WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |

«ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ...»

-- [ Страница 5 ] --

В таблице 12 представлены расчетные данные суммарной чувствительности ИФА с двумя антигенами. Большинство максимальных значений общей чувствительности было получено в сочетании с белком рRv2875 (74-85%). Из 14 отобранных антигенов лучшие показатели суммарной чувствительности (более 80%) были получены для 8 пар антигенов. Наиболее высокое значение чувствительности было получено для пары еRv3875Ar + рRv2875 (85%), при этом суммарная специфичность данного коктейля составила 96,7%, и показатель его диагностической достоверности был также самый высокий (87,7%) среди других вариантов (таблица 12).

По данным литературы, антигенные коктейли, применяемые для серодиагностики туберкулеза, включают, как правило, более двух антигенов [136, 139, 145, 149, 165, 241, 338, 349]. На основании данных, представленных в рисунке 14, нами были определены наиболее эффективные варианты антигенных коктейлей из трех антигенов M. tuberculosis, использованных в работе. Вычисление показателей чувствительности и специфичности для трехантигенного коктейля, как и для коктейля, содержащего два антигена (таблица 13) производилось на основании данных расчетов по cutoff1.

Таблица 12 - Расчетная чувствительность серодиагностического теста с двумя антигенами M. tuberculosis Антигены

–  –  –

Наиболее высокие значения показателей чувствительности (92%) были получены для сочетания антигенов рRv2875 + еRv3875Ar с еRv3874 или с еRv3425. Однако специфичность анализа для последнего варианта коктейля (90%) была ниже, чем для первого (93,3%). Таким образом, наиболее высокой диагностической достоверностью (92,3%), а значит и эффективностью в серодиагностике туберкулеза может обладать тест, основанный на сочетании трех антигенов: рRv2875, еRv3875Ar и еRv3874.

–  –  –

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Около одной трети населения планеты инфицировано M. tuberculosis. Риск активации туберкулеза у данных лиц в течение первых 5 лет после заражения составляет 5%. Кроме того, этот показатель существенно возрастает при наличии у таких людей сопутствующей патологии, прежде всего иммунодефицитов.

Высокие темпы распространения ВИЧ-инфекции и штаммов M. tuberculosis с МЛУ создают в России предпосылки для ухудшения эпидемиологической ситуации по туберкулезу. Решающее значение в борьбе с туберкулезом имеет ранняя достоверная диагностика заболевания, способствующая снижению риска передачи инфекции восприимчивым лицам [23, 25, 51, 217, 302, 335].

Стандартные методы диагностики туберкулеза имеют ряд недостатков, например, таких, как низкая чувствительность микроскопии мазка мокроты у олигобациллярных больных, длительный период роста культуры M. tuberculosis при посеве на твердые питательные среды, неспецифичность рентгенографии, высокая стоимость молекулярных методов детекции микобактерий и ложноположительные реакции при туберкулинодиагностике [51].

К преимуществам серодиагностических тест-систем, детектирующих специфические антитела против антигенов M. tuberculosis, можно отнести их простоту, воспроизводимость, малую инвазивность, возможность выявления заболевания вне зависимости от локализации очага и распространенности инфекции, а также доступность для стран с низким уровнем жизни населения.

Однако для утверждения серодиагностики в качестве стандарта необходимо значительное повышение чувствительности и специфичности существующих серодиагностических тестов [15, 108, 334].

Учитывая актуальность проблемы туберкулеза в нашей стране и необходимость повышения выявляемости заболевания на ранних этапах диагностического поиска, нами была поставлена задача - оценить возможности применения серодиагностики для скрининга туберкулеза в одном из регионов РФ.

С целью реализации поставленной задачи мы применили метод ИФА для определения уровней антительного ответа против 24 рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis у больных туберкулезом и здоровых жителей Саратовской области. Статистическая обработка данных ИФА позволила сравнить показатели эффективности анализов с различными антигенами M. tuberculosis, в том числе с аналогичными антигенами, полученными разными методами, и выявить потенциальные серомаркеры активного туберкулеза.

На первом этапе выполнения работы, на основании данных, полученных из научной литературы, нами был очерчен круг антигенов, имеющих перспективы для применения в серодиагностике туберкулеза. Обоснованием выбора антигенов служило соответствие их характеристик заявленным критериям, таким как:

специфичность антигена для возбудителя туберкулеза, достоверно более высокая реактивность сывороток больных туберкулезом с выбранными антигенами при активном, чем при латентном туберкулезном процессе, отсутствие ложноположительных реакций на исследуемые антигены у здоровых БЦЖвакцинированных людей, доказанная эффективность применения данных антигенов для серодиагностики туберкулеза в регионах с высокой инфицированностью населения M. tuberculosis, а также у различных категорий больных, в том числе при сочетании туберкулеза с ВИЧ-инфекцией.

В список антигенов M. tuberculosis, выбранных нами для получения и дальнейшего использования в ИФА, входили как белки, так и гликолипид ЛАМ (а именно его гексаарабинофуранозидный фрагмент).

Среди отобранных нами белков были антигены (Rv3872, Rv3874, Rv3875), кодируемые генами «RD1 региона», отсутствующего в геномах M. bovis BCG и многих нетуберкулезных микобактерий. Серодиагностика туберкулеза, основанная на определении антител против «RD1 белков», может обладать высокой специфичностью в связи с отсутствием у здоровых БЦЖвакцинированных людей перекрестной реакции на указанные антигены [63].

Выбранные для исследования антигены относились, главным образом, к группе секретируемых белков M. tuberculosis (Rv0040с, Rv0129с, Rv1837с Rv1860, Rv1886с, Rv2376с, Rv2875, Rv3803с, Rv3872, Rv3874, Rv3875, Rv3881с), которые наиболее доступны для клеток иммунной системы и, вероятно, раньше других вызывают антительный ответ в организме больного активным туберкулезом [99, 150, 176, 198].

Меньшее количество антигенов принадлежало к группам мембранных (Rv0934, Rv2873) и внутриклеточных белков M. tuberculosis (Rv0222, Rv1636, Rv2185с, Rv2031с, Rv3425).

В научной литературе для всех указанных выше антигенов M. tuberculosis были представлены доказательства их иммунодоминантности в гуморальном иммунитете при активном туберкулезе [67, 133, 138, 191, 250, 325, 344, 345].

Разными авторами было показано, что серодиагностика туберкулеза, основанная на выявлении антител против некоторых из выбранных нами антигенов M. tuberculosis (например, Rv0934, Rv1636, Rv1837с, Rv2185с) эффективна в случаях (таких как олигобациллярный легочный, внелегочный и сочетанный с ВИЧ-инфекцией туберкулез), когда традиционная диагностика туберкулеза малоинформативна [67, 133, 191, 258, 309, 325]. Использование указанных белков может определять преимущества серодиагностики перед другими методами диагностики.

Важным этапом выполнения работы являлся выбор способа получения антигенов M. tuberculosis для дальнейшего использования в ИФА. Несмотря на высокую чувствительность серотестов, основанных на нативных антигенах, выделенных из культуры микобактерий, получение данных препаратов для целей серодиагностики не представляется целесообразным в связи с длительностью и сложностью культивирования M. tuberculosis [241, 257, 259]. В связи с этим для получения антигенов M. tuberculosis было решено использовать рекомбинантные экспрессионные системы или химический синтез.

Преимуществами экспрессионной системы являются ее E. coli относительная простота, коммерческая доступность, быстрый рост культуры и потенциально высокие уровни экспрессии рекомбинантных белков [52, 345].

В данной работе экспрессионная система E. coli была использована нами для получения 8 рекомбинантных белков M. tuberculosis (еRv0222, еRv1837c, еRv1860, еRv2875, еRv3425, еRv3872, еRv3875, еRv1886с-Rv3875), в том числе одного химерного белка. Экспрессия белков проводилась в штамме E. coli BL21под индукцией ИПТГ и селективным давлением CodonPlus(DE3)-RP антибиотиков. Все белки экспрессировались в тельцах включения и, благодаря наличию в структуре белков полигистидиновых тагов, внесенных в кодирующие последовательности белков методом генетической инженерии, были очищены из лизатов культуры E. coli металлхелатной хроматографией в денатурирующих условиях.

При анализе полученных рекомбинантных белков в ДСН-электрофорезе в 10-12% ПААГ для еRv1860 (45/47кДа комплекс) была обнаружена аномально замедленная миграция (кажущаяся молекулярная масса белка была 45/52 кДа при расчетных значениях 33,5 кДа). Аналогичные результаты были получены и другими авторами как для нативного, так и рекомбинантного Rv1860. Подобное аберрантное миграционное поведение объясняется присутствием в полипептидной цепи белка ригидных терминальных участков, богатых пролином [92, 176, 198].

Низкая электрофоретическая подвижность наблюдалась в исследованиях как для 45кДа, так и для 47кДа (гликозилированной) форм белка Rv1860, полученного в Streptomyces lividans, что, таким образом, опровергало мнение об участии посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, в данном феномене [176].

Незрелые белки Rv2875, Rv1860, Rv0040с в M. tuberculosis содержат сигнальные пептиды, которые отщепляются специфическими протеазами при процессинге белка. Кодирующие последовательности сигнальных пептидов данных белков при клонировании их в E. coli, в отличие от получения в P. pastoris, не удалялись. Сопоставляя расчетные размеры сигнальных пептидов и различия в молекулярных массах белков на ДСН-электрофорезе, можно сделать предположение о том, что наличие двух форм белков, отличающихся друг от друга на 4-6кДа, обусловлено нарушениями процессинга микобактериальных белков в E. coli. Антитела к сигнальным пептидам белков, как правило, не образуются, поэтому их сохранение не должно было повлиять на результаты ИФА. В частности, в работе H. G. Wiker было обнаружено пять В-клеточных эпитопов в зрелом белке Rv2875 (MPT70), но ни одного в области его сигнального пептида. На основании полученных данных можно предположить целесообразность производства белков M. tuberculosis в системе E. coli без нативных сигнальных пептидов [329].

Одним из методов усовершенствования антигенных препаратов для серодиагностики туберкулеза является внесение в их структуру дополнительных эпитопов из других антигенов M. tuberculosis методом химической конъюгации [208].

Основным эпитопом ЛАМ для специфических антител при туберкулезе является его терминальный гексаарабинофуранозид По данным (Araf6).

литературы конъюгаты химически синтезированных с бычьим Araf6 сывороточным альбумином позволяют эффективно выявлять случаи туберкулеза в ИФА [69, 126, 304].

В рамках нашей работы с целью внесения дополнительных эпитопов в структуру антигена и повышения чувствительности серодиагностики с одним антигеном сотрудниками ФБГУН ИОХ РАН было получено 6 гликоконъюгатов еRv2376сАr, еRv2875Аr, еRv3881сАr, еRv3875Аr, еRv1886cеRv0222Аr, Rv3875Аr) рекомбинантных белков M. tuberculosis, экспрессированных в системе E. coli, с синтетическим Araf6 ЛАМ. При синтезе было использовано несколько подходов (метод дифференциации гидроксильных групп арабинофуранозы, преспейсерный подход), позволяющих значительно сократить время и средства, необходимые для получения гликоконъюгатов, что может иметь большое значение при производстве серотестов для массового обследования населения на туберкулез[1, 32].

Рекомбинантные белки M. tuberculosis, полученные в экспрессионной системе E. coli, как правило, отличаются по структуре от их нативных аналогов.

Одним из основных недостатков экспрессионной системы E. coli является отсутствие в ней посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков, в частности, гликозилирования [118]. Многие, главным образом, секретируемые и поверхностные, белки M. tuberculosis гликозилированы, преимущественно Оманнозилированы (Rv0040c, Rv1860, Rv2873, Rv3763 и другие) [53, 81, 88, 198, 284, 329]. Данная модификация играет важную роль в формировании нативной конформации и стабильности молекулы белка, а также в процессах молекулярного распознавания, клеточной адгезии и во взаимодействии с антителами. Кроме того, человеческие антитела, в отличие от мышиных, в период прогрессирования естественного заболевания туберкулезом распознают гликозилированные конформационные эпитопы на нативных белках M. tuberculosis [90, 176, 262].

В связи с вышеизложенным, нами была поставлена задача - получить гликозилированные рекомбинантные белки M. tuberculosis для дальнейшей оценки их серодиагностического потенциала с помощью ИФА [80].

Для достижения поставленных целей нами была выбрана система Pichia pastoris, как наиболее простой, дешевый, хорошо изученный «инструмент»

получения рекомбинантных белков в большом объеме, которые секретируются в культуральную среду в нативной конформации (что позволяет избежать этапа рефолдинга белка) при незначительном количестве собственных белков. Белки в P. pastoris подвергаются посттрансляционным модификациям, в частности, Оманнозилированию, характерному для M. tuberculosis, что дает возможность получать белки по структуре близкие к нативным белкам микобактерий [193].

В системе P. pastoris нами было получено 7 антигенов M. tuberculosis Rv0040с, Rv1837с, Rv1860, Rv2873, Rv2875, Rv1636, Rv2185с - два последних в составе химерного белка рRv1636-Rv2185с. Секрецию белков в культуральную среду обеспечил сигнальный пептид (-фактор), генетическая последовательность которого содержится в плазмиде pPIC9. Кодирующие последовательности нативных сигнальных пептидов секретируемых белков M. tuberculosis были удалены на этапе амплификации генов с хромосомы M. tuberculosis с целью достижения более эффективной секреции их клетками P. pastoris и сохранения полигистидинового участка на N - конце полипептидной цепи.

Экспрессия рекомбинантных белков проводилась в штаммах P. pastoris KM71 (фенотип His+Muts) и GS115 (His+Mut+). Условия культивирования во всех случаях были одинаковыми (состав сред, температурный режим, скорость перемешивания, время культивирования и другое). При этом уровень экспрессии в культуре P. pastoris для разных белков варьировал от 0,05 г/л (рRv1837с) до 0,8 г/л (рRv1860).

Отсутствие экспрессии в P. pastoris при данных условиях культивирования было обнаружено для белков Rv0129с, Rv0934, Rv3425 и Rv3803с (при наличии подтверждений правильного расположения соответствующих генов в хромосоме P. pastoris и роста трансформированных клонов в среде с метанолом). Вероятно, экспрессия белков была минимальной, что может быть обусловлено, например, нестабильностью белка в среде или его протеолизом под действием дрожжевых протеаз. Однако точная причина отсутствия экспрессии данных белков в P. pastoris нами не установлена.

Крайне низкая экспрессия рекомбинантного белка в P. pastoris, либо ее отсутствие при подтвержденном правильном расположении его гена в хромосоме дрожжей может быть связана с неблагоприятными для них условиями культивирования.

Для повышения выхода белка при культивировании рекомбинантных штаммов P. pastoris возможно применение различных способов оптимизации экспрессии. Одним из них является предупреждение протеолитической деградации рекомбинантных белков.

P. pastoris секретирует в среду сравнительно небольшое количество эндогенных белков. Однако среди них все же есть белки, обладающие протеолитической активностью, например, субтилисин (сериновая протеаза), секретирующийся в минорных количествах в среду с метанолом при культивировании P. pastoris [256].

С большей вероятностью протеолиз секретируемых белков может возникнуть при лизисе клеточных мембран и высвобождении вакуолярных протеолитических ферментов (таких, как протеиназы А и В, карбоксипептидаза У, аминопептидаза) в среду при ферментации в культуре высокой плотности.

Причинами повреждения дрожжевых клеток может быть нехватка питательных веществ, а также смена источника углерода, нагревание, изменение рН среды, влияние токсических веществ и другое. Снизить активность протеаз можно с помощью таких веществ как ФМСФ (ингибирует протеиназу B, карбоксипептидазу У), пепстатин (протеиназу А), E-64 (цистеиновые протеазы) и другие.

Насыщение среды азотом, например, добавление дрожжевого экстракта или аминокислот, может также значительно снизить деградацию и повысить экспрессию белка. В качестве ингибитора внеклеточных протеаз P. pastoris мы использовали казаминовые кислоты (солянокислотный гидролизат казеина) до 1% в среде [280].

Для оптимизации экспрессии гетерологичных белков в P. pastoris необходим индивидуальный подбор условий культивирования рекомбинантных штаммов P. pastoris. Например, изменение рН среды может обеспечить его стабильность, а закисление среды до рН=3,0 - снизить активность многих протеаз, не оказав негативного влияния на рост клеток P. pastoris [60, 342].

Изменение температурного режима культивирования также влияет на экспрессию белка. Например, понижение температуры культуры до 20°С снижает активность большинства протеаз, и, по некоторым данным, способствует увеличению продукции рекомбинантного белка, что может быть связано с более эффективным фолдингом белка и повышением жизнеспособности клеток при более низкой температуре [289, 297]. Z. Li отмечает уменьшение формирования димеров и агрегации белка при культивировании P. pastoris при температуре 23°С. А неправильно свернутые и агрегированные белки более подвержены протеолитической деградации. Повышение температуры культивирования выше 32°С может привести к гибели клеток P. pastoris [182].

Однако в нашей работе, несмотря на попытки оптимизировать экспрессию белка Rv0934 в дрожжевой системе за счет использования двух штаммов P. pastoris (GS115 и KM71), двух вариантов сред с рН=6,0 или рН=3,0 и двух температурных режимов (20°С или 29°С), ни в супернатанте культуры P. pastoris, ни в лизате клеток дрожжей белок так и не был обнаружен. Допустимо предположить, что нативный лидерный пептид Rv0934, который не был удален из гена rv0934 при клонировании, затруднил его секрецию P. pastoris, и белок подвергся расщеплению внутриклеточными протеазами дрожжей.

Интенсивное перемешивание культуры обеспечивает лучшую аэрацию среды, что имеет критическое значение для роста дрожжей и продукции ими рекомбинантного белка. Метаболизм метанола клетками требует повышенного содержания кислорода в среде. Также при выращивании культуры высокой плотности поддержание определенной концентрации растворенного кислорода в среде имеет критическое значение. Повышение скорости перемешивания (до 300 об/мин) может способствовать большей доступности кислорода для клеток [76, 313].

Для культивирования культуры P. pastoris используют объем среды, составляющий 1/10 объема колбы, что также увеличивает контактную поверхность среды с кислородом. Однако при таких условиях наблюдается испарение жидкости во время культивирования и, таким образом, концентрирование среды. Мы в нашей работе использовали меньшее соотношение объемов среды/колбы (1:5-1:7), при этом повысив аэрацию среды (за счет двухслойных марлевых лоскутов в качестве «пробок») и компенсируя потери жидкости при испарении.

Концентрация содержания метанола в среде является ведущим параметром, определяющим интенсивность экспрессии белка P. pastoris [281]. Метанол является не только индуктором экспрессии белка, но и единственным источником углерода и энергии для жизнедеятельности клеток [313]. Однако при избыточном содержании метанола и кислорода в среде аккумулируются формальдегид и свободные радикалы в токсичных для клеток дрожжей концентрациях [293].

Кроме того, высокая концентрация метанола ингибирует рост дрожжевых клеток, а низкая - может быть недостаточна для индукции экспрессии целевого белка [201, 281]. Согласно собственным наблюдениям, а также руководствуясь данными литературы, мы выбрали концентрацию индуктора экспрессии белка, метанола, 1% как наиболее оптимальную для получения рекомбинантных белков при данных условиях культивирования.

Сохранение постоянной концентрации метанола в среде позволяет обеспечить более высокий выход белка, по сравнению с колебаниями концентрации при дробном внесении субстрата (один раз в 24 часа). Применение систем, поддерживающих постоянство содержания кислорода и метанола в среде, является оптимальным способом для получения высокого выхода белка [120, 207].

Для всех белков, полученных в P. pastoris, в денатурирующем электрофорезе в ПААГ было выявлено возрастание молекулярных масс на 2-8кДа (примерно соответствующее числу сайтов N-гликозилирования), по сравнению с расчетными значениями, что может свидетельствовать о гликозилировании белков в P. pastoris.

Для белка рRv1860 так же, как и в случае аналогичного белка, экспрессированного в E. coli, была обнаружена замедленная миграция в ПААГ при ДСН-электрофорезе, что связано с наличием богатых пролином ригидных участков на конце полипептидной цепи (коротких повторяющихся мотивов (КПМ)). Кроме того, КПМ иногда принимают участие в неспецифическом связывании белков друг с другом, что может объяснитьолигомеризацию белка рRv0040c [154, 198, 332].

Гомодимер белка рRv2873 обнаруживался только после высаливания его из культуральной среды, а иммуноблот образца супернатанта культуры P. pastoris до высаливания выявлял только мономер рRv2873. Вероятно, увеличение концентрации белка и влияние космотропных агентов (остаточный сульфат аммония (по данным литературы до 0,3М), сульфат натрия, хлорид калия и другие) после высаливания способствовали возникновению и поддержанию межмолекулярных взаимодействий между двумя молекулами белка [58]. Тем не менее, расхождение значений кажущихся и расчетных молекулярных масс белков (как для мономеров, так и гомодимеров) может указывать на гликозилирование и олигомеризованных белков.

Одним из перспективных подходов для объединения эпитопов из различных антигенов является получение химерных белков, кодируемых слитными генами [136].

В настоящей работе было создано два генетически слитых белка, один из них был экспрессирован в P. pastoris (рRv1636-Rv2185с), другой - в E. coli (еRv1886с-Rv3875). Последний был также конъюгирован с Araf6 ЛАМ (еRv1886сRv3875Ar). Ренатурация белка еRv1886с-Rv3875 после хроматографии в денатурирующих условиях потребовала внесения в диализный раствор стабилизирующих компонентов (ДТТ, глицерин). Белок рRv1636-Rv2185с секретировался непосредственно в культуральную среду, что позволило проводить очистку белка в нативных условиях и с помощью диализа удалить лишь некоторые компоненты элюирующего буфера из раствора белка.

Для P. pastoris характерно низкое содержание в среде протеаз. Тем не менее, при экспрессии химерного белка рRv3874-Rv3875-Rv2031с в P. pastoris наблюдалась его N-терминальная деградация. Это, вероятно, было связано с отщеплением первого антигена из-за диссоциации комплекса Rv3874-Rv3875 в составе химерного белка вследствие ацетилирования N-конца Rv3875. Комплекс Rv3874-Rv3875 (CFP-10-ESAT-6) имеет высокий потенциал для применения его в серодиагностике туберкулеза, поэтому проблема получения его в дрожжевой системе, возможно, требует отдельного изучения [202, 220].

Применение в работе протеаза - дефицитных штаммов P. pastoris (SMD1163, SMD1165, SMD1168), подбор оптимальных линкеров, а также модификация или удаление специфических протеолитических сайтов может снизить вероятность деградации слитого белка при получении в дрожжевой системе [124, 224, 347, 348].

С другой стороны, при секретируемом варианте экспрессии необходимо учитывать факторы среды (рН, содержание нейтральных солей, температуру культивирования и другие.), влияющие на растворимость гибридного белка и стабильность его в растворе. Следовательно, при создании химерных рекомбинантных белков необходим индивидуальный подбор систем экспрессии, а также оптимизация условий его получения для каждого белка.

Оценка серодиагностического потенциала антигенов M. tuberculosis проводилась методом ИФА с сыворотками больных легочным туберкулезом и здоровых жителей Саратовской области. Территориальное ограничение при формировании панелей сывороток в пределах одного региона РФ было продиктовано представлением о географической гетерогенности гуморального иммунного ответа при туберкулезе [45, 136, 191, 210, 258, 270, 308, 325].

Согласно данной гипотезе эффективность выявления больных туберкулезом с помощью одного теста в разных регионах может существенно отличаться ввиду особенностей иммуногенетики разных этнических групп, различий циркулирующих в регионе штаммов по спектру M. tuberculosis экспрессирующихся белков, неодинаковых уровней инфицированности населения M. tuberculosis и охвата жителей региона БЦЖ-вакцинацией (таблица 6) [191].

По данным отчета Федерального государственного бюджетного учреждения «Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения» Министерства здравоохранения РФ на 2012 год значения основных статистических показателей по туберкулезу, таких, как заболеваемость, распространенность, смертность, доли больных с МЛУ и ВИЧ, охват профилактическими осмотрами, для Саратовской области были близки к средним значениям по сране. В частности, общая заболеваемость туберкулезом по области в 2012 году – 61,5 против 68,1 (по России), а распространенность – 153,4 против 157,7 на 100000 населения [20].

Активный миграционный процесс может оказать влияние на стабильность тех характеристик региона, которые определяют его географическую специфичность. В Саратовской области наблюдается невысокий уровень миграционных потоков – 1,1% (28 тыс. прибывших из других регионов и стран за 2012 год), тогда как, например, в Московской области этот показатель - 3,2% (222 тыс. человек) [4]. Таким образом, устойчивые усредненные статистическими показатели по туберкулезу в Саратовской области позволяют экстраполировать данные, получаемые в исследовании, на весь регион и, вероятно, частично и на другие регионы РФ со схожими эпидемиологическими характеристиками, по крайней мере, с точки зрения подхода к выполнению работы и сравнения данных.

Тем не менее, для каждого региона подобные исследования должны проводиться отдельно.

Для целей исследования из лечебных учреждений Саратовской области было получено 100 сывороток от доноров, больных туберкулезом легких, и 30 – от здоровых БЦЖ-вакцинированных людей. Донорами сывороток были лица обоих полов старше 18 лет. Во многих исследованиях, посвященных оценке серодиагностического потенциала антигенов M. tuberculosis, так же, как и в нашей работе, использовались только две группы сравнения (больные туберкулезом и здоровые) и схожие объемы выборок, в том числе в составе неравных групп [45, 136, 216, 258, 270, 325, 346].

Для стран с большим резервуаром латентного туберкулеза наиболее значимым является раннее выявление больных в период активации заболевания, в том числе у больных с хроническим течением инфекции. С этой целью панель сывороток больных включала сыворотки как от вновь выявленных больных, так и от больных с рецидивом заболевания. Среди диагнозов доноров сывороток исследуемой группы большую часть составлял инфильтративный туберкулез легких, однако, в 5% случаев был зарегистрирован фиброзно-кавернозный туберкулез, что может говорить о позднем выявлении заболевания.

Важным аспектом применения серодиагностических систем на практике является возможность диагностировать случаи олиго- и абациллярного туберкулеза легких. В нашей работе только 54% больных были бактериовыделителями. При этом все сыворотки пациентов с отрицательными результатами бактериоскопии мазка (73% доноров) или посева мокроты (56% доноров) реагировали в ИФА хотя бы с одним антигеном M. tuberculosis, что может свидетельствовать об эффективности серодиагностики в подобных, трудно выявляемых традиционными методами диагностики, случаях туберкулеза.

При проведении иммуноанализа необходимо аргументированно подходить к выбору класса детектируемых антител. В связи с тем, что антимикобактериальные антитела класса G обнаруживаются в периферической крови больных туберкулезом более продолжительное время и в большей концентрации, чем антитела других классов, а также обладают высоким сродством к антигенам M. tuberculosis, мы отдали свое предпочтение определению в ИФА именно IgG [100, 324].

Твердофазный гетерогенный непрямой ИФА выполняли согласно стандартным методикам, описанным в научной литературе для аналогичных исследований [44, 86, 111, 135, 291, 301, 336]. Анализы со всеми изучаемыми антигенами M. tuberculosis проводились в одинаковых условиях (с теми же реактивами, оборудованием, методиками и исполнителем), что уменьшало влияние дополнительных факторов на результаты работы. Кроме того, на каждый планшет вносили 5 контрольных сывороток для последующего сравнения данных, полученных на разных планшетах с одним антигеном. Перед проведением ИФА были определены оптимальные концентрации антигенов для нанесения на планшет (таблица 1), обеспечивающие связывание максимального числа специфических антител из сывороток, и, таким образом, способствующие более четкому разграничению «положительных» и «отрицательных» сывороток.

Статистический анализ данных проводился с помощью стандартных методов с применением специализированных компьютерных программ.

Согласно данным статистического анализа все использованные нами антигены M. tuberculosis достоверно выявляли туберкулез (различия между средними значениями OD450 для групп здоровых и больных были статистически значимы (p0,05)).

Корреляционный анализ в большинстве случаев не выявил взаимосвязи между повышенными уровнями реактивности сывороток больных туберкулезом против различных антигенов (значений OD450 в ИФА) и клиническими характеристиками их доноров (пол, возраст, диагноз, результаты бактериоскопии мазка мокроты, наличие распада в легочной ткани, рецидива). Несмотря на обнаружение прямой достоверной (p0,05) корреляции между диагнозом «фиброзно-кавернозный туберкулез легких» и повышенной реактивностью сывороток против eRv3875, eRv1860 и еRv3874, рецидивом заболевания - и eRv1860, а также распадом легочной ткани у доноров и высоким титром антител против eRv0040с, малые объемы выборок сравнения данных, использованные для анализа (5-30 образцов), не позволяли судить о закономерности выявленных взаимосвязей для популяции в целом.

Вычисление показателей эффективности применения антигенов для целей серодиагностики туберкулеза таких, как чувствительность, специфичность, диагностическая достоверность, осуществлялось тремя методами: с помощью расчета двух видов «отсекающих значений» (применяемых в эндемичных (по cutoff1) и неэндемичных (по cutoff2) регионах по туберкулезу), а также посредством ROC анализа. Все указанные варианты расчетов результатов ИФА используются в научной литературе для оценки серодиагностического потенциала антигенов M. tuberculosis [119, 146, 149, 179, 239, 241, 253].

Чувствительность анализов со всеми исследованными белками варьировала от 19 до 60% (при расчете по cutoff1) или от 5% до 46% (cutoff2), а диагностическая достоверность (доля истинных результатов из общего объема выборки, эффективность теста) - 37,7% до 69,2% (cutoff1), от 26,9% до 58,5% (cutoff2.). Наименьшие и наибольшие значения обоих показателей были получены для белков, рRv2873 и рRv2875, соответственно. Специфичность анализов с указанными белками составила 100%.

Интересно, что по данным литературы на протяжении последних десятилетий серодиагностический потенциал указанных белков изучался, главным образом, в отношении бычьего туберкулеза [71, 141, 345]. Это было, вероятно, связано с данными о низкой экспрессии Rv2873 (МРТ83) и Rv2875 (МРТ70) M. tuberculosis (показано в исследовании in vitro), и вследствие этого предполагаемым слабо выраженным гуморальным ответом на них при туберкулезе [71, 134, 186, 327, 329]. Тем не менее, в недавнем исследовании G.C.

(2010 года) среди 42 рекомбинантных антигенов Ireton M. tuberculosis, использованных ИФА с сыворотками больных туберкулезом легких из разных популяций, Rv2875 оказался одним из лучших серомаркеров заболевания, выявив 74% больных туберкулезом из Бразилии и 55% - из Индии. Чувствительность ИФА с Rv2873 с сыворотками больных туберкулезом в работе L.

Zhang (2011 год) составила 34,4% [141, 345]. Таким образом, данные, полученные как в нашей работе, так и зарубежными авторами, могут поставить под сомнение представление о низкой экспрессии генов mpt83 и mpt70 в M. tuberculosis, и, следовательно, минорной продукции белков Rv2873 и Rv2875. Действительно, было показано, что, для M. tuberculosis характерен низкий базальный уровень активации генов mpt83 и mpt70, но индуцирование их экспрессии при инфицировании M. tuberculosis макрофага [134, 315]. Кроме того, в исследованиях разных авторов показано, что МРТ70 и МРТ83 вызывают Т-клеточный ответ у больных активным туберкулезом, а предварительная иммунизация лабораторных мышей МРТ83 обеспечивает протективный эффект (меньшую обсемененность легких и селезенки M. tuberculosis) при экспериментальном туберкулезе [150, 214]. В соответствии с представленными данными можно сделать вывод о том, что для активации туберкулезного процесса характерно повышение продукции белков Rv2873 и Rv2875, а также формирование гуморального иммунного ответа на указанные антигены. Следовательно, обнаружение в крови больного антител против Rv2873 и Rv2875 может указывать на наличие туберкулезной инфекции. С другой стороны, все доноры сывороток в детстве были иммунизированы субштаммом M. bovis BCG Russia, для которого характерна высокая экспрессия белков МТВ83 и МТВ70 Однако предположение о возможном [315].

регистрировании у больных в ИФА поствакцинальных анти-Rv2873 и анти-Rv2875 антител нам представляется маловероятным, прежде всего, в связи с отсутствием высоких титров указанных антител у здоровых БЦЖвакцинированных доноров.

При сопоставлении показателей серодиагностической эффективности рRv2873 и рRv2875, полученных в экспрессионной системе P. pastoris, возникает вопрос о причинах столь выраженных различий в значениях чувствительности анализов с ними, притом, что гены mpt83 и mpt70 объединены в составе одного оперона под общим промотором, предполагая схожую интенсивность их экспрессии, а сами белки имеют высокую гомологию. Объяснением результатов, с одной стороны, могут служить различия в доступности белков для иммунной системы, в связи с тем, что Rv2875 (МРТ70/МТВ70) – секретируемый, а Rv2873 (МРТ83/МТВ83) – мембранный белки M. tuberculosis. С другой стороны, некоторыми авторами были получены доказательства различий в динамике антиRv2873 и анти-Rv2875 антител при экспериментальном бычьем туберкулезе.

Например, K.P.Lyashchenko и соавторами антитела против МТВ83 были определены в крови больных животных уже на 4 неделе, а против МРВ70 - только на 18-22 неделях после заражения M. bovis [192, 322, 339]. Таким образом, если подобная стадийность в проявлении гетерогенности гуморального ответа против указанных белков существует и при туберкулезе у людей, тогда различия в полученных нами результатах ИФА с рRv2873 и рRv2875 могут быть связаны с разными сроками взятия образцов крови у пациентов после возникновения заболевания. Тем не менее, мы не можем отрицать вероятность нарушения процессов связывания специфических антител с эпитопами белка рRv2873 из-за структурных отличий белка от его нативного аналога (например, изменения конформации белка вследствие образования его димера или избыточного гликозилирования). Для установления истинной причины выявленных различий, возможно, необходимы дополнительные исследования, в том числе с применением нативного белка MPT83.

С помощью ROC анализа мы смогли не только определить значения необходимых статистических показателей, но и визуально сравнить результаты ИФА, представленные в виде ROC-кривых для анализов с каждым антигеном.

Основной количественной характеристикой ROC-кривой является ППК. При сравнении значений данного показателя, полученного для анализов с разными белками, мы обнаружили, что лучшей диагностической точностью, то есть способностью разграничивать случаи туберкулеза и его отсутствия, обладал тест с рRv1860 (ППК = 0,855), а белки, полученные в системе E. coli, были менее пригодны для целей серодиагностики, по сравнению с аналогичными белками, полученными в P. pastoris, или с конъюгатами данных белков с углеводным фрагментом ЛАМ.

Другие показатели, рассчитанные в ROC анализе, в целом соответствовали результатам стандартного статистического анализа. Тем не менее, с помощью ROC были выявлены и некоторые дополнительные данные. Например, в ROC анализе на основании оптимального «порога отсечения» были определены существенно более высокие, по сравнению с расчетами по cutoff1 и cutoff2 значения чувствительности и диагностической достоверности для белка рRv2873, а высокое значение ОП+ для данных расчетов указывает на низкую вероятность ложноположительных результатов для теста с рRv2873, что позволяет использовать его для серодиагностики в сочетании с другими антигенами.

Посредством ИФА нами был оценен серодиагностический потенциал 12 рекомбинантных антигенов M. tuberculosis (еRv0040с, еRv0222, еRv1837c, еRv1860, еRv2376с, еRv2875, еRv3425, еRv3872, еRv3874, еRv3875, еRv3881с, еRv1886c-Rv3875), полученных в системе E. coli.

Среди них 3 антигена (еRv3872, еRv3874, еRv3875) относились к группе так называемых «RD1 белков». Их гены отсутствуют в геномах всех субштаммов M. bovis BCG и многих нетуберкулезных микобактерий, что предопределяет возможность получения высокоспецифичного диагностического теста, основанного на определении гуморального ответа против «RD1 белков» [63].

В нашей работе специфичность анализов с данными белками была в пределах 86,7 - 100% при разных вариантах расчета. Снижение специфичности в случае анализов с «RD1 белками» может быть обусловлено перекрестной реактивностью организма на гомологичные участки, присутствующие в структуре разных белков, относящихся к одним и тем же семействам, PE/PPE (как Rv3872 (PE35)) и ESAT6 (как Rv3874 (CFP-10) и Rv3875 (ESAT-6)), но продуцируемых как M. tuberculosis, так и другими микроорганизмами [110].

Среди 12 антигенов, экспрессированных в E. coli, лучшие показатели чувствительности и диагностической достоверности были получены именно в анализах с белком еRv3874. Согласно данным научной литературы многие исследователи также признают CFP-10 одним из наиболее перспективных антигенов для целей серодиагностики туберкулеза [349].

Белки Rv0222 и Rv3425 также относят к «RD белкам», но регионы RD4 и RD11, в которых соответственно расположены их гены, присутствуют в геноме M. bovis BCG Russia, и, следовательно, на данные белки может возникать перекрестная реакция у здоровых БЦЖ-вакцинированных людей [155, 250, 349].

Тем не менее, специфичности анализов с еRv0222 и еRv3425 в нашей работе были достаточно высокими, более 90% (при стандартных вариантах расчета показателей). Значения чувствительности анализов с еRv0222 и еRv3425 были средними, однако, при включении их в состав мультиантигенного коктейля в сочетании с такими белками как рRv1860, рRv2875, еRv3874, согласно проведенным расчетам, можно значительно повысить общую чувствительность анализа за счет компенсации индивидуальной гетерогенности гуморального ответа при туберкулезе на разные белки M. tuberculosis.

Шесть рекомбинантных белков M. tuberculosis (еRv0222, еRv2376с, еRv2875, еRv3875, еRv3881с, еRv1886c-Rv3875), полученных в E. coli, были ковалентно конъюгированы с синтетическим Araf6 ЛАМ. Полученные конъюгаты были использованы в ИФА наряду с неконъюгированными формами указанных антигенов.

Сравнение показателей эффективности антигенов для целей серодиагностики показало, что конъюгация белков с главным эпитопом ЛАМ позволяет выявить в ИФА дополнительно от 5 до 16% больных (при расчете по cutoff1 или 5 - 19% –cutoff2) без существенного снижения специфичности анализа.

Наибольший прирост значений показателей чувствительности и диагностической достоверности наблюдался для анализов с белками еRv3875Аr и еRv2875Аr.

Сравнение результатов ИФА с еRv1886c-Rv3875 и еRv1886c-Rv3875Аr показало, что химическое конъюгирование гибридных белков с эпитопом ЛАМ также приводит к повышению эффективности серодиагностики, как и в случае с отдельными белками.

В рамках данной работы была также исследована эффективность использования в ИФА белков Rv0934 и Rv1980c (получены в E. coli) и их конъюгатов с Araf6 ЛАМ, однако, анализ проводился с сыворотками из другого региона (г. Москва). Возрастание чувствительности для конъюгированных антигенов, по сравнению с неконъюгированными составило 13% и 11%, соответственно. Таким образом, «химическое гликозилирование»

рекомбинантных белков M. tuberculosis углеводным фрагментом ЛАМ является одним из перспективных методов для усовершенствования серодиагностических тестов, выявляющих туберкулез.

Многие значимые для серодиагностики, главным образом, секретируемые белки M. tuberculosis в нативных условиях подвергаются гликозилированию.

Наличие маннозных остатков в гликопротеинах M. tuberculosis обеспечивает формирование конформационных эпитопов и эффективное связывание специфических антител [91, 109, 176].

С целью получения гликозилированных белков мы M. tuberculosis использовали дрожжевую систему P. pastoris. Шесть антигенов M. tuberculosis, экспрессированных P. pastoris, а именно, рRv0040с, рRv1837c, рRv1860, рRv2875, рRv2873, рRv1636-Rv2185с, были тестированы в ИФА с сыворотками больных туберкулезом и здоровых людей. На основании результатов анализов было проведено парное сравнение статистических показателей для четырех белков (Rv0040с, Rv1837c, Rv1860, Rv2875), полученных как в системе P. pastoris, так и E. coli. Во всех случаях значения чувствительности и диагностической достоверности анализов были выше у белков из дрожжевой системы. Наиболее заметное повышение значений данных показателей наблюдалось для рRv0040с.

С помощью ИФА был оценен серодиагностический потенциал трех вариантов белка Rv2875 (еRv2875, рRv2875 и еRv2875Аr), что позволило сравнить эффективность всех трех методов получения антигена, использованных в нашей работе, для целей серодиагностики. Возрастание чувствительности анализа с еRv2875 после его конъюгирования с Araf6 было менее значительным, чем после «смены» системы экспрессии на P. pastoris. На основании результатов сопоставления наборов сывороток, которые реагировали в ИФА с различными вариантами антигена Rv2875, можно предположить, что конъюгация белка рRv2875 с фрагментом ЛАМ могла бы способствовать дополнительному повышению чувствительности анализа с указанным белком (согласно расчетам на 16% (cutoff1) и 18% (cutoff2)). Тем не менее, данное предположение может учитываться только после его экспериментального подтверждения.

В отличие от белков рRv0040с, рRv1860 и рRv2875, смена экспрессионной системы (с E. coli на P. pastoris) при получении антигена Rv1837с (МРТ81) не привела значительному улучшению показателей эффективности анализа.

Чувствительность анализа с рRv1837с, по сравнению с еRv1837с, возросла на основании расчетов по cutoff1,2 только на 3% (хотя по результатам ROC анализа эта цифра была все же выше – на 11%). Статистический анализ данных ИФА с рRv1837с, несмотря на такие предрасполагающие факторы, как размер белка (747аа), обуславливающий большое число линейных эпитопов в его структуре, а также получение белка P. pastoris в растворимой и, вероятно, гликозилированной формах, не выявил ожидаемого высокого серодиагностического потенциала рRv1837с для выявления туберкулеза (диагностическая достоверность была от 40,7% до 62,3% - согласно разным методам расчета). Возможным объяснением таких результатов, может быть наличие перекрестно-реагирующих анти-МРТ81 антител у доноров из контрольной группы или неспецифичности экспрессии указанного белка для M. tuberculosis при тех стадиях и формах туберкулеза, которые были у доноров, больных туберкулезом.

В нескольких работах показано, что МРТ81 является серомаркером туберкулеза на ранних стадиях заболевания, причем у ВИЧ-инфицированных людей анти-МРТ81 антитела обнаруживаются за годы до манифестации клинических проявлений туберкулеза [133, 169, 278]. С другой стороны, в исследовании X. Wu результаты тестирования белка МРТ81 с сыворотками больных туберкулезом и здоровых ВИЧ-отрицательных доноров были схожи с результатами, полученными в нашей работе [337].

В нашем исследовании, несмотря на то, что все сыворотки больных туберкулезом распознавали в ИФА те или иные антигены M. tuberculosis, ни один из 24 анализов не позволил с помощью только одного антигена выявить более больных. Это было обусловлено индивидуальной гетерогенностью 60% гуморального ответа при туберкулезе, которая проявлялась различным профилем антимикобактериальных антител у каждого пациента (рисунок 14).

Комбинация из нескольких иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis в составе одного серодиагностического теста может позволить компенсировать различия в антительным ответе при туберкулезе у разных людей.

В нашей работе мы расчетным путем установили наиболее эффективные сочетания антигенов M. tuberculosis, использованных в работе. Наиболее эффективными коктейлями для серодиагностики туберкулеза по данным расчетов среди рассмотренных пар белков можно признать комбинацию рRv2875 + еRv3875Ar (чувствительность - 85%, диагностическая значимость а среди сочетаний трех белков рRv2875 + еRv3875Ar + еRv3874 (чувствительность - 92%, диагностическая значимость - 92,3%) (таблицы 12 и 13).

На возможную эффективность комбинации антигенов Rv2875 и Rv3875 для серодиагностики указывают результаты работ нескольких авторов, в которых анти-Rv3875 антитела детектировались у животных в ранние сроки после экспериментального заражения M. bovis, при этом их титр значительно снижался к моменту обнаружения в крови анти-Rv2875 антител [97, 192, 129,161].

Таким образом, для компенсирования индивидуальной гетерогенности противотуберкулезного гуморального ответа, обусловленной различиями в сроках проведения серодиагностики после возникновения заболевания, при составлении коктейлей необходимо учитывать различия в динамике антител против разных антигенов M. tuberculosis.

Одним из способов объединения антигенов в коктейль является создание химерных полиэпитопных молекул методами генетической инженерии. В нашей работе было создано два химерных белка: рRv1636-Rv2185с и еRv1886с-Rv3875.

На основании результатов статистического анализа мы смогли сравнить серодиагностический потенциал белка еRv3875 и его «генетического конъюгата»

еRv1886с-Rv3875. Сравнение показало, что, несмотря на некоторое повышение чувствительности анализа со слитым белком (на 13%), снижение его специфичности (на 6,7%) за счет перекрестно-реагирующих эпитопов Rv1886с в его составе обусловило в целом незначительный прирост диагностической достоверности (на 7,7%) для белка еRv1886с-Rv3875 по отношению к еRv3875.

Аналогичные результаты были получены при сопоставлении результатов и для конъюгатов указанных белков с фрагментом ЛАМ, еRv3875Ar и еRv1886сRv3875Ar. Объяснением небольшого прироста чувствительности анализа после «объединения» Rv3875 и Rv1886с в составе одной молекулы может служить присутствие в большинстве сывороток, реагирующих с еRv3875, анти-Rv1886с антител.

Снижение общей специфичности анализа является одним из главных недостатков применения гибридных белков в ИФА. Решением этой проблемы может стать объединение в составе химерных молекул только высокоспецифичных эпитопов иммунодоминантных белков M. tuberculosis.

Например, было обнаружено, что такие пептиды, как Р8 и Р9 из Rv3872, РРЕ68’ из Rv3873 или А25 из Ag85B обладают высокой специфичностью, а также иммуногенностью. Для одного из них, РРЕ68’, было показано, что включение его в состав слитого белка CFP-10-ESAT-6 позволяет повысить чувствительность анализа с CFP-10-ESAT-6 без снижения специфичности [165, 210, 340].

В связи с актуальностью проблемы туберкулеза для нашей страны и необходимостью повышения выявляемости данного заболевания на ранних этапах диагностического поиска, нами была поставлена задача - оценить возможности применения серодиагностики для скрининга туберкулеза на примере одного из регионов РФ.

С целью реализации поставленной задачи мы применили метод ИФА для определения уровней антительного ответа против 24 рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis с сыворотками больных туберкулезом и здоровых доноров.

На первой стадии выполнения работы, нами был очерчен круг антигенов, имеющих перспективы для применения в серодиагностике туберкулеза.

Обоснованием выбора антигенов служило соответствие их характеристик заявленным критериям. В список антигенов M. tuberculosis, выбранных нами для получения и дальнейшего использования в ИФА, входили как белки, так и гликолипид ЛАМ.

Важным этапом выполнения работы являлся выбор способа получения антигенов Учитывая недостатки культурального метода M. tuberculosis.

получения нативных антигенов M. tuberculosis, нами было принято решение использовать рекомбинантные экспрессионные системы (E. coli и P. pastoris), а также химический синтез.

Полученные в ходе работы рекомбинантные белки M. tuberculosis, а также их конъюгаты с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ были использованы в ИФА с одним набором сывороток.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«КУЖУГЕТ ЕЛЕНА КРАССОВНА «Хозяйственно-биологические особенности крупного рогатого скота, разводимого в разных природно-климатических зонах Республики Тыва» 06.02.10. Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«СЛАДКОВА Евгения Анатольевна ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ЕРМОЛАЕВ Антон Игоревич ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ МЕЛКИХ СОКОЛОВ В ДОЛИНЕ МАНЫЧА 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ФЕДИН Андрей Викторович КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09 – аллергология и иммунология 14.01.03 – болезни уха, горла и носа ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.