WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |

«ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ...»

-- [ Страница 2 ] --

Негативное влияние на эпидемиологическую ситуацию по туберкулезу в России оказывает рост заболеваемости ВИЧ-инфекцией. Туберкулез является основной оппортунистической инфекцией у ВИЧ-инфицированных. Риск развития туберкулеза у данной категории людей превышает 10% в год, а запаздывание выявления заболевания и начала соответствующего лечения более чем на три недели после его активации является причиной 45-85% случаев летального исхода при сочетании двух инфекций [31, 49, 73, 296].

В РФ наблюдается один из самых высоких темпов роста заболеваемости ВИЧ - инфекцией в мире. Более 10% новых случаев туберкулеза в России выявляется у ВИЧ-инфицированных людей [5, 9, 233].

Для туберкулеза у ВИЧ-инфицированных, как правило, характерны атипичные некавернозные легочные и внелегочные локализации, которые довольно сложно диагностируются классическими клиническими и лабораторными методами. Многокомпонентная превентивная терапия против туберкулеза у всех ВИЧ-инфицированных, особенно повторные курсы или пожизненная профилактика, практически не осуществимы. Кроме того, для ее назначения, согласно рекомендации программы ВОЗ по ВИЧ/СПИД, необходимо исключение активного туберкулеза для снижения риска развития лекарственной устойчивости у циркулирующих штаммов M. tuberculosis [78, 223].

Ухудшению эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России способствуют высокая распространенность туберкулеза среди лиц пенитенциарных учреждений, а также среди мигрантов и социально дезадаптированных лиц. По данным Министерства здравоохранения РФ в 2011 году среди впервые выявленных больных туберкулезом 11,3% составили лица, зарегистрированные Федеральной службой исполнения наказания, 2,7% иностранные граждане, 2,2% - лица без определенного места жительства. Из 35 000 заключенных, больных туберкулезом, в 2011 году около 24% составляли носители штаммов M. tuberculosis с МЛУ и 17,5% имели сочетанную патологию ВИЧ и туберкулез (ВИЧ+ ТБ+) [12, 23].

Неполный охват населения профилактическими осмотрами (65,8% в 2013 году), запаздывание диагностики и низкая эффективность лечения больных туберкулезом с МЛУ также являются факторами, ассоциированными с ростом заболеваемости туберкулезом в России. При этом традиционные методы диагностики туберкулеза не обладают достаточной эффективностью для выявления данного заболевания на ранних стадиях, особенно у детей, у людей со сниженным иммунитетом и другими сопутствующими патологиями [21].

Новые методы диагностики, основанные на детекции реакций иммунитета при туберкулезе, обладают рядом преимуществ, по сравнению с методами «золотого стандарта», и внедрение их в практику может внести вклад в улучшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России [31].

1. 2. Современные методы диагностики туберкулеза

«Золотым стандартом» диагностики туберкулеза считается выявление M. tuberculosis при бактериоскопическом или культуральном исследованиях. Эти методы позволяют визуально обнаружить микобактерии в биологических жидкостях организма, однако, они не всегда эффективны.

С помощью бактериоскопии мазка мокроты трудно отличить M. tuberculosis от других кислотоустойчивых бактерий. Кроме того, для детекции микобактерий в мазке необходимо не менее 105 бактерий на 1 мл образца, что возможно лишь для больных с массивным бактериовыделением. По данным зарубежных авторов, чувствительность данного метода для пациентов с легочным туберкулезом не превышает 50% [31, 85]. В РФ в 2011 году только 31,5% случаев впервые выявленного ЛТБ было подтверждено микроскопией мазка и лишь 43% - посевом мокроты, при рекомендуемых уровнях - 50% и 75%, соответственно [23].

Культуральный метод диагностики туберкулеза высокоспецифичен и позволяет определять чувствительность возбудителя к антибиотикам. Однако этот метод требует длительного ожидания (занимает 4-12 недель) и в части случаев оказывается безрезультатным [162].

Полуавтоматизированный радиометрический культуральный метод с использованием таких систем, как BACTEC TB-460, BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD) и MB/BacT (Organon Teknika), позволяет обнаружить возбудителя в более короткие сроки (10-20 дней), однако, достаточно дорог для повсеместного применения [6, 223].

Рентгенологическое обследование неспецифично и, по мнению некоторых авторов, не является экономически оправданным методом скрининга населения на туберкулез [330]. При сочетании туберкулеза с ВИЧ-инфекцией этот метод часто дает атипичную картину, и в 10-20% изменения на рентгенограмме остаются в пределах нормы [31, 215].

Методы диагностики, основанные на ПЦР (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test, Gen-Probe; Amplicor, Roche; ProbeTec ET, BD Becton Dickinson, Sparks, MD) имеют высокую специфичность. В тоже время, чувствительность их, как правило, невысокая, что обусловлено трудностями амплификации олигобациллярных образцов, влияния ингибиторов, присутствующих в образцах, на течение реакции и другими факторами. С помощью ПЦР сложно дифференцировать от других M. tuberculosis представителей комплекса M. tuberculosis из-за высокого сходства их геномов.

Также применение этих методов ограниченно относительно высокой стоимостью анализа, необходимостью наличия дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов [31, 218, 223, 284].

Иммунодиагностика предоставляет новые возможности для улучшения диагностики туберкулеза. Она позволяет обнаружить активный туберкулезный процесс в организме на основании иммунологических признаков инфекции.

Иммунодиагностика имеет перспективы для выявления туберкулеза в короткие сроки вне зависимости от локализации инфекции и формы заболевания [31].

Современные методы диагностики туберкулеза, основанные на реакциях клеточного и гуморального иммунитета, обладают чувствительностью и специфичностью, достаточными для дифференцирования активного туберкулеза от предшествующей вакцинации БЦЖ или контакта с непатогенными микобактериями (НМБ), а также от предыдущего инфицирования M. tuberculosis [102].

Преимуществами серодиагностических ИХ тест-систем на туберкулез является их простота, воспроизводимость, малая инвазивность, доступность для стран с низким уровнем жизни населения, а также возможность их использования даже в, так называемых, полевых условиях без наличия специализированных лабораторий и персонала [102, 292]. Преимущества и недостатки различных методов диагностики туберкулеза представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Преимущества и недостатки различных методов диагностики туберкулеза [223]

–  –  –

1. 2. 1. Современные методы иммунодиагностики туберкулеза 1. 2. 1. 1. Туберкулинодиагностика Уже более ста лет туберкулинодиагностика остается единственным широко распространенным методом массовой диагностики туберкулеза. С целью выявления людей больных туберкулезом, лиц с повышенным риском развития заболевания или нуждающихся в ревакцинации, а также для мониторинга эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России ежегодно проводится обследование детей, подростков и декретированного контингента с помощью пробы Манту (внутрикожным введением 2 ТЕ туберкулина ППД-Л и регистрацией размеров папулы через 72 часа) [18].

Патофизиологической основой туберкулиновой пробы является гиперчувствительность замедленного типа на вводимый внутрикожно неполный антиген-туберкулин. Гиперергическая реакция на туберкулин и вираж туберкулиновой пробы являются показаниями для дальнейшего обследования на туберкулез [294].

Несмотря на широкое распространение туберкулинодиагностики, у нее есть ряд существенных недостатков. Прежде всего, туберкулин содержит более 200 микобактериальных антигенов, многие из которых встречаются и у других микобактерий, в том числе и у вакцинного штамма M. bovis BCG. Проба Манту имеет низкую специфичность и дает возможности отличить активный туберкулез от вакцинации БЦЖ, предшествующего инфицирования M. tuberculosis или перекрестной реактивности с непатогенными микобактериями окружающей среды [247].

В тоже время, при некоторых патологиях туберкулиновая чувствительность у пациентов может полностью отсутствовать (туберкулиновая анергия).

Туберкулиновая анергия характерна для больных с тяжелым прогрессирующим течением туберкулёза, при сочетании туберкулеза со злокачественными новообразованиями, острыми инфекционными заболеваниями, выраженными иммунодефицитами, а также для 15% пациентов с вновь выявленным туберкулезом, у которых по мере стабилизации процесса реактивность восстанавливается [271].

Напротив, ложноположительные реакции могут быть проявлением поствакцинального иммунитета, возникать при контакте с нетуберкулезными микобактериями, а также при частой (более одного раза в год) постановке пробы («бустерный эффект») [204]. При постановке пробы и оценке результатов существенную роль играет человеческий фактор. Тест Манту довольно сложно выполнить правильно, так как небольшие вариации способа исполнения процедуры изменяют количество туберкулина, внесенное в кожу, и, следовательно, последующую величину реакции. Более того, измерения реакции крайне субъективны [204, 223]. По данным литературы, туберкулиновый кожный тест имеет чувствительность около 70% среди случаев подтвержденного активного туберкулеза, а у людей с ослабленным иммунитетом около 30% [223].

В исследовании А. Ф. Мейснер чувствительность туберкулинодиагностики среди детей составила 53,7%, а среди подростков – только 14,2% [14].

В настоящее время в РФ разрешен к применению «Диаскинтест» («Лекко», Россия), основанный на детекции реакции клеточного иммунного ответа организма на белки M. tuberculosis (ESAT-6, CFP-10). Он высокочувствителен (по данным литературы до 78,4% у взрослых и 90,5% у детей), однако, инвазивность метода, наличие противопоказаний, вероятность развития анергии также могут в некоторых случаях ограничить его применение [26].

1. 2. 1. 2. Методы детекции высвобождения гамма-интерферона

Современные методы диагностики туберкулеза, основанные на реакциях клеточного (Interferon Gamma Release Assays (IGRA)) и гуморального иммунитета (тесты ИФА, ИХ, иммунодот), могут стать привлекательной альтернативой пробе Манту, показывая более высокую эффективность выявления заболевания при отсутствии недостатков, присущих кожному тесту [64].

Методы IGRA (ELISPOT и QuantiFERON-TB) основаны на детекции высвобождения -ИНФ лимфоцитами при контакте с антигенами M. tuberculosis [298].

Метод ELISPOT заключается в определении количества эффекторных Тлимфоцитов, секретирующих -ИНФ in vitro при контакте с антигенами M. tuberculosis. Этот метод обладает высокой чувствительностью, так как позволяет выявлять единичные Т-клетки, имевшие контакт с антигенами M. tuberculosis и, таким образом, диагностировать латентный туберкулез и туберкулез у пациентов со сниженным иммунитетом. Чувствительность метода, по оценкам разных авторов, может достигать 96% - среди пациентов с активным туберкулезом, 85% - при латентной инфекции и около 92% у ВИЧинфицированных туберкулезных больных. В новом поколении тестов ELISPOT Великобритания) в качестве антигенов, T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, стимулирующих продукцию -ИНФ, используются белки (ESAT-6, CFP-10), отсутствующие в вакцинном штамме и у большинства M. bovis BCG нетуберкулезных микобактерий [172, 203].

Оригинальный QuantiFERON-TB и улучшенные его версии QuantiFERON-TB Gold (QFT-G) и QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) (Cellestis ltd., Австралия) – это диагностические препараты, которые посредством метода ИФА определяют уровень -ИНФ, высвобождающегося из Т-клеток цельной крови человека, инфицированного в ответ на стимуляцию их M. tuberculosis, туберкулином PPD, двумя (ESAT-6, CFP-10) или тремя (ESAT-6, CFP-10 и ТВ7.7) белками M. tuberculosis, соответственно [94, 234]. В работе G. Ferrara и соавторов тест QFT-G показал лучшую выявляемость туберкулеза (73%) среди больных активным внелегочным туберкулезом, по сравнению с пробой Манту (68%), однако, худшую, по сравнению с T-SPOT.TB (100%) с теми же образцами крови [96]. В связи с тем, что положительный результат тестов IGRA не позволяет различить латентный и активный туберкулезные процессы, специфичность методов, основанных на определении -ИНФ, при детекции активного туберкулеза может оказаться невысокой (по данным M. Sester - от 59% для TSPOT.TB и от 79% - для QFT-G). Методы IGRA, как правило, менее эффективны в случаях туберкулеза у детей и у людей с иммунодефицитами [64, 268].

В развитых (неэндемичных) странах IGRA рекомендуются использовать для выявления латентного туберкулеза среди контактных лиц, так как эти методы более специфичны и информативны, по сравнению с пробой Манту. В странах, эндемичных по туберкулезу, в связи с высокой инфицированностью населения методы IGRA информативны в основном для целей мониторинга состояния ВИЧинфицированных лиц с высоким риском развития заболевания, например, при семейном контакте с больным туберкулезом, а также при общей оценке эпидемиологической ситуации по туберкулезу в различных популяциях [31].

К преимуществам вышеназванных методов можно отнести неинвазивность методики, объективность оценки результатов, доступность результатов в течение 24 часов, отсутствие влияния предыдущей вакцинации БЦЖ и контакта с нетуберкулезными микобактериями, высокая степень достоверности методов (р0,01). Однако эти методы требуют наличия квалифицированных специалистов, дорогостоящего оборудования, свежих образцов крови с жизнеспособными лейкоцитами, что достаточно трудно выполнить в большинстве регионов с высокой распространенностью туберкулеза [39, 305].

1. 2. 1. 3. Иммуносеродиагностика

Серодиагностика туберкулеза берет свое начало в 1898 году, когда С. Арлоинг впервые использовал сыворотки больных туберкулезом пациентов в реакции гемагглютинации [46]. Однако этот метод не соответствовал в полной мере требованиям по чувствительности и специфичности, предъявляемым для диагностики туберкулеза в тот период.

С внедрением в научную практику в 1971 году простого, воспроизводимого, высокочувствительного и недорогого метода ИФА интерес к серодиагностике туберкулеза в научных кругах снова возобновился. Метод ИФА позволяет регистрировать повышенный уровень антимикобактериальных антител у больных туберкулезом, по сравнению со здоровыми людьми [55, 223].

В ранних исследованиях гуморального иммунного ответа для выявления серореактивных антител использовались грубые антигенные препараты на которые возникали перекрестные реакции у БЦЖM. tuberculosis, вакцинированных здоровых людей и у лиц, контактных по НМБ [170, 318].

Первыми очищенными антигенами, на которые тестировался антительный ответ, были белки, преобладающие в антигенном спектре туберкулина: 38 килодальтон кДа 19 кДа, 14 кДа белки, а также гликолипид (кДа), 30 (Ag85B), липоарабиноманнан (ЛАМ). Наиболее высокие значения чувствительности и специфичности выявлял 38 кДа антиген [36, 42, 350].

В последних исследованиях для оценки гуморального иммунитета у туберкулезных больных методом ИФА используют преимущественно рекомбинантные белки, синтетические пептиды и липидные антигены M. tuberculosis [48, 236, 303].

При создании серодиагностического теста важен аргументированный выбор класса детектируемых антител против антигенов, составляющих основу теста.

Большинство исследователей гуморального иммунного ответа при туберкулезе отдают свое предпочтение определению противотуберкулезных IgG антител, так как их обнаруживают в крови пациентов в активную фазу туберкулеза в большем титре, чем другие классы иммуноглобулинов. Однако в некоторых исследованиях при объединении результатов ИФА тестов, определяющих IgG и IgА к одному антигену наблюдается значительное увеличение общей M. tuberculosis, чувствительности, по сравнению с результатами отдельных тестов. Определение IgM антител, несмотря на низкую частоту положительных реакций, также может внести вклад в улучшение общей чувствительности серодиагностического теста наряду с определением IgG и IgA у больных туберкулезом. Большинство коммерческих серодиагностических тестов детектирует все три класса антител [236].

Разработаны методики определения антител к антигенам M. tuberculosis не только в сыворотке крови, но и в моче, и в других биологических жидкостях [79,170]. Например, в моче определяют антитела против МРТ32, 81 кДа белка, ЛАМ, а в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) - 65 кДа, 14 кДа белки, CFP-10, CFP-21, MPT64, ESAT-6 и другие. Однако в настоящее время эти методы обладают меньшей эффективностью выявления туберкулеза, по сравнению с определением антител в образцах сыворотки крови [56, 167, 168, 211, 279, 299, 300].

На основании результатов, полученных в исследованиях гуморального иммунитета при туберкулезе, разрабатываются тест-системы для серодиагностики.

Данные о некоторых коммерческих серодиагностических тест-системах приведены в таблице 3.

ИФА тест-системы позволяют обнаруживать антитела различных классов к одному или нескольким иммунодоминантным антигенам M. tuberculosis. Данный формат серологических тест-систем имеет преимущества при использовании его в лабораториях с большим количеством образцов, при этом он может быть полностью автоматизирован [44, 292].

Тест-системы для серодиагностики могут быть выполнены в виде ИХ теста, или стрип-теста. Главными преимуществами этих тестов являются их простота, скорость исполнения и невысокая цена. Этот формат, при условии высоких показателей чувствительности и специфичности, является оптимальным для скрининга населения в станах с низким уровнем жизни.

На рисунке 5 представлен график сравнительной эффективности различных коммерческих тест-систем для диагностики туберкулеза.

В настоящее время на территории РФ разрешены к применению в клинической практике Министерства здравоохранения Российской Федерации несколько серологических тестов на туберкулез: TB-Spot ver.2.0 (Span Diagnostics Ltd, Индия), iCHECK-TB (IND, Канада) и ИммуноХром-анти-МТ-Экспресс (ООО Прогрессивные Био-Медицинские Технологии, Россия). TB-Spot ver.2.0 позволяет обнаруживать антитела к антигенам M. tuberculosis (ЛАМ и 38 кДа белку) в 80случаев туберкулеза и имеет специфичность 95%. Другие два теста основаны на определении антител к антигенному комплексу M. tuberculosis А60 - их чувствительность составляет 70-80%, а специфичность - 80-100% среди различных групп туберкулезных больных на территории РФ [44, 292].

–  –  –

Рисунок 5 - График распределения коммерческих тест-систем по их диагностической эффективности при легочном туберкулезе [87] Данные об эффективности тестов в различных регионах существенно отличаются. Например, ИФА тест-система «Pathozyme TB complex plus», детектирующая антитела класса IgG к 38 кДа и 16 кДа белкам M. tuberculosis, выявляет туберкулез среди больных в Индии в 78%, а в Испании в 31% случаев.

Эти различия, характеризующие географическую гетерогенность иммунного ответа на антигены диктуют необходимость создания M. tuberculosis, серодиагностических тестов для каждого отдельного региона с учетом эффективности составляющих его компонентов для данной (антигенов) популяции [145, 331].

Согласно рекомендации ВОЗ для замены методов «золотого стандарта»

диагностики туберкулеза серологический тест должен обладать чувствительностью более 80% и специфичностью более 95% [334]. На рынке представлено большое число сертифицированных зарубежных тестов с соответствующими показателями эффективности (например, ИФА тесты: AndaTB IgG, SEVA TB ELISA Test (JB Trop Dis Res Centre, Индия), Mycowell (Span Diagnostics, Индия); иммуноспот: TB-Spot Ver 2.0, ИХ тесты: SD BIOLINE Ag MPT64 Rapid (S.D. Bio Standard Diagnostic, Индия), TB SCREEN TEST (Bisen Индия), ИммуноХром-анти-МТ-Экспресс), однако, заявленные Biotech, производителями характеристики не всегда подтверждаются в независимых исследованиях. Ни один из существующих в настоящее время коммерческих тестов не может быть рекомендован для применения независимо от традиционных методов диагностики [44, 292, 334].

Несколько лет назад был запатентован новый иммунологический метод выявления туберкулеза «Antibodies также from lymphocyte secretion», называемый «Antibody in lymphocyte supernatant» (ALS), основанный на детекции с помощью ИФА антимикобактериальных антител, секретируемых активированными циркулирующими В-лимфоцитами и плазматическими клетками. По мнению автора патента, R. Raqib, антитело-продуцирующие клетки

- короткоживущие и обнаруживаются в крови только в период активного заболевания, поэтому данный метод выявляет только активный туберкулез.

Чувствительность ИФА с образцами ALS, детектирующими антитела к различным антигенам M. tuberculosis, достигает в некоторых случаях 93% при высокой специфичности. Данный метод имеет перспективы для использования в серодиагностике туберкулеза, в том числе у детей [244, 245, 248, 254].

1. 3. Особенности гуморального иммунного ответа при туберкулезе

Длительный период времени диагностика туберкулеза, основанная на измерении гуморального иммунного ответа, считалась неэффективной и неоправданной, так как основной механизм защиты организма против M. tuberculosis - это клеточно-опосредованный иммунитет. Тем не менее, гуморальный иммунитет является ранним «свидетелем» инфицирования M. tuberculosis, и при активном туберкулезном процессе в сыворотке крови больных туберкулезом обнаруживается повышенный титр противотуберкулезных антител [102, 240].

Принято считать, что клеточно-опосредованный иммунитет играет решающую роль в развитии туберкулеза, так как M. tuberculosis внутриклеточный патоген. При этом значение гуморального иммунитета практически не принимается во внимание в связи с принятой в середине 80-х годов 20 века Th1/Th2 парадигмой, поддерживающей представление о том, что формирование приобретенного иммунитета зависит от поляризации Т-клеток в Тхелперы(Th)-1 или Th2, доминировании одного типа иммунного ответа, например, клеточного в случае туберкулеза, и угнетении другого.

Однако иммунитет против патогенных микроорганизмов является результатом не поляризации Th, а формируется, начиная с распознавания, презентации и представления антигена Т-клеткам. Дифференцировку вновь активированных нативных Т-клеток в зрелые Th1 или Th2 регулируют многие факторы: локальное цитокиновое микроокружение, наличие гормонов, тип антигенпрезентирующих клеток (АПК), стимулирующих Т-клетки, количество антигена и плотность Т – клеточных рецепторов (TCR), сила сигнала - суммарная аффинность связи TCR с антигеном. У человека, в отличие от инбредных мышей, нет строгого разделения профилей секретируемых цитокинов между Th1 и Th2.

Например, Th1 могут секретировать интерлейкин (ИЛ)-10 и ИЛ-13. Главным отличием между популяциями клеток является секреция -ИНФ первым, а ИЛ-4 – вторым типами Т-хелперов. Экспериментальные исследования убедительно демонстрируют наличие взаимозависимости и синергии между клеточным и гуморальным иммунитетом.

В течение развития инфекции внутриклеточный патоген M. tuberculosis может быть локализован и внеклеточно, например, в верхних отделах респираторного тракта в начале заболевания или при разрушении гранулем, и доступен для специфических антител.

C. Lienhardt показано, что у контактных по туберкулезу Th1 ответ превалирует над Th2 ответом, при этом повышение активности Th2 у данной группы пациентов ассоциировано с высоким риском активации заболевания, при клиническом выздоровлении клеточное звено иммунного ответа вновь преобладает над гуморальным [30, 159, 183, 209].

Антитела при туберкулезе играют важную роль в усилении иммунной защиты организма против M. tuberculosis. Они участвуют в нейтрализации токсинов (например, нейтрализуют токсический эффект корд-фактора), в реакциях опсонизации, активации комплемента по классическому пути, антителзависимой клеточной цитотоксичности, презентации антигена, способствуют фагосомально-лизосомальному слиянию, секреции цитокинов. Например, S. de Vallie`re показано, что антимикобактериальные антитела усиливают клеточный иммунитет против микобактерий, в том числе за счет стимулирования пролиферации CD4+ и CD8+ Т клеток и выброса ими -ИНФ [143, 312]. Кроме того, противотуберкулезные антитела препятствуют адгезии бактерий к клеткам тканей хозяина. В частности, в одном из исследований обработка фильтрата культуры M. tuberculosis, интраназально вводимого лабораторным мышам, антителами к поверхностному гликопротеину НВНА, участвующему в адгезии микобактерий к эпителиальным клеткам, позволила уменьшить обсемененность селезенки микобактериями [229].

Протективная роль антител в защите против M. tuberculosis, была описана еще в конце 19 века П. Паквиным и К. Фишем. Например, П. Паквин в 1897 году отмечал положительный эффект терапии туберкулезных больных лошадиными антитуберкулиновыми сыворотками [98, 113, 228].

В настоящее время также получены экспериментальные доказательства протективной роли антител в защите против микобактериальной инфекции [121].

В ряде исследований было продемонстрировано, что введение иммунокомпетентным мышам (дефицитным по В-клеткам или с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID)), инфицированным M. tuberculosis или моноклональных антител против некоторых антигенов M. bovis, M. tuberculosis (НВНА, 16кДа белок, Ag85A, Ag85B, МРТ83, ЛАМ), способствует снижению обсемененности тканей микобактериями и увеличению продолжительности жизни животных за счет уменьшения гранулематозного воспаления и некроза [30, 66, 112, 114, 174, 188, 229, 312].

Данные, полученные свидетельствуют об участии A. M. Costello, антимикобактериальных антител (антител против ЛАМ и сониката культуры в предотвращении развития диссеминированных форм M. tuberculosis) туберкулеза у детей [74].

Гуморальный иммунитет может играть большую роль в защите против туберкулеза, чем предполагалось ранее. Так, например, в недавних исследованиях было показано, что в легких у больных туберкулезом людей обнаруживаются фолликулоподобные агрегаты, состоящие из В-клеток, а у больных обезьян - даже активированные В-клетки. По мнению авторов данных работ, В-клетки и противотуберкулезные антитела могут принимать участие в местном иммунитете в очаге инфекции и в стимуляции общего иммунитета в организме больного туберкулезом [197, 230, 306].

В формировании гуморального иммунного ответа при туберкулезе наблюдается тенденция к нарастанию титра и созреванию аффинности противотуберкулезных антител классов IgG и IgA при усилении активности туберкулезного процесса. При развитии вторичного туберкулеза титр данных антител и их аффинность значительно увеличиваются в связи с активацией механизма иммунологической памяти.

В большинстве случаев, у пациентов с более выраженными поражениями тканей и тяжелым течением заболевания определяются более высокие уровни IgG антител против антигенов M. tuberculosis. Титры антител класса IgA также коррелируют с тяжестью процесса.

Противотуберкулезные IgM антитела при активном туберкулезном процессе определяются редко. Вероятно, это связано с тем, что IgM синтезируются на ранних этапах развития инфекции, присутствуют в крови непродолжительное время и, как правило, в меньшей концентрации, чем IgG и IgA.

Существует предположение о том, что наивные IgM могут связывать широкий спектр антигенов с низкой аффинностью, а зрелые IgG - напротив узкий круг антигенов, но с более высоким сродством к ним. Поэтому большинство исследований гуморального иммунитета при туберкулезе сосредоточено на определении антител класса G или А [100, 324].

Однако в некоторых случаях именно IgM доминирует при ответе на определенные антигены при активном туберкулезном процессе. Например, при изучении гуморального иммунного ответа среди больных туберкулезом Бразилии, чувствительность теста, выявляющего анти-МРТ51 антитела класса IgM, оказалась значительно выше чувствительности теста, определяющего антиМРТ51 IgG, в тоже время среди анти-GlcB антител преобладали IgG [168].

В исследовании E. Gatner, было показано, что при туберкулезе повышен титр и антител класса IgE, однако, они находятся в сыворотке крови в основном в связанном состоянии в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) [107].

После проведенного лечения антительный ответ на M. tuberculosis, как правило, угасает, однако, противотуберкулезные антитела могут персистировать в крови еще некоторое время [168, 275].

Например, в работе M.S. Imaz было выявлено угасание антительного ответа к белкам фильтрата культуры M. tuberculosis в течение 3 лет, а к белкам менее 20 кДа - в течение двух лет после начала химиотерапии [117, 140].

В исследовании S. Hu противотуберкулезные антитела обнаруживались в сыворотке больных до 3 месяцев после начала лечения, однако, уже через 9-12 месяцев они полностью исчезали [137].

Результаты работы демонстрируют потенциальную J. M. Bezerra клиническую ценность определения антимикобактериальных антител класса А для мониторинга эффективности терапии туберкулеза: у 40% наблюдаемых больных туберкулезом в ходе лечения отмечалось снижение титров IgA против гликолипидного и белковых антигенов M. tuberculosis, а к концу терапии 20% больных оказались серонегативными [54].

После начала химиотерапии уровень антимикобактериальных антител может возрастать в результате освобождения антигенов из убитых бактерий, при этом авидность данных антител в большинстве случаев снижается. Чем продолжительнее течение заболевания, тем выше авидность антител, что указывает на созревание аффинности специфических антител в период активного туберкулезного процесса. По данным увеличение авидности M. Lenka специфических антител является лучшим индикатором активации заболевания, по сравнению с возрастанием титра данных антител у больных туберкулезом, особенно в случае рецидива заболевания [179, 180].

Характер иммунного ответа при туберкулезе зависит от природы антигенов M. tuberculosis и их свойств. Например, замечено, что гуморальный иммунный ответ формируется преимущественно на высокомолекулярные белки (38 кДа, 81кДа белки, 309 кДа белок (Rv3347), а Т-клеточный ответ на низкомолекулярные белки (ESAT-6, CFP-10, TB7.7) [50, 57, 169, 170,180].

Антителообразование при туберкулезе могут стимулировать и выявлять различные компоненты микобактерий: белки, липиды, полисахариды.

Некоторые исследователи полагают, что при определенных вариантах туберкулеза на гликолипидные антигены M. tuberculosis формируется более выраженный гуморальный ответ, чем на белковые антигены [102, 145]. Например, гликолипидные антигены обладают лучшей дифференцирующей способностью при серодиагностике в случаях ВИЧ - ассоциированной туберкулезной инфекции, внелегочного и «мазок-негативного» легочного туберкулеза. Вероятно, эти особенности обусловлены различиями в механизмах формирования иммунного ответа на антигены разной природы [199].

Липидные и полисахаридные антигены M. tuberculosis относятся к тимуснезависимым антигенам, которые презентируются незрелыми дендритными, В-клетками, тимоцитами TCR и TCRCD4-CD8- Т-лимфоцитам, а так же Тклеткам натуральным киллерам (НКТ) в комплексе с молекулой CD1. При этом одни антигены, такие как ЛАМ и глюкоза мономиколат, презентируются в комплексе с белками CD1 группы 1 (CD1a, CD1b, CD1c), а другие, галактоцерамиды, с CD1 группы 2 (CD1d).

Активированные антигеном CD1-рестрицированные Т-клетки могут, как секретировать Th2-цитокины (ИЛ-4, ИЛ-13), стимулирующие активацию ВCD1 CD21 - клеток, так и непосредственно взаимодействовать с экспрессирующими В-клетками маргинальной зоны селезенки, способствуя усилению антительного ответа на небелковые антигены [316].

CD1d - рестрицированные НКТ клетки стимулируют продукцию антител плазматическими клетками, переключение класса синтезируемых антител, а также способствуют формированию В-клеток памяти.

Повышенная экспрессия CD1 на незрелых дендритных клетках предполагает, что CD1 - рестрицированные Т-клетки могут функционировать в более раннюю фазу иммунного ответа, чем главный комплекс гистосовместимости (ГКГС) - рестрицированные Т-клетки, а значит, CD1 опосредованная презентация антигенов служит основанием для возможности детекции микобактериальной инфекции вне зависимости от состояния Тклеточного иммунитета [28, 219, 237].

Белковые антигены традиционно презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК) в комплексе с ГКГС II, специфическое взаимодействие с TCR CD4+ T клеток, способствует дифференциации Th0 в Th2, секреции последними ИЛ-4, стимуляции и активации В-клеток, и в дальнейшем продукции антимикобактериальных антител [271].

В течение туберкулезного процесса происходит изменение спектра антигенов, синтезируемых микобактериями в зависимости от стадии и степени распространенности заболевания. Следовательно, и антитела к разным антигенам микобактерий имеют разную динамику.

Например, антитела к 16кДа белку определяются еще в латентную фазу заболевания, а антитела к 38кДа белку характерны для активного прогрессирующего туберкулезного процесса с деструктивным поражением тканей легких.

F. Min показано, что при экспериментальном туберкулезе у макак резус антитела к CFP-10, ESAT-6, MPT64, Ag85B детектируются в крови больных животных уже с 4 недели после заражения, а к ТВ16.3, 14 и 38кДа белкам - только начиная с 6-8 недели [206].

H. C. Koo были обнаружены различия в динамике анти-ESAT-6 и антиМРТ70 антител при экспериментальном бычьем туберкулезе у телят: антитела против ESAT-6 регистрировались уже на 4-12 неделях после заражения M. bovis, а антитела против МРТ70, наоборот, определялись только с 12 недели после заражения, достигая максимальных значений их титра на 20 неделе [161].

Похожие результаты были получены и в других исследованиях [97, 129, 192, 322].

В работах многих авторов антитела к антигенам M. tuberculosis детектируют не только в сыворотке крови, но и в других биологических средах организма: в ЦСЖ, плевральной, асцитической жидкостях и моче.

Некоторые исследователи отмечают, что пик нарастания титра противотуберкулезных антител при туберкулезном менингите наблюдается раньше в ЦСЖ, чем в крови. Более того, уровень антител в ЦСЖ коррелирует с тяжестью клинических проявлений при туберкулезе [170]. В моче также обнаруживают IgA антитела к некоторым белковым и липидным антигенам M. tuberculosis (МРТ32, МРТ81, ЛАМ) [79, 168, 227].

Еще в 1980 году было показано, что отсутствие противотуберкулезных антител в сыворотке больных туберкулезом может быть обусловлено включением этих антител в состав ЦИК. В ЦИК могут входить иммуноглобулины всех классов, присутствующих в повышенных титрах у больных туберкулезом (IgG, IgA, IgM, IgE).

Включение антител в ЦИК может повлиять на эффективность серодиагностики при туберкулезе. Например, в исследовании A. Raja и соавторов свободные антитела классов IgG, IgA и IgM против 16кДа белка M. tuberculosis были выявлены в 62%, 52% и 11% случаев легочного туберкулеза, соответственно, а связанные анти – 16 кДа антитела в составе ЦИК тех же классов в 97,5%, 100% и 45,3% случаев, соответственно.

Большая или меньшая часть противотуберкулезных антител участвует в формировании ЦИК. Показано, что при начальных ограниченных формах туберкулеза ЦИК в крови, как правило, отсутствуют, а при прогрессировании заболевания их количество нарастает, и они оказывают иммунопатологическое воздействие на течение туберкулезного процесса. В процессе лечения в составе ЦИК происходит постепенное снижение концентрации туберкулезных антигенов и повышение уровня антител, что может свидетельствовать об эффективности проводимой терапии [62, 242, 276].

Гуморальный ответ на антигены при туберкулезе M. tuberculosis гетерогенен. В зависимости от этнических и индивидуальных генетических особенностей организма, стадии и формы туберкулеза, сопутствующих заболеваний, а также региона проживания пациента выраженность гуморального ответа на одни и те же антигены может быть различна [191].

Прежде всего, гетерогенность гуморального иммунного ответа при туберкулезе обуславливают иммуногенетические различия больных туберкулезом. Например, полиморфизм системы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) определяет различия в степени резистентности иммунной системы против туберкулеза.

В исследованиях, проведенных как в России, так и в других странах, было показано, что фенотип HLA-DR2 ассоциирован с повышенной восприимчивостью к туберкулезу и измененными антительным и клеточным ответами при легочном туберкулезе [24, 290].

У больных туберкулезом, носителей наблюдается DR2-антигена, повышенный уровень противотуберкулезных антител класса IgG. Р. Selvaraj и соавторами выявлен повышенный титр антител к 38 кДа белку, 30/31 и 32/34 кДа белковым комплексам M. tuberculosis у DR2-позитивных, по сравнению с DR2негативными больными легочным туберкулезом. Также было показано, что фенотип HLA-DR2(DR15), ассоциирован с высоким титром антител к 38 кДа белку M. tuberculosis при туберкулезе [264, 266, 310].

Многие HLA-DR молекулы могут регулировать IgG и IgA антительные ответы на различные антигены M. tuberculosis. В одном из исследований было показано, что у больных туберкулезом с HLA-DR4 и HLA-DR6 наблюдается повышенный уровень анти-Ag85B антител класса IgG, по сравнению с HLA-DR1+ пациентами, а анти-Ag85B антитела класса IgA присутствуют в крови HLA-DR1+ пациентов в более высоком титре, чем у HLA-DR1-[265].

По данным Л.И. Арчаковой наличие в генотипе у больного одного из трех вариантов сочетаний генов (HLA-DRB1*04 и HLA-DQB1*02, HLA-DRB1*16 и (или предрасполагает к тяжелому HLA-DQB1*03 HLA-DQB1*05)) прогрессирующему течению туберкулеза с доминированием гуморального иммунитета, а генотип только HLA-DQB1*03, напротив, ассоциирован с ограниченными формами туберкулеза и незначительным возрастанием титра противотуберкулезных антител в крови [2].

Повышенная восприимчивости к туберкулезу у различных этнических групп также связана с разными HLA-специфичностями: у русских с HLA-В5, -В14 и - В17, у канадцев - B8, у греков- B27, у египтян - A2 и B5.

Сниженная восприимчивость к туберкулезу обнаружена, например, у афроамериканцев с HLA-DR6 [24].

В недавних работах были показаны аллельные различия гена HLA-DRB1 в различных популяциях, например, у больных туберкулезом жителей Тувы наиболее часто встречались генотипы HLA-DRB1*13 и *14, Сирии – его аллель *04, Ирана - *07, Китая и Индии - *15 [3, 8, 24, 27, 158, 235, 252].

Географическая гетерогенность иммунного ответа при туберкулезе обусловлена не только этногенетическими чертами популяции, но и особенностями циркулирующих в данном регионе штаммов M. tuberculosis, отличающихся по спектру экспрессирующихся белков, уровнем распространенности туберкулеза, а также наличием или отсутствием БЦЖ - вакцинирования населения в регионе.

Существование географической гетерогенности антительного ответа при туберкулезе признают многие авторы [45, 136, 210, 258, 270, 308, 325]. Она может быть обусловлена распространением в разных регионах различных клинических изолятов M. tuberculosis.

В работе G. A. de Souza обнаружены разные паттерны экспрессии белков для гипо- и гипервирулентрных штаммов M. tuberculosis, принадлежащих к сполигосемейству Beijing. [286].

В исследовании G. Kumar при определении гуморального ответа на белки фильтрата культуры и цельноклеточные экстракты 39 клинических изолятов M. tuberculosis из 10 регионов Индии было выявлены различия в числе сывороток (чувствительности анализа), реагировавших с разными штаммами, что может говорить о разных антигенных профилях экспрессии у разных штаммов M. tuberculosis на одном этапе культивирования [164].

В регионах, эндемичных по туберкулезу, титр антител к M. tuberculosis специфичным антигенам у здорового населения значительно повышен. Так, например, в работе S. T. Hoff при тестировании слитого белка ESAT6-CFP10 методом ИФА с сыворотками жителей эндемичного региона (Эфиопии) среднее значение оптической плотности в группе здоровых доноров (0,238) было выше значений, полученных для группы больных туберкулезом (0,158) неэндемичного региона (Дании), что авторы связывали с высокой распространенностью латентного туберкулеза в первом случае [135].

Таким образом, при оценке гуморального иммунного ответа на антигены M. tuberculosis необходимо использовать сыворотки больных и здоровых доноров (в качестве отрицательных контролей) из одного региона.

Иммунный ответ на M. tuberculosis различается у пациентов разного пола и возраста. Например, некоторые авторы отмечают наличие повышенной восприимчивости к туберкулезу у лиц женского пола до, а у лиц мужского пола после полового созревания. Данные наблюдения в литературе объясняются возможной протективной ролью женских половых гормонов, однако, истинная причина данного наблюдения пока не установлена [138].

Различия гуморального иммунного ответа при туберкулезе у пациентов разных возрастных групп достаточно хорошо изучены.

У детей уровень продукции противотуберкулезных антител ниже, чем у взрослых, особенно младше 5 лет. Повышенные титры противотуберкулезных антител встречаются в основном у детей старше 6 лет и, главным образом, при прогрессировании заболевания, либо уже при вторичном туберкулезе. Это может быть связано с тем, что титр антител класса G достигает значений взрослого лишь к 6 годам, а класса А - только в подростковом возрасте.

Выраженность гуморального ответа у детей ассоциирована с уровнем обсемененности тканей M. tuberculosis и наличием деструктивных изменений тканей, редко встречающихся у детей младше 10 лет. Тем не менее, у детей, как и у взрослых, наблюдается индивидуальная гетерогенность распознавания антигенов M. tuberculosis в ИФА.

В нескольких работах было отмечено, что у детей превалирует гуморальный ответ на цитозольные белки (в том числе на 65кДа белок), тогда как у взрослых он в основном направлен против секретируемых белков M. tuberculosis [309].

Согласно литературным данным, чувствительность серодиагностических тестов на туберкулез у детей варьирует от 14 до 85%, а специфичность от 86 до 100%. Широкая вариабельность данных значений обусловлена многими факторами: диагностическая точность диагностики зависит от возраста ребенка, времени проведения вакцинации БЦЖ, формы туберкулеза, изотипа антител, определяемого в исследовании, способом определения значения «cutoff». Тем не менее, многие авторы отмечают перспективы применения серодиагностики туберкулеза у детей, так как в сыворотках детей больных туберкулезом определяются повышенные, по сравнению со здоровыми детьми, титры антител против некоторых гликолипидных (PGL-Tb1, диацилтрегалоза (ДАТ)) и белковых (А60, 38 кДа, антигены комплекса Ag85) антигенов M. tuberculosis [33, 130].

С возрастом реактивность специфического противотуберкулезного иммунитета (клеточного и гуморального) угасает.

У лиц, старше 60 лет, выраженность реакции на туберкулин ниже, чем у лиц молодого и среднего возраста. Реактивность пробы Манту в 65-74 года падает с 50% до 10%, а старше 95 лет - до 5%.

В исследовании Н.А.Стоговой показано, что у больных туберкулезом пожилого возраста наблюдается иммунологическая недостаточность Т-звена иммунитета, проявляющаяся абсолютным и относительным снижением Т-клеток, снижением числа Т-хелперов, при повышении Т-супрессоров, а также определяются повышенные концентрации ЦИК и молекул средней массы, по сравнению с показателями для пациентов молодого возраста. Титр противотуберкулезных антител у больных туберкулезом пожилого возраста, как правило, ниже, чем у молодых пациентов, однако, в данной работе параметры Вклеточного иммунитета у пациентов данных возрастных групп не отличались [22, 67].

Острой проблемой современного здравоохранения является сочетание туберкулеза и ВИЧ - инфекции. Туберкулез в данном случае может быть как первичным заболеванием, так и возникать на фоне сниженного иммунитета у пациента с ВИЧ - инфекцией. Особенностью взаимодействия M. tuberculosis и ВИЧ в организме человека является совместное ухудшение ими течения обоих патологий. ВИЧ приводит к снижению числа и активности CD4+ лимфоцитов, а, следовательно, уменьшению выработки ими ИЛ-2, -ИНФ и других факторов, способствуя размножению и диссеминации M. tuberculosis. А M. tuberculosis и его продукты, в свою очередь, активируют репликацию ВИЧ [115].

Несмотря на иммуносупрессию, у ВИЧ - положительных туберкулезных больных все же сохраняется диверсифицированный антительный репертуар, что дает возможность диагностировать туберкулез у ВИЧ-инфицированных пациентов, используя серологический подход, основанный на детекции антител против специфических антигенов M. tuberculosis.

Данные, полученные разными авторами, свидетельствуют о том, что антитела к некоторым антигенам M. tuberculosis присутствуют в крови ВИЧинфицированных в повышенных титрах, причем эти значения не зависят от уровня CD4+ лимфоцитов [308]. Чувствительность серологических тестов, основанных на некоторых антигенах (например, MTB 81, MTB 51, ТВ 9.7 и другие), у ВИЧ+ТБ+ больных иногда оказывается даже выше, чем у ВИЧ-ТБ+. Эти данные определяют дополнительные преимущества серодиагностики, по сравнению с традиционными методами диагностики туберкулеза [41, 278, 325].

–  –  –

При разработке серодиагностических тестов по выявлению туберкулеза необходим обоснованный выбор антигенных препаратов.

Основными критериями их отбора могут служить следующие положения.

Во-первых, кодирующие последовательности выбранных антигенов должны быть специфичны для комплекса M. tuberculosis. Во-вторых, специфические антитела против данных антигенов должны определяться при активном туберкулезном процессе в значительно более высоком титре, чем при латентной инфекции. Втретьих, сыворотки здоровых БЦЖ-вакцинированных людей, а также пациентов с ложноположительной реакцией на туберкулин должны проявлять минимальную реактивность в отношении выбранных антигенов. Важным критерием выбора антигенных препаратов является возможность выявления с помощью них случаев «мазок-негативного» легочного, внелегочного туберкулеза, а также туберкулеза у ВИЧ-инфицированных людей.

Антигены, используемые в серодиагностике туберкулеза, можно классифицировать по локализации в клетке (внутриклеточные, поверхностные, секретируемые), по химической структуре (белки, липиды, полисахариды) или по выполняемым ими функциям (белки «теплового шока», фибронектин связывающие белки, переносчики фосфата и другие).

Первые работы по изучению гуморального иммунного ответа на отдельные антигены M. tuberculosis, были посвящены, как правило, секретируемым белкам, таким как MPT70, MPT64 и белкам комплекса Ag85. Это было связано, прежде всего, с обнаружением этих антигенов в фильтрате культуры в большом количестве, а также тем, что секретируемые белки стимулируют выраженную ответную реакцию иммунной системы. Среди внутриклеточных белков наибольшее внимание было обращено на белки теплового шока, такие как HSP60, HSP70, HSPX. Наиболее изучаемые мембранные антигены - это 19 и 38кДа липопротеины, а также ЛАМ [59,72, 255].

После расшифровки генома M. tuberculosis в 1998 году, стало возможным изучение структуры и свойств многих неизвестных ранее антигенов. Методом сравнительной геномики идентифицировано несколько «регионов различий»

(RD1-16) между M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG [63]. 16 RD кодируют около 100 белков M. tuberculosis (таблица 4).

Таблица 4 - Видовая специфичность антигенов M. tuberculosis [213]

–  –  –

В ходе продолжительного культивирования штамма M. bovis BCG in vitro (аттенуации) последовательно удалялись различные участки генома (RD, отдельные гены), появлялись дупликации (DU1, DU2-I, II, III, IV) и некоторые единичные нуклеотидные полиморфизмы (mmaA3, sigK), определяющие отличия субштаммов M. bovis BCG между собой (рисунок 6) [144].

Рисунок 6 - Генеалогия вакцинных штаммов БЦЖ [144]

M. bovis BCG Russia был получен в 1924 году. По сравнению с другими субштаммами M. bovis BCG, он имеет наибольшие сходства с первой международной вакциной БЦЖ. В геноме M. bovis BCG Russia обнаружены делеции RD1 и гена rv3698, дупликация DU2-I, а также инсерция в 5’ участке гена recA, приводящая к его инактивации, и, тем самым, содействующая высокой стабильности генома [155].

RD1 удален во всех вакцинных штаммах M. bovis BCG, но присутствует у микобактерий туберкулезного комплекса, включая все клинические изоляты M. tuberculosis и некоторые M. bovis. Существующие данные свидетельствуют о том, что RD1 отсутствует также в геномах большинства нетуберкулезных микобактерий. Данные факты предопределяют низкий уровень перекрестного реагирования на «RD1 белки» у БЦЖ-вакцинированных здоровых людей. В RD1 обнаружено 9 открытых рамок считывания, кодирующих 9 белков (Rv3871Rv3879c) [63].



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«МАКАРОВ Андрей Олегович Оценка экологического состояния почв некоторых железнодорожных объектов ЦАО г. Москвы специальность 03.02.13 – «почвоведение» и 03.02.08 – «экология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, Яковлев А.С. кандидат биологических наук Тощева Г.П. Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О...»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«Щепитова Наталья Евгеньевна Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.