WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

«Роль протеинкиназы PAK1 в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы ...»

На правах рукописи

Авилова Екатерина Анатольевна

Роль протеинкиназы PAK1

в регуляции роста эстрогензависимого

и эстрогеннезависимого рака молочной железы

Специальность 14.01.12 – онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении

«Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор – д.м.н., проф., академик РАН М.И. Давыдов).

Научный руководитель:

Красильников Михаил Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии научно-исследовательского института канцерогенеза, заместитель директора по научной работе – директор научноисследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина».

Официальные оппоненты:

Сергеева Наталья Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, руководитель отделения "Прогноза эффективности консервативного лечения" Московского научноисследовательского онкологического института имени П.А. Герцена – филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации;

Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач России, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научноисследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «__» ____________2015 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина»

по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.

Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23) и на сайте www.ronc.ru

Автореферат разослан «__» ________________________2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.017.02, доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к основным критериям определения чувствительности больных раком молочной железы (РМЖ) к гормональным противоопухолевым препаратам [М.А. Красильников, 2004, N.

Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Основной причиной снижения эффективности гормональной терапии РМЖ является переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания рецептора эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER, а также стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Среди последних ведущее значение принадлежит рецепторным тирозинкиназам. До сих пор остается неясным, какие из эффекторов тирозинкиназ являются ключевыми для поддержания эстрогеннезависимого роста и могут ли они играть самостоятельную роль в развитии гормональной резистентности РМЖ.

Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является РАК (р21активированная киназа) 1 – серин-треониновая протеинкиназа, которая путем фософорилирования различных сигнальных белков участвует в регуляции ключевых функций клетки: роста, выживаемости, организации цитоскелета, клеточной подвижности [Z.S. Zhao, 2012]. Помимо этого, РАК1 фосфорилирует рецептор эстрогенов, причем независимо от лиганда, приводя тем самым к снижению гормональной зависимости ERположительных клеток РМЖ [A. Ghosh et al., 2013, M. Kok et al., 2011, J. Bostner et al., 2010]. Об участии PAK в регуляции роста ER-негативного РМЖ известно значительно меньше, хотя о возможном включении PAK в эстрогеннезависимые сигнальные пути косвенно свидельствует описываемая в литературе повышенная экспрессия PAK1 в ERнегативных опухолях молочной железы.

Основной темой диссертации явилось исследование внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за развитие гормональной резистентности злокачественных опухолей, в частности – изучение роли PAK-сигнального пути в регуляции и поддержании эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Среди главных задач работы: исследование значения PAK для активации эстрогеннезависимых митогенных путей; изучение влияния гиперэкспресссии PAK на развитие гормональной резистетности и анализ возможного механизма подавления PAK в эстрогеннезависимых опухолях.

–  –  –

1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы; изучение зависимости экспрессии PAK-1 от стадии роста клеточной культуры;

2. Изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы: влияние РАК1 на рост клеток и активность митогенных сигнальных путей: АР-1, бета-катенина и Snail1; роль -Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков; влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7;

3. РАК1 и выживаемость клеток: изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии;

4. Анализ метилирования РАК1 и его роли в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы.

Научная новизна

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии РАК1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях; выявлены возможные эпигенетические причины сниженной экспрессии РАК1 в ER-позитивных клетках рака молочной железы; исследован механизм поддержания эстрогеннезависимого роста ERнегативных клеток, в том числе с участием ключевых транскрипционных факторов AP-1, бета-катенина/TCF и Snail1; установлена роль Pix в регуляции эффектов РАК1; впервые продемонстрировано участие РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что РАК1 является важным фактором, участвующим в поддержании эстрогеннезависимого роста РМЖ, и позволяют рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной терапии рака молочной железы.

–  –  –

Были получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что позволяет установить роль РАК1 и его эффекторов в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, а также оценить перспективность таргетной терапии РМЖ, направленной на подавление РАК.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 30 марта 2015 года на объединенной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, цитогенетики и отдела химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина».

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 286 источников.

–  –  –

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук.

–  –  –

Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы по изучаемой теме, разработаны протоколы и проведены эксперименты, осуществлены анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка полученных данных, формулирование выводов и оформление диссертационной работы.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. – «онкология», конкретно пунктам 2,3.

–  –  –

Первый раздел обзора литературы включает в себя современные данные о механизмах действия стероидных гормонов. Вторая часть описывает возможные пути развития гормональной резистентности РМЖ: потеря рецептора эстрогена, лиганднезависимая активация рецептора эстрогена, активация митогенных сигнальных путей, поддерживающих рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Третий раздел литературного обзора отражает использующиеся в настоящее время подходы в терапии эстрогензависимых и эстрогеннезависимых РМЖ. Заключительные части посвящены современным представлениям о протеинкиназах семейства PAK: структуре, механизму регуляции, выше- и нижележащим эффекторам PAK1, особенностям экспрессии PAK1 в опухолях РМЖ, а также ее роли в регуляции гормональной чувствительности РМЖ.

Обзор дает представление о состоянии исследования затронутой проблемы, ее актуальности и практической значимости.

Материалы и методы В работе использовались клеточные линии рака молочной железы человека: ERпозитивная эстрогензависимая линия MCF-7 и ER-негативные эстрогеннезависимые линии: MDA-MB-231, HBL-100, SKBR-3, а также устойчивая к гипоксии сублиния MCFH, полученная в результате длительного культивирования клеток MCF-7 в условиях низкого содержания кислорода.

Методы исследования: транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных плазмидных конструкций, а также коротких интерферирующих РНК; определение транскрипционной активности методом репортерного анализа; определение скорости роста клеток МТТ-тестом; SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле с последущим определением уровня экспрессии белков методом иммуноблоттинга, определение метилирования гена в культуре клеток с помощью метилчувствительной ПЦР и бисульфитного секвенирования, статистическая обработка полученных данных.

–  –  –

1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы

1.1. Определение содержания РАК1 и ER методом иммуноблотинга Целью первой части работы явилось исследование экспрессии PAK1 в различных линиях рака молочной железы, выявление возможной корреляции с ER-положительным или ER-отрицательным статусом и гормональной зависимостью РМЖ. Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого ER-позитивного рака молочной железы человека (линия MCF-7) и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы (линии HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3), культивируемых в стандартных условиях, описанных выше. Анализ содержания РАК1 и ER проводился методом иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к PAK1 и -тубулину (рис.

1).

Рисунок 1. Экспрессия PAK1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3.

Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в линии MCF-7.

Определение уровня РAK1 выявило его высокое содержание в эстрогеннезависимых ER-негативных клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3) по сравнению с клетками эстрогензависимой ER-позитивной линии MCF-7.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших повышенный уровень PAK1 в ER-отрицательных клетках РМЖ, в то время как в ER-положительных он практически отсутствовал [C. Holm et al., 2006], а также с результатами исследования клинических образцов, показавших гиперэкспрессию PAK1 более чем в 50% случаев РМЖ [S. Balasenthil et al., 2004].

–  –  –

Для определения зависимости экспрессии PAK1 от стадии роста клеточной культуры клетки MCF-7, HBL-100 и MDA-MB-231 рассеивали в 3-х исходных вариантах таким образом, что к моменту снятия плотность клеток составляла 60, 80 и 100 % от максимального монослоя. Иммуноблотинг образцов проводили с антителами к PAK1 и тубулину (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние плотности клеточной культуры на уровень РАК1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231.

Результаты иммуноблоттинга.

Как видно из полученных данных, экспрессия PAK1 практически не изменялась в зависимости от плотности клеточной культуры и, следовательно, различия в экспрессии РАК1 между отдельными линиями сохранялись на любой стадии роста клеток (рис.2).

Для большинства последующих экспериментов были выбраны две линии клеток, максимально различающиеся по степени экспрессии PAK1: с низким уровнем PAK1 (ERпозитивная линия клеток MCF-7) и с максимально высоким уровнем PAK1 (ERнегативная линия клеток HBL-100).

2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы Для определения роли PAK1 в регуляции роста клеток рака молочной железы мы исследовали особенности роста клеток РМЖ при подавлении PAK1, а также влияние PAK1 на некоторые эффекторы, задействованные в передаче митогенного сигнала в клетках РМЖ, в частности АР-1, бета-катенин и Snail.

2.1. Влияние РАК1 на рост клеток

Для изучения участия РAK1 в регуляции клеточного роста клетки MCF-7 и HBL-100 культивировали на 24-луночных планшетах в присутствии специфического ингибитора PAK1 IPA-3 в концентрации 10 мкМ в течение 3 суток, с последующим определением количества выживших клеток.

Результаты показали, что ингибитор PAK1 IPA-3 приводит к торможению роста клеток, значительно более выраженному в ER-негативной линии HBL-100 по сравнению с ER-позитивной линией MCF-7, что свидетельствует об активном участии РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста клеток (рис. 3).

–  –  –

2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей Для дальнейшего изучения механизма рост-стимулирующих эффектов РАК1 исследовалось его влияние на активность митогенных транскрипционных факторов: АР-1, бета-катенина и Snail1. Был применен метод репортерного анализа, позволяющий оценить транскрипционную активность факторов по их способности взаимодействовать со специфическими участками связывания на ДНК и активировать экспрессию генарепортера люциферазы.

Для изучения роли РАК1 в регуляции активности АР-1 проводилась котрансфекция эстрогензависимых ER-положительных клеток MCF-7 и эстрогеннезависимых ERотрицательных клеток HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РАК1 (контроль – пустой вектор CMV6), ген люциферазы под контролем AP-1-чувствительного промотора (AP1/Luc), а также плазмидой с геном -галактозидазы (для контроля эффективности трансфекции). Для исследования роли РАК1 в регуляции бета-катенина были использованы клеточные линии: MCF/TCF и HBL/TCF (клеточные линии MCF7 и HBL-100, стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию, содержащую ген люциферазы под контролем TCF/LEF- промотора, чувствительного к бета-катенину), которые также были котрансфицированы плазмидами с диким вариантом гена РAK и -галактозидазой.

Рисунок 4. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность АР-1 (а) и катенина (б).

Результаты репортерного анализа.

Мы обнаружили, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к выраженной стимуляции транскрипционной активности АР-1 и бета-катенина, причем в обеих линиях клеток:

MCF-7 и HBL-100 (рис.4). Полученные результаты согласуются с литературными данными о роли PAK1 в стимуляции клеточного цикла и пролиферации [L.E. AriasRomero et al., 2010, L.E. Arias-Romero et al., 2008, Z. Wang et al., 2013].

Последним из митогенных белков был исследован транскрипционный фактор Snail1, один из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода [V. Stemmer et al., 2008], повышенная экспрессия которого характерна для многих эстрогеннезависимых опухолей молочной железы, в том числе – для клеток HBL-100 [A.M. Scherbakov et al., 2013]. Примечательно, что фосфорилирование и активация Snail1 регулируются с участием PAK1-сигнального пути [Z. Yang et al., 2005].

Клетки MCF-7 и HBL-100 трансфицировали плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РAK1, ген-репортер люциферазы под контролем промотора (E-cad/Luc) и -галактозидазу. Результаты Snail1-чувствительного репортерного анализа показали, что РАК1 стимулирует трансрепрессорную активность Snail1, определяемую по степени подавления экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [E.

Batlle et al., 2000], но только в ER-негативных клетках HBL-100, тогда как в клетках MCFактивность Snail-1 практически не менялась (рис.5).

Рисунок 5. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность Snail1.

Проведенный нами генетический нокдаун Snail1 в присутствии малых интерферирующих РНК приводил к значительному, более чем в 2 раза, снижению скорости роста ER-негативных клеток HBL-100, свидетельствуя о важной роли, которую играет Snail1 в регуляции роста эстрогеннезависимых клеток (рис. 6).

–  –  –

Таким образом, на этом этапе работы было продемонстрировано участие PAK1 в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, в том числе через активацию митогенных сигнальных путей: AP-1, -катенин и Snail1.

–  –  –

Мы исследовали роль ко-активатора PAK1 – PIX, в регуляции митогенных сигнальных путей. Регуляция активности РAK1 происходит путем присоединения малых Rho- ГТФаз: Rac1 и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотид-обменных факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму; таким GEF-фактором для PAK1 является PIX, в частности, -Pix. Ранее было показано, что PAK1, несмотря на то, что он является «downstream» эффектором -Pix-Rac1(Cdc42), в то же время фосфорилирует Pix по серину в 488-м положении [U.E. Rennefahrt et al., 2007]. Значение такого фосфорилирования для клетки до сих пор изучено не было. Мы предположили, что данное фосфорилирование может определять митогенные эффекты PAK1, в том числе влияние PAK1 на активность транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина и Snail1.

Действительно, было обнаружено, что трансфекция -Pix-содержащей плазмиды в клетки MCF-7 и HBL-10 приводит к активации бета-катенина (рис. 7б), но никак не влияет на транскрипционную активность АР-1 (рис. 7а).

Рисунок 7. Влияние трансфекции -Pix на транскрипционную активность АР-1 –а; катенина –б.

Результаты репортерного анализа.

С помощью репортерного анализа мы показали, что -Pix стимулирует трансрепрессорную активность Snail1, но только в ER-негативных клетках HBL-100 (рис.

8а), что согласуется с данными, полученными нами ранее в отношении PAK1. Для исследования роли PAK1-зависимого фосфорилирования -Pix в регуляции Snail была использована мутантная форма -Рix, в которой серин в 488-ом положении был заменен на аланин (-Рix-A), что препятствует фосфорилированию киназой PAK1. Оказалось, что, если трансфекция -Pix дикого типа приводит к повышению трансрепрессорной активности Snail1, то замена 488-го серина на аланин блокирует этот эффект, возвращая трансрепрессорную активность Snail1 практически к исходному уровню (рис. 8б).

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о важной роли PAK1-зависимого фосфорилирования -Pix (S488) в стимуляции трансрепрессорной активности Snail1.

–  –  –

Мы изучали возможные изменения содержания ER при трансфекции в клетки MCFплазмиды PAK1 или при действии на клетки специфического ингибитора PAK1 – IPA-3.

Результаты иммуноблоттинга образцов показали, что трансфекция РAK1 приводит к заметному увеличению экспрессии ER в клетках MCF-7; при добавлении IPA-3 экспрессия ER возвращается к исходному уровню (рис. 9).

Рисунок 9. Экспрессия ER в клетках MCF-7 при трансфекции PAK1+/- IPA-3.

Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле.

–  –  –

Рисунок 10. Анализ транскрипционной активности ER после трансфекции РАК1 или действия ингибитора РАК1 IPA-3 в клетках MCF-7. Результаты репортерного анализа.

В целом, полученные данные показали, что рост-стимулирующее действие РАК1 на клетки ER-позитивного РМЖ ассоциировано как со стимуляцией канонических митогенных сигнальных путей: AP-1 и -катенин, так и с активацией эстрогенового сигналинга.

3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются высоким уровнем экспрессии PAK1 [C. Holm et al., 2006] и Snail1 [A.M. Scherbakov et al., 2013], в то время как ER-позитивные клетки, напротив, имеют низкий уровень экспресии этих белков. Вероятно, причина низкого уровня экспрессии PAK1 и Snail1 в ERположительных клетках может быть связана с особенностями внутриклеточного сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из механизмов такой негативной регуляции является подавление рецептором эстрогенов активности Snail1 через ER-зависимую активацию специфического белка-супрессора Snail1 – MTA3 [A. Dhasarathy et al., 2007, N. Fujita et al., 2003].

В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора эстрогенов под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из факторов, ограничивающих уровень Snail1 в ER-позитивных клетках РМЖ.

Участие РАК1 в поддержании роста клеток MCF-7 было продемонстрировано в экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором РАК1: оказалось, что добавление IPA-3 существенно снижает скорость роста клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его физиологической регуляции в клетках РМЖ мы исследовали активность РАК1 в клетках MCF-7 в условиях гипоксии.

3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и HBL-100 (эксперименты выполнены совместно с В.А.Шатской) Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого рака молочной железы человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы линии HBL-100. Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии (1% О2) показал резкое снижение роста клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL-100 (рис. 11). Как уже отмечалось, клетки HBL-100 отличаются высоким уровнем РАК1, что позволило предположить участие последнего в регуляции чувствительности клеток к гипоксии.

количество клеток отн.ед.

–  –  –

Участие PAK1 в ответе клеток на гипоксию было подтверждено в экспериментах по сравнительному анализу содержания РАК1, показаших выраженное увеличение экспрессии РАК1 в клетках MCF-7 в условиях острой гипоксии (1% О2, 18 час) (рис.12).

Рисунок 12. Влияние острой гипоксии на содержание РАК1 в клетках MCF-7. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле.

В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии – для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования условий хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30 сут.

Ранее мы продемонстрировали, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии торможение роста оказывается существенно меньшим. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H; в предыдущих работах мы показали, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода [Д.В.Сорокин и др., 2015].

Было установлено, что базальный уровень РАК1 в клетках MCF-7/H значительно выше, чем в MCF-7 (рис.13).

Рисунок 13. Сравнительный анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H.

Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в в линии MCF-7.

Подавление PAK1 в клетках MCF-7/H в присутствии IPA3 приводит к увеличению чувствительности клеток к гипоксии (рис. 14).

–  –  –

Для дальнейшего изучения механизма протективного действия РАК1 в условиях гипоксии был проведен анализ влияния РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов, индуцируемых в условиях гипоксии. С помощью репортерного анализа с использованием плазмиды HRE/Luc, содержавшей ген люциферазы под контролем гипоксия-респонсивного элемента (HRE), мы обнаружили, что трансфекция РАК1 в клетки приводит к увеличению транскрипционной активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя непосредственное участие РАК1 в активации HIF-1-сигнальных путей (рис. 15).

–  –  –

Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток ER-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ER-негативные опухоли молочной железы отличались повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокой чувствительностью к антипролиферативному действию IPA-3. Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток.

4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей молочной железы мы исследовали возможность метилирования/деметилирования специфических цитозин-гуанин богатых участков гена, располагающихся в 5’регуляторных регионах [X. Zhang et al., 2013, C. Yi et al., 2008, Н.П. Киселева и др., 2007] и определяющих эффективность экспрессии РАК1.

Был проведен сравнительный анализ метилирования промотера гена РАК1 в клетках MCF-7 и HBL-100 методом метичувствительной ПЦР, основанной на использовании метилчувствительных рестриктаз, которые разрезают ДНК по определенным сайтам при отсутствии в них метилированных цитозинов; в результате последующая ПЦР соответствующего фрагмента ДНК будет приводить к образованию продукта только в случае метилирования сайтов рестрикции. Применение двух независимых метилчувствительных рестриктаз (HpaII и HhaI) продемонстрировало наличие метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и его отсутствие в клетках HBL-100 (рис. 16).

Рисунок 16. Анализ метилирования промотора РАК1 методом метилчувствительной ПЦР. а) ПЦР после рестрикции HpaII. Определяются два фрагмента, верхний соответствует промотору РАК1, нижний - внутреннему контролю CUX1; б) ПЦР после рестрикции HhaI. Определяется один фрагмент, соответствующий промотору РАК1. В клетках MCF-7 рестрикции ДНК не происходит из-за метилирования цитозинов в СG-динуклеотидах, синтез фрагмента РАК1 сохраняется. В клетках HBL-100 происходит рестрикция ДНК, фрагмент с промотора РАК1 не синтезируется.

Полученные данные были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования, в основе которого лежит бисульфитная конверсия неметилированного цитозина в тимин (рис. 17).

–  –  –

Рисунок 17. а) Нуклеотидная последовательность СpG-островка, расположенного в промоторной области PAK1. Цветом выделены метилированные цитозины, которые не изменяются в результате бисульфитной конверсии. б) Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках HBL-100 и MCF-7. Результаты метил-специфического секвенирования CpGостровка, расположенного в промоторе РАК1 в культурах клеток HBL-100 и MCF-7.

Метилированный цитозин обнаруживается только в промоторе РАК1 клеток MCF-7.

Вместе с тем, аналогичное исследование метилирования РАК1 в клетках MCF-7/H не выявило существенных изменений в уровне метилирования РАК1 – несмотря на увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с клетками MCF-7 (рис.18).

–  –  –

Рисунок 18. Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках MCF-7/Н.

Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H – остается до конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть результатом действия определенных сигнальных белков – позитивных регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе – HIF-1. Учитывая описанную выше способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно предположить, что эти белки связаны положительными регуляторными связями, которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической гипоксии.

Заключение На сегодняшний день основным критерием определения чувствительности к гормональным противоопухолевым препаратам является содержание рецепторов эстрогенов [М. А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C.

Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Однако, гормональная резистентность может развиваться и при сохранении ER: в результате дисбаланса белковкорегуляторов ER, лиганд-независимой активации ER, стимуляция сигнальных путей, независимых от ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов.

Развитие гормональной резистентности рака молочной железы связано с переходом опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту.

В настоящей работе при исследовании факторов, регулирующих развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы, мы продемонстрировали участие серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста опухолевых клеток. Мы установили, что подобные митогенные эффекты РАК1 ассоциированы со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT--катенинового пути, Snail1-сигнального пути. Продемонстрировано, что для реализации действия РАК1 ключевым фактором является фосфорилирование Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. Показано значение РАК1сигнальной системы в регуляции выживаемости опухолевых клеток, в том числе в условиях гипоксии.

Полученные данные легли в основу предлагаемой схемы действия PAK1 с участием его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов, а также значения РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ (рис. 19).

–  –  –

В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования РАК1 в качестве маркера развития гормональной резистентности РМЖ и потенциального объекта таргетной терапии опухолей молочной железы.

Выводы

1. Сравнительный анализ содержания серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в клетках культивируемых in vitro эстрогензависимой и эстрогеннезависимых линий рака молочной железы показал значительное превышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых сублиниях

2. Продемонстрировано, что РАК1 является одним из факторов, необходимых для поддержания роста клеток рака молочной железы, в большей степени – для роста эстрогеннезависимых опухолей молочной железы

3. Установлено, что митогенный эффект РАК1 ассоциирован со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT--катенинового пути, Snail1-сигнального пути. Для реализации действия РАК1 необходимым фактором является фосфорилирование -Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488.

4. Продемонстрировано участие РАК1 в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы, в частности – в условиях хронической гипоксии. Одним из возможных механизмов участия РАК1 в поддержании роста опухолевых клеток в условиях гипоксии является обнаруженная нами способность РАК1 стимулировать транскрипционную активность HIF-1, одного из основных гипоксия-зависимых протективных факторов клетки.

5. При определении статуса метилирования промотора гена РАК1 установлено, что низкий уровень РАК1 в эстрогензависимых линиях ассоциирован с высоким уровнем метилирования, в то время как в эстрогеннезависимых линиях, отличающихся высоким содержанием РАК1, его промотор полностью деметилирован.

6. В целом, полученные данные свидетельствуют, что эпигеномная регуляция РАК1, в частности – метилирование ДНК, может являться одним из факторов, определяющим повышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы.

Продемонстрированная нами протективная функция РАК1 позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени для таргетной терапии рака молочной железы.

Список работ по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Авилова, Е.А. Значение протеинкиназы PAK1 в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А. Шатская, М.А. Красильников // Биомедицинская химия – 2014. – Т. 60, №3 – C.322-331 (статья также опубликована в английском переводе в Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry (Avilova, E.A. The Role of Protein Kinase PAK1 in the Regulation of Estrogen-Independent Growth of Breast Cancer Protein Kinase Pak1 and Breast Cancer / E.A. Avilova, O.E. Andreeva, V.A. Shatskaya, M.A.

Krasil’nikov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry – 2015. - Vol. 9 - No. 1 – P. 58-62).

2. Авилова, Е.А. Метилирование РАК1 в клетках опухолей молочной железы / Е.А.

Авилова, Е.Б. Кузнецова, М.В.Немцова, А.М.Щербаков, В.А. Шатская, М.А.

Красильников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии

– 2015. – № 5 – С. 39-46.

Тезисы конференций:

1. Авилова, Е.А. Роль РАК1--Pix-сигнального пути в регуляции роста опухолевых клеток/ Авилова Е.А. // Биология – наука ХХI века: 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2015.

– 2015. – С. 215.

2. Авилова, Е.А. Роль РАК1-сигнального пути в развитии гормональной резистентности клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А.

Шатская, М.А. Красильников // 1-й Российский онкологический научнообразовательный форум с международным участием «Белые Ночи – 2015».

Сборник тезисов. М., 2015. – C. 418.

3. Авилова, Е.А. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии / Е.А. Авилова, В.А. Шатская, М.А. Красильников // 1-й Российский онкологический научно-образовательный форум с международным участием «Белые Ночи – 2015». Сборник тезисов. М., 2015. – C. 419.

4. Сорокин, Д.В. Молекулярные механизмы регуляции чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым агентам в условиях гипоксии / Д.В.

Сорокин, С.Е. Семина, Е.А. Авилова, И.А. Якушина, М.А. Красильников // Экспериментальная и фундаментальная онкология – 2014. – C. 123.




Похожие работы:

«ГАЛИНИЧЕВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ЦИКАДОВЫЕ (HEMIPTERA, CICADINA) УРАЛА: СОСТАВ ФАУНЫ, ЭКОЛОГИЯ И ХОРОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород Работа выполнена на кафедре зоологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского» Научный руководитель: доктор биологических...»

«Баскаев Константин Константинович РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОИСКА ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, в группе геномного анализа...»

«УДК 572 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в НИИ и Музее антропологии...»

«ХАФИЗОВ ТОИР ДАДАДЖАНОВИЧ ОСОБЕННОСТИ РОСТ, РАЗВИТИЕ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЧАЙОТА (SECHIUM EDULE L. – CHAYOTE) В УСЛОВИЯХ ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЫ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата сельского хозяйства Душанбе 2015 Работа выполнена на кафедре плодоовощеводства и виноградарства, Таджикского аграрного университета им. Ш.Шотемур. Научный руководитель: Гулов Саидали Маъмурович, доктор...»

«АСКАРОВ АЙНУР ДАМИРОВИЧ ОПТИМИЗАЦИЯ РЕКРЕАЦИОННОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ НА ТЕРРИТОРИИ ЛЕСОПАРКОВОЙ ЗОНЫ ГОРОДА УФЫ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Специальности: 03.02.01 – Ботаника (биология) 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2015 Диссертационная работа выполнена на кафедре экологии и природопользования ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им.М.Акмуллы» Научный...»

«Худоногова Елена Геннадьевна БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ПОЛЕЗНЫХ РАСТЕНИЙ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ, ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Специальность 03.02.01 – ботаника (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оренбург 2015 Работа выполнена на кафедре ботаники, плодоводства и ландшафтной архитектуры в ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет имени А.А. Ежевского» Научный консультант:...»

«Вечерковская Мария Фёдоровна Оценка микробиоты ротовой полости у детей с онкогематологическими заболеваниями 03.02.03. – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Санкт Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения...»

«Разумова Дина Владимировна МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ В КОМПЛЕКСЕ МЕРОПРИЯТИЙ ПО ОБЕСПЕЧЕНИЮ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ В МНОГОПРОФИЛЬНОМ СТАЦИОНАРЕ 03.02.03 – микробиология 14.02.02 – эпидемиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»...»

«ДОБРЕНЬКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЦЕНОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ПОЛОСТИ РТА И МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ БИОКОРРЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения...»

«САГИТОВА МИНЗИЛЯ ГАБДУЛХАЕВНА ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА «ГРАМО» В ПТИЦЕВОДСТВЕ 06.02.05 ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2015 Работа выполнена в условиях кафедры зоогигиены федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанская государственная академия...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена на базовой кафедре биотехнологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии, Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Чичерина Екатерина Александровна БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА 06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир) Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS SIEBOLD ET ZUCC. (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток, 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении «Дальневосточный научно-исследовательский институт лесного хозяйства» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Юрий...»

«АБДУЛЛОЕВ ХУШБАХТ САТТОРОВИЧ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир – 2015 Работа выполнена в ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Макаров Владимир Владимирович,...»

«ЧУЛКОВ Евгений Георгиевич МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ФЛАВОНОИДОВ НА КАНАЛООБРАЗУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ НИСТАТИНА 03.01.03 — молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Ольга Сергеевна Остроумова Институт цитологии РАН...»

«Ильина Елена Петровна Незаконная добыча (вылов) водных биологических ресурсов (по материалам Камчатского края) 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2015 г. Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный юридический университет имени О.Е. Кутафина...»

«УЛАНОВА Светлана Андреевна НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МУНИЦИПАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ШКОЛ В СФЕРЕ ЗДОРОВЬЕСБЕРЕЖЕНИЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ В УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА 14.02.01 – гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Сыктывкарский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации и НИИ гигиены и охраны здоровья детей и подростков ФГБНУ «Научный центр здоровья детей» Научный...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Казань 2015 Работа выполнена в отделе биологической безопасности Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»

«Исаев Аркадий Петрович ТЕТЕРЕВИНЫЕ ПТИЦЫ ЯКУТИИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЧИСЛЕННОСТЬ, ЭКОЛОГИЯ 03.02.04 – Зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск 2014 Работа выполнена в лаборатории горных и субарктических экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения Российской академии наук. Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.