведена оценка зараженности боррелиями клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и Dermacentor sp., собранных в разных регионах России от Архангельской области до Приморского края (Таблица 10).

Средняя зараженность имаго клещей I. persulcatus составила 40,3% (38,4и статистически не отличалась от зараженности I. pavlovskyi 35,7% (30,6p0,05). Зараженность клещей Dermacentor sp. оказалась минимальной – в среднем 1,25% (0,03-6,8%). Данный факт, вероятно, свидетельствует о низкой эффективности размножения боррелий в клещах данного рода вследствие литической активности гемолимфы клещей Dermacentor sp. в отношении клеток боррелий [97].

–  –  –

Зараженность клещей I. persulcatus на изученных территориях варьировала от 5,3% до 48,2%, достигая минимальных величин в Омской области и Республике Коми. В целом, территориальных закономерностей в изменении общей зараженности боррелиями выявлено не было. Значения зараженности в основном соответствуют ранее представленным в литературе. Так, было показано, что среднемноголетний показатель зараженности клещей боррелиями в Пермском крае составляет около 35-40%, а в отдельных районах (вблизи Перми) может достигать 50-70% [19]. В настоящем исследовании инфицированность клещей в Пермском крае составила 44,3% (37,8-50,9%). Показатель зараженности в Новосибирской области – 48% (37,9-58,2%) – оказался чуть выше определенных ранее величин – от 19% до 46% [27, 49, 69, 110]. Данные по некоторым областям отличались от литературных – например, в Омской области зараженность клещей I. persulcatus боррелиями составляла 23,5% [21], в то время как в настоящей работе она находилась на уровне 5,3% (0,1-26,0%). Наблюдаемые несоответствия могут быть объяснены различиями в чувствительности используемых для детекции боррелий методов и репрезентативности выборки, а также территориальными и экологическими особенностями изучаемых природных очагов.

Помимо одиночных взрослых клещей, собранных с растительности, была проанализирована зараженность пулов клещей I. persulcatus, Dermacentor sp.

, а также одиночных клещей предоставленных людьми, I. persulcatus, обратившимися в Центр гигиены и эпидемиологии по Свердловской области по поводу укуса клеща. Исследования были проведены с 2010 г., результаты представлены в Таблице 11. Средний показатель зараженности пулов клещей в превосходил таковой одиночных клещей (48,2% в 58,7% (56,6-60,8%) Свердловской области) в 1,2 раза. Обращает на себя внимание тот факт, что инфицированность клещей, предоставленных пострадавшими от укуса людьми, – 30,2% (27,2-33,3%) – оказалась достоверно ниже таковой одиночных клещей – 48,2% (45,1-51,2%) (p0,05). Данная закономерность была отмечена ранее в Новосибирской области [49]. Авторами было высказано предположение, что наблюдаемые различия в зараженности могут быть связаны с лизисом клеток спирохет под действием системы комплемента человеческой сыворотки в частично напитавшихся клещах. Так как в исследуемой в настоящей работе выборке также присутствовали клещи, напитавшиеся человеческой крови, мы можем принять эту гипотезу в качестве основной.

–  –  –

Необходимость определения видового состава боррелий в клещах, резервуарных хозяевах и клиническом материале обусловлена тремя причинами:

1) анализ видового состава боррелий в разных источниках может прояснить экологические особенности отдельных видов, 2) определение видового состава в укусившем человека клеще или клиническом материале может повлиять на прогнозы заболевания и стратегию лечения, 3) идентификация одиночных видов боррелий необходима для проведения дальнейшего генетического анализа (секвенирование фрагментов генов либо полных геномов). В настоящей работе была разработана система ПЦР-РВ-дифференцировки встречающихся на территории России четырех видов боррелий, включающая в себя наборы праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов, а также схему и условия проведения реакций ПЦР. Особенно актуальна дифференциальная детекция видов B. garinii и B. bavariensis по причине их генетической близости.

Кривые амплификации, полученные в ходе скрининга образцов клещей с помощью ПЦР-РВ, показаны на Рисунке 11.

Рисунок 11 – Кривые амплификации генов uvrA (B. afzelii, канал ROX, и B. garinii s.l., канал JOE/HEX) и glpQ (B. miyamotoi, канал FAM) при наличии разного числа видов боррелий в образце.

С помощью данной системы было дифференцировано около 90% позитивных образцов. Видовую принадлежность части образцов (в среднем 10%) определить не удалось. Выборочное секвенирование фрагментов генов, включающих участки связывания праймеров и зондов, не показало наличия мутаций, за исключением одного случая (была найдена одна нуклеотидная замена в праймере B_uvrA_R, поэтому в последовательность праймера был включен вырожденный нуклеотид).

Хотя наличие нетипируемых образцов можно объяснить генетическим полиморфизмом и, как следствие, неполной специфичностью используемых праймеров или зондов, однако наиболее вероятной причиной является более низкая чувствительность праймеров для дифференцировки, чем для детекции (праймеры на ген 16S рРНК). Данная ситуация требует дальнейшего исследования и совершенствования системы дифференцировки с целью максимального возможного выявления всех видов.

Показатели зараженности клещей I. persulcatus отдельными видами боррелий представлены в Таблице 12. В среднем по всем регионам, встречаемость B.

miyamotoi оказалась наименьшей – 5,4% (4,5-6,4%) относительно общего числа исследованных клещей, что в целом соответствует величинам, определенным ранее [70, 135]. Единственным регионом, в котором B. miyamotoi доминировала над другими видами и её встречаемость превышала 10%, оказалась Курганская область, где данный показатель составил 21% (13,6-30,0%) относительно общего числа клещей и 75,9% (56,5-89,7%) относительно числа позитивных образцов.

Высокая зараженность клещей B. miyamotoi в Курганской области была отмечена и ранее [135], однако, объяснения этому до сих пор не было найдено.

Низкая встречаемость B. miyamotoi (по сравнению с боррелиями комплекса B. burgdorferi s.l.) в клещах I. persulcatus может быть связана с недавним появлением и распространением этого вида вследствие адаптации к твердым клещам (основные переносчики боррелий группы КВЛ – мягкие аргасовые клещи). В пользу этого предположения свидетельствует и низкий уровень генетического разнообразия B. miyamotoi [135]. В отличие от боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., для B. miyamotoi была показана исключительная роль клещапереносчика – генетические различия наблюдаются между изолятами B.

miyamotoi, выделенными из клещей разных видов, в то время как различий внутри группы изолятов из одного переносчика практически не наблюдается [80, 135].

Среди видов B. burgdorferi s.l. наиболее часто встречалась B. afzelii (от 27 до 66% относительно числа позитивных образцов). Особое внимание обращает на себя соотношение B. bavariensis и B. garinii, ранее рассматриваемых в качестве одного вида, а также территориальные особенности их распределения (Рисунок 12). Было отмечено, что микст-инфекции этих двух видов встречаются крайне редко (в среднем в 2% случаев) (Таблица 12). В европейской части России, Тюменской и Курганской областях, Приморском крае B. bavariensis встречалась достоверно чаще, чем B. garinii, тогда как частоты встречаемости этих видов на Урале и в Новосибирской области достоверно не отличались (Рисунок 12).

Одним из преимуществ ПЦР-РВ является возможность одновременной детекции нескольких мишеней. Было показано, что содержание в клеще нескольких видов боррелий (микст-инфекция) является часто встречающимся явлением (в среднем 18,2% (15,7-20,8%) от числа зараженных боррелиями клещей I. persulcatus микст-инфицированы). Анализ частот встречаемости ассоциаций боррелий в клещах может дать ключ к пониманию экологических особенностей отдельных видов и характера их взаимоотношений в организме переносчика. В ходе исследования было показано, что микст-инфекции B. bavariensis и B. garinii встречаются крайне редко – в среднем 2,2% (1,4-3,4%), а микст-инфекции B.

bavariensis и B. afzelii, напротив, достоверно чаще – 8,6% (6,8-10,6%) (p0,05), что может быть объяснено особенностями экологии этих видов. Известно, что B.

bavariensis (как и B. afzelii) использует в качестве основного резервуарного хозяина мелких млекопитающих, тогда как B. garinii – птиц [103, 116].

Наши результаты согласуются с исследованиями, проведенными ранее и показавшими, что B. garinii подгрупп NT29 (сейчас B. bavariensis) и 20047 (B.

garinii s.s.) практически не встречаются одновременно в клещах, при этом в образцах мелких млекопитающих и клещей ДНК B. afzelii выявляется только в сочетании с ДНК B. garinii подгруппы NT29 [27].

Одной из важнейших задач настоящей работы стала оценка информативности системы видовой дифференцировки для обнаружения одиночных видов боррелий для последующего типирования изолятов с помощью методики МЛСТ [115]. Для этого 118 образцов, в которых метод ПЦР-РВ выявил наличие только одного вида боррелий, были типированы методом МЛСТ.

Последующее секвенирование показало, что 2 образца содержали смесь видов (1

– B. afzelii+B. bavariensis, 1 – B. bavariensis+B. garinii), один из которых не детектировался предложенной системой ПЦР-РВ. В 22 образцах содержались смеси двух внутривидовых генетических вариантов. Для остальных 94 образцов были получены «чистые» последовательности восьми генов. При этом не было Таблица 12 – Встречаемость видов Borrelia sp. и смешанных (микст) инфекций

–  –  –

Рисунок 12 – Соотношение B. garinii и B. bavariensis в разных регионах России. Частота встречаемости каждого вида указана относительно числа позитивных образцов.

зарегистрировано ни одного случая несовпадения определения вида по результатам ПЦР-РВ и филогенетического анализа.

Таким образом, было показано, что разработанная система дифференцировки позволяет эффективно и специфично определять видовую принадлежность боррелий в природных образцах.

3.3. Соотношение видов боррелий в зоне симпатрии клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi Ранее было доказано, что I. pavlovskyi является компетентным хозяином для боррелий [100]. Данный вид сходен с I. persulcatus генетически, морфологически и экологически. Он имеет дизъюнктивный ареал (Западная Сибирь и Дальний Восток, Рисунок 12) и обитает в тех же биотопах, что и I. persulcatus. Однако, в отличие от I. persulcatus, взрослые особи I. pavlovskyi чаще используют в качестве хозяев птиц, а не мелких млекопитающих [25]. Определенная в настоящем исследовании зараженность и боррелиями I. persulcatus I. pavlovskyi статистически не отличалась (Таблица 12). На сегодняшний день имеется недостаточно данных относительно видового состава боррелий, встречающихся в клещах I. pavlovskyi. В работе Коренберга Э.И. с соавторами было показано, что в I. pavlovskyi могут быть обнаружены B. garinii 20047 и ChY13p (B. garinii s.s.), B.

garinii NT29 (B. bavariensis) и B. afzelii, т.е. практически те же виды, что и в I.

persulcatus (наличие B. miyamotoi в указанной работе не исследовалось) [100]. При этом было отмечено, что B. garinii NT29, вероятно, ассоциирована с клещами I.

В настоящем исследовании данное предположение было persulcatus.

подтверждено: в клещах I. persulcatus в Томской области, как и в большинстве регионов, преобладала B. bavariensis (B. bavariensis – 50,4% (44,6-58,0%), B.

garinii – 8,8% (5,5-13,3%)), а в клещах I. pavlovskyi – B. garinii (B. garinii – 48% (38,9-57,2%), B. bavariensis – 12,2% (7,0-19,3%)) (Рисунок 12). При этом результаты по разным населенным пунктам, полученные в 2013 и 2014 гг., отличались: в 2013 году в клещах I. pavlovskyi (собраны в окрестностях населенных пунктов Лоскутово, Богашево, Тимирязевское) был обнаружен исключительно вид B. garinii (Таблица 12). Однако, в 2014 году в популяции I.

pavlovskyi из других мест в окрестностях того же города Томск (с. Коларово, д.

Казанка) были детектированы все четыре вида боррелий. Встречаемость B.

miyamotoi в двух видах клещей статистически не отличалась – данный вид детектировался с частотой 6,3% (4,3-8,9%) в I. persulcatus и 4,1% (2,2-6,7%) в I.

pavlovskyi (в среднем за 2013-2014 гг.) (p0,05). В то же время B. afzelii достоверно чаще обнаруживалась в I. persulcatus – 16,7% (13,5-20,4%) против 9% (6,2-12,5%) в I. pavlovskyi (p0,05).

Преобладание B. garinii над B. bavariensis в клещах I. pavlovskyi может быть частично объяснено тем фактом, что взрослые особи I. pavlovskyi чаще питаются на птицах, являющихся основным резервуарным хозяином вида B.garinii s.s.

Однако, для исключения эффекта выборки и подтверждения связи B. garinii с клещами I. pavlovskyi требуются дальнейшие исследования.

Предложенная система дифференцировки позволяет по-новому оценить видовой состав боррелий, циркулирующих в природных очагах, и частоту микстинфекций. Кроме того, она показала эффективность в выделении одиночных видов для последующего проведения генетических исследований (в частности, МЛСТ). В перспективе предполагается адаптировать предложенную систему для определения видов боррелий в клиническом материале.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ПОПУЛЯЦИЙ B. BURGDOREFERI S.L. НА ОСНОВЕ МЛСТ

–  –  –

За период 2011-2014 гг. было получено и проанализировано методом МЛСТ 105 объединенных последовательностей восьми генов домашнего хозяйства B.

burgdorferi s.l. (общая длина 4785 п.н., у 17 образцов была обнаружена делеция в 3 п.н. в гене clpX). Изоляты и образцы ДНК боррелий были выделены в нескольких регионах России – от Санкт-Петербурга до Владивостока (Таблица 13). В дальнейшем изоляты и образцы ДНК будут обозначаться как «изоляты» для краткости. Общее число сиквенс-типов из России, включая три ранее выявленные японскими учеными (ST86, ST373 и ST374), составило 108, что позволяет составить представление о генетической структуре популяций боррелий на территории страны. Типированные изоляты принадлежали трем видам боррелий – B. afzelii (29 изолятов), B. garinii (41) и недавно предложенному виду B.

bavariensis (35). При этом был выявлен 51 сиквенс-тип, не представленный в базе Borrelia MLST (ST431-446 и ST593-627). Последовательности 34 изолятов относились к восьми установленным сиквенс-типам: ST128 (Китай, Монголия, Япония), ST154 (Китай), ST244 (Англия, Германия), ST328 (Монголия, Китай), ST364 (Япония), ST366 (Япония), ST372 (Япония) и ST374 (Россия, Московская область) (Таблица 13).

–  –  –

Ранее было показано, что B. garinii является крайне неоднородной группой, в которой сначала выделяли пять серотипов (3-7) [193], а затем три геногруппы (20047, NT29 и СhY13p) на основе метода ПЦР-ПДРФ [110, 127]. В 2009 году, после разработки метода МЛСТ для типирования боррелий, серотип 4 был выделен в отдельный вид B. bavariensis [116]. Естественно, в связи с введением новой классификации встал вопрос о соответствии геногрупп и видов боррелий. В частности, в России B. bavariensis не фигурирует в научных публикациях. Хотя статус этого вида еще недавно обсуждался в литературе [129], с 2013 года он представлен в базе данных NCBI Taxonomy и LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) в качестве самостоятельного вида [120]. Анализ сиквенс-типов боррелий из Азии позволил установить, что многие из них филогенетически ближе к B. bavariensis, чем к собственно B. garinii. Так, в 2011 г.

Takano A. с соавторами были выделены две группы сиквенс-типов B. garinii – A и B, причем ко второй группе относились как типовой штамм B. bavariensis PBi, так и азиатские изоляты [171]. В 2012 году Margos G. с соавторами было установлено, что к виду B. bavariensis, по-видимому, должны быть отнесены не только PBiподобные штаммы, но и все штаммы группы NT29 [119]. Причем формирование двух подгрупп в пределах B. bavariensis можно объяснить специализацией к разным переносчикам: PBi-подобные штаммы были обнаружен только в Европе и переносятся I. ricinus, в то время как боррелии группы NT29 распространены в Азии и переносятся преимущественно I. persulcatus [119].

Для окончательного решения вопроса о соответствии групп боррелий, выявляемых на основе МЛСТ и анализа 5S-23S рРНК межгенного спейсера, было исследовано 24 изолята согласно обеим методикам. В анализ были включены также последовательности референсных штаммов. На Рисунке 13 представлены филогенетические деревья, построенные на основе последовательностей межгенного спейсера и сиквенс-типов. Сравнительный анализ показывает, что общая топология деревьев сохраняется при использовании разных подходов, при этом МЛСТ является более надежным методом с точки зрения статистической поддержки и дает большие значения бутстрепа (Рисунок 13). В целом, выделяемые ранее геногруппы соответствуют видам по новой классификации:

20047 – B. garinii, а NT29 – B. bavariensis. Наиболее значимым различием в топологии является положение геногруппы B. garinii ChY13p, которая хотя и характеризуется особым профилем рестрикционных фрагментов, сближающим эту группу с B. afzelii [110], при анализе консервативных генов домашнего хозяйства была отнесена к виду B. garinii (Рисунок 13).

Рисунок 13 – Сравнение филогенетических деревьев, построенных на основе 5SS рРНК межгенного спейсера (A) и сиквенс-типов (B) методом Neighbor-joining, бутстреп 500 реплик, вставки/делеции были удалены при попарном сравнении последовательностей. Образцы отмечены значками в соответствии с видами (определены по МЛСТ). Жирным шрифтом выделены названия референсных штаммов (ввиду отсутствия ST для штамма ChY13p для анализа был использован ST штамма N161, принадлежащего той же группе). Последовательности B. burgdorferi s.s. B31 используются в качестве внешней группы.

Так как геномная группа NT29 соответствует B. bavariensis, то используя результаты ПЦР-ПДРФ (новые и накопленные ранее), можно оценить территориальное распределение и встречаемость «нового» вида, что позволит внести ясность в филогенетические исследования и лучшим образом классифицировать различные группы боррелий, известные под названием B.

garinii. Например, исследование 227 изолятов B. garinii, выделенных на территории 16 регионов России (от Калининграда до Сахалина) и исследованных методом ПЦР-ПДРФ показало, что 117 (51,6%) относились к группе 20047 (B.

garinii); 108 (47,5%) – к подгруппе NT29 (B. bavariensis); 2 (0,9%) – к подгруппе ChY13p [127]. Таким образом, виды B. garinii и B. bavariensis в России встречаются почти в равном соотношении, причем последний вид был обнаружен на всей территории России почти с самого начала исследований возбудителей ИКБ [138].

Аналогичная ситуация наблюдается и для группы B. afzelii NT28, последовательность IGS которой имеет общие признаки как с B. afzelii, так и с B.

garinii [106]. Несмотря на то, что анализ последовательностей IGS позволяет считать группы B. afzelii NT28 и B. garinii ChY13p промежуточными формами между этими двумя видами (Рисунок 3), данные МЛСТ не поддерживают эту гипотезу. Таким образом, можно предполагать, что изменения последовательности IGS не отражают реальных процессов эволюции боррелий и не могут являться единственным критерием для выделения геномных групп.

Вопрос о причинах возникновения и сохранения специфических мутаций в IGS и возможность рекомбинации требует дальнейшего изучения.

4.2. Филогеографическая структура B. afzelii

Для того, чтобы выявить филогеографические особенности популяций боррелий на территории России, для каждого вида были построены филогенетические деревья и проанализировано географическое распределение сиквенс-типов. Наиболее выраженной оказалась генетическая структура B. afzelii.

Все последовательности изолятов этого вида из России были получены впервые и не совпадали ни с одним ранее известным сиквенс-типом. Было выявлено четкое разделение сиквенс-типов на европейские и азиатские (Рисунок 14). В группе сиквенс-типов из Западной Европы встретились два сиквенс-типа, выделенные в Китае, и, вероятно, попавшие туда в результате заноса (ST105 и ST133). Все сиквенс-типы, выделенные в России (за исключением ST599, Кировская область), формировали обособленную группу на филогенетическом древе. Данная группа делилась на две: одна объединяла сиквенс-типы из Приморского края, Китая и Японии, вторая – из европейской части страны, Урала и Сибири, а также один ST из Приморского края. Сиквенс-типы ST432, ST593, ST595, ST606 и ST609, выделенные на территории Урала, значительно отличались от основной группы (Рисунок 14). В целом, все изоляты, выделенные на территории России, оказались филогенетически ближе к азиатским популяциям боррелий, чем к европейским.

Изоляты B. afzelii из европейской части страны, Урала и Сибири не формировали обособленных групп, что свидетельствует о возможности их перемещения между разными регионами. Тем не менее, четкая филогеографическая структура наблюдается на уровне крупных регионов – Европы, России, Азиатских стран.

Наблюдаемая генетическая структура B. afzelii в какой-то степени может объясняться преимущественной ассоциацией этого вида с мелкими млекопитающими, обладающими относительно небольшой подвижностью (в сравнении с птицами).

Рисунок 14 – Филогенетическое древо, построенное на основе конкатенированных последовательностей фрагментов генов домашнего хозяйства B. afzelii. Для построения использованы сиквенс-типы из международной базы данных и полученные в настоящем исследовании. Деревья построены методом Neighbor-joining. Цветом и значками обозначены сиквенс-типы, выделенные на территории разных регионов России, а также азиатские и европейские сиквенс-типы. Сиквенс-типы, обсуждаемые в тексте, выделены жирным шрифтом.

Так, ранее было показано, что для B. afzelii характерна клональная структура и географическая приуроченность сиквенс-типов [91, 118, 183]. Также было высказано предположение, что популяционная структура B. afzelii в Западной Европе обусловлена особенностями распространения грызунов как основных резервуарных хозяев после окончания последнего ледникового периода [184].

Интересно, что изоляты, недавно выделенные на территории Норвегии, обладают сиквенс-типами, очень сильно отличающимися от большинства европейских ST [178], что расширяет представления о генетической изменчивости B. afzelii.

Изоляты B. afzelii, для которых параллельно было проведено секвенирование 5S-23S рРНК межгенного спейсера, относились преимущественно к группе VS461. В единственном случае (Prm7050-2012, ST442) среди изолятов B. afzelii встретилась последовательность группы NT28, первоначально выделенная на основе анализа профилей рестрикции 5S-23S рРНК IGS [122]. Так как на настоящий момент ни одного образца B. afzelii из этой группы еще не было типировано по схеме МЛСТ, провести полноценный анализ не представляется возможным. Несмотря на специфическую структуру спейсера 5S-23S рРНК IGS боррелий B. afzelii NT28, можно утверждать, что на уровне консервативных генов различия между группами VS461 и NT28 минимальны.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«ПЛОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА ИНДИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ Специальность: 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Шестакова Вера Владимировна МОРФО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS MILL. К КОККОМИКОЗУ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ТУНЁВ ВИТАЛИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ПРОМЫСЕЛ ПЕЛЯДИ Coregonus peled (Gmelin, 1789) ТАЗОВСКОГО БАССЕЙНА Специальность 03.02.08 – экология (биология) 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«Жукова Дарья Григорьевна ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ У БОЛЬНЫХ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В УСЛОВИЯХ МНОГОПРОФИЛЬНОГО СТАЦИОНАРА 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.