WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

«ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ

МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ

ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И

БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

на правах рукописи

ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ

АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ

ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Специальность: 03.02.03 – микробиология.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Бикетов Сергей Федорович Оболенск – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Объекты исследования

Методы исследования

Личное участие автора в получении результатов

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Объем и структура диссертации

Основная часть

Глава 1. Обзор литературы

1. 1. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации....31

1. 2. Современные методы диагностики туберкулеза

1.2.1. Современные методы иммунодиагностики туберкулеза

1. 2. 1. 1. Туберкулинодиагностика

1. 2. 1. 2. Методы детекции высвобождения гамма-интерферона

1. 2. 1. 3. Иммуносеродиагностика

1. 3. Особенности гуморального иммунного ответа при туберкулезе

1. 4. Антигены Mycobacterium tuberculosis, имеющие потенциал для серодиагностики туберкулеза

1.4.1. Критерии отбора антигенов M. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза

1. 4. 2. Способы получения антигенных препаратов M. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза

1. 4. 3. Белковые антигены M. tuberculosis, обладающие потенциалом для использования в серодиагностике туберкулеза

1. 4. 3. 1. «RD1 белки» M. tuberculosis

1. 4. 3. 2. Другие потенциальные белковые антигены M. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза

1. 4. 4. Липидные и углеводные антигены M. tuberculosis.

1. 4. 4. 1. Липоарабиноманнан (ЛАМ)

1. 4. 5. Конъюгаты белков M. tuberculosis с углеводными фрагментами ЛАМ...85 1. 4. 6. Мультиантигенные композиции, используемые в серодиагностике туберкулеза

Глава 2. Собственные исследования

2. 1. Получение антигенов M. tuberculosis разными методами

2. 1. 1. Получение рекомбинантных белков M. tuberculosis в экспрессионной системе E.coli

2. 1. 2. Результаты химической конъюгации рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом ЛАМ

2. 1. 3. Получение рекомбинантных белков M. tuberculosis в экспрессионной системе P. pastoris

2. 2. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА)

2. 2. 1. Результаты ИФА с белками M. tuberculosis, экспрессированными в системе E.coli

2. 2. 2. Результаты ИФА с конъюгатами белков M. tuberculosis, полученных в системе E. coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ

2. 2. 3. Результаты ИФА с белками M. tuberculosis, экспрессированными в системе P. pastoris

2. 3. Сравнение диагностического потенциала рекомбинантных и синтетических антигенов M. tuberculosis

2. 3. 1. Сравнение показателей эффективности применения в ИФА белков M. tuberculosis, полученных в E. coli, и их конъюгатов с гексаарабинофуранозидом ЛАМ

2. 3. 2. Сравнение результатов применения в ИФА аналогичных рекомбинантных белков M. tuberculosis, полученных в разных экспрессионных системах

2. 3. 3. Сравнение результатов применения в ИФА трех вариантов одного белка M. tuberculosis, полученного разными методами................119

2. 4. Определение расчетных показателей эффективности мультиантигенных композиций, включающих антигены M. tuberculosis, использованные в работе

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Перспективные направления дальнейшей разработки темы

Приложения

Приложение 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе

Приложение 2. Основные характеристики белков M. tuberculosis, использованных в работе

Приложение 3. Гель – электрофореграмма образцов ДНК

Приложение 4. Гель - электрофореграммы белков M. tuberculosis, использованных в работе

Приложение 5. Результаты иммуноблот анализа

Принятые обозначения и сокращения

Список литературы

Список иллюстративного материала

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Одной из приоритетных задач отечественного здравоохранения является улучшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), Российская Федерация (РФ) входит в список 22 стран с высоким бременем туберкулеза, на которые приходится около 80% случаев данного заболевания в мире. Согласно ее оценке, до 20% новых случаев туберкулеза в России остаются недиагностированными в течение года [335]. При этом каждый невыявленный больной с активной формой туберкулеза ежегодно может заразить до 15 человек, а риск возникновения заболевания у тубинфицированных лиц составляет от 15 до 50% уже в течение первых двух лет после контакта с больным.

Своевременное применение эффективных методов диагностики туберкулеза может способствовать снижению темпов распространения данного заболевания [29, 31, 223].Традиционные методы диагностики туберкулеза обладают рядом недостатков: длительность культурального цикла Mycobacterium tuberculosis, недостаточная чувствительность анализа мазков, неспецифичность радиологического анализа и туберкулиновых проб, трудности диагностики внелегочного туберкулеза и другие [223].

Методы диагностики туберкулеза, основанные на детекции реакций иммунитета, могут стать привлекательной альтернативой традиционным методам, так как позволяют в ранние сроки выявлять заболевание вне зависимости от локализации очага и распространенности инфекции [31, 108].

Одним из перспективных методов иммунодиагностики туберкулеза является серодиагностика. Она в отличие, например, от туберкулинодиагностики обладает способностью дифференцировать активный туберкулез от латентной инфекции или предшествующей вакцинации бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ).

К ее преимуществам можно также отнести простоту, воспроизводимость, малую инвазивность методик, скорость исполнения анализов.

Серодиагностические тест-системы, выполненные в формате иммунохроматографических (ИХ) тестов, за счет невысокой цены и возможности их применения без специализированных лабораторий и медицинского персонала, могут быть востребованы для скрининга населения на туберкулез в странах с низким уровнем медицины [15, 108].

При разработке серодиагностических тест-систем по выявлению туберкулеза необходим аргументированный выбор антигенных препаратов.

Эффективность данных тестов также в значительной степени зависит от качества антигенов, входящих в их состав, что обусловлено, прежде всего, способом их производства. Например, применение дрожжевой системы экспрессии Pichia pastoris, в отличие от традиционно используемой бактериальной системы Escherichia coli, позволяет получать рекомбинантные белки M. tuberculosis в гликозилированной форме, что сближает их по структуре с нативными антигенами и обеспечивает эффективное взаимодействие данных антигенов со специфическими антителами в иммунологических анализах [185, 273].

Важной задачей при конструировании новых антигенов для серотестов является оптимизация композиции эпитопов для компенсации индивидуальной и региональной гетерогенности гуморального ответа больных туберкулезом [349].

Перспективными подходами для объединения нужных эпитопов из различных антигенов являются получение химерных белков, кодируемых слитными генами, а также химическая конъюгация белков с углеводными молекулами, например, с гексаарабинофуранозидом (Araf6) - основным эпитопом липоарабиноманнана (ЛАМ) [108, 126, 136].

Таким образом, наиболее актуальной задачей развития серодиагностики туберкулеза является создание новых антигенов, которые смогут обеспечить чувствительность и специфичность серотестов, требуемые для возможности их применения в качестве первичного дополнительного метода обследования населения на туберкулез.

Степень разработанности темы исследования

Впервые серодиагностика туберкулеза была применена в конце 19 века С. Арлоингом, но показала низкую эффективность [46].

Интерес к разработке серологических тестов на туберкулез возобновился после внедрения в научную практику иммуноферментного анализа (ИФА) [55, 223]. Однако использование в ИФА грубых антигенных препаратов из культуры M. tuberculosis приводило к возникновению перекрестных реакций с сыворотками здоровых людей, и, следовательно, низкой специфичности анализов [170, 318].

Современные серотесты включают преимущественно хорошо очищенные нативные или рекомбинантные белковые, а также гликолипидные антигены M. tuberculosis [48, 236, 303].

В настоящее время на рынке представлено более 70 серодиагностических тестов на туберкулез, но, в связи с недостаточными показателями их чувствительности и специфичности, ни один из тестов не рекомендован ВОЗ для применения без учета результатов традиционных методов диагностики туберкулеза [44, 292, 334, 335].

–  –  –

Цель исследования - получение рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis и оценка их потенциала для применения в серодиагностике туберкулеза.

Задачи исследования:

1. Сформулировать критерии выбора антигенов Mycobacterium tuberculosis, пригодных для серодиагностики туберкулеза.

2. Применить системы экспрессии Escherichia coli, Pichia pastoris, а также методы химического синтеза и конъюгации для получения антигенов Mycobacterium tuberculosis.

3. Сформировать панели сывороток здоровых доноров и пациентов с диагнозом туберкулез из одного региона Российской Федерации.

4. Провести сравнительный анализ чувствительности и специфичности взаимодействия полученных антигенов Mycobacterium tuberculosis с сыворотками здоровых доноров и туберкулезных больных с помощью иммуноферментного анализа.

5. Установить перспективные комбинации рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis для серодиагностики туберкулеза с учетом данных об индивидуальной вариабельности антительного ответа при туберкулезной инфекции.

Научная новизна

Впервые показана возможность получения ряда антигенов Mycobacterium tuberculosis, а именно Rv0040c, Rv1837c, Rv1860, Rv2873, Rv1636 - Rv2185c и Rv2875, в экспрессионной системе Pichia pastoris с целью дальнейшего использования их в качестве основного компонента серодиагностического теста на туберкулез.

Установлено, что серодиагностический потенциал белков, экспрессированных в дрожжевой системе Pichia pastoris, выше, чем у аналогичных белков, экспрессированных в системе Escherichia coli, что свидетельствует о том, что применение системы Pichia pastoris для получения антигенов может повысить эффективность Mycobacterium tuberculosis серодиагностики туберкулеза.

Получены новые данные о конъюгатах рекомбинантных белков с углеводными молекулами, а именно показано, что химическое конъюгирование ряда белков Mycobacterium tuberculosis, экспрессированных в системе Escherichia coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана приводит к повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом.

Результаты тестирования 24 антигенов Mycobacterium tuberculosis с сыворотками, полученными из Саратовской области, позволили выявить наиболее перспективные антигены для применения в серодиагностике туберкулеза на территории данного региона.

Определены перспективные комбинации рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis для эффективного выявления туберкулеза с помощью серодиагностики в конкретном регионе (Саратовской области).

Теоретическая и практическая значимость работы Разработана научно обоснованная концепция получения рекомбинантных антигенов пригодных для использования в Mycobacterium tuberculosis, серодиагностике туберкулеза.

Определена значимость различных способов гликозилирования (микробиологического и химического) белковых антигенов Mycobacterium tuberculosis для их иммунореактивности в серологических тестах, что расширяет представления о роли углеводных молекул в иммунном ответе при туберкулезе.

Показана возможность использования дрожжевой системы экспрессии Pichia pastoris для получения рекомбинантных белков Mycobacterium tuberculosis, пригодных для серодиагностики туберкулеза. Установлено, что антигены, экспрессированные в Pichia pastoris, имеют более высокую иммунореактивность с сыворотками больных туберкулезом, чем антигены, экспрессированные в системе Escherichia coli.

Применяемые в работе лабораторные методы для получения ряда антигенов Mycobacterium tuberculosis в дрожжевой системе экспрессии Pichia pastoris могут быть легко масштабированы, что создает основу для массового производства недорогих и эффективных туберкулезных серотестов.

Установлено, что химическое конъюгирование рекомбинантных белков с синтетическим гексаарабинофуранозидом Mycobacterium tuberculosis липоарабиноманнана является перспективным методом повышения эффективности серодиагностики туберкулеза.

Полученные данные о серодиагностическом потенциале различных рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis могут учитываться при разработке новых серотестов на туберкулез.

Подобрана мультиантигенная композиция из рекомбинантных и синтетических антигенов Mycobacterium tuberculosis, обладающая высокой прогностической эффективностью, для выявления больных туберкулезом в Саратовской области.

Результаты работы были использованы при разработке иммунохроматографических тестов для серодиагностики микобактериозов, в частности, туберкулеза и лепры (акт внедрения от 1.12.2014 г.).

Методология и методы исследования

Работа выполнена в отделе иммунобиохимии патогенных микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Методология исследования была определена соответственно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с получением антигенов M. tuberculosis разными способами и оценкой их потенциала для целей использования в серодиагностике туберкулеза.

Объекты исследования

Основными объектами исследования являлись сыворотки крови больных туберкулезом и здоровых БЦЖ-вакцинированных доноров из Саратовской области.

Панель сывороток контрольной группы составляли образцы сывороток от 30 здоровых БЦЖ-вакцинированных доноров из Саратовской области. Все доноры из контрольной группы были пациентами неврологического отделения Медицинского учреждения здравоохранения «1-ой городской клинической больницы им. Ю. Я. Гордеева» города Саратова, не состоящими на учете в туберкулезном диспансере и не имеющими клинических признаков туберкулеза.

В панель сывороток исследуемой группы входили образцы от 100 больных туберкулезом легких с подтвержденным диагнозом, полученные из Государственного учреждения здравоохранения «Областного клинического противотуберкулезного диспансера» Саратовской области.

68% доноров больных туберкулезом были мужчины. Средний возраст больных составил 39 (от 18 до 80) лет. 90% доноров исследуемой группы были вновь выявленными больными, остальные - имели рецидив хронического туберкулеза.

Распределение доноров по диагностированным формам туберкулеза было следующее (рисунок 1): 76% - инфильтративная, 11% - диссеминированная, 5% фиброзно-кавернозная, 5% - очаговая формы туберкулеза, 2% - туберкулема, 1% цирротический туберкулез.

У 30 больных был выявлен туберкулез легких в фазе распада. 54% из всех больных были бактериовыделителями.

Для 27% больных диагноз был подтвержден бактериоскопией мазка мокроты с окраской по Цилю-Нильсену, для 44% - посевом мокроты на плотные питательные среды.

У 27% доноров исследуемой группы было выявлено носительство штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

Ни один донор не имел вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) положительного статуса. От всех доноров получено информированное согласие на использование образцов крови в исследовании.

Сыворотки были собраны в течение двух недель, разделены на аликвоты, хранились при температуре минус 80°С и использовались в течение одного года.

Изменений в их активности при повторных контрольных анализах не наблюдалось.

В качестве материалов исследования в работе также были использованы хромосома M. tuberculosis штамма H37Rv (ФБУН ГНЦ ПМБ); плазмиды pET32b(+), pPIC9 (Invitrogen, США), pPMC1fopL-ag85B-esat-6 (ФБУН ГНЦ ПМБ);

штаммы E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP (Novagen, Inc., США), E. coli TOP10’F, E. coli DH5, P. pastoris KM71 и GS115 (Invitrogen, США).

–  –  –

Методы исследования В работе использовали методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез ДНК, молекулярное клонирование, методы выделения ДНК), микробиологии (культивирование E. coli, P. pastoris), биохимии (аффинная хроматография, определение концентрации белка, высаливание, диализ, электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)), иммунохимии (иммуноблот, ИФА), химии (химический синтез и конъюгация), статистики (параметрические и непараметрические методы анализа данных, анализ кривых операционной характеристики (ROC (receiver-operating characteristic) анализ)).

Полимеразная цепная реакция. Реакционная смесь для ПЦР (25мкл) включала 10мМ Трис-HCl (pH=8,3), 1,5мМ MgCl2, 50мМ KCL, 0,2мМ дезоксинулеотидтрифосфат 400 нМ олигонуклеотидов, 5% (дНТФ), диметилсульфоксид, 1ед. ДНК полимеразы (Fermentas, Литва).

Taq Хромосомную ДНК M. tuberculosis штамма Н37Rv добавляли из расчета 10 нг на 25 мкл реакционной смеси.

Параметры ПЦР реакций: начальная денатурация 95С-3мин, 30 циклов:

денатурация 95С - 30с, отжиг 50 - 64С (в зависимости от нуклеотидного состава праймеров) - 30с, элонгация 72С - от 30с до 3мин (в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента ДНК), завершающая элонгация 72С - 10мин.

Гены белков Rv0222, Rv1860, Rv2875, Rv3425, Rv3872, Rv3875 амплифицировали с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv методом ПЦР со специфическими праймерами (Синтол, Москва) (приложение 1).

Размеры амплифицированных генов и их расположение в хромосоме M.

tuberculosis штамма H37Rv указаны в приложении 2.

Для амплификации гена rv1837c первоначально с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv методом ПЦР с помощью праймеров For2,6kb и Rev2,6kb амплифицировали участок ДНК (2600 пар оснований (п. о.)), содержащий нуклеотидную последовательность гена rv1837c. Очищенный продукт ПЦР, 2600 п. о., использовали в качестве матрицы для амплификации гена rv1837c со специфическими праймерами.

Кодирующая последовательность rv1886c-rv3875 амплифицировали с pPMC1fopL-ag85B-esat-6 (любезно предоставлена В.М.Павловым (ФБУН ГНЦ ПМБ)) методом ПЦР.

Гены rv0040c, rv1636, rv2185c, rv1860, rv2873, rv2875 амплифицировали с хромосомы M. tuberculosis штамма H37Rv методом ПЦР со специфическими праймерами (приложение 1).

Ген rv1837c амплифицировали с плазмиды pET32bRv1837c. Гены rv0040c, rv1860, rv2875 амплифицировали без сигнальных последовательностей. Длины сигнальных последовательностей в генах рассчитывали программой SignalP 3.0 Server [272], они составили для rv0040c – 96 п. о., rv1860 –117 п. о., rv2875 – 90 п. о. «Гистидиновые таги», состоящие из 6 нуклеотидных последовательностей гистидина, вносили в гены с их 5’ концов праймерами.

Анализ соответствия длин полученных фрагментов размерам амплифицируемых генов проводили посредством электрофореза (приложение 3).

Электрофорез ДНК. Электрофорез ДНК проводили в 1-2% агарозном геле в однократном трис-ацетатном буфере (ТАЕ (40 мМ Трис HCl, рН=8,0; 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); 20 мМ ледяная уксусная кислота)).

Детектировали результаты визуализизацией гелей, окрашенных бромистым этидием, в ультрафиолетовом излучении.

Методы выделения ДНК. Выделение плазмидной ДНК производили набором AxyPrep plasmid miniprep kit, геномной ДНК - AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit, а очистку ДНК из растворов и гелей - AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen BioScience, США).

Молекулярное клонирование и трансформация клеток E. coli.

Полученные ампликоны генов (rv0222, rv1860, rv2875, rv3425, rv3872, rv3875, rv1837c, rv1886c-rv3875), гидролизованные сначала ферментом NdeI в течение 3 часов при 37С в однократном буфере О (Fermentas, Литва), а затем ферментами XhoI (для Rv1860), либо HindIII (для остальных генов) в однократном буфере R (Fermentas, Литва) в течение 3 часов при 37С, вставили по сайтам рестрикции NdeI и XhoI, либо NdeI и HindIII в плазмиду pET32b(+), гидролизованную соответствующими ферментами, в открытую рамку считывания с кодирующей последовательностью шести гистидинов.

Лигирование гидролизованных вектора и генов проводили в соотношении линеаризованных концов вектор: вставка - 1:5, в 10мкл реакционной смеси, содержащей 5 ед. Т4ДНК лигазы (Fermentas, Литва), в течение 1 часа при 22С.

Полученными лигазными смесями трансформировали химически компетентные клетки E. coli штамма TOP10 методом «теплового шока» в течение 45с при 42С.

Трансформанты растили на среде Луриа-Бертани (LB) с 100 мкг/мл ампициллина при 37С. Соответствие нуклеотидных последовательностей вставок в рекомбинантных плазмидах соответствующим генам белков подтверждали секвенированием данных плазмид с Т7 праймерами (приложение 1) на приборе Швеция). Выделенными рекомбинантными MEGA Base750 (Amersham, плазмидами трансформировали химически компетентные клетки E. coli штамма BL21-CodonPlus(DE3)-RP методом «теплового шока» в течение 45с при 42С.

Молекулярное клонирование и трансформация клеток P. pastoris.

Вектор pPIC9 и гены rv0040c, rv1636, rv1837c, rv1860, rv2873, rv2875 гидролизовали ферментами рестрикции EcoRI и NotI в однократном буфере О (Fermentas, Литва) в течение 16 часов при 37С, затем проводили лигирование гидролизованных вектора и генов в соотношении линеаризованных концов вектор: вставка - 1:5, в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 ед. Т4 ДНКлигазы (Fermentas, Литва), в течение 1 часа при 22С. Плазмиду pPIC9Rv1636 и ген rv2185с рестрицировали ферментами AvrII и NotI в буфере Tango (Fermentas, Литва) при 37С в течение 16 часов, затем проводили лигирование линеаризованных плазмиды pPIC9Rv1636 и гена rv2185с. Полученными лигазными смесями трансформировали химически компетентные клетки E. coli штамма DH5 методом «теплового шока» 45с при 42С.

Схема рекомбинантной плазмиды pPIC9 с встроенным геном белка представлена на рисунке 2.

Трансформанты растили на среде LB с 100 мкг/мл ампициллина при 37С.

Выделенные из них плазмиды анализировали на наличие соответствующих вставок рестрикционным картированием по сайтам EcoRI и NotI, методом ПЦР с праймерами AOX1 5’ и AOX1 3’, а также секвенированием плазмид с AOX1 3’ и AOX1 5’ праймерами на приборе MEGA Base750 (Amersham, Швеция).

Рекомбинантные плазмиды pPIC9Rv0040c, pPIC9Rv1837c, pPIC9Rv1860, pPIC9Rv2873, pPIC9Rv1636-Rv2185с линеаризовали ферментом SacI, а плазмиду pPIC9Rv2875 - ферментом SalI (так как сайт рестрикции SacI присутствовал в гене Rv2875).

Клетки штаммов P. pastoris GS115 (для плазмид pPIC9Rv1636-Rv2185с и и (для остальных плазмид) трансформировали pPIC9Rv1837c) KM71 линеаризованными плазмидами методом электропорации на приборе MicroPulser (Bio-Rad Laboratories, Inc.,США) в 0,2 см кювете в растворе 1 М сорбитола при 4°С (напряжение – 2 кВ, длительность воздействия – 5 мс).

На рисунке 3 представлена схема вставки гена белка в AOX1 и his4 локусы хромосомы P. pastoris.

Рисунок 2 - Конструкция рекомбинантной плазмиды pPIC9. Примечания:

PAOX1 – промотор гена AOX1; 6•cat - нуклеотидная последовательность, соответствующая 6 гистидинам; ATG - точка начала транскрипции; SacI, SalI, EcoRI, NotI - сайты рестрикции; HIS4 - ген гистидинол дегидрогеназы в pPIC9, his4 - мутантный ген гистидинол дегидрогеназы в хромосоме P. pastoris; стоп стоп-кодон.

Рисунок 3 - Схема вставки гена белка в AOX1 (а) и his4 (б) локусы хромосомы P. pastoris. Примечания: PAOX1 – промотор гена AOX1; 6•cat нуклеотидная последовательность, соответствующая 6 гистидинам; HIS4 - ген гистидинол дегидрогеназы в pPIC9, his4 - мутантный ген гистидинол дегидрогеназы в хромосоме P. pastoris; стоп - стоп-кодон; стрелки на рисунке (а) обозначают возможные позиции вставки гена.

Селекцию трансформантов проводили на чашках с агаром с минимальной средой с декстрозой (minimal dextrose (MD)) (1,34% дрожжевой азотной основы (yeast nitrogen base (YNB)) (Invitrogen, США), 0,04% биотин (Sigma-Aldridge, Германия), 2% глюкоза, 1,5% агар (Panreac, Испания)) - по росту без гистидина, затем на чашках с агаром с минимальной средой с метанолом (minimal methanol (MM)) (1,34% YNB, 0,04% биотин, 1% метанол, 1,5% агар) - по росту с метанолом. Подтверждали наличие генов в хромосомах трансформированных штаммов методом ПЦР с AOX1 5’ и AOX1 3’ праймерами (приложение 1).

Экспрессия рекомбинантных белков M. tuberculosis в системе E. coli.

Экспрессию белков проводили в штамме E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP под индукцией 1мМ изопропил--D-галактопиранозид (ИПТГ) и селективным давлением антибиотиков в среде LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% хлорид натрия). Трансформированные штаммы-продуценты рекомбинантных белков M. tuberculosis выращивали в 5 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 34 мкгмл хлорамфеникола, ночь при 30°С, 250 об/мин до насыщения OD600=4. Затем 1 мл полученной ночной культуры вносили в 500 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл), хлорамфениколом (34 мкг/мл), растили до достижения поздней логарифмической фазы около 2 часов при 37oC, затем добавляли ИПТГ до 1 мМ, фенилметилсульфонил флуорид (ФМСФ) до 1 мМ и инкубировали при 37oC, 250 об/мин, в течение 4 часов.

Экспрессия рекомбинантных белков в системе P. pastoris. Для оценки экспрессирующей способности отобранных клонов, было проведено культивирование в «малом объеме». Отобранные клоны растили 48 часов при 30С, 250 об/мин в буферизированной среде с глицерином (buffered glycerolcomplex medium (BMGY)) (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ калийфосфатный буфер, pH=6,0, 1,34% YNB, 0,04% биотин, 1% глицерин), затем клетки переносили в буферизированную среду с метанолом (buffered methanolcomplex medium (BMMY)) (состав аналогичен BMGY, но глицерин заменен на 1% метанол) до OD600=1. В качестве ингибитора протеаз вносили в среду казаминовые кислоты (Becton Dickinson, США) до 1%. Культуру инкубировали 100 часов при 30С, 250 об/мин, отбирая пробы культуры (клетки и супернатант) и добавляя метанол до концентрации 1% в среде каждые 24 часа. Образцы клеток из 0,5 мл среды лизировали с помощью литиказы (Sigma-Aldrich, Германия) (0,1 мг/мл) в лизирующем буфере (1 М сорбитол, 10 мМ Трис-HCl, рН=7,5, 10 мМ дитиотреитол (ДТТ), 10 мМ ЭДТА), а образцы супернатанта из 0,5 мл среды концентрировали высаливанием белков сульфатом аммония до насыщения 70%, затем осадок растворяли в 10 мкл однократного буфера для образцов (50 мМ Трис-HCl, 10% глицерин, 1% додецилсульфат натрия (ДСН), 0,0025% бромфеноловый синий, 100 мМ -меркаптоэтанол). Образцы анализировали в ДСН-электрофорезе в 10-12% ПААГ и в иммуноблоте. Препаративное культивирование (объем среды 400 мл) проводили в соответствии с методикой для культивирования в «малом объеме».

Электрофорез белков. Электрофорез белков проводили по методу Лэммли в 10-12% разделяющем полиакриламидном геле [171]. Образцы белков вносили в гель в однократном буфере для образцов (50 мМ Трис-HCl, рН=6,8, 10% глицерин, 2% ДСН, 0,02% бромфеноловый синий, 1% -меркаптоэтанол).

Визуализировали полосы белков в геле после окраски их PageBlue ProteinStain (Fermentas, Литва).

Очистка белков из культуры E. coli. Очистку белков из культуры E. coli проводили методом металлхелатной хроматографии в денатурирующих условиях с 8 М мочевиной. Культуру собирали после 4 часов индукции, центрифугировали 2800g 15 мин, клетки ресуспендировали в буфере нанесения (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 8M мочевина, 10 мМ имидазол), вносили ФМСФ до 1 мМ, обрабатывали ДНКазой I (10000 ед./мл), лизоцимом (20 мг/мл) и озвучивали на дезинтеграторе UDM-10 («Techpan», Польша) при 44 кГц, 1,8 кВт, 10 раз по 30 с, при 0°С. Лизат клеток центрифугировали 37000 g 15мин.

Наличие белка в лизате культуры клеток E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP подтверждали ДСН - электрофорезом в 10-12% ПААГ, а присутствие полигистидинового тага – в иммуноблоте Супернатант после [16].

центрифугирования лизата клеток наносили на колонку (Amersham, Швеция) с 5 мл иминодиуксусной сефарозы (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия), предварительно насыщенной ионами никеля и уравновешенной буфером нанесения. Колонку промывали 10 объемами буфера нанесения, 3 объемами буфера с 60 мМ имидазола (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ NaCl, 8 M мочевина, 60 мМ имидазол), затем элюировали белки элюирующим буфером (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 250 мМ имидазол, 8 M мочевина, 500мМ NaCl).

Фракции анализировали электрофорезом в 10% ПААГ (приложение 4 рисунки А, Б, Е1).

Очистка белков из культуры P. pastoris. Очистку белков из культуры P. pastoris проводили методом металлхелатной хроматографии в нативных условиях. На пятые сутки индукции культуру P. pastoris центрифугировали 3000g 15мин, отбирали супернатант. Высаливали белки из супернатанта сульфатом аммония (Panreac, Испания) до насыщения раствора 70%, центрифугировали полученный раствор 33000g 30мин, осадок растворяли в буфере нанесения (50 мМ Трис-НСl, 500 мМ KCl, 10 мМ имидазол, рН=8,0) в объеме, соответствующем 2/3 первоначально отобранного количества супернатанта культуры.

Раствор наносили на колонку с иминодиуксусной сефарозой (Iminodiacetic acid Sepharose, Sigma-Aldridge, Германия), предварительно насыщенную ионами никеля и уравновешенную буфером нанесения. Промывали колонку 3 объемами колонки (15 мл) буфера нанесения и 10 мл буфера с 30 мМ имидазола (50 мМ Трис-НСl, рН=8,0, 500 мМ KCl, 30 мМ имидазол). Элюировали белки элюирующим буфером (50 мМ Трис-НСl, 500 мМ KCl, 300 мМ имидазол, рН=8,0). Полученные фракции анализировали ДСН-электрофорезом в 10% ПААГ (приложение 4 рисунки В, Г, Е2).

Диализ белков. Белки диализовали против фосфатного буфера (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН=7,4) с добавлением ФМСФ до 1мМ в течение 16 часов при 22°С.

Определение концентрации белков. Концентрации белков определяли ДСН-электрофорезом в 10% ПААГ или по методу Лоури [16]. Концентрации очищенных белков высчитывали с помощью коэффициентов молярной экстинкции (абсорбции) согласно закону Бира [222]. Измерения проводились на спектрофотометре СФ-56 (ОКБ Спектр, Россия) на 280 нм против диализного буфера.

–  –  –

Рисунок 4 - Строение гликоконъюгата белка с гексаарабинофуранозидом ЛАМ. Примечания: 1 - гексаарабинофуранозид ЛАМ, 2 - агликон-спейсер, 3квадратная кислота.

Первоначально синтезировали гексаарабинофуранозид в виде гликозида с агликоном-спейсером, необходимым для удаления углеводного лиганда от носителя и эффективного связывания гликоконъюгата со специфическими антителами. Затем проводили конъюгирование гексасахарида с рекомбинантными белками M. tuberculosis, используя в качестве линкера фрагмент квадратной кислоты. Появление в ультрафиолетовом (УФ) спектре белка дополнительной интенсивной полосы поглощения подтверждало успешное конъюгирование его с гексасахаридом. Размеры конъюгатов анализировали электрофорезом (приложение 4 рисунок Д).

Иммуноблот анализ. Белки, разделенные ДСН-электрофорезом в 10% ПААГ, переносили из геля на поливинилиденфторидную мембрану (SigmaAldridge, Германия) с помощью прибора для блота (Mini trans-blot electrophoretic transfer cell (Bio-Rad,США)). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком (Sigma-Aldridge, Германия) в 50 мМ фосфатном буфере при 4°С в течение 16 часов. После трехкратного промывания отмывочным буфером (50 мМ фосфатный буфер (рН=7,4), 0,05% твин-20 Германия)) мембраны (Sigma-Aldridge, инкубировали с моноклональными антиполигистидиновыми мышиными антителами, меченными пероксидазой хрена (Monoclonal anti-polyhistidine peroxidase conjugate produced in mouse (Sigma-Aldridge, Германия)) в разведении 1:2000 в течение 2 часов при 37°C в 50 мМ фосфатном буфере с 0,05% твин-20, затем, после отмывания мембран их проявляли 1 мМ динитрометилбензидин ацетат (Sigma-Aldridge, Германия) с 10 мкл 33% Н2О2 в 10 мл в 50 мМ фосфатного буфера (рН=7,4). Результаты представлены на рисунках А и Б приложения 5.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Детектирование специфических антител против антигенов M. tuberculosis в сыворотках доноров проводили с помощью метода твердофазного гетерогенного непрямого ИФА.

Оптимальные количества компонентов ИФА определяли титрованием по методу «шахматной доски» (checkerboard system) с разведением сывороток (больных или здоровых доноров) в одном направлении, а антигена или анти-IgG конъюгата в другом. Для анализа были выбраны наименьшие разведения сывороток (1:100), антигенов (0,1-1 мкг на лунку) и пероксидазного конъюгата антител против IgG человека (1:10000) при которых обнаруживаются различия между образцами двух групп сравнения. Большие концентрации конъюгата и сывороток могли стать причиной повышения оптической плотности образца в лунке за счет фона, обусловленного неспецифическим взаимодействием их с планшетом, а меньшие – не обеспечить связывания всех активных центров антигенов, и, следовательно, не выявлять всех молекул антител [301].

Кроме бланк-контроля (одной лунки с исследуемым антигеном, но без внесения антител сывороток доноров) в качестве контролей ИФА использовали 5 сывороток (2 сыворотки здоровых и 3 больных пациентов), которые наносили на каждый планшет с каждым исследуемым антигеном для последующего сравнивания результатов, полученных на разных планшетах с одним антигеном.

Белки иммобилизовали в 96-луночных планшетах средней сорбции (Medium binding F-bottom plate (Greiner bio-one, Германия [65])) в концентрации 0,1-1 мкг на лунку (таблица 1) в 50 мМ карбонатно-бикарбонатного буфера (35 мМ NaHCO3, 15 мМ Na2CO3, рН=9,6) при 4°С в течение 16 часов.

После однократного отмывания лунок отмывочным буфером (50 мМ фосфатным буфером с 0,025% твин-20) в них вносили по 200 мкл 5% обезжиренного молока (Sigma-Aldridge, Германия) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, 250 об/мин.

Промывали лунки дважды отмывочным буфером, затем в них вносили образцы сывороток, разведенные 1:100 в 50 мМ фосфатном буфере (рН=7,4), и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, 250 об/мин. Отмывали планшеты четыре раза.

В каждую лунку вносили пероксидазный конъюгат антител против IgG человека (Sigma-Aldridge, Германия) в разведении 1:10000, инкубировали в течение 1 часа при 37°С и 250 об/мин. Промывали планшеты отмывочным буфером 5 раз. Вносили субстрат, содержащий тетраметилбензидин (ФГУП ГНЦ «НИОПИК») и регистрировали оптическую плотность на приборе Model 680 (BioRad, США) при 450 нм после остановки реакции 1М H2SO4 [111, 301].

–  –  –

Статистический анализ данных. Для статистического анализа данных, полученных в ИФА, использовали общепринятые методы статистической обработки данных, описанные в книге С. Гланца «Медико-биологическая статистика» [7], а также программы MedCalc (MedCalc Software, Бельгия) и Microsoft Office Exel (Microsoft, США).

Тип распределения значений в выборках (группах здоровых и больных) определяли с помощью теста Д’Агостино-Пирсона в программе MedCalc [77].

При распределении данных анализа с белками по нормальному закону в обеих выборках высчитывали параметрические критерии различий, в противном случае применяли непараметрический тест Манна-Уитни. Согласно центральной предельной теореме при большом размере выборки (n100), распределение значений в группе признавали нормальным вне зависимости от результатов теста Д’Агостино-Пирсона.

Выборочное среднее и выборочное стандартное отклонение вычисляли с помощью программы Microsoft Exel по формулам:

X= X n; SD=( X - X) n - 1, (3) где X - выборочное среднее значений OD450 для контрольной, либо исследуемой групп, X - значение OD450 для одного образца, n - объем выборки, SD выборочное стандартное отклонение для группы.

Для определения статистической значимости выявленных различий высчитывали стандартную ошибку разности выборочных средних по формуле:

S Xб-Xз = ((nб - 1) SDб + (nз - 1) SDз)(1 nб + 1 nз) (nб + nз - 2), (4) а затем критерий Стьюдента (t):

t = Xб - Xз SXб-Xз, (5) где nб – численность больных, nз – численность здоровых. Число степеней свободы,, определяли как = (nб - 1) + (nз - 1). (6) Критерий Стьюдента направлен на оценку различий средних величин Xз и Xб обеих выборок, которые распределены по нормальному закону. Если при данном числе степеней свободы и уровне значимости расчетное t t, то различия между группами признавались статистически значимыми. При 5% уровне значимости (p0,05) отвергали нулевую гипотезу о том, что различие между генеральными совокупностями равно нулю (когда различие объясняется случайностью выборки), и принимали альтернативную гипотезу, признающую статистическую значимость различий между группами.

Доверительный интервал разности истинных средних определяли по формуле:

Xб-Xз - t SXб-Xз б-з Xб-Xз + t SXб-Xз. (7) Если при =0,05 интервал разницы средних принимал положительные значения, следовательно, можно было заключить, что с вероятностью 95% истинное значение разницы средних лежало в диапазоне определяемых значений, то есть различия между группами были статистически значимы. Медиану (50-й перцентиль), значение признака, которое делит вариационный ряд выборки на две равные части, для каждой выборки определяли с помощью компьютерных программ.

Непараметрический тест Манна—Уитни позволял установить различия между группами по разнице сумм рангов каждой группы. Критерий МаннаУитни, U, определяли по формуле:

U = nбnз + (nх(nх+1)) - Тх, (8) где Тх-большая из двух ранговых сумм, соответствующая выборке с nх единиц.

Для полученных значений критериев определяли уровни значимости различий.

Чем ниже оказывалось U, тем выше достоверность различий между уровнями признака в рассматриваемых выборках. При p (вероятности справедливости нулевой гипотезы) менее уровня значимости =0,05 различия между группами здоровых и больных признавали статистически значимыми. На основании данных статистической обработки данных рассчитали два «отсекающих» значения cutoff:

cutoff1, которое наиболее часто используется в научной литературе для вычисления значений чувствительности и специфичности анализов в регионах, эндемичных по туберкулезу [119, 146, 149, 179, 239, 241, 253] cutoff1 = Xз + 2SD (9) и показатель для неэндемичных по туберкулезу регионов [136, 145, 153, 163, 337] cutoff2 =Xз+ 3SD.

(10) Сыворотки больных туберкулезом, значения OD450 для которых были больше или равны cutoff, определяли как истинно положительные (ИП), меньше cutoff – ложноотрицательные (ЛО). Сыворотки из контрольной группы, значения OD450 для которых были меньше cutoff, определяли как истинно отрицательные (ИО), а больше или равны cutoff – ложноположительные (ЛП).

Чувствительность (Ч) и специфичность (С) анализов высчитывали по формулам:

Ч = (ИП nб) х100%, С = (ИО nз) х 100%, (11) где nз и nб - объемы выборок контрольной и исследуемой групп, соответственно.

Показатель отношение правдоподобия объединяет показатели чувствительности и специфичности и показывает насколько вероятность получить данный результат теста выше у больных, чем у здоровых пациентов.

Положительное отношение правдоподобия (ОП+), отношение вероятности того, что положительный результат теста выявит наличие заболевания, к вероятности того, что он выявит отсутствие заболевания, или отношение истинно положительного уровня к ложно- положительному, и отрицательное отношение правдоподобия (ОП-), отношение вероятности того, что отрицательный результат теста выявит наличие заболевания, к вероятности того, что он выявит отсутствие заболевания, или отношение ложно- отрицательного уровня к истинно отрицательному, рассчитывали по формулам:

ОП+ = Ч 1 - С; ОП- = 1 - Ч С. (12) Значение ОП+ показывает во сколько раз вероятность положительного результата у больного выше, чем у здорового пациента. Чем больше значение ОП+ (1) и меньше ОП- (1), тем выше эффективность теста [101].

Диагностическая достоверность (диагностическая точность или эффективность) выражается в виде доли правильно классифицированных субъектов, или истинных результатов, из общего объема выборки.

Диагностическая достоверность (ДД) зависит от распространенности заболевания, поэтому используется для сравнения результатов анализов для одной популяции, либо в комплексе с другими диагностическими критериями [277]. Ее рассчитывали так:

ДД = (ИП+ИО) nб+nз. (13) Корреляционный анализ позволяет выявить взаимосвязь между изменением значений двух различных признаков. Сила этой связи выражается в значении коэффициента корреляции (Пирсона), который обозначается r. При r = 0 корреляция между значениями признаков отсутствует, r 0 – связь между ними прямая, r 0 – обратная. Статистическую значимость результатов анализа признавали при р 0,05.

Статистическая значимость различий в частотах истинных результатов между группами определяли с помощью критерия (критерия Пирсона) с поправкой Йеитса на непрерывность (так как = 1), определяемого как =(|О - Е|- ) Е, (14) где О - наблюдаемое число в клетке таблицы сопряженности, Е - ожидаемое число в той же клетке. Полученные значения критериев сравнивали с критическими значениями при степени свободы = 1 и определяли соответствующие уровни значимости статистических различий. При p0,05 признавали статистическую значимость различий в частотах между двумя группами.

ROC анализ используется для визуализации и анализа поведения диагностических систем [93]. Данный метод позволяет дифференцировать случаи заболевания от нормальных показателей. Анализ ROC-кривых используется для сравнения эффективности двух и более диагностических тестов [105, 351].

Кривая ROC – это график зависимости истинно положительного уровня (чувствительности) от ложноположительного (1 специфичность, или представительность) для различных возможных значений диагностического теста.

Она демонстрирует зависимость между чувствительностью и специфичностью анализа (любое повышение чувствительности приводит к снижению специфичности). Чем ближе кривая расположена к оси ординат (чувствительность) и чем дальше от оси икс (представительность), тем более точным является тест.

Точность теста определяется с помощью площади под ROC-кривой (ППК). Идеальный тест имеет значение ППК, равное 1. ППК, равное 0,5, означает, что тест является неэффективным. Чем ближе кривая к диагонали, соответствующей ППК = 0,5, тем ниже дифференцирующая способность теста между здоровыми и больными пациентами. С помощью параметра ППК можно сравнивать различные тесты между собой. ROC анализ позволяет определить оптимальный порог отсечения, или значение критерия, при котором сумма чувствительности и специфичности для данного теста максимальна. Данному критерию соответствует параметр индекс Юдена (Youden index), J, который рассчитывается по формуле:

J = максимальные (чувствительность (К) + специфичность (К) - 1), (15) где К - выбранный программой критерий [341].

Графически J соответствует максимальному расстоянию по вертикали между ROC-кривой и диагональю. Индекс Юдена позволяет сравнивать эффективность различных тестов.

Личное участие автора в получении результатов

–  –  –

M. tuberculosis с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ получила совместно с Л. О. Кононовым, Н. М. Подвальным, П. И. Аброниной и Т. М.

Мельниковой (ФБГУН ИОХ РАН). Секвенирование фрагментов рекомбинантных плазмид, а также хромосом рекомбинантных штаммов P. pastoris, несущих целевые гены проводила совместно с А. Г. Богуном (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование бактериальной (Escherichia и дрожжевой coli) (Pichia pastoris) систем экспрессии, а также химическое конъюгирование рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана позволяет получить антигены Mycobacterium tuberculosis, взаимодействующие с сыворотками больных туберкулезом.

2. Рекомбинантные антигены Mycobacterium tuberculosis, полученные в экспрессионной системе Pichia pastoris, обладают большей чувствительностью в ИФА с сыворотками больных туберкулезом, по сравнению с аналогичными антигенами, полученными в экспрессионной системе Escherichia coli.

3. Химическое конъюгирование ряда рекомбинантных белковых антигенов Mycobacterium tuberculosis, полученных в экспрессионной системе Escherichia coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом липоарабиноманнана приводит к повышению чувствительности ИФА с сыворотками больных туберкулезом.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов исследования обусловлена использованием в ней большого объема фактического материала, полученного с использованием методов молекулярной биологии, микробиологии, иммунологии и органической химии на современном сертифицированном оборудовании. Экспериментальные данные были статистически обработаны с помощью специализированных компьютерных программ и представлены в виде графиков и таблиц.

Диссертация апробирована на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 38 от 14 ноября 2014 г.).

Результаты работы были доложены и обсуждены на Научно-практической школе-конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (21-22 апреля 2009 г., Оболенск) и на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (24-26 ноября 2010 г., Москва).

–  –  –

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях и 2 тезиса – в материалах конференций.

Объем и структура диссертации Основной текст диссертации изложен на 209 страницах машинописного текста и состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы и собственные исследования, заключения и 5 приложений. Список литературы содержит 351 источник, в том числе 29 - отечественных и 322 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

–  –  –

1. 1. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации Туберкулез относится к заболеваниям, имеющим глобальное распространение. Одна треть населения земного шара инфицирована M. tuberculosis и каждый год около 9 миллионов людей заболевают туберкулезом.

Туберкулез второе место после ВИЧ/СПИД в структуре смертности от одного инфекционного агента. ВОЗ включила Российскую Федерацию в список из 22 стран с высоким бременем туберкулеза [335]. Согласно отчету Федерального центра мониторинга противодействия распространению туберкулеза в РФ в 2013 году общая распространенность туберкулеза составила 145,7, заболеваемость - 63, а смертность – 11,3 на 100 000 населения. Наиболее тяжелая эпидемическая ситуация по туберкулезу в 2013 году была в Дальневосточном, Уральском и Сибирском федеральных округах РФ [19, 21].

Высокий уровень заболеваемости туберкулезом в России обусловлен, прежде всего, наличием в стране большого резервуара туберкулезной инфекции, который поддерживается за счет значительной инфицированности населения [11, 29].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«ПОЕДИНОК НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА УДК 602.3:582.282/284:57.086.83]:[681.7.069.24+577.34 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СЪЕДОБНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ МАКРОМИЦЕТОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук Научный консультант Дудка Ирина...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«Щепитова Наталья Евгеньевна Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Искам Николай Юрьевич ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ АЦИД-НИИММП НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ГОВЯДИНЫ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства; 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов. ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.