WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |

«ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ...»

-- [ Страница 4 ] --

В работе S.L. Zhang представлен вариант коктейля, включающего антигены Rv3425, ЛАМ и 38 кДа белок. Комбинация трех данных антигенов в одном тесте позволила повысить чувствительность серодиагностики с одним антигеном с 20,6до 61,8% для легочного и внелегочного туберкулеза, специфичность при этом снизилась только на 3,5-7% [349]. Из 21 протестированного в ИФА антигена L. Zhang было отобрано 5 антигенов (Rv2031c, Rv2185c, Rv2537c, Rv2785c, Rv3354) со специфичностью 100%. Эти белки вошли в состав антигенного коктейля, который показал в ИФА с 150 сыворотками больных туберкулезом и 150 сыворотками здоровых людей значения чувствительности (76%) и специфичности (96 - 98%) [345].

Объединение различных антигенов в единый коктейль может повлиять на их стабильность в смеси и, следовательно, на эффективность взаимодействия со специфическими антителами. Возможным вариантом решения этой проблемы является создание гибридных белков, состоящих из наиболее иммуногенных белков M. tuberculosis, либо только из иммунодоминантных эпитопов этих белков [165, 210, 340]. В работе R. L. Houghton комбинация химерного белка TbF6 (CFP-10, MTB8, MTB48, 38 кДа белки M. tuberculosis) с DPEP (МРТ32) позволила выявить 86% больных туберкулезом популяции из Бразилии, 75% - из Турции, 71,2% из Южной Африки. Данный коктейль позволил выявить не только легочный, но и внелегочный туберкулез [136, 320, 338].

Гибридный белок CFP-10-ESAT-6 высокоэффективен в серодиагностике туберкулеза. В работе J.-N. Xu данный белок выявил 65% (специфичность 91,4%), а слитый белок CFP-10-ESAT-6-РРЕ68’, содержащий пептид РРЕ68’ (домен белка РРЕ68) – 73,3% больных туберкулезом (специфичность - 94,3%).

Химерные белки, содержащие только высокоспецифичные пептиды иммунодоминантных белков M. tuberculosis, имеют перспективы стать лучшими серомаркерами туберкулеза [116, 210, 269, 186, 340]. В недавнем исследовании с помощью 2 химерных белков, состоящих из 3 (38кДа-ESAT6-CFP10) и 4 (Mtb8.4MPT64-TB16.3-Mtb8) антигенов M. tuberculosis было выявлено более 85% случаев легочного и около 75% внелегочного туберкулеза (при специфичности 90%) [95].

Также, по данным литературы, высоким потенциалом для применения в серодиагностике туберкулеза обладают такие химерные белки как 38kDa-ESAT-6, Ag85B-HBHA и другие [132, 338].

Одним из вариантов генетической конъюгации микобактериальных антигенов является слитый белок Ag85B-ESAT-6, он включает в себя последовательности двух высокоиммуногенных секретируемых белков M. tuberculosis. Антиген Ag85B-ESAT-6 имеет перспективы для использования его в качестве вакцины у людей. Группа исследователей под руководством P. Andersen уже продемонстрировала возможность использования его в качестве вакцины на мышах: Ag85B-ESAT-6 стимулировал выраженный дозозависимый иммунный ответ и индуцировал высокий уровень протекции сравнимый с БЦЖ.

Данный белок имеет потенциал для применения его и в серодиагностике туберкулеза [175].

В таблице 8 представлены результаты тестирования различных вариантов мультиантигенных композиций (коктейлей) в серодиагностике туберкулеза.

На основании вышеизложенного можно заключить, что серодиагностика является перспективным методом для выявления туберкулеза, однако, для утверждения ее в качестве стандарта необходимо значительное повышение чувствительности и специфичности существующих серологических тестов.

Наибольшей эффективностью для обнаружения туберкулеза будут обладать серотесты, основанные на мультиантигенных композициях, включающих иммунодоминантные белковые и гликолипидные антигены M. tuberculosis.

–  –  –

Примечания: через дефис указаны гибридные белки, ЛТБ – легочный туберкулез, «м+/-» - мазок-положительные /отрицательные случаи ЛТБ, ВТБ - внелегочный туберкулез, С – специфичность.

–  –  –

В данной работе мы получили в экспрессионной системе E. coli восемь рекомбинантных белков M. tuberculosis (еRv0222, еRv1837c, еRv1860, еRv2875, еRv3425, еRv3872, еRv3875, еRv1886с-Rv3875), в том числе один гибридный белок.

Гены белков Rv0222 (786 п. о.), Rv1860 (975 п. о.), Rv2875 (581 п. о.), Rv3425 (528 п. о.), Rv3872 (297 п. о.), Rv3875 (285 п. о.) амплифицировали с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv.

При амлификации гена rv1837с хромосомы M. tuberculosis H37Rv в ПЦР образовались неспецифические продукты реакции. В связи с этим использовали двухэтапную схему амплификации. Первоначально амплифицировали участок ДНК M. tuberculosis штамма H37Rv, 2600 п. о., содержащий последовательность гена rv1837c (2223 п. о.). Затем очищенный ПЦР продукт, 2600 п. о., использовали в качестве матрицы для амплификации гена rv1837c со специфическими праймерами.

Кодирующая последовательность белка Rv1886c-Rv3875 (1143 п. о. (855 п.

о+ 285 п. о.)) амплифицировали с плазмиды pPMC1-FL-ag85B-esat-6, любезно предоставленной Т.Б. Кравченко и В.М. Павловым (ФБУН ГНЦ ПМБ). Между генами белков и была расположена генетическая Rv1886c Rv3875 последовательность, кодирующая аминокислоту серин [13].

Гены белков вставили в плазмиду pET32b(+) между сайтами рестрикции NdeI в позиции 639 и либо XhoI в позиции 158 (для гена rv1860), либо HindIII в позиции 173 (для остальных генов). Все гены клонировали в открытую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью шести аминокислотных остатков гистидина в позициях 140-157.

Экспрессия белков проводили в штамме BL21-CodonPlus(DE3)-RP E. coli под индукцией ИПТГ и селективным давлением антибиотиков. Оптимальный уровень экспрессии белков был достигнут через 4 часа индукции для всех рекомбинантных белков. Все белки экспрессировались в нерастворимой форме в тельцах включения.

Молекулярные массы белков определялись по ДСН - электрофорезу в 10 ПААГ в сравнении с маркерами молекулярной массы белков (приложение 4 рисунки Е1 и Е2).

Молекулярные массы белков в большинстве случаев соответствовали расчетным данным, определенным исходя из аминокислотного состава (приложение 2): еRv0222 (268 аа) – 29 кДа, еRv1837c (747 аа) – 82 кДа, еRv2875 (199 аа) – 22 кДа (18 кДа), еRv3425 (182 аа) – 21 кДа, еRv3872 (105 аа) – 12 кДа, еRv3875 (101 аа) – 10 кДа (20 кДа), еRv1886с-Rv3875 (395 аа) – 40 кДа.

Для белка еRv3875 как в ДСН-электрофорезе, так и в иммуноблоте была обнаружена полоса 20 кДа, которая по молекулярной массе соответствовала димеру указанного белка (10 кДа).

Белок еRv1860 кДа комплекс) в данных исследованиях (45/47 обнаруживался в виде 2 полос – 45 и 52 кДа, при расчетной молекулярной массе 30 кДа. Существование подобного аберрантного миграционного поведения для данного белка отмечалось и другими авторами. Его объясняют присутствием в белках ригидных терминальных участков полипептидной цепи богатых пролином (или коротких повторяющихся мотивов (КПМ)) [176,198].

Для белков еRv2875, еRv1860, еRv0040с в ДСН-электрофорезе и иммуноблоте наблюдалось наличие двух полос белка, отличающихся на 4-6 кДа, что соответствовало расчетным молекулярным массам сигнальных пептидов в составе полипептидных цепей (приложение 4 рисунок Е1, для белка еRv0040с полосы в ДСН - электрофорезе 28 и 32 кДа).

Концентрации белков определяли по ДСН - электрофорезу, сравнивая с бычьим сывороточным альбумином. Они составили для еRv0222 - 0,4 г/л, еRv1837c - 0,05 г/л, еRv1860c - 0,2 г/л, еRv2875 – 0,8 г/л, еRv3425 - 0,4 г/л, еRv3872 – 0,8 г/л, еRv3875 - 1 г/л, еRv1886c-Rv3875 - 0,1 г/л.

Очистку белков проводили металлхелатной хроматографией в денатурирующих условиях. Клеточные стенки E. coli разрушали ультразвуком.

Целевые белки солюбилизировали в растворе с 8 М мочевиной и полученную суспензию наносили на колонку, содержащую иминодиуксусную сефарозу, насыщенную ионами никеля. Элюирование белков происходило при концентрации имидазола в элюирующем буфере 250 мМ. При ренатурации белков еRv1886c-Rv3875 и еRv3875 в состав диализного буфера вносили ДТТ до 1 мМ и глицерин до 3%, что позволило снизить агрегацию белка и повысить процент выхода целевого продукта. В состав диализного буфера также вносили ФМСФ до 1 мМ в качестве ингибитора протеаз.

Концентрации очищенных белков после диализа, а также других использованных в ИФА белков высчитывали с помощью коэффициентов молярной экстинкции. Коэффициенты экстинкции составили: (еRv0222) = 14060 М-1см-1, (еRv1837c) = 77860 М-1см-1, (еRv1860) = 30440 М-1см-1, (еRv2875) = 5360 М-1см-1, (еRv3425) = 39970 М-1см-1, (еRv3872) = 1280 М-1см-1, (еRv3875) = 18350 М-1см-1, (Rv1886c-Rv3875) = 93530 М-1см-1, (Rv0040c) = М-1см-1, М-1см-1, М-1см-1, (Rv2376c) = (Rv3874) = 6970 (Rv3881c) = 40210 М-1см-1.

Концентрации белков составили: еRv0222 – 0,5 г/л, еRv1837c - 0,1 г/л, еRv1860 – 0,3 г/л, еRv2875 – 1,1 г/л, еRv3425 - 0,2 г/л, еRv3872 – 0,8г/л, еRv3875 г/л, еRv1886c-Rv3875 - 0,25 г/л, еRv0040с – 0,3 г/л, еRv2376с - 0,6 г/л, еRv3874 - 0,5 г/л, еRv3881с - 0,3 г/л.

2. 1. 2. Результаты химической конъюгации рекомбинантных белков M. tuberculosis с гексаарабинофуранозидом ЛАМ В ФБГУН ИОХ РАН получили 6 конъюгатов белков с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ (еRv0222Аr, еRv2376cАr, еRv2875Аr, еRv3875Аr, еRv3881cАr, еRv1886c-Rv3875Аr). Гексасахарид в структуре Araf6 гликоконъюгатов пространственно удален от молекулы белков посредством агликона-спейсера для целей эффективного связывания данного эпитопа со специфическими антителами [1, 32].

Концентрации белков составили: еRv0222Аr - 0,15 г/л, еRv1886c-Rv3875Аr г/л, еRv2376cАr - 0,6 г/л, еRv2875Аr - 0,17 г/л, еRv3875Аr - 0,16 г/л, еRv3881cАr - 0,3 г/л. Полученные конъюгаты были стабильны в водных растворах и хранились в замороженном виде. Данные белки использовались в ИФА наряду с другими исследуемыми антигенами.

Получение рекомбинантных белков в 2. 1. 3. M. tuberculosis экспрессионной системе P. pastoris В данной работе мы впервые получили шесть рекомбинантных белков M. tuberculosis, в том числе один химерный белок, в экспрессионной системе P. pastoris (рRv0040с, рRv1837c, рRv1860, рRv2873, рRv2875, рRv1636-Rv2185с).

Гены указанных выше белков были клонированы в плазмиду pPIC9 в открытую рамку считывания с -фактором последовательностью, (сигнальной обеспечивающей секрецию белка в P. pastoris). При амплификации генов с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv с 5’ концов в состав генов с помощью праймеров вносили нуклеотидную последовательность CATCATCACCATCACCAT, соответствующую 6 аминокислотным остаткам гистидина, с 3’ конца – терминаторные кодоны (TAA, TAG или TGA) (приложение 1). Кодирующая последовательность химерного белка рRv1636Rv2185с (894 п. о.) содержала нуклеотидные последовательности генов rv1636 (438 п. о.) и rv2185с (432 п. о.), разделенные последовательностью CCTAGG, соответствующей сайту AvrII.

Несмотря на рекомендации производителя системы P. pastoris использовать при экспрессии секретируемых белков как нативные сигнальные последовательности, так и -фактор в составе плазмиды pPIC9, в нашей работе кодирующие последовательности лидерных пептидов белков Rv0040с (96 п. о.), Rv1860 (117 п. о.), Rv2875 (90 п. о.) были удалены на стадии амплификации генов.

Этому было несколько причин. Во-первых, как указывают многие авторы, фактор обеспечивает лучшую экспрессию белка в P. pastoris, по сравнению с нативными лидерными пептидами [249]. Во-вторых, наличие двух лидерных последовательностей в белке может привести к нарушению процессинга и фолдинга белка. Еще один фактор, обусловивший удаление сигнальных пептидов, это размещение нуклеотидной последовательности 6 остатков гистидина на 5’конце генов белков, то есть, отщепление нативного сигнального пептида могло бы повлечь за собой потерю полигистидинового тага, расположенного на N-конце полипептидной цепи, и, следовательно, невозможность очистки его из культуры с помощью аффинной хроматографии. Размеры сигнальных пептидов определялись программой SignalP 3.0 Server [272] и сверялись с данными литературы и баз данных [181, 287]. Отщепление -фактора от белка осуществляется в два этапа.

На первом этапе продукт гена kex2 разрывает связь между аргинином и глутамином в участке, соответствующем позиции 1204 в плазмиде pPIC9, а затем продукт гена ste13 разрушает дублированную последовательность глутаминаланин.

Белок Rv2873 - поверхностный липопротеин M. tuberculosis, связанный с клеточной стенкой посредством липидного якоря. Программой SignalP 3.0 Server участок белка Rv2873 (33 аминокислотных остатка) также определился как трансмембранный якорь. В связи с этим, ген данного белка был клонирован в плазмиду PIC9 полностью (663 п. о.). Кроме того, M. Harboe опубликованы данные о том, что у кроликов, иммунизированных 13 и 20-мерными пептидами Nконца полипептидной цепи Rv2873, в части случаев образуютя антитела к сигнальному пептиду данного белка [127].

Рекомбинантные плазмиды pPIC9Rv0040c, pPIC9Rv1837c, pPIC9Rv1860, pPIC9Rv2873, pPIC9Rv1636-Rv2185с были линеаризованы ферментом рестрикции SacI для дальнейшего встраивания генетических конструкций в области генов (для и (для хромосомы AOX1 GS115) aox1:ARG4 KM71) P. pastoris.

Рекомбинантная плазмида pPIC9Rv2875 была линеаризована рестрикционным ферментом SalI, что обеспечило вставку гена rv2875 в his4 участок хромосомы Трансформация линеаризованными плазмидами P. pastoris. P. pastoris обеспечивает стимулирование рекомбинации и правильное встраивание генов в хромосому P. pastoris.

Клетки штамма GS115 P. pastoris были трансформированы плазмидами pPIC9Rv1837c и pPIC9Rv1636-Rv2185с методом электропорации. Трансформанты были высеяны на минимальную среду с глюкозой (MD), а затем колонии пересеяны на чашку со средой MM (минимальной среде с метанолом) и MD. В клетках GS115, трансформированных рекомбинантными плазмидами pPIC9, линеаризованными по сайту рестрикции SacI, осуществляется вставка гена в одной из трех областей локуса AOX1 (AOX1 промотора, терминатора транскрипции, либо 3’AOX1). В результате клетки синтезируют алкогольоксидазу I (продукт гена AOX1), обеспечивающую метаболизм метанола в качестве единственного источника углерода, и формируется фенотип His+Mut+. Однако в 5случаев возможно вытеснение гена AOX1 у His+ трансформантов, тогда формируется фенотип His+Muts (в отсутствии алкогольоксидазы I клетки плохо утилизируют метанол и медленно растут на среде MM). В данном случае для дальнейшего анализа были отобраны колонии, которые с одинаковой интенсивностью росли как на среде с глюкозой, так и на среде с метанолом, т.е.

имели фенотип His+Mut+.

Клетки штамма KM71 P. pastoris были трансформированы плазмидами также методом pPIC9Rv0040c, pPIC9Rv1860, pPIC9Rv2873, pPIC9Rv2875 электропорации, но высевались только на среду MD, так как в данном штамме возможен только фенотип His+Muts.

Для каждого штамма было отобрано по 10 колоний, из которых были выделены хромосомы для проведения генетического анализа. ПЦР анализ выделенных хромосом с 5’AOX1, 3’AOX1 и -factor праймерами (приложение 1) подтвердил наличие и правильное расположение соответствующих генов в геноме P. pastoris. Секвенирование хромосом «положительных» клонов, отобранных по данным ПЦР, подтвердило соответствие генетических последовательностей вставок генам белков для большинства анализированных колоний.

Для экспрессии белков отбирали по одной колонии каждого штамма и растили в среде с глицерином (BMGY) до достижения клетками лог-фазы.

Глицерин в составе BMGY (а также глюкоза в составе MD) способствовал депрессии промотора АОХ во время интенсивного роста клеток дрожжей, что препятствовало селекции неэкспрессионных мутантных клонов. Затем клетки переносили в среду с индуктором экспрессии белка, метанолом (BMMY). Для всех штаммов при культивировании поддерживали в среде концентрацию метанола 1% [70].

В состав сред входили калий-фосфатный буфер (рН=6,0), обеспечивающий поддержание оптимального рН среды, а также пептон и дрожжевой экстракт, стабилизирующие белки в среде и уменьшающие протеолиз. В качестве ингибитора внеклеточных протеаз в среду вносили казаминовые кислоты (Becton Dickinson, США) до 1% [231].

При наращивании культуры P. pastoris мы использовали соотношение объемов среды/колбы 1:5-1:7, изолируя среду в колбе от воздуха в качалке двуслойным стерильным марлевым лоскутом, и ежедневно вносили в среду деионизованную воду 10% от объема среды (вычислено по данным ежедневного измерения изменений количества среды в процессе аналитической экспрессии в «малом объеме»).

Экспрессия рекомбинантных белков в P. pastoris проводилась в одинаковых условиях: состав сред (в том числе рН буфера (рН=6,0)), интенсивность перемешивания (250 об/мин), температура (30°С), время культивирования (100 часов) были идентичны. Образцы культуры отбирали каждые 24 часа и анализировали в ДСН-электрофорезе и иммуноблоте. ДСН-электрофорез супернатанта и лизата клеток P. pastoris показал, что все рекомбинантные белки секретировались в среду.

Концентрации целевых белков в среде определяли по ДСН-электрофорезу.

Они составили: рRv0040c - 0,6 г/л, рRv1837c - 0,05 г/л, рRv1860 - 0,8 г/л, рRv2873

- 0,05 г/л, рRv2875 - 0,5 г/л, рRv1636-Rv2185с - 0,1 г/л.

Кроме указанных белков, в плазмиду pPIC9 было последовательно клонировано три гена M. tuberculosis (rv3874, rv3875, rv2031c). Плазмида была линеаризована ферментом SacI и pPIC9Rv3874-Rv3875-Rv2031с трансформирована в хромосому P. pastoris штамма КМ71 (генетическая вставка была подтверждена ПЦР и секвенированием хромосомы). Однако в ДСНэлектрофорезе в ПААГ с образцами супернатанта культуры было обнаружено 2 полосы 26 и 28 кДа, что, вероятно, соответствует сумме расчетных молекулярных масс Rv3875 (10 кДа + 2 кДа (1 сайт гликозилирования)) и Rv2031c (16 кДа), а в иммуноблоте соответствующих полос не было обнаружено.

В рамках данной работы мы также клонировали ген белка Rv0934 в хромосому P. pastoris как штамма KM71, так и GS115. Секвенирование хромосом полученных штаммов подтвердило правильное расположение гена в хромосоме P. pastoris, а также соответствие нуклеотидной последовательности вставки гену rv0934. Культуру растили как на минимальной среде с глюкозой (BMG), так и на среде с метанолом (BMM). Однако экспрессия белка (при двух вариантах температурного режима - 30°С и 20°С) не была обнаружена, и в иммуноблоте с образцами супернатанта и клеточного лизата культуры отсутствовала полоса около 40 кДа, соответствующая белку Rv0934.

Гены двух секретируемых белков, Rv0129с и Rv3803с, были клонированы в плазмиду PIC9, а затем в хромосому P. pastoris без нативных лидерных последовательностей (соответствие гена и правильное расположение в геноме P. pastoris подтверждено секвенированием хромосом). Однако, ни в ДСНэлектрофорезе, ни в иммуноблоте полос, соответствующих данным белкам не было обнаружено. Также отсутствовала, либо была крайне низкой экспрессия белка Rv3425 в P. pastoris.

При белков в к каждому сайту N-маннозилировании P. pastoris гликозилирования (аспарагин-X-серин/треонин, где Х-любая аминокислота кроме пролина) присоединяется в среднем от 8 до 14 остатков маннозы, что соответствует примерно 1,4-2,5кДа.

В аминокислотных последовательностях изучаемых белков обнаружено 1 (Rv1636, Rv1837с, Rv2873), 2 (Rv2875) или 3 (Rv0040с, Rv1860) сайтов Nгликозилирования, что предполагает увеличение молекулярной массы белков, по сравнению с расчетными данными на 1,4-7,5 кДа. Также в P. pastoris возможно Оманнозилирование белков.

Расчетные молекулярные массы белков, полученные исходя из аминокислотного состава, были: рRv0040с (292 аа) – 30,4 кДа, рRv1837c (755 аа) – 82,2 кДа, рRv1860 (300 аа) – 30,5 кДа, рRv2873 (234 аа) – 23,8 кДа, рRv2875 (177 аа) - 18 кДа, рRv1636-Rv2185с (306 аа) – 33,6 кДа.

В нашей работе молекулярные массы белков, полученные по данным ДСНэлектрофореза в 10-12% ПААГ, отличаются от расчетных значений. Возрастание молекулярных масс для белков рRv1837c (88 кДа), рRv1636-Rv2185с (36 кДа), рRv2873 (26/52 кДа) и рRv2875 (23 кДа) в электрофорезе на 2-8 кДа, по сравнению с расчетными значениями, можно объяснить гликозилированием данных белков. После высаливания и очистки белка рRv2873 из супернатанта культуры P. pastoris, на ДСН-электрофорезе была обнаружена дополнительная полоса, соответствующая молекулярной массе димера указанного белка (52 кДа).

В ДСН-электрофорезе белка рRv1860 была обнаружена полоса около 55 кДа. Полученные данные можно объяснить замедленной миграцией белка в ПААГ, как и в случае аналогичного белка, экспрессированного в E. coli, а также N-маннозилированием 3 сайтов гликозилирования при отсутствии лидерного пептида [176]. Для рRv0040с в ДСН-электрофорезе в 10% ПААГ была обнаружена полоса около 65кДа, вероятно, соответствующая массе димера белка и 6 гликозилированных остатков [198].

Для форсирования и облегчения процесса очистки белка за счет уменьшения объема супернатанта, удаления пептона, солей фосфатного буфера, а также для создания оптимального рН белкового раствора, обеспечивающего связывание белков с сефарозой, белки из супернатанта культуры P. pastoris сначала высаливали сульфатом аммония при насыщении 70%, а затем осадок, содержащий целевые белки, растворяли в буфере нанесения в объеме,

–  –  –

2. 2. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) В настоящей работе для оценки диагностического потенциала рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis мы использовали твердофазный гетерогенный непрямой ИФА. Анализ выполнялся по вышеуказанной методике, условия проведения анализов, реактивы и оборудование во всех случаях были одинаковыми.

В таблице 1 указаны концентрации антигенов в ИФА.

Статистический анализ данных ИФА проводился согласно стандартным статистическим методам, описанным в книге С. Гланца «Медико-биологическая статистика» [7], с использованием компьютерных программ MedCalc (MedCalc Software, Бельгия) и Microsoft Office Exel (Microsoft, США).

Результаты статистической обработки данных, полученных в ИФА с исследуемыми антигенами, представлены в таблицах 9 и 10.

Нормальное распределение данных было выявлено в обеих группах (больных и здоровых) для анализов с белками, экспрессированными в P. pastoris, а также для конъюгированного белка еRv1886c-Rv3875Аr. После логарифмирования данных нормальное распределение было получено в обеих выборках также еще для 4 белков (еRv0040c, еRv0222Аr, еRv2376cАr и еRv3874).

Нормальное распределение только в группах здоровых было получено для всех белков, за исключением еRv3425 и еRv3881с. Так как группа больных включает большое число значений (n=100), то согласно центральной предельной теореме распределение значений в данной группе можно считать нормальным.

Таким образом, параметрические критерии значимости были рассчитаны для анализов с белками, для которых данные распределены по нормальному закону, то есть со всеми, кроме еRv3425 и еRv3881с.

Таблица 9 - Результаты статистического анализа данных ИФА

–  –  –

95% доверительный интервал (ДИ) разницы истинных средних ни в одном случае не включал ноль, т.е. между группами существовали различия при уровне статистической значимости 0,05. Значения критерия Стьюдента во всех случаях соответствовали вероятности справедливости нулевой гипотезы, p0,05, следовательно, различия между выборочными средними обеих групп были статистически значимы.

Для выявления уровней значимости различий между группами для анализов с белками еRv3425 и еRv3881с, а также для сравнения данных в работе был использован непараметрический тест Манна-Уитни. Во всех случаях значения критерия U соответствовали p0,05, что свидетельствует о статистической значимости различий между группами.

Таким образом, все изученные рекомбинантные белки M. tuberculosis достоверно выявляли туберкулез в ИФА.

Для определения силы взаимосвязи между уровнями реактивности сывороток больных туберкулезом против различных антигенов (значений OD450 в ИФА) и клиническими характеристиками пациентов (пол, возраст, диагноз, результаты бактериоскопии мазка мокроты, наличие распада в легочной ткани, рецидива) был использован корреляционный анализ.

Прямая достоверная корреляция, соответствующая р 0,05, была выявлена между наличием диагноза «фиброзно-кавернозный туберкулез легких» и повышенной реактивностью сывороток против eRv3875 (r = 0,19, 95% ДИ = 0,006 - 0,37), eRv1860 (r = 0,19, 95% ДИ = 0,007 - 0,37), еRv3874 (r = 0,36, 95% ДИ = 0,18 - 0,52); рецидивом заболевания и антительным ответом против eRv1860 (r = 0,22, 95% ДИ = 0,03 - 0,39); а также наличием распада легочной ткани и ответом против eRv0040с (r = 0,29, 95% ДИ = 0,1 - 0,46).

В таблице 10 приведены результаты статистической обработки данных ИФА с использованием двух вариантов «отсекающих» значений.

Наряду с cutoff2, равного сумме среднего OD450 контрольной группы плюс три стандартных отклонения, мы использовали для расчетов также вариант cutoff1, определяемый как среднее OD450здоровых+2SD. Последний вариант «отсекающего»

значения сравнительно часто используется в литературе при оценке серодиагностического потенциала антигенов в регионах, M. tuberculosis эндемичных по туберкулезу [119, 146, 149, 179, 239, 241, 253].

На основании этих данных были рассчитаны чувствительность, специфичность и диагностическая достоверность анализов со всеми использованными в работе антигенами. Чувствительность анализов со всеми исследованными антигенами варьировала от 19 до 60% (cutoff1), от 5% до 46% (cutoff2). Наименьшие и наибольшие показатели чувствительности были получены для белков, экспрессированных в P. pastoris, рRv2873 и рRv2875, соответственно.

–  –  –

Специфичность при расчете по cutoff2 во всех случаях составляла 100%, а по cutoff1 колебалась в пределах 86,7-100%. Специфичность 100% по cutoff1 была выявлена для белков еRv2875, рRv2875, еRv2875Ar и рRv2873.

Диагностическая достоверность отражает долю истинных результатов из общего объема выборки, а, следовательно, эффективность теста. Значения данного показателя в работе варьировали от 37,7% до 69,2% (cutoff1), от 26,9% до 58,5% (cutoff2). Лучшие значения диагностической достоверности были получены для анализов с белком рRv2875, а худшие - с рRv2873с при обоих вариантах расчета [105, 351].

При оценке статистической значимости различий в частотах между группами был использован критерий с поправкой Йеитса. В большинстве случаев уровень статистической значимости различий оказался низким, p0,05, что подтверждает значимость различий в частотах между выборками. Однако для анализов с еRv0040c (cutoff1) и рRv2873 (cutoff2), была получена только 0,5% значимость различий, что свидетельствует об отсутствии достоверности различий в частотах между выборками при данных значениях чувствительности и специфичности, то есть о низкой эффективности теста.

Результаты ROC анализа представлены в таблице 11. В ROC анализе результаты ИФА были представлены в виде графика, позволяющего визуально (или посредством сопоставления значений показателя ППК для них) оценить эффективность анализов с различными антигенами, сравнить результаты тестов для аналогичных белков, полученных разными способами. Кроме того, в ROC анализе, на основании установленных «оптимальных критериев» («порогов отсечения») были определены значения показателей чувствительности и специфичности для ИФА со всеми антигенами. В таблице 11 указаны «оптимальные критерии» (К), а также соответствующие им индексы Юдена (J) для каждого анализа. Чувствительность анализов, соответствующая «оптимальному критерию», варьировала от 31% (рRv2873) до 69% (еRv1886c Rv3875Аr), специфичность от 70% (еRv0040c) до 100% (еRv2875Аr). Наиболее высокий индекс Юдена был получен для белка рRv2875 (0,613), низкий - для рRv2873 (0,277). Диагностическая достоверность анализов, определенная по данным, соответствующим выбранному критерию К, была от 46,9% (для рRv2873) до 73,8% (для рRv2875).

Таблица 11 - Результаты ROC анализа

–  –  –

С помощью таблиц сопряженности 2х2 определялись значения критериев с поправкой Йеитса для результатов анализов со всеми белками. Полученные значения критерия во всех случаях соответствовали р0,05, что подтверждает значимость различий в частотах между двумя группами.

Кроме того, в ROC анализе были определены показатели отношения правдоподобия для соответствующих выбранных значений чувствительности и специфичности. Значения ОП+ были 1,93, а ОП- 0,71, что свидетельствует об эффективности тестов при выбранных показателях.

С помощью ROC анализа были вычислены значения ППК. Наиболее высокое значение ППК было для ROC-кривой, построенной на основании данных анализа с белком рRv1860 (0,855), низкое - с рRv2873 (0,635).

Таким образом, наибольшей диагностической точностью среди всех анализов обладал тест с белком рRv1860.

2. 2. 1. Результаты ИФА с белками M. tuberculosis, экспрессированнымив системе E. coli

В нашей работе мы использовали 12 рекомбинантных белков M. tuberculosis (еRv0040с, еRv0222, еRv1837c, еRv1860, еRv2376с, еRv2875, еRv3425, еRv3872, еRv3874, еRv3875, еRv3881с, еRv1886c-Rv3875), полученных в системе E.coli, в ИФА с сыворотками больных туберкулезом легких и здоровых жителей Саратовской области.

Данные, полученные в ИФА, представлены в виде точечной диаграммы на рисунке 7 (А, Б).

Показатели чувствительности для анализов с белками, экспрессированными в E.coli, варьировали от 27% до 53% при расчете по cutoff1 и от 16% до 41% cutoff2. В обоих случаях наибольшие показатели чувствительности были получены для белка еRv3874. Также высокие значения чувствительности для cutoff1 были получены для белков еRv1860 (47%), еRv0222 (47%) и слитого белка еRv1886c-Rv3875 (48%).

Специфичность анализов с данными белками составила 90-93,3%. Однако при расчете статистических показателей по cutoff2 значения чувствительности для анализов с последними двумя белками (28% и 26%, соответственно) оказались существенно ниже значений для анализов с еRv1860 (38%) и еRv3874 (41%).

Рисунок 7 (А, Б) - Точечная диаграмма результатов ИФА с антигенами M. tuberculosis, полученными в экспрессионной системе E.coli, и их конъюгатами с гексаарабинофуранозидом ЛАМ. Примечания: красной чертой обозначены значения cutoff1, синей – выборочные средние для групп.

Наиболее низкие значения чувствительности анализов были получены с белками еRv0040c и еRv2376c (27% и 31% - cutoff1, 19% и 16% - cutoff2, соответственно).

При расчете специфичностей анализов на основании cutoff2 значение показателя 100% было получено во всех случаях, а на основании cutoff1 - только для еRv2875.

Диагностическая достоверность была минимальна для анализов с белками еRv0040с (40,7%) при расчете по cutoff1 и с еRv2376с (35,4%) - cutoff2, а максимальна - для еRv3874 при обоих вариантах расчета (62,3% и 54,6%, соответственно).

Чувствительность анализа с еRv1886c-Rv3875 оказалась на 13% выше (cutoff1), чем для еRv3875, однако, снижение специфичности (на 6,7%) для анализа со слитым белком обусловило незначительный прирост в его диагностической достоверности, по сравнению с еRv3875 (на 7,7%).

Кривые ROC представлены на рисунке 8 (А, Б, В).

В ROC анализе чувствительность ИФА с белками, экспрессированными в E.coli, была от 39% (еRv2376с, еRv3881c) до 68% (еRv3874), специфичность от 70% (еRv0040c) до 100% (еRv2875). Диагностическая достоверность анализов, определенная по данным, соответствующим выбранному критерию, была от 50,3% (для еRv2376c) до 72,3% (для еRv3874).

В ROC анализе значение ОП+ для ИФА с еRv0040с составило 1,93, что говорит о том, что вероятность истинно положительного результата выше вероятности ложноположительного результата менее чем в два раза, то есть эффективность теста с данным белком мала.

Наибольшее значение ППК среди рекомбинантных неконъюгированных белков было получено для еRv3874 (0,807), наименьшее - для еRv0040с (0,657).

Значение ППК для анализа еRv1886c-Rv3875 оказалось ниже, чем для еRv3875, что говорит о меньшей диагностической точности анализа со химерным белком, по сравнению с еRv3875.

Рисунок 8 (А, Б, В) – ROC - кривые для анализов с белками M. tuberculosis, полученными в системе E.coli, и их конъюгатами с гексаарабинофуранозидом ЛАМ. Примечание: в скобках указаны значения ППК.

2. 2. 2. Результаты ИФА с конъюгатами белков M. tuberculosis, полученных в системе E. coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ В данной работе в ИФА было использовано 6 химических конъюгатов рекомбинантных белков с синтетическим M. tuberculosis гексаарабинофуранозидом ЛАМ (еRv0222Аr, еRv2376сАr, еRv2875Аr, еRv3875Аr, еRv3881сАr, еRv1886c-Rv3875Аr).

Результаты ИФА представлены на рисунке 7 (А, Б).

Наименьшие показатели чувствительности для анализов с конъюгированными белками были получены согласно расчетам по cutoff1 и cutoff2 для белка еRv2376сАr (41% и 21%, соответственно), а наибольшие - для еRv1886c-Rv3875Аr (59%) и еRv2875Аr (43%), соответственно.

Специфичность анализов составляла от 90% (еRv1886c-Rv3875Аr) до 100% (еRv2875Аr) (cutoff1) и 100% (cutoff1) во всех случаях. Диагностическая достоверность была максимальна для анализов с белком еRv1886c-Rv3875Ar (66,1%) при расчете по cutoff1 и с еRv2875Ar (56,1%) - cutoff2, а минимальна для еRv2376сAr при обоих вариантах расчета (53% и 39,2%, соответственно).

Результаты ROC анализа представлены на рисунке 8 (А, Б, В).

По результатам ROC анализа значения показателей чувствительности для тестов с конъюгатами варьировали от 49% (еRv2376сAr) до 69% (еRv1886cRv3875Ar), специфичности от 80% (еRv1886c-Rv3875Ar) до 100% (еRv2875Ar) и диагностической достоверности от 59,2% (еRv2376сAr) до 71,5% еRv1886cRv3875Ar.

Наибольшее значение ППК среди анализов с конъюгированными белками было получено для теста с еRv3881сAr (0,84), наименьшее – с еRv2875Ar (0,745).

Значение ППК для еRv1886c-Rv3875Ar (0,836) было выше, чем для еRv3875Ar (0,817). Прирост диагностической достоверности для еRv1886c-Rv3875Аr, по сравнению с еRv3875Аr, в связи со снижением специфичности для слитого белка, был незначительный (на 2,4-6,1% по всем вариантам расчета).

2. 2. 3. Результаты ИФА с белками M. tuberculosis, экспрессированнымив системе P. pastoris

В данной работе 6 рекомбинантных белков M. tuberculosis (рRv0040с, рRv1837c, рRv1860, рRv2875, рRv2873, рRv1636-Rv2185с), экспрессированных в системе P. pastoris, были использованы в ИФА с сыворотками больных туберкулезом и здоровых жителей Саратовской области. Данные, полученные в ИФА для рекомбинантных белков M. tuberculosis, представлены на рисунке 9.

Как при расчетах статистических показателей по cutoff1 и cutoff2, так и в ROC анализе наибольшие значения чувствительности (60%, 46% и 68%) и диагностической достоверности (69,2%, 58,5% и 73,8%) были получены в тесте с белком рRv2875, а наименьшие - с рRv2873 (чувствительность - 19%, 5% и 31%, диагностическая достоверность – 37,7%, 26,9% и 46,9%, соответственно).

Специфичность анализов с белками, полученными в дрожжевой системе, при расчете по cutoff составляла 93,3 - 100%, а в ROC анализе - 86,7 - 96,7%.

В анализе одни из лучших значений чувствительности и ROC диагностической достоверности были получены также для анализов с рRv0040с (65% и 70,7%), рRv1860 (68% и 72,3%, соответственно). Чувствительность теста с рRv2873 в ROC анализе оказалась значительно выше (31%), чем при расчетах по cutoff (19% и 5%), при этом значение «оптимального критерия», полученного в данном анализе, соответствовало среднему OD450здоровых+1,35SD, а значение ОП+ было близко к 10, что свидетельствует о низкой вероятности ложноположительного результата в тестах с рRv2873. Таким образом, использование рRv2873 в составе мультиантигенного коктейля может способствовать повышению чувствительности серодиагностического теста без снижения специфичности. Значения показателей ОП+ (10,2) и ОП- (0,34), полученные для анализов с белком рRv2875, указывают на возможную высокую достоверность тестов ИФА с данным белком в качестве антигена. На рисунке 10 (А, Б) представлены ROC-кривые и указаны соответствующие значения ППК для анализов с антигенами, полученными в P. pastoris. Наиболее высокое значение ППК было получено для ROC-кривой, построенной на основании данных анализа с белком рRv1860 (0,855), наименьшее – с рRv2873 (0,635).

Рисунок 9 - Точечная диаграмма результатов ИФА с антигенами

M. tuberculosis, полученными в разных экспрессионных системах. Примечания:

красной чертой обозначены значения cutoff1, синей – выборочные средние для анализа с одним антигеном.

2. 3. Сравнение диагностического потенциала рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis В настоящей работе методом ИФА оценивался диагностический потенциал 24 рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis. Благодаря использованию в ИФА аналогичных антигенов M. tuberculosis, полученных тремя «способами», и одного набора сывороток мы смогли сравнить преимущества разных вариантов белков для целей серодиагностики и определить наиболее оптимальный из них в каждом случае.

Рисунок 10 (А, Б) - ROC - кривые для анализов с белками M. tuberculosis, полученными в разных экспрессионных системах. Примечания: в скобках указаны значения ППК.

Статистический анализ данных ИФА проводили с использованием трех методов расчетов показателей эффективности применения антигенов в серодиагностике: с учетом двух вариантов «отсекающих значений» для эндемичных (cutoff1) и неэндемичных (cutoff2) по туберкулезу регионов, а также по Все указанные варианты анализа результатов ИФА ROC-кривым.

используются в литературе для оценки серодиагностического потенциала антигенов M. tuberculosis [119, 146, 149, 179, 239, 241, 253].

На рисунке 11 представлена диаграмма распределения значений диагностической достоверности анализов со всеми антигенами, вычисленных разными методами статистического анализа.

В следующих подглавах будут изложены результаты сравнения данных, полученных в ИФА.

Рисунок 11 - Диаграмма значений диагностической достоверности ИФА с антигенами M. tuberculosis, рассчитанных разными методами статистического анализа

–  –  –

В данной работе было проведено сравнение результатов ИФА с 6 белками M. tuberculosis (еRv0222, еRv2376с, еRv2875, еRv3875, еRv3881с, еRv1886cRv3875), экспрессированными в E. coli, и химическими конъюгатами данных белков с гексаарабинофуранозидным фрагментом ЛАМ (еRv0222Аr, еRv2376сАr, еRv2875Аr, еRv3875Аr, еRv3881сАr, еRv1886c-Rv3875Аr).

Парное сравнение результатов статистического анализа данных ИФА выявило возрастание значений показателей чувствительности (в среднем на 10,3% (5-16%) - при расчете по cutoff1, и на 13,2% (5-19%) –cutoff2) и диагностической достоверности (в среднем на 8% (4,6-11,5%) - cutoff1, и на 10,1% (3,8-14,6%) – cutoff2) анализов с конъюгатами относительно неконъюгированных форм вышеуказанных белков. Наибольший прирост значений данных показателей наблюдался для анализов с белками еRv3875Аr (cutoff1) и еRv2875Аr (cutoff2).

Специфичность анализов с конъюгатами, как правило, оставалась в пределах ± 3,3%, по сравнению с показателями для неконъюгированных белков. Химическая конъюгация белков еRv3875 и еRv1886с-Rv3875 позволила повысить чувствительность анализа на 16% (cutoff1и cutoff2) и 11% (cutoff1, или 14% соответственно, без снижения специфичности. На рисунке cutoff2), 12 представлено схематическое изображение данных, полученных в ИФА как с рекомбинантными белками M. tuberculosis, так и с их конъюгатами с одной панелью сывороток больных туберкулезом.

В ROC анализе также отмечалось увеличение чувствительности (в среднем на 8,7% (4-11%)) и диагностической достоверности (в среднем на 7,2% (3,8-8,4%)) анализов для конъюгированных белков. Для белков еRv3875Аr и еRv1886сприрост показателей чувствительности, по сравнению с их Rv3875Аr неконъюгированной формой, составил 9% и 11%, а диагностической достоверности – на 8,4% и 7,7%, соответственно.

.

Рисунок 12 - Лепестковая диаграмма сравнения данных ИФА с рекомбинантными белками M. tuberculosis, полученными в системе E. coli, и их конъюгатами. Примечания: окружностями красного цвета обозначены границы cutoff1 для анализов с рекомбинантными белками (внутренний круг) и их конъюгатами (внешний круг) белками.

Возрастание ППК наблюдалось в большинстве случаев (на 0,034-0,115), однако, для белка Rv2875Аr было выявлено незначительное снижение значения данного показателя (на 0,023). По результатам статистического анализа данных можно заключить, что в большинстве случаев химическая конъюгация рекомбинантных белков экспрессированных в с M. tuberculosis, E. coli, фрагментом ЛАМ обеспечила повышение эффективности выявления туберкулеза.

–  –  –

Четыре рекомбинантных белка M. tuberculosis (Rv0040с, Rv1837с, Rv1860, Rv2875), полученные как в экспрессионной системе E. coli, так и P. pastoris, были использованы в качестве антигенов в ИФА с сыворотками больных туберкулезом и здоровых пациентов. Сравнение результатов ИФА с указанными антигенами выявило повышение значений чувствительности (в среднем на 12% (3-20%) - при расчете по cutoff1, и на 9% (3-22%) –cutoff2) и диагностической достоверности (в среднем на 10,2% (4-17,8%) - cutoff1, 6,95% (2,3-17%) – cutoff2) у белков, полученных в дрожжевой системе, по сравнению с белками, экспрессированными E. coli. Специфичность оставалась, как правило, неизменной, а в случае анализа с рRv0040с она оказалась выше на 10%, чем в анализе с еRv0040с. На рисунке 13 представлено схематическое изображение данных, полученных в ИФА с белками, экспрессированными как в E. coli, так и в P. pastoris с одной панелью сывороток больных туберкулезом.

ROC анализ также показал возрастание значений чувствительности (в среднем на 9% (4-14%)) и диагностической достоверности (в среднем на 10,4% (7,7-14,6%)) для рекомбинантных белков, экспрессированных в P. pastoris, по сравнению с белками, экспрессированными в E. coli. Значение ППК для ROCкривых в случае белков, полученных в P. pastoris, было выше (на 0,039 - 0,166), чем для аналогичных белков, полученных в системе E. coli.

Рисунок 13 - Лепестковая диаграмма сравнения данных ИФА с белками

M. tuberculosis, полученными в разных экспрессионных системах. Примечания:

внутренний круг обозначает cutoff1 для анализов с белками, экспрессированными в системе E. coli, внешний – в системе P. pastoris, по кругу указаны номера сывороток, на вертикальной оси отложены соответствующие значения OD450.

Для рRv0040с значение ППК оказалось на 0,166 пунктов выше, чем для еRv0040с, что может свидетельствовать о более высокой дифференцирующей способности анализа с рекомбинантным белком, полученным в дрожжевой системе.

По результатам статистического анализа данных можно заключить, что в ряде случаев рекомбинантные белки M. tuberculosis, экспрессированные в системе P. pastoris, могут быть более эффективны в серодиагностике туберкулеза, чем аналогичные белки, экспрессированные в системе E. coli.

2. 3. 3. Сравнение результатов применения в ИФА трех вариантов одного белка M. tuberculosis, полученного разными методами Белок M. tuberculosis Rv2875 был получен в двух экспрессионных системах (E. coli - еRv2875 и P. pastoris - рRv2875), а также был создан конъюгат белка еRv2875 с гексаарабинофуранозидом ЛАМ (еRv2875Ar).

Чувствительность ИФА с белком рRv2875, экпрессированным в P. pastoris, оказалась на 17% и 22% (cutoff1 и cutoff2, соответственно) выше, чем для аналогичного белка, полученного в E. coli. Химическая конъюгация белка еRv2875 с Araf6 ЛАМ, позволила повысить чувствительность анализа на 9% и соответственно. Учитывая отличия в наборе сывороток, которые 19%, реагировали в ИФА с различными вариантами антигена Rv2875, можно предположить, что конъюгация белка рRv2875 с Araf6 ЛАМ могла бы способствовать дополнительному повышению чувствительности анализа с указанным белком (по расчетам до 76% (cutoff1) и 64% (cutoff2)).

В ROC анализе было выявлено повышение показателей эффективности (чувствительности на 20%, диагностической достоверности на 14,6%) для теста с рRv2875, по сравнению с еRv2875, а также низкий ОП- (0,34), который указывает на минимальную вероятность ложноотрицательных результатов для анализа с рRv2875.

Кроме того, значение показателя ППК для анализа с белком, полученным в дрожжевой системе, было на 8,3% выше, чем для еRv2875. В анализе с белком Rv2875Ar прирост значений показателей, по сравнению с еRv2875, был слабо выражен (повышение чувствительности на 4%, диагностической достоверности на 3,8%, а специфичности на 3,3%), а значение ППК оказалось даже ниже значения для еRv2875. Одним из объяснений снижения ППК может служить повышение уровня неспецифического связывания сывороток здоровых людей после конъюгирования антигена с фрагментом ЛАМ.

Определение расчетных показателей эффективности 2. 4.

мультиантигенных композиций, включающих антигены M. tuberculosis, использованные в работе Гуморальный ответ во время туберкулезной инфекции направлен против многих антигенов M. tuberculosis, однако, в зависимости от стадии, формы туберкулеза и иммуногенетических особенностей организма каждый пациент имеет индивидуальный профиль антимикобактериальных антител [191]. В нашей работе мы также выявили наличие индивидуальной гетерогенности при распознавании сыворотками больных туберкулезом разных антигенов M. tuberculosis. На рисунке 14 представлено графическое изображение различий в реактивности сывороток больных туберкулезом с разными антигенами M. tuberculosis. Из рисунка видно, что во всех сыворотках больных туберкулезом определялись диагностически значимые титры антимикобактериальных антител к тем или иным антигенам M. tuberculosis, использованным в ИФА. При расчете статистических показателей по cutoff1 все 100 сывороток реагировали в ИФА с тем или иным антигеном, 3 из них - со всеми 24 антигенам, а 4 сыворотки содержали антитела только к одному антигену (еRv0222Ar, еRv3874, еRv3875Ar или еRv1886c-Rv3875Ar). Сыворотки, содержащие антитела ко всем исследуемым антигенам, принадлежали донорам с диагнозом «инфильтративный туберкулез легких в фазе распада». Можно предположить, что повышенная внеклеточная репликация M. tuberculosis, наблюдаемая исследователями в очагах распада тканей легких при туберкулезе, ассоциирована с увеличением секреции микобактериальных антигенов, и, следовательно, более высокому титру специфических антител [258]. Сыворотки, в которых определялись антитела только к одному антигену, принадлежали вновь выявленным больным с диагнозом «инфильтративный туберкулез легких» без признаков распада и отрицательными результатами бактериоскопии мазка мокроты и культурального исследования. Возможно, у данных пациентов заболевание протекало на начальных стадиях, поэтому были выявлены антитела именно к ранним секретируемым белкам M. tuberculosis, Rv3874 и Rv3875 (последний белок также входил в состав слитого белка еRv1886c-Rv3875).

Рисунок 14 - Гетерогенность распознавания антигенов M. tuberculosis сыворотками больных туберкулезом. Примечания: красным обозначены ячейки с OD450 cutoff2, оранжевым - с OD450 cutoff1, но cutoff2, не окрашены ячейки со значением OD450 cutoff1.

При расчете по cutoff2 у 96% сывороток выявлялись антитела хотя бы к одному антигену, ни одна сыворотка не содержала антитела ко всем антигенам и 8 сывороток реагировали только с одним антигеном (рRv0040с, еRv0222Ar, рRv2875, еRv3425, еRv3872, еRv3874 (две сыворотки) или еRv3875Ar).

Несмотря на то, что в 100% сывороток (при расчете по cutoff1, или 96% - по cutoff2) присутствовали антитела к тем или иным антигенам, использованным в работе, ни один из 24 анализов не позволил с помощью только одного антигена выявить более 60% больных (по cutoff1 или 46% - по cutoff2). Комбинация из нескольких антигенов в одном серодиагностическом тесте может позволить компенсировать отсутствие антител к одному из антигенов в коктейле наличием антител к другому антигену, и тем самым повысить общую чувствительность анализа, по сравнению с анализом с одним антигеном.

В данной работе расчетным путем были определены предполагаемые значения общей чувствительности анализов с двумя антигенами из числа исследованных. Для расчета эффективности антигенных коктейлей из нескольких вариантов аналогичных белков, полученных разными способами, были выбраны антигены, обладающие лучшими показателями диагностической достоверности.

Например, из трех аналогичных белков еRv2875, еRv2875Ar, рRv2875 для расчета антигенного коктейля был выбран рRv2875.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«Владимирова Элина Джоновна ИНФОРМАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЛЕСНОЙ КУНИЦЫ И НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ СО СРЕДОЙ ОБИТАНИЯ (CARNIVORA: CANIDAE ET MUSTELIDAE) Том 1 03.02.08 – экология, 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Егорова Жанна Геннадьевна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКТИВНОСТИ И КАЧЕСТВА МЯСА, ПОЛУЧЕННОГО ОТ СВИНЕЙ ПОСЛЕ ОВАРИОЭКТОМИИ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Гиро Татьяна Михайловна Саратов – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 1 ОБЗОР...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ФЕДИН Андрей Викторович КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09 – аллергология и иммунология 14.01.03 – болезни уха, горла и носа ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«СЛАДКОВА Евгения Анатольевна ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.