WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б.Н. ЕЛЬЦИНА

На правах рукописи

Мухачева Татьяна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В

ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Ковалев Сергей Юрьевич, кандидат биологических наук Екатеринбург - 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности биологии и экологии боррелий

1.1.1. Систематическое положение. Видовое разнообразие

1.1.2. Морфология, особенности биологии

1.1.3. Организация генома

1.1.4. Экологические особенности

1.2. Боррелии как возбудители иксодового клещевого боррелиоза

1.3. Географическое распространение B. burgdorferi s.l.

1.4. Методы установления видовой принадлежности B. burgdorferi s.l.............. 22

1.5. Изучение внутривидового разнообразия B. burgdorferi s.l.

1.5.1. Анализ последовательностей межгенных спейсеров

1.5.2. Анализ последовательностей генов поверхностных белков................ 29 1.5.3. Мультилокусное сиквенс-типирование на основе секвенирования генов домашнего хозяйства

1.5.4. Мультилокусный спейсер-анализ

1.6. Изучение боррелий и их распространение на территории России............... 35

1.7. Особенности филогеографии и экологии B. miyamotoi

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот

2.2.2. Определение наличия ДНК боррелий в образцах

2.2.3. Определение видовой принадлежности боррелий

2.2.4. Определение видовой принадлежности клещей

2.2.5. Мультилокусное сиквенс-типирование боррелий комплекса В.

burgdorferi s.l

2.2.6. Секвенирование фрагментов кодирующих генов и 16S-23S IGS В.

miyamotoi

2.2.7. Мультилокусный спейсер-анализ В. miyamotoi

2.2.8. Филогенетический анализ

2.2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЧАСТОТ

ВСТРЕЧАЕМОСТИ ВИДОВ БОРРЕЛИЙ В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ

РАЗНЫХ РЕГИОНОВ РОССИИ

3.1. Частота встречаемости боррелий в клещах

3.2. Видовой состав и соотношение видов боррелий

3.3. Соотношение видов боррелий в зоне симпатрии клещей I. persulcatus и I.

pavlovskyi

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ПОПУЛЯЦИЙ B. BURGDOREFERI S.L. НА ОСНОВЕ МЛСТ

4.1. Сравнение результатов МЛСТ и анализа 5S-23S рРНК межгенного спейсера

4.2. Филогеографическая структура B. afzelii

4.3. Филогеографическая структура B. bavariensis

4.4. Филогеографическая структура B. garinii

4.5. Особенности и ограничения метода МЛСТ

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ПОПУЛЯЦИЙ В. MIYAMOTOI

5.1. Анализ последовательностей фрагментов кодирующих генов и 16S-23S IGS В. miyamotoi

5.2. Разработка методики мультилокусного спейсер-анализа (МЛСА).............. 83

5.3. Применение методики МЛСА для анализа популяций B. miyamotoi........... 83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Боррелии комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato являются возбудителями иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) – мультисистемного природноочагового заболевания, регистрируемого на территории 72 субъектов Российской Федерации с ежегодной заболеваемостью от 6,4 до 9,9 тысяч случаев [30].

Было установлено, что повсеместное распространение и преимущественное эпидемическое значение в России имеют виды B. garinii и B. afzelii, а также недавно обнаруженный вид B. miyamotoi. В 2009 году один из серотипов B. garinii было предложено рассматривать в качестве отдельного вида B. bavariensis на основе данных мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) [116]. Было показано, что метод МЛСТ обладает высокой информативностью и может быть применен как для изучения эволюции боррелий в целом, так и для выявления филогенетических линий, отличающихся повышенной патогенностью для человека [89, 115, 118]. Однако, на момент начала настоящего исследования в международную базу данных МЛСТ были депонированы последовательности только трех изолятов из России. Иностранными исследователями подчеркивалось, что изучение изолятов с территории нашей страны – ключевой пункт в понимании эволюции и распространения боррелий по территории Евразии [118].

Кроме того, в связи с изменением классификации боррелий необходимым было проведение сравнительных исследований с использованием традиционных и новых генетических маркеров для уточнения таксономического статуса геногрупп внутри видов B. garinii и B. afzelii [13], а также их соотношения в разных регионах. Молекулярно-генетический анализ B. miyamotoi на территории России выявил отсутствие генетической изменчивости данного вида, что обусловило необходимость разработки новой системы генотипирования, основанной на вариабельных генетических маркерах.

Степень разработанности темы исследования Идентификация первых российских изолятов B. burgdorferi s.l., полученных в 1987-1989 гг., была проведена с использованием моноклональных антител [14]. В дальнейшем для дифференциальной диагностики видов боррелий широко использовался метод ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР) 5S-23S рРНК межгенного спейсера. Этот подход позволил выделить внутри вида B. garinii три геногруппы, характеризующиеся разными профилями рестрикционных фрагментов: 20047, NT29 и СhY13p. Было установлено, что в клещах Ixodes persulcatus чаще встречается геногруппа B.

garinii NT29, а в I. pavlovskyi и I. ricinus – геногруппа 20047. Был также проведен детальный филогенетический анализ B. garinii и B. afzelii, выполненный на основе данного межгенного спейсера [12, 127]. Однако, выделение филогенетических групп на основе лишь анализа профилей рестрикции и (или) последовательностей 5S-23S рРНК спейсера (длиной около 250 п.н.) обязательно должно быть подтверждено исследованиями других генетических маркеров. В 2008 г.

появились данные об обнаружении B. miyamotoi на территории России [69]. В 2011 году российскими учеными впервые было показано, что данный вид является патогенным для человека [135]. Для изолятов B. miyamotoi, выделенных из одного вида клещей, был показан крайне низкий уровень генетической изменчивости или её отсутствие [51, 57, 58, 71, 80, 172]. В частности, изоляты B.

miyamotoi азиатского типа, выделенные на территории России от Балтийского моря до Дальнего Востока, обладали идентичными последовательностями по таким широко используемым генетическим маркерам, как гены 16S рРНК, флагеллина, белков P66 и GlpQ [70, 71, 135].

–  –  –

Задачи исследования

1. Установить спонтанную зараженность боррелиями клещей I. persulcatus, I.

pavlovskyi и Dermacentor sp., собранных с растительности и от населения в разных регионах России.

2. Разработать систему определения видовой принадлежности боррелий на основе видоспецифичной ПЦР в реальном времени и установить соотношение B.

afzelii, B. bavariensis, B. garinii и B. miyamotoi в клещах, собранных в разных регионах.

3. Установить филогеографическую структуру боррелий B. afzelii, B.

bavariensis и B. garinii на основе мультилокусного сиквенс-типирования.

4. Разработать систему мультилокусного спейсер-анализа для выявления генетической изменчивости B. miyamotoi и применить её для образцов B.

miyamotoi азиатского типа, выделенных на территории России.

Научная новизна работы В настоящей работе впервые была разработана система дифференцировки видов боррелий, циркулирующих в природных очагах на территории России, на основе ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами TaqMan, что дает возможность оценить не только видовой состав, но количественное содержание каждого вида в образце. Впервые данная система была применена для анализа большой выборки клещей из разных регионов страны, что позволило показать ассоциацию B. garinii с клещами I. pavlovskyi в Томской области.

Впервые было проведено исследование популяций боррелий B. afzelii, B.

bavariensis и B. garinii, циркулирующих в природных очагах России, с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (105 изолятов и образцов ДНК);

выявлен 51 сиквенс-тип, не представленный в базе данных Borrelia MLST Database (ST431-446 и ST593-627). Показано, что российские изоляты B. afzelii формируют обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

Впервые была разработана система мультилокусного спейсер-анализа, которая может быть применена для исследования всех типов B. miyamotoi.

Впервые высказана гипотеза о крайне низком генетическом разнообразии азиатского типа и его клональном распространении по территории Евразии, а также показано, что в популяциях клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi циркулирует один и тот же генетический вариант B. miyamotoi.

Теоретическая и практическая значимость работы Данные, полученные в настоящей работе, позволяют охарактеризовать генетическую структуру видов боррелий, встречающихся на территории России, с точки зрения новых подходов к изучению генетического разнообразия микроорганизмов, основную роль среди которых играет мультилокусное сиквенстипирование. Предложенная в настоящей работе система видовой дифференцировки позволяет быстро и эффективно определить видовую принадлежность изолятов и может быть использована другими исследователями, в том числе для исследования клинических образцов. Применение метода мультилокусного сиквенс-типирования позволило пополнить международную базу данными о 105 российских изолятах и провести сравнительный анализ с изолятами из других стран по стандартизованной схеме. Разработанная в настоящей работе система мультилокусного спейсер-анализа B. miyamotoi может быть использована зарубежными исследователями для выявления генетической изменчивости данного вида в других странах. Полученные в настоящей работе последовательности были депонированы в общедоступные базы данных NCBI (435 последовательностей) и GenBank Borrelia MLST Database (последовательности восьми генов 105 изолятов и образцов ДНК).

Материалы, полученные в ходе настоящей работы, использовались при подготовке курса «Биоинформатика», преподаваемом студентам департамента «Биологический факультет» Уральского федерального университета.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Недавно предложенный вид B. bavariensis соответствует геногруппе NT29 B. garinii и встречается в клещах I. persulcatus чаще или с той же частотой, что и B. garinii (объединяет геногруппы 20047 и ChY13p). Напротив, в клещах I.

pavlovskyi преобладает B. garinii.

2. Все российские сиквенс-типы B. afzelii были выявлены впервые, большая часть из них формирует обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

3. Филогеографическая структура B. bavariensis и B. garinii характеризуется высоким генетическим разнообразием и неоднородным географическим распределением сиквенс-типов.

4. Азиатский тип B. miyamotoi отличается крайне низкой генетической изменчивостью как на уровне кодирующих генов, так и на уровне некодирующих межгенных спейсеров, что может свидетельствовать о быстром клональном распространении B. miyamotoi по территории Евразии.

Апробация работы и публикации Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: 14-15 апреля 2010 г., г. Екатеринбург: 65-ая Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 1-2 ноября 2011г., г. Омск: Всероссийская конференция с международным участием «Современные аспекты природной очаговости болезней»; 11-12 апреля 2012 г., г. Екатеринбург: 67-ая Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 26-29 июня 2012 г., г. Иркутск: международная научная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами»; 1-5 октября 2012 г., г. Екатеринбург: II Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации»; 15-19 апреля 2013 г., г. Екатеринбург:

Всероссийская конференция молодых учёных «Экология: теория и практика»; 5-7 июня 2013 г., г. Санкт-Петербург: международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций»; 8-10 октября 2013 г., г. Москва:

российская конференция с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита»; 11-13 ноября 2014 г., г. Омск: научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней».

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в зарубежных журналах, входящих в международную систему научного цитирования Web of Science и рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации Текст диссертации изложен на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 22 рисунками. Список литературы содержит 201 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора

Работа была частично поддержана грантами РФФИ: № 10-04-96062_урал «Происхождение, распространение и эволюция вируса клещевого энцефалита на Среднем Урале и прилегающих территориях»; № 12-04-31263_мол_а «Генетическая изменчивость популяций таежного клеща и ее связь с эволюцией возбудителя клещевого энцефалита»; № 13-04-96045_урал «Унификация исследований генетического разнообразия возбудителей клещевых инфекций как основа мониторинга природных очагов Среднего Урала». Часть работ была выполнена в рамках проведения НИР базовой части государственного задания «Биоразнообразие природных и трансформированных экосистем и технологии его поддержания и восстановления» № 2014/2485. Продолжение работы планируется проводить в рамках международного проекта «Acceleration of adaptive evolution to vector or host environments by genomic recombination in tick-borne bacteria» под руководством Dr. Volker Fingerle (Bavarian Health and Food Safety Authority, Германия).

Основные результаты получены лично автором. Выделение генетического материала, постановка реакций ПЦР, обсуждение результатов и частично планирование экспериментов проводилось совместно с сотрудниками и студентами лаборатории молекулярной генетики Уральского федерального университета. Сбор материала осуществлялся как автором, так и привлеченными людьми. Присвоение номеров аллелей и сиквенс-типов осуществлялось куратором базы данных Borrelia MLST Database Gabriel Margos (Bavarian Health and Food Safety Authority, Германия).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

1.1.1. Систематическое положение. Видовое разнообразие Боррелии принадлежат царству типу классу Bacteria, Spirochaetes, Spirochaetia, порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Borrelia Swellengrebel 1907 (NCBI Taxonomy ID 138).

В настоящее время выделяют 36 видов боррелий, которые объединяются в три несистематические группы: 1) группа иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) или болезни Лайма, представители которой вследствие высокого фенотипического и генетического сходства объединены в комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato; 2) группа клещевых возвратных лихорадок (КВЛ), преимущественно ассоциированная с аргасовыми клещами (B. duttoni, B. parkeri, B. turicatae, B. hermsii и др.), но включающая также B. recurrentis, переносчиком которой являются вши, и три вида, встречающиеся в иксодовых клещах (B.

miyamotoi, B. lonestari и B. theileri); 3) недавно описанная группа боррелий, связанных с рептилиями, включающая в себя вид и ряд B. turcica неохарактеризованных видов [76]. Следует отметить, что систематика боррелий на уровне вида (часто обозначаемого «геновид», поскольку виды выделяются на основе анализа генетических свойств) подвергается постоянному уточнению, в результате чего список видов регулярно пополняется новыми. В настоящее время внутри комплекса B. burgdorferi s.l. выделяют по меньшей мере 19 видов, 9 из которых были описаны после 2005 года (Таблица 1) [76, 118].

–  –  –

Боррелии – подвижные микроаэрофильные бактерии спиралевидной формы, окрашивающиеся анилиновыми красителями. Клетки разных видов боррелий варьируют по длине, диаметру, плотности витков спирали, их регулярности и количеству периплазматических фибрилл (жгутиков). Длина клетки варьирует от 8 мкм (B. coriaceae) до 20-30 мкм (B. burgdorferi), а ширина – от 0,2 мкм (B.

burgdorferi) до 0,5 мкм (B. recurrentis и B. persica). Размеры клеток могут зависеть от возраста культуры (как правило, в стационарной фазе клетки удлиняются) и состава питательной среды [40].

Таблица 1 – Эколого-географическая характеристика видов комплекса B. burgdorferi s.l.

Названия видов, обладающих доказанной или вероятной патогенностью для человека, выделены серым цветом [76].

–  –  –

Представители рода Borrelia исторически считаются грамотрицательными из-за наличия двойной клеточной мембраны, однако её строение отличается от такового типичных грамотрицательных бактерий. В частности, в составе внешней мембраны B. burgdorferi не были обнаружены липополисахариды [173]. Кроме этого, внешняя мембрана Borrelia sp. обладает значительно большей текучестью, имеет меньшую плотность транспортных белков и легко растворяется в слабых растворах поверхностно-активных веществ [142, 187]. Наиболее изученными белками наружной мембраны являются белки семейства Osp (outer surface protein): OspA, OspB (кодируются линейной плазмидой lp54) и OspC (кодируется кольцевой плазмидой cp26).

Движение клеток осуществляется благодаря ассиметричному ротационному вращению субтерминально и биполярно прикрепленных периплазматических фибрилл (Рисунок 1). Количество фибрилл варьирует от 3 до 20 и зависит от вида и условий культивирования.

Рисунок 1 – Электронная микрофотография негативно окрашенной клетки B.

burgdorferi. Стрелками указаны точки прикрепления семи периплазматических фибрилл [40].

Боррелии – хемоорганотрофы, основным источником энергии для которых является глюкоза, а конечным продуктом обмена при этом является молочная кислота. В качестве альтернативных источников углерода могут также использоваться глицерин, фруктоза и мальтоза. Кроме того, боррелии способны к утилизации N-ацетилглюкозамина и, соответственно, хитина, что позволяет им длительно существовать в пищеварительном тракте клеща между актами его питания. Как и многие паразитические организмы, боррелии утратили гены ряда ферментов основного обмена, в частности белков цикла Кребса, окислительного фосфорилирования, электрон-транспортной цепи, -окисления жирных кислот, синтеза множества ферментов и, следовательно, имеют относительно низкий уровень метаболизма, что объясняет низкие темпы роста (12-30 часов между делениями) и высокую требовательность к составу питательной среды [77].

Многолетние попытки получения культур in vitro привели к созданию среды для культивирования, современная версия которой носит название BarbourStoenner-Kelly II (BSK-II) по имени авторов, внесших вклад в её разработку [39].

При температуре культивирования 33°C такая среда может (30-37°C) обеспечивать рост культур как B. burgdorferi, так и B. hermsii. Однако, некоторые виды боррелий (в частности, B. miyamotoi) не удавалось культивировать в среде BSK-II [45, 95]. В 2014 году появилось три публикации, предлагающие модификации среды BSK и модифицированной среды Kelly-Pettenkofer (MKP), способные поддерживать рост B. miyamotoi [121, 172, 186].

1.1.3. Организация генома

Геном видов рода Borrelia состоит из одной линейной хромосомы с ковалентно замкнутыми концами, длиной около 900 тысяч п.н., и многочисленных плазмид – как кольцевых, так и линейных, размером от 5 до 220 т.п.н. (общий размер около 600 т.п.н.) [41, 42, 93, 142]. В настоящее время полногеномные последовательности получены для семи видов боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. и одиннадцати видов группы КВЛ. Хромосома типового штамма B. burgdorferi B31 (номер доступа GenBank NC_001318) содержит 860 генов (797 из которых кодируют белки) и 26 псевдогенов.

Хромосомы, которые несут большую часть генов домашнего хозяйства, относительно постоянны по составу и расположению генов внутри рода, тогда как генетическая информация, содержащаяся в плазмидах, более вариабельна. Геном B. burgdorferi B31 включает 12 линейных и 9 кольцевых плазмид, однако, их количество варьирует в зависимости от вида и может уменьшаться в процессе культивирования [142]. Функции большинства плазмидных генов до сих пор не изучены, однако известно, что некоторые из них обусловливают синтез различных липопротеинов, поринов, декорин-связывающих белков и т. д.

Организация генов рРНК боррелий заслуживает особого внимания. Так, боррелии комплекса B. burgdorferi s.l. обладают одной копией 16S рРНК и двумя копиями каждого из генов 23S рРНК и 5S рРНК, все гены расположены внутри участка хромосомы длиной около 10 т.п.н. [161]. Гены 23S рРНК (rrlA и rrlB) и 5S рРНК (rrfA и rrfB) тандемно повторяются в порядке 23S-5S-23S-5S и не связаны с геном 16S рРНК (rrs), расположенным на расстоянии около 2 т.п.н. Отдельные копии 23S-5S повторов разделены спейсером (5S-23S рРНК intergenic spacer, IGS) длиной около 180 п.н. Внутри 23S-5S повтора последовательности 23S и 5S рРНК разделены спейсером длиной 22 п.н. В геноме боррелий группы КВЛ имеется только одна копия каждого гена рРНК [161].

1.1.4. Экологические особенности

Боррелии – единственные спирохеты, для поддержания и передачи которых необходимы членистоногие переносчики (в большинстве случаев ими являются разные виды клещей). Необходимость размножения как в холоднокровных (клещ), так и в теплокровных (птицы, млекопитающие) хозяевах привела к появлению ряда экологических особенностей, отсутствующих у других спирохет.

Инфицированные боррелиями клещи в процессе питания через слюну заражают животных, а неинфицированные клещи получают возбудителей от животных, в крови которых циркулируют боррелии [9, 43]. Возбудители, клещипереносчики и популяции позвоночных животных, поддерживающие их существование, образуют трехчленные паразитарные системы, характеризующиеся разветвленными связями между всеми составляющими [16, 17]. Прокормителями иксодовых клещей в природных очагах могут выступать не менее 300 видов позвоночных, из них около 100 видов мелких млекопитающих (мыши, полевки крысы, белки, зайцы, ежи и др.) и более 170 видов птиц (преобладают птицы, гнездящиеся на земле) [26, 76, 177]. Несмотря на значительное число видов теплокровных хозяев, только некоторые из них способны эффективно поддерживать размножение и жизнедеятельность боррелий, а также обеспечивать их передачу клещу в процессе его питания.

Восприимчивость хозяев к боррелиям во многом определяется наличием в их крови специфических белков – компонентов системы комплемента, обладающих бактерицидной активностью. Так как активация системы комплемента неспецифична и происходит в кишечнике клеща (куда попадает кровь в процессе питания), спирохеты могут подвергнуться лизису еще до попадания в организм хозяина. Таким образом, взаимодействие с системой комплемента позвоночного хозяина может оказывать большое влияние на циркуляцию боррелий в природных очагах, определяя круг потенциальных хозяев [177]. Например, было показано, что B. afzelii и B. garinii 4 серотипа (сейчас B. bavariensis) чувствительны к сыворотке птиц, в то время как B. garinii других серотипов к ней устойчива, но погибает под действием сыворотки грызунов [103] (Рисунок 2). Однако, данные ассоциации с переносчиками, хотя и были показаны экспериментально, не могут рассматриваться как абсолютные, поскольку в ряде публикаций была показана возможность нахождения видов боррелий в «нетипичных» хозяевах [11, 13, 75].

Вероятно, большую роль в распространении боррелий играют перелетные птицы, так как они не только являются резервуарными хозяевами для таких видов как B. burgdorferi, B. garinii, B. valaisiana, но и распространяют инфицированных клещей на большие расстояния. Было показано, что в организме некоторых видов птиц латентная инфекция может активироваться при ослаблении иммунной системы, что может объяснять распространение спирохет в том случае, если время перелета птиц превышает время питания клещей [62, 87].

Боррелии комплекса B. burgdorferi s.l. используют в качестве переносчиков твердых клещей рода Ixodes, при этом основную роль играют четыре вида клещей комплекса I. ricinus: I. ricinus L. (Европа), I. persulcatus Schulze (Азия), I.

scapularis Say (Атлантическое побережье США) и I. pacificus Cooley & Kohls (Тихоокеанское побережье США) [143, 167]. Было показано, что I. pavlovskyi Pomerantsev (распространен на Алтае и Дальнем Востоке) также является компетентным переносчиком боррелий и может иметь значение для поддержания популяции боррелий на своем ареале [5, 100].

Рисунок 2 – Схема, показывающая ассоциацию видов боррелий комплекса B.

burgdorferi s.l. и позвоночных хозяев, обусловленную чувствительностью отдельных видов к действию системы комплемента [103].

Так как клещи обладают ограниченной подвижностью, распространение переносимых ими возбудителей связано прежде всего с передвижениями резервуарных хозяев (возбудители при этом могут находиться как в тканях хозяина, так и в питающихся на них клещах) [131]. Для понимания процессов распространения патогенов, в частности боррелий, необходимо учитывать вклад разных путей их передачи между компонентами паразитарной системы.

Заражение позвоночных животных боррелиями происходит через слюну клеща в ходе его питания. Так как основной средой для размножения боррелий служит кишечник клеща, для их перехода в слюнные железы и попадания в кровь животного требуется некоторое время. Экспериментально было определено, что для эффективной передачи боррелий клещами I. scapularis и I. pacicus требуется время питания клеща более 36 часов [60, 132]. Для I. persulcatus данный показатель ниже (24 часа), а доля голодных клещей с генерализованной инфекцией и, соответственно, наличием боррелий в слюнных железах значительно выше, чем у I. scapularis [13].

Заражение неинфицированного клеща происходит при поглощении крови, содержащей боррелий, т.е. такая передача возможна только при наличии системной инфекции в организме хозяина, сопровождающейся бактериемией.

Хотя было показано, что заражение клещей боррелиями может осуществляться также при совместном питании (co-feeding) из общего очага воспаления без развития системной инфекции хозяина [81, 144], значение этого пути передачи до сих пор спорно [185].

Трансовариальная передача B. burgdorferi s.l. (от зараженной самки к яйцам), хотя и была показана в ряде экспериментов, является редким явлением и не играет большой роли в поддержании популяции боррелий [155]. Напротив, этот тип передачи, вероятно, важен для боррелий группы КВЛ, в частности, B.

miyamotoi [155, 162]. В отличие от трансовариальной, трансстадиальная передача (последующим стадиям жизненного цикла клеща при линьке), является эффективной и позволяет боррелиям сохраняться в клеще в течение его жизни [34].

1.2. Боррелии как возбудители иксодового клещевого боррелиоза

Иксодовый клещевой боррелиоз (синонимы: болезнь Лайма, Лаймборрелиоз) – группа трансмиссивных природно-очаговых инфекций, передающихся иксодовыми клещами и вызываемых боррелиями комплекса B.

burgdorferi s.l., а также, как было показано недавно, B. miyamotoi [10, 135, 168]. В России активное изучение ИКБ началось в 1987 г. [8, 14]. Среди инфекций, передающихся клещами, ИКБ является самой распространенной в России, Европе и США [24, 154, 167, 168]. В нашей стране данное заболевание было включено в официальный перечень нозологических форм в 1991 г. под названием «клещевой боррелиоз (болезнь Лайма)». В настоящее время ИКБ регистрируется на территории 72 субъектов Российской Федерации с ежегодной заболеваемостью от 6,4 до 9,9 тысяч случаев [30]. Так, в 2012 году на территории России было зарегистрировано 8286 случаев ИКБ, в 2013 – 5715, в 2014 – 6179 [201].

Клинически ИКБ может протекать с поражением кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной системы, сердца и часто приобретает хронический и латентный характер [18]. Достоверным клиническим признаком боррелиоза можно считать мигрирующую эритему – кольцевидное покраснение, развивающееся на коже человека в месте укуса клеща (входные ворота инфекции). По наличию или отсутствию данного признака выделяют эритематозную и безэритемную формы ИКБ [15]. Поверхностный липопротеин A (OspA) использовался в качестве основы для разработки по крайней мере двух вакцин для профилактики ИКБ:

LYMErix (SmithKlineBeecham, США) и ImuLyme (PasteurMerieux-Connaught, США). Обе вакцины содержали исключительно антиген B. burgdorferi s.s., при этом только LYMErix поступила в продажу и была доступна на рынке с 1998 по 2002 год, после чего была снята с производства из-за низкой иммуногенности и большого количества побочных эффектов [56, 128, 159]. Сложности в создании вакцины связаны как с изначальной гетерогенностью боррелий, так и с различными молекулярными механизмами, позволяющими им уходить от иммунного ответа [108, 198]. Хотя в последние годы появляются новые перспективные вакцины, предназначенные как для иммунизации человека [56], так и грызунов для элиминации боррелий из природного очага [149], эффективной вакцины против ИКБ до сих пор не существует [159].

Было показано, что клиническая картина боррелиоза может зависеть от вида возбудителя. Получены данные о существовании связи между B. garinii и неврологическими проявлениями ИКБ, B. burgdorferi s.s. и Лайм-артритом, B.

afzelii и хроническим атрофическим дерматитом [35, 36, 37, 181], B. miyamotoi и лихорадочными формами ИКБ Более того, предполагается, что [135].

патогенность штаммов боррелий неодинакова и внутри вида. Анализ аллелей гена ospC и 16S-23S межгенного спейсера B. burgdorferi s.s. показал, что некоторые группы аллелей могут обуславливать повышенную инвазивность штаммов и их способность вызывать диссеминированную инфекцию в организме человека [65, 98, 163, 169, 195, 196]. Данные мультилокусного сиквенс-типирования, полученные в 2013 г., также позволили выявить филогенетические линии B.

burgdorferi s.s., отличающиеся по своей патогенности для человека [89]. При этом было отмечено, что данный метод является предпочтительным для предсказания возможности развития локальной или системной инфекции по сравнению с типированием ospC. Однако, для видов B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii таких исследований проведено не было.

1.3. Географическое распространение B. burgdorferi s.l.

Боррелии комплекса B. burgdorferi s.l. приурочены к лесной зоне северного полушария (Рисунок 3). Наиболее высокое разнообразие видов отмечено в Европе, где выделены B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. valaisiana, B.

lusitaniae, B. spielmanii и B. bissettii. В Северной Америке преобладает B.

burgdorferi s.s., однако вдоль восточного побережья встречаются также B.

andersonii, B. bissettii, B. americana, B. andersonii, B. carolinensis, и B. kurtenbachii [118].

Распределение видов боррелий определяется в первую очередь специализацией к переносчику и/или совместимостью с позвоночным хозяином.

Существуют виды, встречающиеся локально, например, B. tanukii, B. turdi и B.

japonica в Японии [79] или B. lusitaniae на территории Средиземноморского бассейна. В то же время, ряд видов обладают широким ареалом и часто могут использовать в качестве переносчиков несколько видов клещей. Так, на территории Европы встречается восемь видов боррелий, три из которых (B.

garinii, B. afzelii, и B. bavariensis) также широко распространены в Азии [138, 171].

B. valaisiana, хотя в основном распространена в Европе, иногда обнаруживается и в азиатских странах [123, 124]. Удивительно то, что B. burgdorferi s.s., которая встречается на двух континентах и способна поддерживаться в популяциях по меньшей мере трех переносчиков (I. ricinus, I. scapularis и I. pacificus) (Рисунок 3), не обнаруживается в I. persulcatus – основном переносчике B. afzelii, B. garinii и B.

bavariensis в таежной зоне Евразии. В свою очередь, B. garinii и B. afzelii распространены по всей территории Евразии, но не встречаются в Северной Америке [118]. B. garinii имеет, пожалуй, самый большой ареал. Этот вид распространен не только по всей лесной зоне Евразии, но также обнаруживается в колониях морских птиц (переносчик – Ixodes uriae) в Арктике и на восточном побережье Канады [62, 164].

Рисунок 3 – Карта, демонстрирующая распространение видов комплекса B.

burgdorferi s.l. Серым цветом показан ареал переносчиков – клещей рода Ixodes [118].

1.4. Методы установления видовой принадлежности B. burgdorferi s.l.

Для исследования боррелий обычно используют материалы, полученные от клещей-переносчиков, животных - резервуарных хозяев и зараженных людей.

Определение наличия боррелий в материале может производиться как прямыми (микроскопия, выделение в культуре, полимеразная цепная реакция (ПЦР)), так и непрямыми (серологическими) методами. Серологические же методы (наряду с анализом последовательностей 16S рРНК) послужили основой для выделения видов внутри ранее единого вида B. burgdorferi. Так, исходя из различной иммунореактивности поверхностного белка боррелий OspA, было выделено семь серотипов B. burgdorferi [192, 193] (Таблица 2). При этом вид B. garinii оказался иммунологически крайне неоднородной группой, внутри которой выделили пять серотипов (3-7), что было подтверждено и на генетическом уровне [191]. Особый интерес представлял при этом серотип 4, поскольку он, во-первых, часто выделялся из тканей животных и цереброспинальной жидкости больных в Европе, но крайне редко детектировался в клещах I. ricinus [96, 114, 194], а вовторых, был устойчив к действию системы комплемента сыворотки грызунов [96, 103]. В 2009 году серотип 4 было предложено выделить в отдельный вид B.

bavariensis [116]. Определение видовой принадлежности боррелий необходимо не только для проведения филогенетических и экологических исследований, но также может иметь значение в медицинской практике для предсказания вероятного характера течения заболевания.

Таблица 2 – Иммунореактивность штаммов B. burgdorferi с различными моноклональными антителами в иммуноблоттинге [193]

–  –  –

Выбор метода для определения видовой принадлежности боррелий зависит от многих факторов, в т.ч. цели исследования, наличия необходимого лабораторного оборудования и количества ДНК в пробе. Золотым стандартом остается метод ДНК-ДНК гибридизации [166], однако, он является трудоемким и рекомендуется только для определения и уточнения таксономического статуса вида. В эпидемиологических исследованиях применяются другие методы:

рестрикционный анализ, видоспецифичная ПЦР, секвенирование фрагментов генома и некоторые другие. Рассмотрим более подробно основные методы, используемые в настоящее время для определения видовой принадлежности (дифференцировки видов) боррелий.

ПЦР-ПДРФ (Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР) Этот метод дифференцировки подходит для боррелий комплекса B.

burgdorferi s.l. и основан на особой организации генов рРНК (см. раздел 1.1.3). В 1994 Postic D. с соавторами была предложена методика амплификации 5S-23S рРНК межгенного спейсера с последующим разрезанием ампликонов (длиной п.н.) рестриктазами или и 226-266 MseI (T/TAA) DraI (TTT/AAA) электрофоретическим разделением образовавшихся фрагментов [137] (Рисунок 4).

Данный метод позволил проводить дифференцировку видов B. burgdorferi s.s., B.

garinii, B. afzelii, B. japonica.

Рисунок 4 – Общая схема проведения ПЦР-ПДРФ 5S-23S рРНК межгенного спейсера. Показаны электрофоретические профили разных видов после рестрикции DraI. Профиль А соответствует виду B. burgdorferi s.s., профиль B – B. garinii (геногруппа 20047), профиль C – B. garinii (геногруппа NT29), профиль D – B. afzelii [125].

Несмотря на то, что метод ПЦР-ПДФР оказался удобным для проведения эпидемиологических исследований, в т.ч. для оценки частоты одновременного инфицирования несколькими видами, и оказал большое влияние на дальнейшие молекулярно-генетические исследования боррелий, он обладает двумя основными недостатками. Во-первых, этот метод применим исключительно для боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., во-вторых, при наличии точечных мутаций в сайтах рестрикции определение вида может быть ошибочным либо невозможным.

ПЦР – RLB (reverse line blotting, обратный лайн-блоттинг) Данный метод дифференцировки боррелий также основан на использовании межгенного спейсера 5S-23S рРНК боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. в качестве мишени для гнездной ПЦР. При этом вид определяется по гибридизации ПЦР-продукта с видоспецифичными олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на мембране [153]. Первоначально с помощью данного метода можно было дифференцировать B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii и B.

valaisiana [153]. Позднее были разработаны зонды для новых видов, таких как B.

lusitaniae, B. spielmanii, B. bissettii, B. bavariensis, а также для европейского типа B.

miyamotoi [82, 140].

Метод ПЦР-RLB оказался очень продуктивным и используется многими исследователями [83, 92, 111, 112, 175]. Тем не менее, его трудно рекомендовать для клинической практики из-за относительной трудоемкости метода лайнблоттинга. Кроме того, основным недостатком этого метода является невозможность количественной оценки содержания боррелий каждого вида в образце.

Классическая мультиплексная ПЦР Параллельно с разработкой метода ПЦР-RLB, для дифференцировки видов B.

burgdorferi s.l. был предложен метод классической мультиплексной ПЦР, заключающийся в одновременной амплификации нескольких мишеней (либо одной, но имеющей значительные вставки/делеции) с последующей регистрацией результатов путем электрофоретического разделения продуктов. В качестве мишени был выбран ген ospA, имеющий различную последовательность у видов B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii [59]. После обнаружения в иксодовых клещах B. miyamotoi были также разработаны праймеры для амплификации видоспецифичных генов (5S-23S рРНК IGS для B. burgdorferi s.l. и ген глицерофосфодиэфир-фосфодиэстеразы glpQ - для B. miyamotoi) [49]. Хотя методика мультиплексной ПЦР очень проста и может использоваться в любой молекулярно-генетической лаборатории, она обладает более низкой чувствительность по сравнению с ПЦР в реальном времени и, как все методы детекции результатов по конечной точке (после проведения ПЦР), не позволяет оценить количество мишени в образце.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с последующим анализом кривых плавления ДНК ПЦР в реальном времени отличается от классической ПЦР тем, что количество ампликонов регистрируется в каждом цикле – либо с помощью неспецифичных интеркалирующих красителей, либо последовательностьспецифичных зондов. В первом случае для идентификации продуктов ПЦР часто используется анализ кривой плавления ДНК. Этот метод может использоваться для детекции полиморфизмов в амплифицируемых последовательностях, а, следовательно, и дифференцировки видов, которым они принадлежат.

В работе [146] в качестве мишени использовали фрагмент гена ospA, поскольку вариабельные участки в его составе позволяют дифференцировать виды B. burgdorferi s.s., B. garinii и B. afzelii. Температуру плавления ампликонов определяли по максимумам флуоресценции: для B. burgdorferi s.s. она составила 63°C, B. garinii – 68°C, B. afzelii – 73°C [146].

В 2006 году была предложена новая методика, позволяющая провести дифференцировку шести видов: B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii, B.

valaisiana, B. lusitaniae и B. spielmanii, мишенью при этом был выбран ген hbb (кодирует белок из семейства гистоно-подобных белков) (Рисунок 5) [136]. После выделения B. bavariensis в отдельный вид было показано, что данная методика может быть применена и для детекции этого вида, т.к. температуры плавления продуктов амплификации hbb B. bavariensis и B. garinii отличаются (Рисунок 5) [158]. При этом 9 из 91 образцов (9,9%), содержащих ДНК боррелий, не удалось дифференцировать данной методикой, что свидетельствует о разной чувствительности методов детекции и дифференцировки.

–  –  –

ПЦР в реальном времени с флуоресцентно мечеными зондами Основными недостатками использования интеркалирующих красителей являются: во-первых, низкая специфичность, связанная с детекцией любой (в том числе и неспецифической) двухцепочечной ДНК в реакционной смеси, а вовторых, невозможностью определения количественного содержания каждой мишени. Этих недостатков лишена ПЦР-РВ с детекцией продуктов при помощи флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов или TaqMan MGB, комплементарных участку на одной из цепей внутри ампликона. Так как в настоящее время ПЦР-РВ широко используется как в научных исследованиях, так и в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, существует большое количество методик дифференцировки боррелий [45, 135, 179]. Мишенями при этом являются гены 16S рРНК, ospA, glpQ (для B. miyamotoi и B. lonestari) и некоторые другие. Однако, данные работы касаются прежде всего дифференцировки B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi, в то время как методики ПЦРРВ с использованием TaqMan, позволяющей дифференцировать встречающиеся в Европе и России виды B. burgdorferi s.l., в литературе нами не было найдено.

1.5. Изучение внутривидового разнообразия B. burgdorferi s.l.

Хотя серологические тесты и рестрикционный анализ применяются и для изучения разнообразия боррелий внутри вида, в данной главе вы остановимся на рассмотрении метода, обладающего наибольшей разрешающей способностью, а именно секвенирования генов и их фрагментов с последующим сравнительным анализом. Чаще всего для изучения внутривидового разнообразия используются последовательности 5S(rrf)-23S(rrl) и 16S(rrs)-23S(rrl) межгенных спейсеров, плазмидных генов поверхностных липопротеинов ospА и ospС, p66, хромосомных генов домашнего хозяйства [189].

1.5.1. Анализ последовательностей межгенных спейсеров

Межгенный спейсер 5S-23S рРНК, пожалуй, представлен наибольшим количеством последовательностей штаммов и изолятов боррелий в базе данных GenBank.

Это связано с простотой его амплификации, а также достаточной информативностью (за счет высокой вариабельности) не только на межвидовом, но и на внутривидовом уровне. Кроме того, было показано, что данный маркер не находится под давлением отбора и подходит для изучения относительно недавних событий специализации и расселения боррелий [55]. В связи с этим данный маркер широко применяется для изучения распределения изолятов боррелий на небольших территориях [27, 55, 127, 133, 170]. По результатам анализа профилей рестрикции данного спейсера, а также его последовательностей, было выделено три геногруппы B. garinii, различающиеся по профилю рестрикционных фрагментов (названия даны в соответствии с референсными штаммами): 20047, NT29 и СhY13p [106, 137], а также две геногруппы B. afzelii: VS461 и NT28 [38, 122].

Хотя 5S-23S рРНК межгенный спейсер, несомненно, является крайне ценным маркером для проведения молекулярно-эпидемиологических исследований, его анализ должен сопровождаться использованием дополнительных подходов, в частности, мультилокусного сиквенс-типирования. Так, на основании определения нуклеотидной последовательности IGS был предложен новый вид B.

ruski, впервые обнаруженный в России, в окрестностях Санкт-Петербурга [33].

Однако, проведенный в 2013 году анализ последовательностей IGS B. ruski и B.

afzelii в сравнении с данными мультилокусного сиквенс-типирования показал, что B. ruski неотличима от B. afzelii [55]. Таким образом, в настоящее время B. ruski не выделяется в качестве самостоятельного вида и рассматривается в качестве одного из генетических вариантов B. afzelii.

1.5.2. Анализ последовательностей генов поверхностных белков

Сравнительный анализ последовательностей генов поверхностных белков также широко распространен. Было показано, что уровень вариабельности гена ospC, к примеру, превосходит таковой 5S-23S рРНК межгенного спейсера [50].

Однако, в связи с тем, что данный ген расположен на плазмиде, он подвержен относительно частой рекомбинации и горизонтальному переносу, поэтому малопригоден для проведения филогенетических и эпидемиологических исследований. Кроме того, кодируемый этим геном белок может быть связан с патогенностью штаммов, т.е. находится под давлением отбора [104, 188, 190].

Анализ последовательностей гена ospA, расположенного на линейной плазмиде lp54, показал однородную генетическую структуру B. burgdorferi и B. afzelii, в том время как B. garinii, напротив, отличалась генетической неоднородностью [191]. Ценность плазмидных локусов заключается прежде всего в возможности их использовании для выявления случаев горизонтального переноса между и внутри видами, а также для выявления экологических особенностей боррелий, к примеру, для определения ассоциаций с определенными резервуарными хозяевами.

–  –  –

Любые методы, основанные на анализе только одного гена, позволяют получить ограниченную информацию и не всегда пригодны для филогенетических исследований. Кроме того, результаты анализа разных генов, по тем или иным причинам выбранных для исследования разными лабораториями, с трудом поддаются сопоставлению и стандартизации. В условиях невозможности (или высокой стоимости) получения полногеномных последовательностей выходом стало исследование нескольких геномных локусов, или методика мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ, MLST) [165, 180].

Впервые она была предложена Maiden M.C. с соавторами в 1998 г. для изучения генетической структуры менингококка Neisseria meningitidis [113].

МЛСТ основывается на анализе ограниченного числа (обычно от 6 до 10) фрагментов бактериальных генов длиной примерно 450-500 п.н., предпочтительно «нейтральных», не кодирующих известные факторы вирулентности или патогенности, но являющихся маркерами филогенетического родства. При этом, несмотря на относительно небольшое число полиморфных сайтов в последовательности одного гена, метод обладает большой разрешающей способностью за счет анализа нескольких подобных генов. Для МЛСТ выбираются гены, расположенные равномерно по всему геному и обладающие примерно одинаковой скоростью накопления мутаций [180].

Схема проведения МЛСТ приведена на Рисунке 6. Нуклеотидные последовательности выбранных локусов определяются методом прямого секвенирования, затем каждой уникальной последовательности присваивается номер аллеля. Набор аллелей всех исследуемых локусов конкретного штамма определяет его сиквенс-тип (ST). Эволюционные взаимосвязи различных ST и генетическое расстояние между ними могут оцениваться как путем анализа конкатенированных последовательностей локусов, так и путем сравнения аллельных профилей.

Рисунок 6 – Схема мультилокусного сиквенс-типирования [118]. БД – база данных.

Последовательности аллелей, сиквенс-типов, а также информация об исследованных изолятах хранятся в стандартизованной и удобной для поиска форме в общедоступных базах данных [31].

Одной из важных проблем изучения эволюционных связей между видами и популяциями бактерий является возможность генетической рекомбинации.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«Васильева Ольга Валерьевна Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Гунин А.Г. Чебоксары – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«МИНАЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ ПОВЕДЕНИЕ ЛОСЯ В УСЛОВИЯХ ДОМЕСТИКАЦИИ (биотелеметрическое исследование) Специальность 03.00.08 зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 1992. -2ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение........... 3 Глава 1. Материал и методика....... 7 Глава 2. Система радиоопределения Лось-2 и оптимальные методы работы с...»

«КОЛОТВИН АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ Прогностическая значимость генетического полиморфизма патогена и хозяина для оценки эффективности терапии и развития фиброза печени при хроническом гепатите С Молекулярная биология –...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»

«УДК 591.15:575.17-576.3 БЛЕХМАН Алла Вениаминовна ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШИРОКОАРЕАЛЬНОГО ВИДА HARMONIA AXYRIDIS PALL. ПО КОМПЛЕКСУ ПОЛИМОРФНЫХ ПРИЗНАКОВ 03.00.15 генетика Диссертация на соискание ученой степени V кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Гуляева Анна Федоровна ТРАВЯНЫЕ МЕЛКОЛИСТВЕННЫЕ ЛЕСА КУЗНЕЦКОЙ КОТЛОВИНЫ: СИНТАКСОНОМИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., ст.н.с. Н.Н. Лащинский Новосибирск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.