WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 |

«ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДУЛЯТОРОВ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ШАРОНОВА Ирина Николаевна

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ

ДЕЙСТВИЯ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДУЛЯТОРОВ

ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

03.03.06 – нейробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2015

Работа выполнена в Отделе исследований мозга Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии» (г. Москва)

Научный консультант:

Скребицкий Владимир Георгиевич, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор (ФГБНУ НЦН)

Официальные оппоненты:

Антонов Сергей Михайлович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией сравнительной физиологии мозжечка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук Базян Ара Саакович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией нейрохимических механизмов обучения и памяти Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук Островская Рита Ушеровна, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Защита диссертации состоится 20 апреля 2015 года в 15:30 на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 при Биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.

Ломоносова по адресу: Москва, Ломоносовский проспект, 27 и на сайте http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан 10 марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Химическая передача в синапсах признана в настоящее время главным механизмом связи между нейронами, обеспечивающим обработку информации в мозге (Eccles, 1964; Katz, 1966). В нервной системе млекопитающих быстрая синаптическая передача между нейронами осуществляется с помощью медиаторов (нейротрансмиттеров), действующих на лиганд-управляемые ионные каналы (ligand-gated ion channels

- LGICs) разного типа. Лиганд-управляемые каналы представляют собой встроенные в липидный мембранный бислой высокоспециализированные протеиновые комплексы, в которых рецептор, связывающий активирующую молекулу (лиганд), и ионный канал являются частью одного и того же протеинового комплекса, в связи с чем LGICs называют также ионотропными рецепторами.

Основная функция лиганд-управляемых каналов состоит в передаче сигнала от нейрона к нейрону и/или к эффекторным клеткам. Исследование механизмов межклеточной передачи электрических сигналов в нервной системе и выявление свойств постсинаптических рецепторов, участвующих в этом процессе, является центральной проблемой современной нейробиологии.

Постсинаптические ионотропные рецепторы являются также мишенью действия многих физиологически активных веществ и фармакологических препаратов, используемых при лечении разных форм церебральной патологии (Аничков, 1982; Скребицкий, 1985, Раевский и Георгиев, 1986; Сергеев и др., 1999; Островская и др., 2002, 2005; Воронина, 2005; Скребицкий и др., 2008;

Харкевич, 2008; Narahashi, 2000; Korpi et al., 2002, Ostrovskaya et al., 2007;

Lemoine et al., 2012). Эти препараты способны модифицировать состояние канал-рецепторного комплекса посредством разных механизмов, понимание которых необходимо для более рационального их использования при коррекции разных форм церебральной патологии и создания новых соединений с заданными свойствами. В этой связи изучение свойств ионотропных рецепторов нейрональной мембраны и механизмов их модуляции эндогенными и экзогенными лигандами является актуальной проблемой современной нейробиологии и клинической фармакологии.

Заметный прогресс в изучении свойств LGICs был достигнут благодаря идентификации генов, кодирующих эти мембранные белки. Эти исследования показали, что некоторые LGICs, несмотря на различия в их функции, имеют сходные аминокислотные последовательности. В соответствии с этим критерием, все LGICs были разделены на три основных суперсемейства: (1) Cys-петельные рецепторы, (2) ионотропные глутаматные рецепторы и (3) ATPуправляемые пуринорецепторы (P2X каналы) (Le Novr and Changeux, 2001;

Collingridge et al., 2009).

Наиболее изученными в настоящее время являются рецепторы Cysпетельного семейства, к которому принадлежат никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, 5-НТ3 рецепторы, ГАМКА и глициновые рецепторы (Cascio, 2004).

Семейство глутаматных рецепторов включает в себя рецепторы, избирательными агонистами которых являются -амино-3-гидрокси-5метилизоксазол-4-пропионовая кислота (АМРА), каинат и N-метил-D-аспартат (NMDA) (Mayer, 2006; Greger et al., 2007).

Являясь основным возбуждающим медиатором, глутамат участвует практически во всех функциях ЦНС, включая развитие нервной системы, обучение и память, пластические и компенсаторные перестройки (Dingledine et al., 1999; Lemoine et al., 2012). Кроме того, патогенез различных групп неврологических заболеваний связан с избыточной активацией рецепторов возбуждающих аминокислот (Parsons et al., 2005). В связи с этим вопросы, касающиеся регуляции глутаматных рецепторов различными эндогенными и экзогенными факторами, представляют интерес как для теоретической нейронауки, так и практической фармакологии.

Основным тормозным передатчиком в ЦНС является гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Быстрая тормозная передача осуществляется с участием ионотропных ГАМКА рецепторов, сопряженных с хлорным каналом. Интерес к структуре и функции ГАМКА рецепторов определяется тем, что они играют ведущую роль в регуляции возбудимости мозга и синхронизации нейронной активности, а также являются мишенями действия многих фармакологических препаратов, включая такие клинически важные соединения, как бензодиазепины, барбитураты, нейростероидные гормоны, этанол, антиконвульсанты и общие анестетики (Sieghardt, 2006, 2013), что определяет практическое значение исследования свойств этих рецепторов.

Наряду с рецепторами для основных медиаторов возбуждающей и тормозной нейропередачи - глутамата и ГАМК, в мозге довольно широко представлены также рецепторы для АТФ, медиаторные функции которого были выявлены относительно недавно (Burnstock, 1972). Ионотропные рецепторы для АТФ получили название пуринорецепторов второго типа или P2X рецепторов. Однако основные данные о P2X рецепторах были получены при исследовании периферической нервной системы и на системах экспрессии, их роль в деятельности ЦНС изучена довольно слабо. Вместе с тем, накапливается все больше данных о том, что АТФ может выступать в качестве медиатора или ко-медиатора синаптической передачи (North, 2002), участвовать в развитии нервной системы и в пластических перестройках в ЦНС (Fujii, 2004; Lee et al., 2012), а также вызывать цитотоксические эффекты, что делает Р2Х рецепторы мишенью для терапевтических воздействий при различных заболеваниях (Franke and Illes, 2006, Koles et al., 2007; del Puerto et al., 2013).

Большинство лиганд-управляемых каналов, помимо сайта для связывания нейротрансмиттера, имеют и другие сайты, при взаимодействии с которыми соответствующие вещества могут менять активность канал-рецепторного комплекса. Ионотропные рецепторы модулируются большим числом различных молекул, включая эндогенные вещества, имеющие физиологическое значение и/или играющие роль в патологических процессах, а также экзогенными фармакологическими препаратами. Модуляция активности ионотропных рецепторов может осуществляться с помощью нескольких принципиально различных механизмов, выявление которых имеет значение как для практической нейрофармакологии, так и для понимания общих закономерностей функционирования разных типов ионотропных рецепторов и принципов модуляции их активности.

Среди экспериментальных подходов, применяемых для исследования свойств нейрональных рецепторов и выявления молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов, одно из ведущих мест занимает электрофизиологический метод, основанный на регистрации токов в условиях фиксации напряжения – patch-clamp метод, который позволяет регистрировать токи, связанные с активацией определенного типа рецепторов или ионных каналов (Hamill et al., 1981; Sakmann and Neher, 1984; Verkhratsky and Parpura, 2014).

Цель исследования. Используя метод регистрации токов от изолированных нейронов, исследовать биофизические и фармакологические характеристики ионотропных рецепторов глутамата, ГАМК и АТФ в нейронах ЦНС и выявить механизмы взаимодействия с ними ряда эндогенных и экзогенных модуляторов.

Основные задачи исследования

1. Исследовать модуляцию глутаматных рецепторов NMDA типа эндогенными модуляторами (гистамин, спермин) и канальными блокаторами.

Выявить влияние некоторых нейропротекторов (такрин, амиридин, этилизопропил амилорид) на активность NMDA рецепторов.

2. Исследовать биофизические и фармакологические свойства глутаматных рецепторов АМРА типа в нейронах разных отделов мозга и выявить особенности эффектов канальных блокаторов и аллостерических модуляторов в этих нейронах.

3. Выявить механизмы и особенности взаимодействия с ГАМКА рецепторами препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами (пенициллин, фуросемид, нифлумат).

4. Исследовать модуляцию ГАМКА рецепторов ионами меди и цинка.

5. Выявить основные характеристики взаимодействия нестероидных противовоспалительных препаратов из группы фенаматов с ГАМКА рецепторами.

6. Описать свойства нативных ионотропных пуринорецепторов (Р2Х) и исследовать их фармакологические характеристики.

Научная новизна работы. В проведенном исследовании выявлены новые модуляторы нативных ионотропных рецепторов в нейронах головного мозга, исследованы особенности этих рецепторов в разных типах нейронов и раскрыты механизмы их модуляции физиологическими активными веществами.

В частности, впервые обнаружено, что глутаматные рецепторы NMDA типа обладают местом связывания для эндогенного биогенного амина гистамина, вызывающего аллостерическую потенциацию активности этого рецептора.

Показано, что нейропротектор такрин блокирует NMDA каналы по механизму “foot-in-the-door”. Описаны особенности биофизических и фармакологических свойств глутаматных рецепторов АМРА типа в нейронах мозжечка и стриатума.

Впервые показано, что пенициллин, фуросемид и нифлумат блокирует каналы ГАМКА рецепторов по механизму “foot-in-the-door”. Получены экспериментальные подтверждения теоретического предположения о том, что открытая конформация канала препятствует диссоциации агониста.

Впервые выявлено высокоаффинное место связывания для ионов меди на ГАМКА канал-рецепторном комплексе, которое может обеспечивать новый тип модуляции активности ионотропных рецепторов – тоническое торможение следовыми количествами ионов металлов. Описаны механизмы взаимодействия нестероидных противовоспалительных средств с ГАМКА рецепторами.

Впервые описаны фармакологические и биофизические свойства токов, активируемых АТФ в нейронах туберомамиллярного ядра, позволившие идентифицировать субъединичный состав опосредующих их Р2Х рецепторов.

Научно-теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии и фармакологии. Данные, полученные в диссертационном исследовании, вносят существенный вклад в понимание свойств постсинаптических рецепторов, участвующих в возбуждающей и тормозной синаптической передаче, и механизмов их модуляции рядом физиологически активных веществ.

Полученные в работе данные о наличии физиологически и фармакологически различных изоформ АМРА рецепторов в разных типах нейронов головного мозга способствуют пониманию функционального значения различий в молекулярном составе нативных ионотропных рецепторов и открывают возможность для избирательного воздействия на определенные типы нейронов.

Данные о взаимодействии канальных блокаторов с ионной порой глутаматных и ГАМКА рецепторов имеют значение для понимания механизмов сопряжения связывания агониста с конформационными перестройками каналрецепторного комплекса, приводящими к открыванию канала, и для выявления строения канальной поры.

Практическая значимость работы определяется тем, что многие модуляторы, механизмы действия которых были исследованы в настоящей работе, являются фармакологическими препаратами, используемыми в клинической практике.

Полученные в ходе исследования данные расширят представления о механизмах действия анксиолитиков и нейропротекторов (абекарнил, такрин, амиридин, этилизопропил амилорид, НПВС) на нейроны ЦНС. Обнаруженные новые свойства некоторых препаратов (такрин, фенаматы) служат экспериментальным обоснованием для разработки на их основе новых лекарственных средств для лечения острых и хронических заболеваний ЦНС.

Работа относится к числу фундаментальных исследований, и ее результаты могут быть включены в курсы по нейрофизиологии и биофизике в высших учебных заведениях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Медиатор гистамин может выступать в качестве модулятора активности глутаматных рецепторов NMDA типа, обеспечивая один из механизмов влияния гистаминергической системы на синаптическую пластичность, связанную с NMDA рецепторами.

2. Глутаматные рецепторы АМРА типа, экспрессирующиеся в разных популяциях нейронов, обладают различными биофизическими и фармакологическими свойствами, исследование которых с помощью электрофизиологических и фармакологических методов позволяет получить информацию о субъединичном составе этих рецепторов.

3. ГАМКА рецепторы содержат высокоаффинный участок связывания ионов меди, который может опосредовать тоническое торможение активности этих рецепторов.

4. Нестероидные противовоспалительные средства из группы фенаматов обладают способностью модулировать активность ГАМКА рецепторов посредством разных механизмов, определяемых концентрацией модулятора, степенью активации рецептора и уровнем мембранного потенциала.

5. Связывание пенициллина и фуросемида с открытым каналом ГАМКА рецептора предотвращает его закрывание и диссоциацию агониста, что позволяет предположить, что сайты связывания этих блокаторов участвуют в воротном механизме, обеспечивающем открывание/закрывание канала ГАМКА рецептора.

6. Исследование свойств и принципов функционирования лигандуправляемых каналов с использованием электрофизиологических методов, в отличие от методов их исследования в стационарных условиях (биохимические, иммунохимические и другие), позволяет выявить характер и динамику взаимодействия того или иного препарата с мишенью с учетом ее состояния – уровня активации рецептора, величины мембранного потенциала, степени десенситизации и других факторов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях, конгрессах и съездах: на XVIII, XIX, XX, XXI, XXII Съездах Физиологического общества им.

И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004; Москва, 2007; Калуга, 2010;

Волгоград, 2013), на Съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005; Ялта 2010), Международных конференциях «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация»

(Пущино, 2007, 2009, 2011), Международных Междисциплинарных Конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2006, 2008, 2013), Ежегодных форумах по нейронаукам (SFN) (Вашингтон, 1993, 1996; ЛосАнджелес, 1998; Новый Орлеан, 2000; Орландо, 2002; Сан-Диего, 2001, 2004;

Вашингтон, 2005, 2014), Европейских форумах по нейронаукам (FENS) (Брайтон, Великобритания, 2000; Париж, Франция, 2002; Лиссабон, Португалия, 2004; Вена, Австрия, 2006; Амстердам, Нидерланды, 2010; Милан, Италия, 2014) и других.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 64 печатных работах, из которых 24 в журналах, рекомендуемых ВАК (18 в зарубежных и 6 в отечественных журналах).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 327 стр., состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 772 отечественных и иностранных источника.

Материал и методы исследования Исследование биофизических и фармакологических свойств ионотропных рецепторов и механизмов действия на них модуляторов проводили на изолированных нейронах, выделенных из срезов мозга крысят в возрасте от 14 до 25 дней. Нейроны выделяли из срезов гиппокампа, мозжечка, стриатума и гипоталамуса. Изоляцию нейронов осуществляли методом вибродиссоциации, в большинстве случаев без использования энзиматической обработки (Vorobjev, 1991). Для регистрации токов использовали метод фиксации потенциала на целой клетке (пэтч-кламп метод в варианте "целая клетка"). Подведение агонистов и модуляторов осуществлялось с помощью оригинального устройства для быстрой аппликации (Vorobjev et al., 1996), которое позволяло проводить смену раствора около нейрона с постоянной времени от 4 до 40 мс в зависимости от задач эксперимента. Для активации тока агонист апплицировали в большинстве опытов в течение 1-2 с, интервал между отдельными аппликациями составлял 30-60 с. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программных пакетов Excel (Microsoft) и Prizm (GraphPad Software). Данные в большинстве случаев представлены как средние значения со стандартными ошибками измерения (SEM).

При работе с животными соблюдались правила, сформулированные в Приказе Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Протокол исследования, выполняемого в рамках диссертационной работы, одобрен этическим комитетом Научного центра неврологии РАМН (протокол № 04/09 от 07.04.09).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Модуляторы постсинаптических глутаматных рецепторов

1.1.Модуляция глутаматных рецепторов NMDA типа гистамином и спермином Гиппокамп является структурой, тесно связанной с процессами памяти.

Активация NMDA рецепторов в этой структуре участвует в индукции длительной потенциации (Collingridge et al., 1983), а функционирование самих NMDA рецепторов модулируется большим числом агентов, действующих преимущественно через системы вторичных посредников (Coultrap et al., 2012;

Lisman et al., 2012). На обработку информации в гиппокампе в числе прочих влияют сигналы, поступающие из подкорковых структур. В данном разделе работы мы изучали влияние нейромедиатора гистамина на NMDA токи в изолированных пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа.

–  –  –

гистамина сравнивали ответы, вызываемые совместной аппликацией Lаспартата и меняющихся концентраций спермина с ответами, полученными после добавления 20 мкМ гистамина к тем же растворам (Рис. 3). Обнаружили, что степень потенциации NMDA токов гистамином снижается при повышении концентрации спермина. Анализ зависимости ингибирующего влияния спермина на потенциацию, вызываемую 20 мкМ гистамина, дает величину IC50 145 мкМ и коэффициент Хилла 1.23. Очень близкие величины EC50 и IC50 для спермина позволяют предполагать, что сайт, занимаемый спермином для вызова потенцирующего эффекта NMDA ответов, может быть тем же самым, что и сайт, который занимает спермин для предотвращения облегчения NMDA ответов под действием гистамина.

Сходство эффектов и окклюзия потенцирующих эффектов гистамина насыщающими концентрациями спермина позволяют предположить, что гистамин взаимодействует с сайтом связывания полиаминов на NMDA рецепторе. В пользу этого предположения свидетельствуют также полученные позже данные о сходных молекулярных детерминантах гистамин- и полиаминвызываемой потенциации. Было показано, что потенцирующий эффект гистамина, наблюдаемый на рекомбинантных NMDA рецепторах, также как и эффект спермина, селективен для рецепторов, содержащих субъединицу NR2B (Williams et al., 1994), которые играют центральную роль в синаптической пластичности. Показано также сходство зависимости эффектов гистамина и спермина от pH (Saybasili et al., 1995; Yanovsky et al., 1995). Однако имеются полученные недавно данные, которые позволяют предположить, что гистамин взаимодействует с собственным сайтом на NMDA рецепторе, который аллостерически связан с полиаминовым сайтом (Burban et al., 2011).

Гистаминовые нейроны образуют протяженную и разветвленную систему иннервации, берущую начало от туберомамиллярного ядра в заднем гипоталамусе и проецирующуюся диффузным образом в различные области мозга. Участие этих нейронов в модуляции таких физиологических процессов как arousal или когнитивные функции хорошо документировано (Haas et al., 2008; Lin et al., 2011). Посредством обнаруженного нами эффекта гистаминергическая система может специфическим образом модулировать события, опосредуемые NMDA рецепторами, в структурах-мишенях – коре и гиппокампе. Одновременно с усилением возбудимости нейронов в результате блокады аккомодации и длительной следовой гиперполяризации эта аминная система, которой долго не уделялось достаточного внимания, может воздействовать на пластические перестройки и процессы формирования памяти. Активация NMDA рецепторов через сайт связывания гистамина может представлять потенциальный терапевтический интерес. Современная гипотеза шизофрении предполагает дефицит глутаматергической передачи и рассматривает активаторы NMDA рецепторов как возможный новый класс антипсихотических препаратов (Menniti et al., 2013).

1.2. Механизмы блокады NMDA рецепторов такрином Ведущая роль глутаматных рецепторов NMDA типа в повреждениях нейронов, вызываемых при многих патологических состояниях повышением концентрации внеклеточного глутамата, диктует необходимость поиска эффективных и нетоксичных блокаторов этих рецепторов, которые могут быть использованы для снижения эксайтотоксичности. К таким потенциально значимым нейропротекторам относятся, прежде всего, канальные блокаторы (Rogawski, 2000; Khodorov, 2004; Ehrnhoefer et al., 2011).

Препарат такрин используется при лечении болезни Альцгеймера (Ballard, 2002; Minarini et al., 2013). Показано, что он защищает нейроны от нейротоксического действия NMDA (Davenoprt et al., 1988). Мы исследовали влияние такрина на токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов в изолированных нейронах поля СА1 гиппокампа. NMDA рецепторы активировали аппликацией L-аспартата в безмагниевом растворе, содержащем 1 мкМ глицина. Обнаружили, что при отрицательных значениях мембранного потенциала ко-аппликация L-аспартата и такрина вызывает подавление NMDA тока и замедление его деактивации, проявляющиеся уже при концентрации такрина 10 мкМ (Рис. 4). Дальнейшее повышение концентрации такрина до 50мкМ приводило к усилению блокирующего эффекта и появлению кратковременного возрастания входящего тока – так называемого «хвостового тока». Временной ход деактивации тока описывался одной экспонентой с постоянной времени спада (off) около 60 мс в контроле и 200 мс после блокады 100 мкМ такрина. Полумаксимальная блокирующая концентрация для такрина (IC50) составляла 25±5 мкМ, коэффициент Хилла 2±0.2 (n=4).

Эффекты, сходные с эффектами такрина, наблюдались при ко-аппликции Lаспартата и амиридина, препарата, который также как и такрин является ингибитором ацетилхолинэстеразы и используется при лечении болезни Альцгеймера. Однако эффект амиридина обнаруживался при более высоких концентрациях этого препарата (Рис. 4 В).

Эффекты такрина имели выраженный потенциалозависимый характер (Рис.

5). При положительных поддерживаемых потенциалах блокирующий эффект был пренебрежимо мал даже при концентрации такрина 200 мкМ. Эта же концентрация практически полностью блокировала входящие токи. Усиление блокады при гиперполяризации сопровождалось увеличением времени спада хвостового тока (Рис. 5).

–  –  –

Описанные свойства блока NMDA каналов такрином свидетельствуют о том, что такрин является блокатором открытого ионного канала. Однако, в отличие от таких блокаторов как кетамин, МК-801 и других, которые, связываясь с каналом, не препятствуют его закрыванию, то есть действуют по механизму «ловушки» (Honey et al., 1985; Halliwell et al., 1989; Antonov and Johson, 1996), такрин удерживает канал в открытом состоянии до тех пор, пока он не уйдет из канала, действуя по механизму последовательного блока или “foot-in-the-door”, о чем свидетельствует появление хвостового тока после прекращения совместной аппликации агониста и такрина.

Кинетика и амплитуда хвостового тока не менялись под действием конкурентного антагониста NMDA рецепторов APV и антагониста места узнавания глицина кинурената. Описанные свойства хвостового тока позволяют рассматривать его как результат пролонгирования активности NMDA каналов, которая начиналась во время аппликации агониста. Модель последовательного блока предсказывает, что блокатор, быстро диссоциирующий из канала, должен вызывать заметное удлинение времени открываний от первого открывания до финального закрывания в отдельной пачке (Colquhoun and Hawkes, 1982, 1983). Для NMDA рецепторов было показано, что однократное связывание агониста вызывает длинный кластер открываний канала, которые заканчиваются, когда рецептор возвращается в покоящееся, несвязанное состояние (Gibb and Colquhoun, 1991; Lester and Jahr, 1992). Только после конца одиночной активации NMDA канал может быть реактивирован. В контрольных условиях длительность активационного цикла не превышает времени спада NMDA ответа, которое в наших экспериментах составляло около 60 мс. Блок такрином замедляет спад NMDA тока до 650 мс и может в этом случае увеличивать время одиночной активации до 10 раз, а, следовательно, уменьшать вероятность повторной активации NMDA рецептора.

Таким образом, уменьшение NMDA тока под действием такрина происходит двумя путями. Во-первых, он уменьшает общее время открытого состояния во время одиночной активации, как это происходит и при блокаде магнием. Вовторых, он снижает вероятность повторной активации NMDA канала.

1.3. Функциональные свойства глутаматных рецепторов AMPA типа в разных популяциях нейронов Глутаматные рецепторы АМРА типа, опосредующие быструю синаптическую передачу, представляют собой катион-проводящий комплекс, образованный различными комбинациями 4-х субъединиц – GluA1-4 (Collingridge et al., 2009; Traynelis et al., 2010). Исследования рекомбинантных АМРА рецепторов показало, что их биофизические и фармакологические свойства зависят от композиции субъединиц, альтернативного сплайсинга и редактирования РНК, а использование иммуногистохимических и радиолигандных методов выявило различное распределение в мозге субъединиц АМРА рецептора (Mayer, 2006; Traynelis et al., 2010). Разный паттерн экспрессии субъединиц АМРА рецепторов обеспечивает разнообразие их свойств, к которым относятся проницаемость для Ca2+, кинетика деактивации и десенситизации, чувствительность к блокаторам и модуляторам.

Вместе с тем, особенности функционирования нативных АМРА рецепторов в разных типах нейронов и их композиция изучены крайне слабо. Такие данные имеются в отношении нейронов гиппокампа (Geiger et al., 1995) и новой коры (Jonas et al., 1994; Lambolez et al., 1992). Другие структуры мозга в этом плане практически не исследованы.

Цель настоящего раздела работы состояла в выявлении свойств АМРА рецепторов, представленных в функционально различных типах нейронов. Мы исследовали биофизические и фармакологические особенности АМРА рецепторов в трех типах нейронов – клетках Пуркинье (КП) мозжечка, гигантских интернейронах (ГИН) и проекционных нейронах стриатума.

Известно, что рецепторы, в состав которых наряду с другими субъединицами входит субъединица GluA2, практически непроницаемы для кальция и имеют линейную вольт-амперную характеристику. При отсутствии этой субъединицы канал приобретает способность пропускать ионы кальция, а его вольт-амперная характеристика нелинейна (Burnashev, 1996). Для выявления кальциевой проницаемости каналов мы проанализировали изменения потенциала реверсии ответов при замене одновалентных катионов в наружном растворе на ионы кальция. Для активации АМРА рецепторов использовали каинат, который при взаимодействии с АМРА рецепторами вызывает недесенситизирующийся ток.

Было обнаружено, что вольт-амперные характеристики ответов на каинат линейны в КП и проекционных нейронах стриатума, в то время как в ГИН стриатума в области положительных потенциалов наблюдали входное выпрямление (Рис. 7). Каналы, сопряженные с АМРА рецепторами, имели низкую проницаемость для Са2+ в КП и проекционных нейронах стриатума, но были высокопроницаемы для Са2+ в интернейронах (PCa/PNa 0.04, 0.04 и 1.01, соответственно).

Ранее было показано, что некоторые положительно заряженные полиаминовые токсины из яда паука, а также спермин избирательно блокируют токи через каналы АМРА рецепторов, в составе которых отсутствует GluА2 (Гришин и др., 1986; Jackson and Usherwood, 1988; Antonov et al., 1989).

Обнаружено также, что дикатионовое производное адамантана, синтезированное в Институте экспериментальной медицины в СанктПетербурге – ИЭM-1460, ранее описанное как блокатор NMDA каналов, также вызывает специфичный к субъединичному составу блок рекомбинантных АМРА рецепторов (Magazanik et al., 1997). В нашей работе мы сравнили способность этого препарата блокировать АМРА каналы с их кальциевой проницаемостью и свойствами выпрямления (Рис. 7). Обнаружили, что АМРА рецепторы в клетках Пуркинье и проекционных нейронах стриатума имеют низкую чувствительность к блокатору. Токи, вызываемые аппликацией 100 мкМ каината, уменьшались при действии 100 мкМ блокатора на 4±1% (n=4) в клетках Пуркинье и на 12±1% (n=20) в проекционных нейронах стриатума.

Гигантские интернейроны стриатума имели высокую чувствительность к блокатору: величина блока составляла 95±6%, а IC50 блока 2,6±0,4 мкМ (n=16).

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что ИЭМ-1460 может быть использован в качестве маркера нативных АМРА рецепторов, не содержащих субъединицы GluA2 и обладающих высокой проницаемостью для ионов Са2+.

Гетерогенность АМРА рецепторов связана не только с различиями в их субъединичном составе, но и с тем, что каждая из 4-х субъединиц может существовать в двух молекулярных формах – flip и flop (Sommer et al., 1990).

Какой из двух модулей будет входить в состав рецептора, контролируется через посредство альтернативного сплайсинга.

–  –  –

Как показано на рекомбинантных рецепторах, модули flip и flop по-разному влияют на свойства глутаматных каналов: flip формы имеют более медленную кинетику и бльшую амплитуду стационарного компонента ответа на аппликацию глутамата (Sommer et al., 1990). При исследовании свойств АМРА рецепторов в нейронах стриатума мы обнаружили, что при активации этих рецепторов глутаматом (1 мМ) десенситизация ответов в гигантских интернейронах происходит примерно в 5 раз быстрее, чем в проекционных нейронах, что дало основание предполагать, что flip и flop варианты субъединиц АМРА рецепторов по-разному представлены в этих типах нейронов. Фармакологическим инструментом для выявления flip и flop форм рецепторов является препарат циклотиазид, который сильнее потенцирует токи через АМРА рецепторы в flip форме, чем во flop сплайс варианте (Partin et al., 1995). Мы обнаружили, что циклотиазид по-разному действует на токи, опосредуемые АМРА рецепторами в двух исследовавшихся популяциях нейронов стриатума (Рис. 8).

Циклотиазид вызывал увеличение амплитуды ответа на каинат (200 мкМ) в 6.77±1.1 раз в проекционных нейронах (n=4) и только в 1.65±0.1 раза в интернейронах (n=4). Величина EC50 составляла 21±4.9 мкМ для проекционных нейронов и 30±4.0 мкМ для гигантских интернейронов. Таким образом, циклотиазид обладает значительно большей эффективностью в отношении потенциации ответов в проекционных клетках, чем в интернейронах, хотя

–  –  –

Эти наблюдения позволяют предположить, что механизмы взаимодействия циклотиазида с разными типами АМРА рецепторов различны. В проекционных нейронах сродство циклотиазида к рецептору не зависит от активации рецептора, а в интернейронах связывание агониста или переход канала в открытое состояние уменьшают сродство рецептора к циклотиазиду.

Таким образом, это исследование показывает, что два типа нейронов стриатума – проекционные и гигантские интернейроны – экспрессируют глутаматные рецепторы АМРА типа, которые могут быть разделены на основании их чувствительности к циклотиазиду, и позволяет предположить, что субъединицы АМРА рецепторов в проекционных нейронах экспрессируются преимущественно в flip форме, а в интернейронах – в flop.

Это предположение нашло подтверждение в проведенном нами анализе мРНК в отдельных нейронах с помощью метода RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). Анализ показал наличие субъединиц GluA1, GluА2 и GluА3 в обоих сплайс вариантах в проекционных нейронах и GluA1 и GluА4 только в flop форме в интернейронах. Таким образом, молекулярно-биологические исследования подтверждают наши электрофизиологические данные о преимущественной экспрессии flop форм АМРА рецепторов в интернейронах стриатума, учитывая, что при наличии субъединиц в обоих сплайс вариантах, в определении функциональных свойств рецепторного комплекса доминирует flip вариант.

Результаты, полученные в настоящем разделе работы с использованием селективных блокаторов и модуляторов АМРА рецепторов, свидетельствуют о различии функциональных свойств этих рецепторов, представленных в разных нейрональных популяциях. Хотя физиологическое значение специфичной для определенного типа клеток экспрессии АМРА рецепторов до конца непонятно, можно ожидать, что регуляция композиции рецепторов определяет кинетику и силу передачи в глутаматергических синапсах.

2. Влияние эндогенных и экзогенных модуляторов на ГАМКА рецепторы

2.1. Влияние -карболина абекарнила на активность ГАМКА рецепторов ГАМКА рецепторы центральных нейронов являются мишенью действия анксиолитических препаратов, наиболее известными из которых являются бензодиазепины, в частности, диазепам. Бензодиазепины осуществляют эффекты, связываясь с бензодиазепиновым сайтом ГАМКА рецептора и аллостерически модулируя ответы на ГАМК. Однако, помимо анксиолитических свойств, эти препараты имеют ряд побочных эффектов, включающих сонливость, миорелаксацию и возможное развитие зависимости.

Поэтому усилия фармакологов направлены на поиск избирательных анксиолитиков, лишенных этих побочных эффектов. Предполагалось, что одним из таких препаратов может быть абекарнил – не-бензодиазепиновый лиганд бензодиазепинового сайта ГАМКА рецептора. Обладая выраженной анксиолитической активностью в экспериментах на животных, этот препарат не имел атаксиогенных свойств (Turski et al., 1990; Stephens et al., 1990). Эти наблюдения позволили предположить, что абекарнил может являться либо частичным агонистом бензодиазепиновых рецепторов, либо селективным агонистом для их субпопуляции (Stephens et al., 1990). Однако данных поведенческих исследований не достаточно, чтобы выбрать между этими

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что для ГАМКА рецепторов в клетках Пуркинье мозжечка абекарнил является полным агонистом бензодиазепиного сайта, вызывая эффекты, сходные по величине с эффектами полного агониста диазепама. Медленная кинетика эффектов абекарнила не позволила нам корректно оценить величину ЕС50 для этого препарата, однако из представленных данных ясно, что абекарнил был более действенным агонистом – пороговая концентрация, вызывающая потенциацию ГАМК-тока, составляла 50-100 нМ для диазепама и 2 нМ для абекарнила.

Прототип лигандов бензодиазепиновых рецепторов диазепам обладает не только анксиолитическими, но и седативными свойствами. Полученные недавно данные свидетельствуют о том, что седативные эффекты опосредуются преимущественно ГАМКА рецепторами, содержащими субъединицу 1, а анксиолитические - 2- и/или 3-содержащими рецепторами (Atack, 2011). Тип ГАМКА рецепторов в клетках Пуркинье (с субъединичным составом 12/32) наиболее часто встречается в центральных нейронах. В наших исследованиях абекарнил обнаружил свойства полного агониста этих рецепторов. Возможно, именно с этим обстоятельством связан тот факт, что, как показали более поздние клинические исследования, анксиолитические и седативные свойства у абекарнила, как и у диазепама, выражены примерно в равной степени (Rickels at al., 2000). Поэтому этот препарат в настоящее время не рассматривают как селективный анкcиолитик (Whiting, 2006; Gale and Millichamp, 2011). Однако как седативный препарат он имеет преимущество перед диазепамом, поскольку, в отличие от последнего, не меняет уровень экспрессии мРНК субъединиц ГАМКА рецептора при длительном применении (Holt et al., 1996).

2.2. Модуляция ГАМКА рецепторов нестероидными противовоспалительными средствами из группы фенаматов Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) широко используются в клинической практике как препараты, оказывающие жаропонижающее, анальгезирующее, кардиопротективное и противовоспалительное действие (Green, 2001). Основные эффекты НПВС связаны с их способностью угнетать синтез простагландинов путем ингибирования циклооксигеназного пути. НПВС хорошо проникают через гематоэнцефалический барьер, с чем связывают ряд центральных эффектов этих препаратов. Было показано, что они обладают нейропротекторными свойствами при нейродегенеративных заболеваниях (McGeer and McGeer, 2007) и в экспериментальных моделях с глутаматной токсичностью (Chen et al. 1998), а также вызывают аналгезию при прямом введении их в ЦНС (McCormac, 1994). Наиболее выражены центральные эффекты у НПВС, относящихся к группе фенаматов. Было обнаружено, что фенаматы способны блокировать или потенцировать ответы, вызываемые ГАМК, в ооцитах Xenopus (Woodward et al., 1994; Halliwell et al., 1999). В то же время механизмы, лежащие в основе этих эффектов, недостаточно ясны. Задача настоящего раздела работы состояла в исследовании механизмов взаимодействия фенаматов с ГАМКА рецепторами центральных нейронов. На изолированных клетках Пуркинье мозжечка были исследованы механизмы действия трех препаратов из группы фенаматов:

нифлумовой (НФК), толфенамовой (ТФК) и мефенамовой (МФК) кислот.

При поддерживаемом потенциале -70 мВ одновременная аппликация ГАМК в концентрации 2 мкМ (около ЕС20) и исследуемого препарата вызывала двухфазную модуляцию ГАМК-активируемого тока. В диапазоне от 1 до ~100 мкМ фенаматы потенцировали ответы до 600% с EC50 40.0±3.7 мкМ для НФК, 10.1±3.2 мкМ для ТФК и 15.5±5.0 мкМ для МФК. При концентрациях фенаматов более 300 мкМ наблюдали угнетение ответов (Рис. 14).

Помимо влияния на амплитуду стационарного компонента ответа, ТФК и МФК заметно удлиняли время деактивации токов (off), вызываемых ГАМК. В записях, приведенных на Рис. 14 Б и В, при совместной аппликации 2 мкМ ГАМК и ТФК off возрастала с ~50 мс в контроле до 140, 240 и 360 мс при аппликации ГАМК с 3, 10 и 30 мкМ ТФК. МФК (3, 10 и 30 мкМ) увеличивала время деактивации до 240, 430 и 610 мс, соответственно. В среднем, время деактивации возрастало в 8.28±1.29 раз (n=6) под действием 100 мкМ ТФК и 12.5±1.5 раз (n=3) под действием 100 мкМ МФК.

Рис. 14. Влияние фенаматов на ГАМК-активируемые токи. (А-В) Примеры модуляции токов, вызываемых 2 мкМ ГАМК, нифлумовой (НФК) (А), толфенамовой (ТФК) (Б) и мефенамовой (МФК) (В) кислотами. Потенцирующие эффекты представлены на верхних панелях, ингибирующие – на нижних панелях записей. Поддерживаемый потенциал -70 мВ. (Г) Концентрационные зависимости эффектов фенаматов. (Д) Влияние фенаматов на скорость деактивации токов, вызываемых 2 мкМ ГАМК.

При активации рецепторов разными концентрациями ГАМК обнаружили, что потенцирующее действие фенаматов ослабляется при возрастании концентрации ГАМК. Для диапазона концентраций ГАМК 1-10 мкМ наблюдали сдвиг влево кривой доза ответ с уменьшением ЕС50 для ГАМК с 4.26±3.7 мкМ в контроле до 3.15±0.40 мкМ в присутствии 30 мкМ НФК (n=4, p0.05), до 2.11±0.23 мкМ в присутствии 10 мкМ ТФК (n=4, p0.01), до 1.59±0.25 мкМ в присутствии 30 мкМ МФК (n=4, p0.01). Такая зависимость эффектов препаратов от концентрации агониста указывает на аллостерический механизм потенцирующего эффекта. При концентрации ГАМК выше 10 мкМ потенцирующий эффект сменялся ингибирующим.

С целью исследования способности фенаматов взаимодействовать с закрытым ионным каналом НФК, ТФК или МФК апплицировали в разных концентрациях непосредственно перед изолированной аппликацией ГАМК.

При использовании этого протокола НФК потенцировала ответы на ГАМК с ЕС50=311±153 мкМ, ТФК с ЕС50=20.9±3.6 мкМ, МФК с ЕС50=30±12 мкМ (n=4Блокирующий эффект при этом не развивался. Эти наблюдения свидетельствуют о том, потенцирующий эффект фенаматов опосредуется их взаимодействием с сайтом, локализованном вне канальной поры. Исследование потенциалозависимости эффектов фенаматов показало, что потенцирующие эффекты при деполяризации мембраны ослабляются, а блокирующие усиливаются. Зависимость блокирующих эффектов фенаматов от мембранного потенциала указывает на то, что место их связывания, опосредующее блокирующий эффект, находится в канальной поре. Подробнее блокирующие эффекты НФК будут описаны в следующем разделе работы.

Полученные результаты позволяют предположить, что на ГАМКА рецепторе существуют, по крайней мере, два места связывания для фенаматов: (1) сайт с более высокой аффинностью, опосредующий потенцирующий эффект, и (2) низкоаффинный сайт, вызывающий блокирующий эффект. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что модулирующие эффекты фенаматов определяются совокупностью факторов – уровнем активации ГАМКА рецепторов, мембранным потенциалом и концентрацией модулятора.

При исследовании возможного участия известных модуляторных сайтов на ГАМКА рецепторном комплексе в потенцирующих эффектах фенаматов мы обнаружили, что они не связаны с взаимодействием фенаматов с бензодиазепиновым сайтом, поскольку антагонист бензодиазепинового места связывания флумазенил не предотвращал их развитие. Потенцирующие эффекты фенаматов были не-аддитивны с эффектами противосудорожного препарата лореклезола, что позволяет предполагать, что место связывания фенаматов может совпадать или частично перекрываться с местами связывания лореклезола и, возможно, анестетиков, поскольку описано совпадение или аллостерическое взаимодействие этих сайтов (Olsen and Li, 2011).

Исследования на свежеизолированных нейронах дают возможность оценить влияние фенаматов и на синаптическую активность, опосредуемую ГАМКА рецепторами. На соме этих нейронов сохраняются синаптические бутоны, из которых происходит спонтанное выделение медиатора, приводящее к развитию миниатюрных постсинаптических токов (мПСТ). Блокада подавляющего большинства мПСТ антагонистом ГАМКА рецепторов габазином (10 мкМ) свидетельствует о том, что они связаны с выделением ГАМК из пресинаптических терминалей и представляет собой тормозные ПСТ (мТПСТ).

В контроле спад мТПСТ был двухфазным и аппроксимировался двумя экспонентами – быстрой (1=4.4±0.03 мс) и медленной (2=29.3±7.4 мс). В присутствии 10 мкМ фенаматов амплитуда мТПСТ не менялась заметным образом, однако длительность мТПСТ сильно возрастала. Величина 1 в присутствии 10 мкМ ТФК была такой же, как и в контроле (4.6±0.04 мс), а 2 возрастала и достигала величины 59.1±0.2 мс (Рис. 15 А-В). В присутствии 100 мкМ ТФК амплитуда мТПСТ уменьшалась, а кинетика спада становилась еще медленнее. Величина 1 не отличалась от контроля (4.6±0.9 мс), а 2 возрастала до величины 258.1± 25.1 мс (Рис. 15 А-В). В присутствии 10 мкМ МФК 1 составляла 3.7±0.3 мс, а 2 775±58 мс. Эффекты фенаматов развивались быстро и были полностью обратимыми. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ГАМКергических синапсах на клетках Пуркинье фенаматы заметно увеличивают длительность постсинаптических токов. Учитывая описанное ранее значительное увеличение времени деактивации ГАМК-индуцируемых токов под действием фенаматов, мы можем рассматривать обнаруженные изменения кинетики мТПСТ как результат взаимодействия этих препаратов с постсинаптическими рецепторами. Поскольку увеличение длительности мТПСТ происходит при концентрациях фенаматов, которые могут достигаться в плазме крови при их клиническом использовании, можно ожидать, что описанные изменения параметров мТПСТ имеют место и при синаптической передаче в условиях in vivo.

Рис. 15. Влияние ТФК на спонтанные мТПСТ в изолированных нейронах Пуркинье. (А) Записи мТПСТ в контроле и в присутствии 10 и 100 мкМ ТФК. (Б) Диаграммы, представляющие величины постоянных времени спада () мТПСТ в контроле и в присутствии ТФК. Светлые столбики – величины для быстрой компоненты (1), заштрихованные – для медленной компоненты (2). Каждый столбик – средняя величина ± стандартные ошибки среднего (120 событий, 5 клеток), ** - p0.01, *** - p0.001. (В) – усредненные кривые спада мТПСТ в контроле и в присутствии ТФК и биэкспоненциальная подгонка этих кривых (сплошные линии).

2.3. Механизмы действия блокаторов на каналы ГАМКА рецепторов Блокаторы ионных каналов широко используются для изучения свойств и функциональной архитектуры ионных каналов. В настоящем разделе работы было проведено исследование механизмов взаимодействия с канальной порой ГАМКА рецептора трех препаратов – фуросемида, пенициллина и нифлумовой кислоты.

–  –  –

Обнаружили, что при поддерживаемом потенциале -70 мВ совместная аппликация ГАМК и фуросемида (1–5 мМ) подавляет ответы на ГАМК дозозависимым образом (Рис.16). Эффект фуросемида развивался быстро и был полностью обратим. Преинкубация клетки в растворе фуросемида не влияла ни на кинетику начальной фазы контрольного ответа, ни на величину блока, вызываемого его ко-аппликацией с ГАМК. Эти свойства блока указывают на отсутствие взаимодействия фуросемида с закрытым каналом и позволяют предполагать, что место связывания блокатора находится в канальной поре.

Величина блокирующего эффекта фуросемида возрастала при сдвиге мембранного потенциала в сторону деполяризации (Рис. 17). В концентрации 5 мМ фуросемид подавлял стационарный компонент ГАМК тока на 32.4±1.3%

–  –  –

Величина блока возрастала при увеличении концентрации ГАМК (Рис. 19). Так, при мембранном потенциале -70 мВ стационарный компонент ответов на 3 мкМ ГАМК при ко-аппликации с 1 мМ пенициллина уменьшался до 75±6.1% от контроля, ответов на 10 мкМ ГАМК – до 49±2.7%, а ответов, вызываемых 100 мкМ ГАМК, – до 36±6.2% (n=4). Стационарный компонент ответов, вызываемых низкими концентрациями ГАМК (1-2 мкМ) практически не изменялся под действием пенициллина, однако при этом наблюдалось удлинение ответа (Рис. 19 А).

–  –  –

Потенциалозависимоcть блока указывает на то, что место связывания препарата находится в канальной поре.

Анализ потенциалозависимости блока с использованием модели Вудхулл (Рис.

20 В, уравнение 1) показал, что величина для молекулы пенициллина составляет 0.39±0.03, а KD(0)=200±20 мкМ.

После окончания совместной аппликации ГАМК и пенициллина, также как и после аппликации фуросемида, наблюдали появление хвостового тока, амплитуда и кинетика которого зависели от концентрации блокатора и поддерживаемого потенциала (Рис. 18 А, 20 А). Хвостовой ток не регистрировался, когда пенициллин присутствовал в наружном растворе (Рис.

21 Б).

2.3.3. Механизмы блокирующего действия фуросемида и пенициллина Описано два основных механизма канального блока для лигандуправляемых каналов: «ловушка» и последовательный блок (или “foot-in-thedoor”). Канальные блокаторы, действующие по механизму ловушки, позволяют каналу закрываться и агонисту диссоциировать, когда блокатор продолжает быть связанным с каналом. Это приводит к «запиранию» блокатора в канале (Blanpied et al., 1997; MacDonald et al., 1991; Samoilova et al., 1999). В ситуации, когда блокатор заперт в канальной поре, выход из блока происходит только в присутствии агониста. В схеме последовательного блока канал не может закрыться, пока находится в блокированном состоянии (Adams, 1976; Neher and Steinbach, 1978; Neher, 1983; Antonov and Johnson, 1996; Benveniste and Mayer, 1995; Sobolevsky et al., 1999).



Pages:   || 2 |

Похожие работы:

«Бадтиев Юрий Саламович МЕТОДОЛОГИЯ БИОДИАГНОСТИКИ КАЧЕСТВА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ВОЕННЫХ ОБЪЕКТОВ 03.00.16 – Экология, 05.26.02 Безопасность в чрезвычайных ситуациях АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2006 Работа выполнялась в период с 1986 по 2006 г.г. в НИИ «Медстатистика», НИЦ информационных технологий экстремальных проблем, Экологическом центре...»

«САВИНОВ Иван Алексеевич Сравнительная морфология и филогения порядка Celastrales 03.02.01 – «Ботаника» Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН» Официальные оппоненты Нина Ивановна Шорина доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО Московский педагогический государственный...»

«МЕЛЬЧЕНКО Александр Иванович МИГРАЦИЯ РАДИОНУКЛИДОВ В АГРОЭКОЦЕНОЗАХ В УСЛОВИЯХ ЛЕСОСТЕПНОЙ И СТЕПНОЙ ЧЕРНОЗЕМНОЙ БИОГЕОХИМИЧЕСКОЙ ЗОНЫ ЮГА РОССИИ Специальность 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Краснодар 2014 Работа выполнена в лаборатории радиационной и химической экологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической...»

«ДОМНИНА Виктория Леонидовна ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ Г. ТУЛА МЕТОДАМИ БИОИНДИКАЦИИ И БИОТЕСТИРОВАНИЯ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тула 2015 Работа выполнена на кафедре биологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тульский государственный педагогический университет имени Л.Н....»

«Ильина Елена Петровна Незаконная добыча (вылов) водных биологических ресурсов (по материалам Камчатского края) 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2015 г. Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный юридический университет имени О.Е. Кутафина...»

«ПОПОВ Игорь Юрьевич ВЫМИРАНИЕ MARGARITIFERA MARGARITIFERA (L.) НА ЮГЕ АРЕАЛА В РОССИИ И МОДЕЛЬ ПРИРОДОХРАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискания учёной степени доктора биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете Официальные оппоненты: Иешко Евгений Павлович, доктор биологических наук, Институт биологии Карельского научного центра РАН заведующий лабораторией паразитологии животных и...»

«УДК 639.2.055: 639.2.053.7 БУЛГАКОВА Татьяна Ивановна РЕГУЛИРОВАНИЕ МНОГОВИДОВОГО РЫБОЛОВСТВА НА ОСНОВЕ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Специальность– 05.18.17 –промышленное рыболовство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва – 2009 г. Работа выполнена в лаборатории Системного анализа промысловых биоресурсов Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО) Официальные оппоненты: доктор...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНИРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Душанбе – 2014 Работа выполнена на кафедре защиты растений Таджикского аграрного университета им. Шириншоха Шотемура Научный руководитель: Кахаров Кахар Хабибуллаевич доктор сельскохозяйственных наук,...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологическом институте Российской академии наук доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Научный...»

«Жукова Дарья Григорьевна Диагностика и прогнозирование реакций гиперчувствительности к лекарственным препаратам у больных в периоперационном периоде в условиях многопрофильного стационара 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального...»

«КРАВЕЦ Виктор Сергеевич ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕТЕЙ С АУТИЗМОМ И ИХ МАТЕРЕЙ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Белгород 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук. Научный руководитель: Юров Иван Юрьевич, доктор биологических наук Официальные оппоненты: Курило Любовь...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – «Ботаника» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»

«ФЕДИН АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09. – аллергология и иммунология 14.01.03. – болезни уха, горла и носа АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пенза – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения...»

«Запольских Анна Михайловна Особенности эпидемиологии и профилактики пандемического гриппа в условиях мегаполиса 14.02.02 – эпидемиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научно исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель: Доктор медицинских...»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Балашовском институте (филиале) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г....»

«Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва — 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава Российской Федерации Научные руководители: Миронов Андрей...»

«Нгуен Тхи Тху Ха МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ ЛЕСНОГО ФОНДА ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ И ЦЕНТРАЛЬНОГО ВЬЕТНАМА 06.03.02 Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Использование недревесных ресурсов вносит существенный вклад в улучшение качества жизни населения многих стран, включая Россию и Вьетнам. До настоящего...»

«УСАЧЕВ ИВАН ИВАНОВИЧ Микробиоценоз кишечника, его оценка и контроль у овец, целенаправленное формирование у новорожденных ягнят 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Москва-2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», на кафедре терапии, хирургии, ветеринарного акушерства и...»

«Виноградов Илья Игоревич МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОГРАНИЧНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.03.02 – патологическая анатомия Рязань – 2015 Работа выполнена на кафедре патологической анатомии с курсом судебной медицины ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» Научные руководители: доктор медицинских наук Андреева Юлия Юрьевна...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.