WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных ...»

-- [ Страница 3 ] --

Рисунок 2.5.

1.6 – Чувствительность фекальных изолятов E. casseliflavus к антибактериальным препаратам Половина исследуемых штаммов обладала E. casseliflavus промежуточным уровнем резистентности к ванкомицину, ципрофлоксацину, энрофлоксацину и линезолиду. Все культуры Е. casseliflavus сохраняли чувствительность к тетрациклину и аминогликозидам и проявляли умеренную резистентность в отношении цефтриаксона.

В ходе исследований установлено, что полирезистентностью к антибактериальным препаратам (к трм и более классам АБП) обладали 20,0±5,96% культур E. faecium, 30,7±7,38% штаммов E. hirae, 33,3±7,86% изолятов E. durans. Среди культур E. flavescens и E. casseliflavus процент полирезистентных штаммов составил 20,0±10,32 и 50,0±20,41%, соответственно.

Таким образом, резистентность к ампициллину в 3,5 раза чаще распространена среди штаммов E. faecium, чем E. hirae (р0,05). Количество цефтриаксонрезистентных культур E. durans в три раза превышало число таковых культур E. faecium (р0,05). Все фторхинолоны были менее активны в отношении изолятов E. faecium по сравнению с культурами E. hirae и E. durans (р0,01). Резистентность к линезолиду в большей степени распространена среди культур E. hirae, E. durans и E. flavescens, чем среди штаммов E. faecium и E. faecalis (р0,001).

В популяции фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных, обнаружен низкий процент ванкомицинрезистентных штаммов (1,9±1,07%). На фенотипическом уровне выявлена широкая распространнность резистентности культур энтерококков к фторхинолонам (к ципрофлоксацину – 50,0±3,92%, к норфлоксацину – 33,3±3,70%, к энрофлоксацину – 64,9±3,75%) и линезолиду (53,8±3,91%). Максимальную чувствительность изоляты sp. проявляли в отношении Enterococcus ампициллина – 87,0±2,64%, стрептомицина – 94,5±1,79% и гентамицина – 96,3±1,48%.

75

–  –  –

Примечание: гены кодируют резистентность к: aac(6)-Ie-aph(2")-Ia – высоким уровням гентамицина, aph(3)-IIIa и ant(4)-Ia – аминогликозидам (кроме гентамицина), tetM – тетрациклину и миноциклину, tetL – тетрациклину, vanA

– ванкомицину и тейкопланину, vanB – различным концентрациям ванкомицина, vanC-1и vanC2/3 – низким концентрациям ванкомицина.

Рисунок 2.5.

2.1 – Генетическая характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов Enterococcus sp.

E. faecium (6,6±3,70%) (р0,001) и E. hirae (15,3±5,76%) (р0,05). Штаммы, содержащие ген tetL, не были обнаружены.

Анализ генотипического профиля резистентности Enterococcus sp. к гликопептидам выявил наличие гена vanA, кодирующего резистентность к ванкомицину и тейкопланину, среди 58,3±8,21% культур E. durans и 46,7±7,43% штаммов E. faecium. Менее распространнным данный ген оказался среди изолятов E. faecalis (14,3±7,63%), чем среди культур E. durans и E. faecium (р0,01). В то же время, только у штаммов E. faecalis был зарегистрирован ген vanB в 14,3±7,63% случаев.

Среди фекальных изолятов E. faecalis, E. flavescens и Е. casseliflavus ген vanC1, кодирующий резистентность к низким концентрациям ванкомицина, обнаружен в 57,1±10,80, 60,0±12,64 и 100% случаев, соответственно.

Генетическая детерминанта vanC2/3 выявлена у 100% штаммов E. flavescens и Е. casseliflavus. Достоверно чаще данным геном обладали культуры E. faecalis (57,1±10,80%), чем изоляты E. faecium (6,6±3,70%) (р0,001).

В результате проведнного исследования установлено, что в геноме энтерококков фекальной микрофлоры животных наиболее распространнными генетическими детерминантами антибиотикорезистентности являются: tetM (35,1±3,74%), aac(6)-Ie-aph(2)-Ia (33,4±3,70%), ant(4)-Ia (31,5±3,64%) и vanA (29,6±3,58%). Наибольшее количество различных генов антибиотикорезистентности зарегистрировано в геноме культур E. faecalis.

Корреляционный анализ фено- и генотипических характеристик резистентности бактерий рода к аминогликозидам и Enterococcus гликопептидам показал наличие обратной взаимосвязи (r=-0,625; р0,001) между присутствием в геноме генетических детерминант резистентности и фенотипическим проявлением признака. У исследуемых культур энтерококков выявлена достоверная положительная связь между наличием генов резистентности к тетрациклинам и их экспрессией (r=0,685; р0,001).

78

2.6 Антагонистическая активность фекальных изолятов энтерококков in vitro

Явление антагонизма широко распространено среди микроорганизмов.

В межмикробных взаимодействиях важную роль играют бактериоцины – экскретируемые за пределы бактериальной клетки антимикробные вещества, обеспечивающие регуляцию популяции бактерий и поддерживающие колонизационную резистентность макроорганизма.

2.6.1 Характеристика антагонистической активности фекальных изолятов энтерококков При исследовании антагонистической активности энтерококков установлено, что 37,0±3,79% выделенных культур подавляли рост вирулентных штаммов Enterococcus faecalis и бактерий рода Listeria.

В отношении остальных культур коллекции микроорганизмов антагонистическая активность бактерий рода Enterococcus не выявлена.

Антагонистически активные изоляты энтерококков принадлежали к видам E. faecium (30 штаммов), E. durans (24 штамма) и E. flavescens (6 штаммов). Среди культур вида E. faecium доля антагонистически активных штаммов составила 66,6±7,03%, среди E. durans – 66,6±7,86%, среди E. flavescens – 40,0±12,64%.

Культуры энтерококков-антагонистов были изолированы в одинаковом проценте случаев из фекалий крупного рогатого скота и свиней (12,9±2,63%), в меньшем проценте случаев (11,1±2,46%) – из фекалий лошадей, в то время как штаммы Enterococcus sp. фекальной микрофлоры коз антагонистической активностью не обладали.

Коэффициент антагонистической активности культур E. faecium в отношении бактерий Listeria monocytogenes составил 7,0±0,42, штаммов E. durans – 6,8±0,41, изолятов E. flavescens – 6,7±1,55 (в соответствии с рисунком 2.6.1.1).

–  –  –

* активности, усл. ед.

* 4

–  –  –

Примечание: * – достоверность различий выраженности антагонистической активности культур E. faecium по сравнению с культурами E. durans – (р0,05); *** – достоверность различий выраженности антагонистической активности культур E. faecium по сравнению с культурами видов E. durans и E. flavescens (р0,001).

Рисунок 2.6.

1.1 – Выраженность антагонистической активности культур энтерококков в отношении Listeria sp. и Enterococcus faecalis

–  –  –

меньшей степени ингибировали рост листерий изоляты E. faecium (коэффициент активности 6,9±0,35). Минимальным значением коэффициента антагонистической активности (5,2±1,37) характеризовались штаммы E. flavescens.

В отношении вирулентных штаммов Enterococcus faecalis энтерококки обладали менее выраженным антагонизмом, чем к листериям, со средним значением коэффициента антагонистической активности: 6,2±0,37 для E. faecium, 5,1±0,35 для Е. durans и 5,4±0,82 для Е. flavescens. Активность штаммов E. faecium была достоверно выше по сравнению с культурами Е. durans (р0,05).

Анализ результатов, полученных при изучении антагонистической активности энтерококков фекальной микрофлоры животных в отношении тест-культур микроорганизмов, установил различия в способности энтерококков ингибировать рост патогенных бактерий рода Listeria и вирулентных штаммов Enterococcus faecalis. Культуры энтерококковантагонистов разных видов достоверно отличались по уровню антагонистической активности в отношении тест-штаммов листерий.

2.6.2 Влияние факторов макроорганизма на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков in vitro При персистировании в желудочно-кишечном тракте макроорганизма энтерококки должны сохранять свою способность подавлять размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под воздействием хлороводородной кислоты и жлчи. Поэтому на следующем этапе исследования мы изучили влияние факторов макроорганизма (хлороводородная кислота, жлчь) на антагонистическую активность фекальных изолятов Enterococcus sp. in vitro.

81 2.6.2.1 Оценка воздействия хлороводородной кислоты на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков В ходе проведнных исследований установлено, что соинкубирование штаммов Enterococcus sp. с хлороводородной кислотой в концентрации 0,3% вызывает преимущественное повышение антагонистической активности энтерококков в отношении тест-культур микроорганизмов (в соответствии с рисунком 2.6.2.1.1).

Так, 0,3% HCl увеличивало антагонистическую активность штаммов E. faecium в отношении L. ivanovii – на 21,1% (р0,001), в отношении L. monocytogenes на 14,2% (р0,05), в отношении L. innocua – на 6,4%.

Максимальное увеличение антагонистической активности культур E. faecium наблюдалось по отношению к L. seeligeri – на 28,9% (р0,001). Однако данная концентрация хлороводородной кислоты снижала способность изолятов E. faecium ингибировать рост вирулентных штаммов E. faecalis на 6,4%.

Концентрация хлороводородной кислоты оказывала 0,3% стимулирующий эффект на антимикробную активность культур Е. durans в отношении штаммов L. monocytogenes, L. innocua и L. ivanovii, увеличивая значения коэффициента антагонистической активности в 1,06, 1,17 и 1,50 раза, соответственно. В отношении тест-культур L. seeligeri и E. faecalis после соинкубирования с 0,3% HCl отмечался менее выраженный антагонизм, коэффициент антагонистической активности снизился до 6,8±0,20 и 4,7±0,25 против 7,1±0,44 и 5,1±0,35 в контроле, соответственно.

При инкубировании изолятов Е. flavescens с хлороводородной кислотой в концентрации 0,3% антилистериозная активность возрастала: против L. monocytogenes – на 34,3%, против L. innocua – на 16,2%, против L. ivanovii

– на 90,0%, против L. seeligeri – на 76,9%. В то же время, увеличивалась антимикробная активность штаммов Е. flavescens в отношении культур E. faecalis на 18,8% по сравнению с контролем.

–  –  –

* *** *** 5 *** *

–  –  –

Примечание: * – достоверность различий значений коэффициента антагонистической активности культур энтерококков в отношении тест-штаммов в контроле и после соинкубирования с хлороводородной кислотой – (р0,05); ** – (р0,01); *** – (р0,001).

–  –  –

Разнонаправленное действие на выраженность антагонистической активности бактерий рода оказывало соинкубирование Enterococcus штаммов-антагонистов с хлороводородной кислотой в концентрации 0,5% (в соответствии с рисунком 2.6.2.1.1). Коэффициент антагонистической активности изолятов E. faecium снижался в отношении культур L. innocua, L. ivanovii и E. faecalis на 3,8, 5,8 и 14,5% по сравнению с контролем, при этом составив 7,5±0,18, 8,0±0,20 и 5,3±0,31, соответственно. Наряду с этим, отмечалось повышение активности штаммов E. faecium против листерий: на 1,4% – в отношении L. monocytogenes, на 14,4% – в отношении L. seeligeri (р0,05).

Воздействие 0,5% HCl достоверно снижало способность изолятов Е. durans ингибировать рост штаммов листерий (кроме L. ivanovii) и E. faecalis. Коэффициент антагонистической активности в отношении Listeria sp. уменьшался в 1,50 раза (р0,001), в отношении E. faecalis – в 1,21 раза (р0,05) по сравнению с контрольными значениями. Соинкубирование Е. durans с 0,5% хлороводородной кислоты привело к увеличению антимикробной активности в отношении L. ivanovii на 25%.

Воздействие хлороводородной кислоты в концентрации 0,5% в меньшей степени оказывало ингибирующий эффект на антагонистическую активность штаммов Е. flavescens. Под влиянием 0,5% HCl снижалась антилистериозная активность в отношении L. monocytogenes и L. innocua на 11,9 и 32,4% по сравнению с контролем, значения коэффициента антагонистической активности составили 5,9±1,54 и 5,0±1,36, соответственно. Однако, в случае с L. ivanovii, L. seeligeri и E. faecalis антимикробная активность культур Е. flavescens усиливалась. Отмечено повышение коэффициента антагонистической активности в отношении:

L. ivanovii до 7,6±1,57 против 5,0±1,57 в контроле; L. seeligeri до 5,8±1,66 против 5,2±1,37 в контроле; E. faecalis до 6,0±0,51 против 5,4±0,82 в контроле.

84 Таким образом, в большинстве случаев соинкубирование энтерококков-антагонистов с 0,3% хлороводородной кислотой наиболее эффективно повышает антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в то время как воздействие 0,5% хлороводородной кислотой вызывает снижение способности фекальных изолятов энтерококков ингибировать рост тесткультур.

2.6.2.2 Оценка воздействия жлчи на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков После соинкубирования антагонистически активных штаммов энтерококков с 1% жлчи выявлено разнонаправленное влияние на уровень их антагонизма в отношении тест-культур (в соответствии с рисунком 2.6.2.2.1).

При изучении влияния 1% жлчи на антимикробную активность культур E. faecium нами было установлено достоверное снижение активности в отношении штаммов L. innocua, L. ivanovii и E. faecalis на 10,2% (р0,05), 16,4% (р0,001) и 16,1% (р0,05) по сравнению с контролем, соответственно.

В отношении штаммов L. monocytogenes антимикробный эффект культур E. faecium уменьшался на 4,2%, в отношении L. seeligeri – усиливался на 14,4% (р0,05).

Коэффициент антагонистической активности изолятов Е. durans в отношении бактерий рода Listeria и Enterococcus преимущественно снижался по сравнению с контрольными значениями. Так, жлчь в концентрации 1% ослабляла способность штаммов-антагонистов ингибировать рост L. monocytogenes на 4,4%, L. innocua – на 18,4% (р0,01), L. ivanovii – на 3,8%, E. faecalis – на 5,8%, тогда как в отношении штаммов L. seeligeri происходило усиление антимикробного эффекта в 1,23 раза (р0,01).

–  –  –

* *** 7 *** * * *** ** 6 *** * * 5 ***

–  –  –

Примечание: * – достоверность различий значений коэффициента антагонистической активности культур энтерококков в отношении тест-штаммов в контроле и после соинкубирования с жлчью – (р0,05); ** – (р0,01); *** – (р0,001).

–  –  –

Действие жлчи в концентрации 1% на антагонистическую активность культур Е. flavescens имело следующие особенности: максимальное увеличение активности наблюдалось в отношении L. ivanovii и L. seeligeri – на 74,0 и 67,0% от контрольного значения. Значение коэффициента антагонистической активности к штаммам L. monocytogenes увеличилось до 8,2±1,41 против 6,7±1,55 в контроле, к изолятам L. innocua – до 9,4±1,13 против 7,4±2,22 в контроле, к культурам E. faecalis – до 6,4±0,25 против 5,4±0,82 в контроле.

Соинкубирование энтерококков с раствором жлчи 5%-ным сопровождалось достоверным снижением антагонистической активности изолятов E. faecium в отношении всех тест-культур (в соответствии с рисунком 2.6.2.2.1). Способность ингибировать рост L. monocytogenes уменьшалась на 22,8% (р0,001), L. innocua – на 19,2% (р0,001), L. ivanovii – на 29,4% (р0,001), L. seeligeri – на 10,0% (р0,05) по сравнению с контрольными значениями. Наибольшее ослабление признака наблюдалось по отношению к вирулентным штаммам E. faecalis, при этом коэффициент антагонистической активности составил 4,2±0,29, что в 1,47 раза меньше контрольного показателя (р0,05).

Соинкубирование штаммов Е. durans с 5% жлчи оказывало стимулирующее действие на антилистериозный эффект в отношении L. innocua и L. ivanovii, антагонистическая активность усилилась в 1,26 (р0,01) и 1,34 раза, соответственно. Противоположный эффект наблюдали при изучении антагонизма культур Е. durans к штаммам L. monocytogenes, L. seeligeri и E. faecalis: активность снижалась на 14,7% (р0,05), 9,8% (р0,001) и 13,7% (р0,05), соответственно.

В меньшей степени под влиянием 5% жлчи изменялась выраженность антагонистической активности культур Е. flavescens. В отношении тестштаммов коэффициент антимикробной активности L. monocytogenes уменьшался на 4,4% по сравнению с контролем. Способность изолятов Е. flavescens подавлять рост культур L. innocua и L. ivanovii повышалась на 87 8,0%. Коэффициент антагонистической активности в отношении культур L. seeligeri и E. faecalis составил 6,2±1,23 и 6,3±0,20, соответственно, что на 19,2 и 16,6% больше контроля.

В ходе проведнных исследований установлено преимущественно ингибирующее действие различных концентраций жлчи на антагонистическую активность энтерококков фекальной микрофлоры животных. В наибольшей степени способность культур Enterococcus sp.

подавлять рост тест-штаммов снижалась под влиянием концентрации жлчи 5%.

2.6.3 Генотипическая характеристика бактериоциногении фекальных изолятов энтерококков Изучение изолятов энтерококков на наличие генетических детерминант бактериоциногении показало, что 69 культур (42,5±3,88%) обладали тем или иным геном, кодирующим синтез энтероцинов. При этом наблюдалась прямая корреляция (r=0,891) между наличием генов бактериоциногении и проявлением антагонистической активности (р0,001).

Генетические детерминанты бактериоциногении были обнаружены у штаммов энтерококков трх видов: E. faecium, Е. durans и Е. flavescens (в соответствии с рисунком 2.6.3.1).

Геном entA, кодирующим синтез энтероцина А, культуры E. faecium обладали в большем проценте случаев (46,7±7,43%), по сравнению с изолятами Е. durans (8,3±4,59%) (р0,001). Среди штаммов Е. flavescens данный ген выявлен у 20,0±10,32% изолятов.

Ген, ответственный за продукцию энтероцина В, достоверно чаще регистрировался у изолятов E. faecium, чем у культур Е. durans (р0,001).

Частота его обнаружения составила 40,0±7,30 и 8,3±4,59% случаев, соответственно.

% *** *** *** 30 10 E. faecium E.durans E. flavescens Примечание: гены кодируют: entA – энтероцин А, entB – энтероцин В, entP – энтероцин Р, bac31– бактериоцин 31, entL50A – энтероцин L50A, entL50B – энтероцин L50B, entAS-48 – энтероцин AS-48, cylLs и cylLl – литические компоненты цитолизина. *** – достоверность различий частоты встречаемости генов энтероцинов среди культур E. faecium, по сравнению с культурами Е. durans – (р0,001).

Рисунок 2.6.

3.1 – Распространнность генов бактериоциногении в популяции фекальных изолятов энтерококков

–  –  –

В популяции фекальных изолятов энтерококков генетические детерминанты entAS-48, cylLs и cylLl не были обнаружены.

Культуры Enterococcus sp., обладающие генами бактериоциногении, были изолированы из фекалий крупного рогатого скота (55,5±6,76%), свиней (47,0±6,98%) и лошадей (41,6±8,21%).

Наиболее разнообразный спектр генов бактериоциногении представлен у штаммов E. faecium. Энтерококки, содержащие в геноме несколько генов бактериоциногении (три и более), принадлежали к видам E. faecium и Е. flavescens. В геноме двух штаммов E. faecium и Е. flavescens были выявлены комплексы генов продукции энтероцинов (entA, entP, entL50A, entL50B). Штамм E. faecium, изолированный из фекалий лошади, обладал набором из пяти генов энтероцинов (entA, entP, bac31, entL50A, entL50B).

В результате проведнных исследований выявлена широкая распространнность генов бактериоциногении среди фекальных изолятов энтерококков, напрямую коррелирующая с проявлением антагонистической активности.

2.7 Антилистериозная активность Enterococcus faecium Ef79OSAU in vivo

На следующем этапе работы нами была предпринята попытка изучения антагонистической активности энтерококков на модели in vivo экспериментальной листериозной инфекции.

Известно, что листериоз представляет собой сапрозоонозное инфекционное заболевание людей и животных, возбудителями которого являются бактерии рода Listeria. Данное заболевание характеризуется множеством источников возбудителя инфекции, разнообразием путей и факторов его передачи, полиморфизмом клинических проявлений, высокой летальностью (Пушкарева В.И. и др., 2012).

В качестве штамма-антагониста была выбрана культура Enterococcus faecium Ef79OSAU, изолированная из кишечника свиньи, обладающая выраженным антагонистическим эффектом в отношении бактерий рода Listeria in vitro и не имеющая факторов патогенности на фено- и генотипическом уровне.

На протяжении всего эксперимента морские свинки опытной группы характеризовались активным поведением, умеренным аппетитом, чистым волосяным покровом (в соответствии с рисунком 2.7.1 А). Животные контрольной группы через сутки после инфицирования становились угнетенными, отказывались от корма и воды, сидели нахохлившись, шерсть была взъерошена. В агональном состоянии у животных наблюдались параличи, запрокидывание головы на спину, плавательные движения конечностями (в соответствии с рисунком 2.7.1 Б).

А Б Рисунок 2.7.1 – Клиническая картина экспериментального листериоза морских свинок: А – животные опытной группы, Б – павшее животное контрольной группы В ходе проведнных исследований установлено, что заражение морских свинок вызывает развитие инфекции, сопровождающейся гибелью 33,3% животных контрольной группы. Через сутки после инфицирования погибли две морские свинки, через пять суток пало еще одно животное контрольной группы. В опытной группе гибель животных от листериозной инфекции не наблюдали.

Этим данным соответствовали и результаты определения показателя микробной обсеменнности (КОЕ/г) внутренних органов у животных исследуемых групп. Количество листерий в органах морских свинок, получавших культуру энтерококков, на третьи и пятые сутки инфекции было достоверно меньше, чем в органах животных контрольной группы.

В обсеменнности листериями селезнки морских свинок опытной и контрольной групп наблюдалась тенденция к первоначальному увеличению числа бактерий в органе к третьим суткам инфекции с последующим уменьшением количества листерий к последнему дню эксперимента (в соответствии с рисунком 2.7.2 А).

Cпустя 24 часа, бактерии рода Listeria из селезнки животных обеих групп не выделялись. Через трое суток после инфицирования, концентрация листерий в селезнке животных опытной группы достигала 244,0±20,72 КОЕ/г, что в среднем в 1,3 раза меньше таковой в контрольной группе (р0,05). В опытной группе морских свинок количество листерий в селезнке на пятые сутки течения инфекции было достоверно ниже (26,0±7,42 КОЕ/г), чем в контрольной группе (184,0±16,04 КОЕ/г) (р0,001).

Аналогичную тенденцию наблюдали при изучении результатов посевов ткани печени: через сутки после инфицирования концентрация листерий в органе животных контрольной группы достигала 2,0±0,50 КОЕ/г, обсеменнность L. monocytogenes VIMHA 004 печени животных опытной группы к третьим суткам инфекции составила 236,0±17,45 КОЕ/г против 279,0±12,16 КОЕ/г в контрольной группе (в соответствии с рисунком 2.7.2 Б).

На пятые сутки от момента заражения в опытной группе животных отмечалось достоверное снижение количества листерий в печени (9,0±1,83 КОЕ/г) по сравнению с контролем (1305,0±21,67 КОЕ/г) (р0,001).

Концентрация листерий в кишечнике и его содержимом у животных обеих групп возрастала с течением времени (в соответствии с рисунком 2.7.2 В). При этом степень обсеменнности листериями кишечника

–  –  –

* * * *** 200 ***

–  –  –

А Б В Примечание: * – достоверность различий уровня обсеменнности листериями внутренних органов морских свинок в опытной и контрольной группе животных – (р0,05); *** – (р0,001).

–  –  –

и его содержимого у морских свинок на третьи и пятые сутки инфекции была ниже в опытной группе животных (р0,05).

Количество L. monocytogenes VIMHA 004 в кишечнике и его содержимом у животных опытной группы через 24 часа от момента инфицирования достигало 140,0±11,50 КОЕ/г (в контрольной группе – 180±20,0 КОЕ/г). На третьи сутки инфекционного процесса в кишечнике и его содержимом у животных, получавших культуру энтерококков, число листерий составило 377,0±7,24 КОЕ/г, в контрольной группе – 407,0±8,71 КОЕ/г; на пятые сутки аналогичные показатели для опытной и контрольной групп составили 1600,0±54,80 и 1796,0±39,76 КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, в результате проведнного исследования выявлена способность штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU снижать летальность и микробную обсеменнность внутренних органов при экспериментальной листериозной инфекции у морских свинок.

94

III ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактерии рода рассматриваются в качестве Enterococcus представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта большого числа организмов: млекопитающих, птиц, рептилий и насекомых.

Систематика энтерококков существенно изменилась за последние десять лет, и в настоящее время род Enterococcus включает более 40 видов микроорганизмов, характеризующихся разнообразными местообитаниями.

Помимо пищеварительного тракта, внешняя среда обитания энтерококков включает в себя растения, почву, воду, донные отложения и песок (Weigand M.R. et al., 2014).

Изучение биологических свойств микроорганизмов рода Enterococcus представляет особый научный и практический интерес, поскольку данные микроорганизмы применяются в пищевой индустрии для производства молочнокислых и ферментированных продуктов питания, а также являются эффективным компонентом пробиотических препаратов.

Известно, что энтерококки могут оказывать многостороннее воздействие на физиологические, биохимические, иммунные процессы, протекающие в организме человека и животных (Шендеров Б.А., 2005;

Maldonado G.С. et al., 2007; Preter V. et al., 2007). Данные бактерии способны поддерживать колонизационную резистентность кишечного биотопа за счт активной конкуренции с патогенными микроорганизмами за лимитируемые питательные субстраты и сайты адгезии на эпителиальных клетках, а также участвуют в метаболизме углеводов, жлчных кислот, холестерола, синтезе витаминов и ряда других биологически активных веществ (Gibson G.R., Roberfroid M., 1995; Доронин А.Ф., Шендеров Б.А., 2002).

Некоторые штаммы энтерококков обладают антимикробной активностью, связанной с выработкой ими антибактериальных веществ неспецифического действия, таких как органические кислоты, перекись водорода, лизоцим. В то же время, антагонистическая активность Enterococcus sp. может реализовываться за счт синтеза бактериоцинов (энтероцинов). Данные соединения представляют собой белки, синтезируемые на рибосомах, проявляющие антимикробное действие по отношению к родственным видам бактерий (Brando A. et al., 2010). Особый интерес представляет использование энтероцинов в терапии инфекционных патологий, а также в качестве консервантов для предотвращения порчи пищевых продуктов.

Однако, несмотря на вышеперечисленные положительные свойства энтерококков, эти бактерии являются условно-патогенными микроорганизмами. Обладая высокой репродуктивной способностью, устойчивостью к факторам врожденного иммунитета хозяина, а также к различным абиотическим воздействиям, бактерии рода Enterococcus могут выступать в роли этиологического агента экзогенных и эндогенных инфекционных процессов, особенно у иммунокомпрометированных организмов. В связи с этим, актуальным остается комплексное изучение биологических свойств культур выделенных из Enterococcus sp., естественного места обитания (кишечного биотопа животных).

Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

Изучить видовой состав энтерококков, выделенных из фекалий 1.

здоровых сельскохозяйственных животных.

Охарактеризовать факторы патогенности, персистенции и 2.

антибиотикорезистентности бактерий рода Enterococcus на уровне фено- и генотипа.

Определить антагонистическую активность и гены 3.

бактериоциногении у штаммов энтерококков, оценить влияние факторов макроорганизма на антагонистическую активность культур Enterococcus sp.

in vitro.

Изучить антагонистическую активность культур энтерококков in 4.

vivo.

Анализ результатов проведнных исследований позволил выявить различия видового состава энтерококков фекальной микрофлоры продуктивных животных: энтерококки фекалий моногастричных животных характеризовались большим разнообразием видов, чем у жвачных.

Доминирующим видом у полигастричных животных являлся E. durans, у лошадей и свиней – E. faecium. Изоляты вида E. faecalis были обнаружены только в кишечном биотопе жвачных животных.

В настоящее время отсутствует единое мнение относительно доминирования определнных видов энтерококков в кишечном биотопе животных. Некоторые авторы указывают, что основными представителями энтерококков в кишечнике крупного рогатого скота, свиней и лошадей являются E. faecium (Kagkli D.M. et al., 2007), другие – E. faecalis (Vermette C.J. et al., 2010), третьи – E. hirae (Guerrero-Olmos K. et al., 2014).

Предположительно, данные различия могут быть связаны с особенностями рациона и содержания животных в различных регионах. Кроме того, в более ранних работах идентификация энтерококков проводилась на основании биохимических тестов, которые не всегда дают верный результат при исследовании близкородственных видов Enterococcus sp. (Гармашева И.Л., Коваленко Н.К., 2010), в то время как используемый в нашей работе молекулярно-генетический метод позволяет говорить о более высокой точности результатов идентификации.

Одним из важнейших этапов изучения выделенных культур энтерококков стало выявление возможных факторов патогенности. Известно, что наличие факторов вирулентности у представителей группы потенциально-патогенных микроорганизмов играет ведущую роль в развитии инфекционного процесса (Литвин В.Ю., Пушкарева В.Н., 1994).

В ходе проведнных исследований нами установлено, что культуры Enterococcus sp. не обладали гемолитической и желатиназной активностями на фенотипическом уровне. Показано, что для фекальных изолятов энтерококков характерно наличие протеолитической активности.

Выраженность данного признака варьировала в зависимости от видовой принадлежности энтерококков. Наибольший уровень активности определн у культур E. cаsseliflavus, тогда как наименьший – у штаммов E. faecium.

Из литературных данных известно, что к факторам вирулентности прежде всего относятся те микробные протеолитические ферменты, которые действуют на компоненты межклеточного матрикса и факторы иммунной системы, обуславливая патогенез инфекционного заболевания (Петровская В.Г., 1984; Cole M.F. et al., 1994). В этом контексте протеолитическую активность фекальных энтерококков следует рассматривать не как фактор вирулентности, а как одну из важнейших характеристик молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающую потребность бактерий в ростовых факторах – аминокислотах. В работах S. Menndez et al. (2004) и A. Bhardwaj et al. (2008) показано, что энтерококки обладают более высоким уровнем протеолитической активности, чем другие молочнокислые бактерии.

Активность протеолитических ферментов Enterococcus sp. обуславливает протеолиз белков молока, необходимый при производстве кисломолочных продуктов (Архипов А.Н. и др., 2012).

В результате молекулярно-генетического исследования в популяции фекальных изолятов энтерококков нами не обнаружено генетических детерминант известных факторов вирулентности (cylA, cylB, cylM – цитолизинов, gelE – желатиназы, sprE – сериновой протеазы, hyl – гиалуронидазы, asa – поверхностных белков, участвующих в адгезии).

Данные об отсутствии в геноме фекальных энтерококков, выделенных от животных, генетических детерминант факторов вирулентности 98 отличаются от имеющихся в литературе. Так, Qin X. et al. (2001) обнаружили в геноме штаммов Enterococcus faecalis OG1RF гены gelE и sprE, кодирующие желатиназу и сериновую протеазу. В исследованиях C. Sabina et. al. (2007) и F. Biavasco (2007) установлено, что ген, обуславливающий протеолитическую активность (gelE) содержат 50% культур Enterococcus sp., выделенных из кишечника животных, причм 11% штаммов обладают желатиназной активностью на уровне фенотипа. По данным Poeta P. et al.

культуры фекальной микрофлоры птиц (2006), Enterococcus sp.

характеризовались наличием генов сyl-оперона (cylA, cylB, cylM) и проявляли

-гемолитическую активность.

Отсутствие факторов вирулентности у изученных фекальных культур энтерококков предполагает безопасность их использования в качестве основы пробиотических препаратов и заквасок прямого внесения.

Существенный вклад в длительное переживание энтерококков в организме хозяина вносят факторы персистенции. В отличие от хорошо изученных факторов вирулентности (Бухарин О.В. и др., 2013;

Пошвина Д.В., Сычева М.В., 2014), определены лишь некоторые персистентные характеристики бактерий рода поэтому Enterococcus, следующим этапом работы явилось изучение персистентных свойств фекальных изолятов энтерококков.

Способность инактивировать лизоцим определена нами у всех исследуемых штаммов Enterococcus sp. Впервые выявлен неизвестный ранее признак энтерококков – антикарнозиновая активность. Среди культур энтерококков разных видов максимальными значениями активностей обладали изоляты E. hirae и E. durans.

Полученные нами данные перекликаются с результатами Н.В. Бугеро (2010), которая отмечала взаимосвязь антилизоцимной активности и репродуктивной способности фекальных энтерококков. Наличие персистентных свойств у энтерококков в условиях здорового организма объяснимо, так как локализуясь в кишечнике, бактерии должны, прежде всего, преодолеть совокупность факторов местного иммунитета, напряжнность которого определяется в том числе и антимикробными пептидами.

Немаловажную роль для персистенции бактерий рода Enterococcus в желудочно-кишечном тракте играет их способность образовывать биоплнки, которые представляют собой высокоорганизованные, изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие из активно функционирующих клеток и покоящихся форм, заключнных в общий экзополимерный матрикс и ассоциированных с биологической или небиологической поверхностью (Гостев В.В., Сидоренко С.В., 2010).

Существование бактерий в биоплнках повышает их выживаемость и устойчивость к стрессовым условиям окружающей среды.

Нами была определена способность образовывать биоплночные структуры на абиотической поверхности у 20,3±3,16% штаммов Enterococcus sp. Культуры, формирующие биоплнки, относились к видам E. faecium, E. hirae, E. durans и E. flavescens, при этом коэффициент биоплнкообразования изолятов энтерококков варьировал от 1,2 до 1,4.

У энтерококков описаны гены, обуславливающие синтез поверхностных белков (Esp) (Cafini F. et al., 2015), а также конъюгативная плазмида pBEE99, обеспечивающая устойчивость к ультрафиолетовому облучению и способность биоплнкообразования (Coburn P.S. et al., 2010), однако, в нашем исследовании, ни у одного из изученных штаммов энтерококков генетическая детерминанта esp не выявлена.

Уместно предположить, что впервые обнаруженная нами у энтерококков антикарнозиновая активность в совокупности с антилизоцимным признаком и способностью образовывать биоплнки способствуют длительному переживанию данных бактерий в организме животных.

На следующем этапе работы была определена чувствительность фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных, к антибактериальным препаратам.

Известно, что интенсивное использование антибиотиков в медицине и ветеринарии способствует возникновению и широкому распространению механизмов антибиотикорезистентности у бактерий (Nilsson O., 2012;

Lebreton F. et al., 2013). Антимикробные препараты оказывают селективное давление не только на патогенные микроорганизмы, но и на симбиотические бактерии желудочно-кишечного тракта человека и животных. Доказано, что резистентные к антимикробным препаратам энтерококки могут передаваться человеку от домашних животных в результате тесного контакта (Simjee S. et al., 2002), а также при употреблении в пищу контаминированных продуктов животного происхождения (Hammad A.M., Shimamoto T., 2014).

Энтерококки, в свою очередь, могут передавать гены устойчивости другим бактериям (Hammerum A.M., 2012).

Результаты определения антибиотикочувствительности культур Enterococcus sp. показали, что подавляющее большинство штаммов (от 85,1±2,79 до 96,3±1,48%) сохраняли чувствительность в отношении ванкомицина, ампициллина и аминогликозидов (стрептомицина и гентамицина). Обнаружен высокий процент культур, резистентных к фторхинолонам (к ципрофлоксацину – 50,0±3,92%, к норфлоксацину – 33,3±3,70%, к энрофлоксацину – 64,9±3,75%) и линезолиду (53,8±3,91%).

Нами установлены видовые особенности антибиотикорезистентности энтерококков фекальной микрофлоры животных: устойчивость к фторхинолонам в большей степени характерна для культур E. faecium и E. faecalis, резистентность в отношении линезолида распространена среди изолятов E. hirae, E. durans и E. flavescens.

Результаты наших исследований по данному вопросу находят сво подтверждение в работе N. Klibi et al. (2014), которые выявили чувствительность штаммов энтерококков, выделенных из фекалий продуктивных животных, к ванкомицину и тейкопланину, ампициллину, стрептомицину и гентамицину. Распространнность резистентности к ципрофлоксацину среди культур энтерококков разных видов составила Но, тем не менее, в литературе имеются сообщения о 22-25%.

распространении ванкомицин- и линезолидрезистентных штаммов энтерококков (Novais C. et al., 2003; Bourgeois-Nicolaos N. et L., 2007;

Nowakiewicz A. et al., 2014).

Анализ генотипического профиля резистентности Enterococcus sp.

позволил определить наиболее распространнные генетические детерминанты антибиотикорезистентности: tetM (35,1±3,74%), aac(6)-Ieaph(2)-Ia (33,4±3,70%), ant(4)-Ia (31,5±3,64%) и vanA (29,6±3,58%).

Культуры E. faecalis характеризовались максимальным разнообразием генов резистентности.

Полученные сведения согласуются с результатами исследований F.M.

Aarestrup et al. (2000) и R. Del Campo et al. (2003), установивших наличие генов tetM и tetL в геноме тетрациклинрезистентных штаммов энтерококков.

В работе P. Poeta et al. (2005) охарактеризованы гены резистентности к аминогликозидам штаммов энтерококков, выделенных от животных в Португалии. Не исключено, что выявленный нами спектр антибиотикорезистентности фекальных культур Enterococcus sp. обусловлен природной устойчивостью энтерококков к ряду АБП (цефалоспорины, лактамы, фторхинолоны), связанной с наличием генетических детерминант антибиотикорезистентности. Определение устойчивости к антимикробным препаратам энтерококков кишечного биотопа животных необходимо для оценки их значения как резервуара генов резистентности.

Бактерии рода Enterococcus способны продуцировать антимикробные пептиды – бактериоцины, обладающие ингибирующей активностью в отношении близкородственных штаммов. Предполагается, что синтез бактериоцинов дает конкурентное преимущество штаммам-продуцентам перед другими бактериями, заселяющими один и тот же биотоп (Snchez J.

et al., 2007). В связи с этим, изучение антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов является важным этапом исследования биологических свойств энтерококков микрофлоры фекалий животных.

В ходе исследований установлена антагонистическая активность 37,0±3,79% выделенных культур энтерококков в отношении бактерий рода Listeria и вирулентных штаммов Enterococcus faecalis, из них 50±6,45% принадлежали к виду E. faecium, 40,0±6,32% – к E. durans и 10,0±3,87% – к E. flavescens. В отношении вирулентных штаммов E. faecalis энтерококки проявляли менее выраженный антагонизм, чем к листериям. Изоляты E. faecium обладали наибольшей способностью подавлять рост тест-штаммов по сравнению с культурами энтерококков других видов.

Дальнейшие исследования установили разнонаправленное действие факторов макроорганизма (хлороводородная кислота, жлчь) на антагонистическую активность энтерококков.

Так, соинкубирование энтерококков-антагонистов с 0,3% хлороводородной кислоты вызывало преимущественное повышение антагонистической активности Enterococcus sp. в отношении тест-культур коллекции, тогда как 0,5%-ный раствор хлороводородной кислоты снижал способность фекальных изолятов энтерококков ингибировать рост тест-штаммов в среднем на 10,2%. Жлчь в исследуемых концентрациях (1% и 5%) достоверно подавляла антимикробную активность изолятов E. faecium и E. durans. У штаммов под воздействием жлчи происходило усиление E. flavescens антагонистической активности, однако описанные изменения у культур данного вида оказались недостоверны, то есть были на уровне тенденций.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что энтерококки не утрачивают антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов после воздействия хлороводородной кислоты и жлчи.

Имеются данные о том, что бактерии рода Enterococcus сохраняют жизнеспособность при прохождении через желудочно-кишечный тракт, поскольку устойчивы к действию хлороводородной кислоты и жлчи (Strompfov V. et al., 2004). Однако изменения кислотности среды влияют на бактериоциногенную активность энтерококков. В работе K. Banwo et al.

(2013) показано выраженное снижение антимикробной активности бактериоцинов при высоких значениях рН и сохранение их свойств при более низких. Это обуславливается тем, что оптимальный уровень кислотности среды для производства бактериоцинов молочнокислыми бактериями часто находится ниже такового для роста микроорганизмов. Предположительно, снижение активности объясняется адсорбцией молекул бактериоцинов на клеточной поверхности бактерий-продуцентов, что зависит от рН среды клеток и более выражено при высоких значениях водородного показателя (Parente E., Ricciardi A., 1999). В более ранних исследованиях B. Gedek (1987) установил, что жлчные соли снижают рост и антимикробную активность лактобактерий в отношении тест-культуры B. subtilis АТСС 6633.

Таким образом, эволюционно сложившаяся устойчивость энтерококков к факторам макроорганизма способствует успешной колонизации и функциональной активности бактерий в кишечном биотопе.

Проведнный молекулярно-генетический анализ выявил в геноме фекальных культур энтерококков генетические детерминанты, ответственные за синтез энтероцинов А, В, Р, L50A, L50B и бактериоцина 31. Наиболее распространнными были гены entA (16,7±2,93%) и entP (33,4±3,70%).

В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространнность генов бактериоциногении (что согласуется с данными K. Nigtov et al. (2005), V. Strompfov et al. (2008)), напрямую коррелирующая с наличием антилистериозной активности и активностью в отношении вирулентных изолятов вида Выявленная E. faecalis.

закономерность находит подтверждение в работах W. Theppangna et al. (2007) и (2011), которые охарактеризовали спектр G.B. zdemir et al.

антимикробной активности наиболее часто встречающихся у штаммов Enterococcus sp. бактериоцинов А и Р. Названные энтероцины ингибируют рост Listeria sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus sp., Carnobacterium sp., Leuconostoc sp., Lactococcus sp., Clostridium sp. и выявляются практически в одинаковом проценте случаев.

На следующем этапе работы мы предприняли попытку изучения антагонистической активности энтерококков на модели in vivo экспериментального листериоза морских свинок.

В качестве штамма-антагониста была выбрана культура Enterococcus выделенная из кишечника свиньи, обладающая faecium Ef79OSAU, выраженным антилистериозным эффектом in vitro и не имеющая факторов патогенности на уровне фено- и генотипа.

Листериоз представляет собой бактериальное сапрозоонозное инфекционное заболевание людей и животных, возбудителями которого являются патогенные бактерии рода Listeria. Одним из путей реализации антимикробной активности энтерококков в модели экспериментального листериоза может быть ускорение элиминации листерий из внутренних органов животных.

Результаты определения показателя микробной обсеменнности внутренних органов (селезнки, печени, кишечника и его содержимого) соответствовали данным выживаемости животных опытной и контрольной групп (гибель 33,3% животных из группы контроля). Количество листерий в органах морских свинок опытной группы на третьи и пятые сутки инфекции было значимо меньше, чем в органах животных контрольной группы. Таким образом, штамм Enterococcus faecium Ef79OSAU обладает защитным эффектом при экспериментальном листериозе морских свинок.

Аналогичный протективный эффект культуры Lactobacillus delbrueckii UFV-H2b20 обнаружен L.M. dos Santos et al. (2011) при экспериментальной листериозной инфекции гнотобионтных мышей. Результаты исследований доказывают увеличение количества клеток Купфера в печени, сопровождающееся элиминацией листерий из органа. Другим возможным объяснением эффективного устранения возбудителя может являться производство иммунными клетками хемокинов, привлекающих большое число иммунокомпетентных клеток в инфицированный орган. V. Veckman et al. (2003) доказали, что лактобактерии способны индуцировать экспрессию генов хемокинов макрофагами.

Полученные нами результаты согласуются с данными H.J. Choi et al.

(2012), показавшими в работе иммуномодулирующее действие культуры Enterococcus faecium JWS 833, выделенной из кишечника птицы (утки), при экспериментальном листериозе мышей. Штамм Enterococcus faecium JWS 833 повышал концентрацию в сыворотке крови оксида азота (II) и воспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-) при внутривенном заражении животных, при этом количество клеток листерий в печени снижалось.

Вероятно, аналогичная способность Enterococcus faecium Ef79OSAU модулировать секрецию цитокинов, повышать функциональную активность фагоцитирующих клеток крови обеспечивает е положительное действие в качестве эффективного средства защиты от листериоза.

Оценивая фактические данные в целом, следует выделить следующие моменты: кишечный биотоп продуктивных животных разных видов характеризуется особенностями видового состава бактерий рода Enterococcus; энтерококки, изолированные из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных разных видов, обладают специфичным биопрофилем; авирулентные, антагонистически активные энтерококки, выделенные из кишечника животных, могут быть использованы в качестве биопрепаратов для защиты от листериоза.

106

ВЫВОДЫ

Выявлены различия видового состава энтерококков фекальной 1.

микрофлоры продуктивных животных разных видов. Установлено, что фекальные изоляты характеризуются большим Enterococcus sp.

разнообразием видов у моногастричных животных, чем у жвачных.

Доминирующим видом у полигастричных животных явился E. durans, у лошадей и свиней – E. faecium.

Выделенные штаммы энтерококков являются апатогенными 2.

вследствие отсутствия факторов вирулентности на фенотипическом (гемолитическая, желатиназная активности) и генетическом (cylA, cylB, cylM, gelE, sprE, hyl, asa, esp) уровнях.

Установлено, что все изоляты Enterococcus sp. обладают 3.

персистентным потенциалом (антилизоцимная и антикарнозиновая активности, биоплнкообразование), способствующим длительному переживанию данных бактерий в кишечном биотопе животных.

Среди культур энтерококков разных видов на фенотипическом 4.

уровне распространена резистентность к фторхинолонам и линезолиду, тогда как наибольшую чувствительность штаммы сохраняли к ванкомицину, ампициллину и аминогликозидам. Для изученных бактерий рода Enterococcus характерно наличие генетических детерминант резистентности к аминогликозидам и гликопептидам при отсутствии их экспрессии.

В популяции фекальных изолятов энтерококков выявлена 5.

широкая распространенность антагонистической активности в отношении бактерий рода Listeria и вирулентных штаммов Enterococcus faecalis, напрямую коррелирующая с наличием генов бактериоциногении. Показано, что энтерококки не утрачивают антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов после воздействия хлороводородной кислоты и жлчи.

На основании комплексной оценки фенотипических и 6.

генетических характеристик энтерококков, выделенных из кишечного биотопа здоровых животных, отобран штамм Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий выраженным антагонистическим эффектом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не имеющий факторов вирулентности.

Профилактическое назначение морским свинкам штамма 7.

Enterococcus faecium Ef79OSAU снижает летальность и микробную обсеменнность внутренних органов животных при экспериментальной листериозной инфекции.

108

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложен авирулентный штамм Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода и вида Культура депонирована в Listeria Enterococcus faecalis.

Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Габричевского» Роспотребнадзора в качестве перспективной для производства биопрепаратов (справка № 63 от 14 февраля 2014 г.).



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНУРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор с.-х. наук, профессор КАХАРОВ К.Х. Душанбе, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Жабина Виктория Юрьевна Экспериментальная и производственная оценка элективных питательных сред и дезинфектантов при туберкулезе крупного рогатого скота 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА Роль молекулярно-биологических маркеров и многофункционального белка YB-1 в лечении и прогнозе больных раком молочной железы 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант:...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (род CLETHRIONOMYS) СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Е. Докучаев Магадан – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. МАТЕРИАЛ И...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Улановская Ирина Владимировна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEMEROCALLIS HYBRIDA HORT. КОЛЛЕКЦИИ НИКИТСКОГО БОТАНИЧЕСКОГО САДА 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор З.К. Клименко Ялта – 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ 1. ИСТОРИЯ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.