WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных ...»

-- [ Страница 2 ] --

По данным C.R. Jackson et al. (2011), резистентность к линкомицину (92,3% штаммов), флавомицину (71,9% штаммов) и тетрациклину (24,5% штаммов) выявлена среди изолятов E. hirae, E. faecalis и E. faecium, выделенных от крупного рогатого скота.

Установлен высокий процент резистентности Enterococcus sp., выделенных от свиней, к макролидам и тетрациклинам (Tremblay C.L. et al., 2012).

В исследовании S. Ramos et al. (2012), ванкомицинрезистентные энтерококки были выделены из образцов фекалий свиней, крупного рогатого скота и овец, при этом изолированные от свиней штаммы проявили устойчивость к тетрациклину и эритромицину.

Широкое применение антимикробных препаратов в животноводстве привело к различным изменениям бактериальных геномов (Schwarz S., Chaslus-Dancla E., 2001) и способствовало приобретению микроорганизмами, колонизирующими желудочно-кишечный тракт животных, антибиотикорезистентности (McEwen S.A., Fedorka-Cray P.J., 2002).

Животные могут выступать в качестве резервуара для резистентных штаммов энтерококков (Van den Bogaard A.E. et al., 2002; Vignaroli C. et al., 2011).

Исследования, в которых сравниваются молекулярно-генетические характеристики антибиотикорезистентных энтерококков, выделенных от человека и животных, подтверждают возможность передачи штаммов от животных-компаньонов человеку при тесных контактах (Hammerum A.M. et al., 2000; Freitas A.R. et al., 2011).

Таким образом, изучение устойчивости к антибактериальным препаратам фекальных энтерококков животных является важным для оценки их значения как резервуара генов резистентности.

1.4 Практическое применение бактерий рода Enterococcus

Бактерии рода являются представителями группы Enterococcus молочнокислых бактерий и находят широкое применение в пищевой промышленности при приготовлении кисломолочных и ферментированных продуктов питания. Некоторые штаммы энтерококков используются в качестве пробиотиков для улучшения здоровья человека и животных.

Благодаря своей кислотопродукции, термотолерантности, протеолитической и эстеролитической активностям, бактерии рода Enterococcus являются важным компонентом ферментированных пищевых продуктов. Энтерококки часто применяются для производства традиционных сыров в странах Средиземноморья (Gelsomino R. et al., 2001; Sarantinopoulos Р. et al., 2002). Численность Enterococcus sp. в сырах колеблется в пределах от 104 до 106 КОЕ/г, доминирующими видами являются E. faecium и E. faecalis (Garcа M.C. et al., 2002; Gelsomino R. et al., 2002).

Энтерококки были выделены из некоторых сухих ферментированных колбас, таких как чоризо, из сырого мяса, ветчины, готовых к употреблению салатов (Pesavento G. et al., 2014), из ферментированных оливок (de Castro A.

et al., 2002).

Наиболее часто встречающимися видами рода Enterococcus в пищевых продуктах являются E. faecium и E. faecalis (Lopez-Diaz T.M. et al., 1995;

Suzzi G. et al., 2000). B. Martn et al. (2009) изучили видовой состав энтерококков традиционных ферментированных колбас. Подавляющее большинство культур было идентифицировано как E. faecalis (31,4%) и E. faecium (30,7%); в меньшем проценте случаев – E. sanguinicola (14,9%), E. devriesei (9,7%), E. malodoratus (7,2%); редкими изолятами являлись культуры E. casseliflavus (3,4%), E. gilvus (1,0%), E. gallinarum (1,3%), E. hermanniensis (0,2%) и E. durans (0,2%).

Несколько ранее неизвестных видов энтерококков впервые были выделены из продуктов питания. Так, например, в Тайланде виды Enterococcus camelliae и Еnterococcus thailandicus были изолированы из ферментированных чайных листьев и ферментированной колбасы, соответственно (Sukontasing S. et al., 2007; Tanasupawat S. et al., 2008). Из итальянских сыров выделены новые виды E. italicus и E. lactis, вошедшие в род Enterococcus (Fortina M.G. et al., 2004; Morandi S. et al., 2012).

Однако, несмотря на вклад энтерококков в формирование органолептических свойств пищевых продуктов, вопрос о применении данных бактерий в пищевой промышленности остается спорным в связи с их способностью вызывать инфекционно-воспалительные процессы и передавать генетические детерминанты факторов патогенности и антибиотикорезистентности другим штаммам микроорганизмов (Werner G.

et al., 2013; Gousia P. et al., 2015).

Энтерококки успешно используются в качестве пробиотиков. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН и Всемирной организации здравоохранения, пробиотики определяются как живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах, вызывают улучшение здоровья организма-хозяина.

Несмотря на то, что бактерии рода Enterococcus имеют долгую историю пробиотического использования, некоторые штаммы условнопатогенных микроорганизмов представляют собой потенциальный резервуар генов вирулентности и антибиотикорезистентности и, следовательно, не рассматриваются как безопасные для человека (GRAS), но являются важными пробиотиками для животных (Fijan S., 2014). Применение пробиотиков на основе штаммов энтерококков в ветеринарии в основном направлено на лечение и профилактику диареи, стимуляцию иммунной системы, улучшение роста животных.

Среди пробиотических штаммов энтерококков, применяемых для профилактики и лечения диареи у животных, наиболее изученным является E. faecium SF68 (NCIMB 10415).

В работе W. Vahjen et al. (2007) было показано, что присутствие пробиотического штамма E. faecium NCIMB 10415 в кишечнике поросят снижает количество бактерий E. faecalis в толстой кишке.

D. Taras et al. (2006) в своем исследовании продемонстрировали снижение смертности поросят и частоты возникновения диареи в период отъма при введении в рацион свиноматок и их потомства пробиотического штамма Enterococcus faecium NCIMB 10415.

Сопоставимые результаты были получены A. Zeyner и E. Boldt (2006), которые установили, что ежедневное пероральное введение Enterococcus faecium DSM 10663 поросятам в период от рождения до отъма уменьшает частоту развития диареи.

Положительный эффект применения пробиотического штамма Enterococcus faecium EK13 у новорожденных поросят был отмечен в работе V. Strompfov et al. (2006). Введение пробиотика в рацион поросят уменьшало количество кишечной палочки в фекалиях, а также приводило к снижению уровня холестерина и повышению концентрации молочной и пропионовой кислот в толстом кишечнике.

У крупного рогатого скота пробиотические препараты применяются с целью улучшения пищеварения, стимуляции роста и развития молодняка.

Добавление в корм лактирующим коровам препарата, содержащего штаммы E. faecium, повышает усвояемость корма, увеличивает надой молока и концентрацию глюкозы в крови, снижает количество -оксибутирата в крови (Nocek J.E., Kautz W.P., 2006).

Показано снижение риска развития метаболического ацидоза дойных коров при скармливании им Enterococcus faecium EF212 (Ghorbani G.R. et al., 2002; Emmanuel D.G. et al., 2007).

Многие исследователи отмечают благоприятное влияние пробиотических энтерококков на здоровье сельскохозяйственной птицы (Vahjen W. et al., 2002; Mountzouris K.C. et al., 2007; Samli H.E. et al., 2010).

Влияние штамма Enterococcus faecium E253 на минеральный обмен и антиоксидантный статус цыплят-бройлеров изучено М. Capcarova et al.

(2011). Отмечено повышение уровня кальция и снижение содержания триглицеридов в сыворотке крови цыплят.

Результаты исследования G.T. Cao et al. (2013) свидетельствуют о том, что добавление в рацион цыплят-бройлеров лиофилизированной культуры Enterococcus faecium стимулирует рост птицы, нормализует состав кишечной микрофлоры, способствует элиминации патогенного штамма E. coli K88 из кишечника.

Зарубежными исследователями описаны примеры применения энтерококков для домашних животных. Так, включение штамма Enterococcus faecium SF68 в состав корма для собак значительно стимулировало иммунный ответ щенков после вакцинации против чумы (Benyacoub J. et al., 2003).

W. Vahjen и K. Mnner (2003) исследовали влияние пробиотического штамма E. faecium NCIМB 10415 на фекальную микрофлору здоровых собак.

Было показано, что 18-дневное применение пробиотика снижало количество бактерий Clostridium sp. в фекалиях, в то время как обсеменнность Salmonella sp. и Campylobacter sp. значительно возрастала.

Изучение влияния культуры Enterococcus faecium SF68 на иммунную систему организма котят выявило увеличение процентного содержания CD4+ лимфоцитов в период вакцинации (Veir J.K. et al., 2007).

Несмотря на вышеизложенное, использование энтерококков в качестве стартерных культур или пробиотиков вызывает вопрос об их безопасности, поскольку, с одной стороны, в литературе достаточно полно описан положительный пробиотический эффект отдельных штаммов, а с другой стороны, энтерококки, являясь условно-патогенными микроорганизмами, служат этиологическими агентами инфекционно-воспалительных заболеваний человека и животных и могут содержать в своем геноме гены вирулентности и антибиотикорезистентности. В связи с этим, биологические свойства штаммов энтерококков должны быть тщательно изучены перед практическим применением, а также проанализировано соотношение риск/польза для здоровья организма.

Таким образом, изучение биологических свойств фекальных энтерококков, выделенных от животных, является актуальным не только с точки зрения расширения представления о биологической роли этих микроорганизмов в экосистеме, но и с точки зрения их возможного практического применения. Сведения о биологических свойствах фекальных энтерококков, выделенных от животных на территории Российской Федерации, крайне немногочисленны и противоречивы, что и предопределило цель настоящего исследования, задачи которого изложены во введении.

37

–  –  –

Работа проводилась в период с 2012 по 2015 гг. на базе лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней и вивария ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет», в лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, а также в условиях учебного хозяйства Покровского сельскохозяйственного колледжа

– филиала ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»; СПК колхоз «Россия» Оренбургского района Оренбургской области; СПК колхоз «Урал» Оренбургского района Оренбургской области.

Выделение бактерий рода Enterococcus и изучение их биологических свойств осуществляли по представленной схеме (в соответствии с рисунком 2.1.1).

2.1.1 Выделение и идентификация бактерий рода Enterococcus

В работе были изучены 162 штамма бактерий рода Enterococcus, выделенные из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных, в том числе 54 – из фекалий крупного рогатого скота; 21 штамм – из фекалий коз; 51 – из фекалий свиней и 36 культур – из фекалий лошадей.

Отбор фекалий производился в стерильные одноразовые герметичные контейнеры с дальнейшей транспортировкой в условия лаборатории.

Микроорганизмы выделяли с использованием классических бактериологических методик.

Один грамм нативных фекалий без консерванта растирали в стерильной ступке с 9 мл стерильного 0,85%-ного раствора NaCl (10-1 разведение). Из основного разведения делали дополнительные 10-кратные разведения в стерильном изотоническом растворе NaCl. Из разведений 10-3 и 10-5 вносили по 0,1 мл суспензии на поверхность дифференциальнодиагностических сред и растирали шпателем Дригальского.

Выделение бактерий рода Enterococcus из фекалий сельскохозяйственных животных Идентификация выделенных фекальных культур энтерококков

–  –  –

В качестве дифференциально-диагностических сред использовали Enterococcosel-Agar (CONDA, Испания), жлчно-эскулиновый агар с азидом натрия (HiMedia, Индия), молочно-ингибиторную среду (Калина Г.П., 1972).

Инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 ч. При обнаружении характерного для энтерококков роста (образование на Enterococcosel-Agar и жлчно-эскулиновом агаре с азидом натрия коричнево-чрного преципитата вокруг колоний, рост чрных мелких колоний на молочно-ингибиторной среде) часть изученной колонии брали для приготовления мазка, окрашивали по Граму и микроскопировали. Если при микроскопии подтверждалась однородность колонии, то оставшуюся часть отсевали на агар Шедлера (HiMedia, Индия) для получения чистой культуры.

Видовую идентификацию штаммов энтерококков и определение наличия генетических детерминант факторов вирулентности, антибиотикорезистентности и бактериоциногении проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Бактериальные лизаты для постановки ПЦР получали с помощью реагента «ДНК-Экспресс» (Литех, Россия). Для этого суточную агаровую культуру энтерококков петлй вносили в пробирку с реагентом, перемешивали на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 10 с, помещали пробирку в твердотельный термостат и инкубировали при температуре 98 °С в течение 20 минут. После завершения инкубации пробирки центрифугировали при 12000 об/мин при комнатной температуре в течение 15 с. Надосадок помещали в чистые пробирки. Полученный супернатант использовали в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

ПЦР проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия).

Реакционная смесь включала 1 мкл бактериального лизата, по 0,5-1 мкл специфических праймеров, 0,8 мкл дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (10 mM, Thermo Scientific, США), 2,5 мкл 10хПЦР-буфера (Хеликон, Россия), 1,5 мкл хлорида магния (25 mM, Fermentas, Литва), 0,2-1 мкл фермента Taqполимеразы (5 ед/мкл, Хеликон, Россия). Реакционную смесь доводили до 25 мкл водой без нуклеаз (Fermentas, Литва). Синтез всех использованных в работе праймеров осуществлн компанией «СИНТОЛ» (Россия).

Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном агарозном геле (1-2%), окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров применяли GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва).

Плотность агарозного геля и маркеры молекулярного веса подбирали в зависимости от молекулярной массы продуктов амплификации. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определнной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс (в соответствии с рисунком 2.1.1.1). Для документирования полученных результатов гелевые пластины фотографировали.

Примечание: дорожки М маркер молекулярного веса (GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва)); дорожка К- – отрицательный контроль;

штамм 69,70,80,84,85 – специфический продукт реакции (360 bp); штамм 79

– специфический продукт реакции (215 bp).

Рисунок 2.1.

1.1 – Электрофореграмма продуктов амплификации генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы

–  –  –

Для обнаружения генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, в смесь для ПЦР добавляли 1 мкл каждого праймера соответствующей группы, 0,5 мкл фермента Taq-полимеразы, осуществляли амплификацию фрагмента ДНК по протоколу: 1 цикл – 92 °C, 4 минуты; 30 циклов – 92 °C в течение 30 с, 1 минута при 55 °C (для групп 1, 2, 5 и 6) или 60 °C (для групп 3, 4 и 7), 1 минута при 72 °C; 1 цикл элонгации при 72 °C в течение 7 минут.

43 2.1.2 Методы изучения биологических свойств бактерий рода Enterococcus 2.1.2.1 Определение факторов патогенности бактерий рода Enterococcus Факторы патогенности фекальных изолятов энтерококков выявляли микробиологическими методами.

Желатиназную активность определяли посевом суточной агаровой культуры микроорганизмов уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Инкубировали в течение 24 часов при температуре 37 °С. Учт результатов проводили после охлаждения пробирок с ростом микроорганизмов при температуре 4 °С в течение 2 часов и по «текучести» желатины делали заключение о наличии фермента (Биргер М.О., 1982).

Для выявления гемолитической активности осуществляли посев суточных культур энтерококков пятачками на 5%-й кровяной агар и после инкубации при 37 °С в течение 24 часов определяли наличие зоны гемолиза вокруг выросших штаммов (Биргер М.О., 1982).

Активность протеаз культур Enterococcus sp. определяли по убыли альбумина после инкубации с исследуемыми штаммами биуретовым методом по А.И. Нетрусову с соавт. (2005).

К 0,5 мл взвеси микроорганизмов добавляли 1 мл 1%-ного раствора альбумина в К-фосфатном буфере (рН=7,5), перемешивали и инкубировали 30 минут при 37 °С. Реакцию останавливали на льду. Затем осаждали клетки центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. 1 мл супернатанта смешивали с 2 мл биуретового реактива. После 10 минут экспозиции при комнатной температуре, для созревания окраски, измеряли оптическую плотность полученного раствора на фотометре STAT FAX 2100 (длина волны 492 нм) против биуретового реактива. Контроли получали смешиванием 0,5 мл супернатанта с 1 мл изотонического раствора NaCl (контроль 1) и 1 мл

–  –  –

Для обнаружения генов hyl, asa, esp проводили мультиплексную ПЦР, в реакционную смесь добавляли по 0,5 мкл праймеров, 0,3 мкл фермента Taqполимеразы. Выявление остальных генетических детерминант факторов вирулентности осуществляли при помощи специфической ПЦР, в смесь для реакции вносили по 1 мкл праймеров, 0,2 мкл фермента Taq-полимеразы.

Протокол амплификации генов, кодирующих факторы вирулентности, содержал: 1 цикл – 92 °С, 3 мин; 5 циклов – 92 °С, 5 с, 59 °С, 5 с, 72 °С, 5 с;

25 циклов – 1 мин при 92 °С, 1 мин при 59 °С, 1 мин при 72 °С; последний цикл включал 20 с при 92 °С, 1 мин – 59 °С и элонгацию в течение 10 мин при 72 °С.

2.1.2.2 Определение факторов персистенции бактерий рода Enterococcus

Антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методике О.В. Бухарина с соавт. (1997) фотометрическим методом. Для этого бактериальную массу исследуемых культур стандартной бактериологической петлй засевали в 3 мл жидкой питательной среды – бульон Шедлера (HiMedia, Индия) и культивировали в термостате при температуре 37 °C в течение 24 ч. На спектрофотометре STAT FAX 2100 (длина волны 492 нм) измеряли оптическую плотность бульонной культуры против бульона Шедлера. Супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Для определения АЛА в качестве тест-штамма использовали суточную агаровую культуру Micrococcus luteus АТТС 15307. Выросшие бактериальные клетки тестштамма убивали хлороформом в течение 60 минут, смывали, фильтровали через крупнопористый фильтр, дважды отмывали 1/15 М фосфатным буфером с трилоном Б и один раз 1/15 М фосфатным буфером (рН=6,2), после чего оптическую плотность суспензии микрококка доводили до 0,300.

На 1/15 М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. Супернатант исследуемых культур микроорганизмов, объмом 0,9 мл, смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 минут при температуре 37 °C. 0,5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавляли к 2 мл суспензии тест-штамма микрококка и измеряли оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре STAT FAX 2100 (длина волны 492 нм) против 1/15 М фосфатного буфера. В качестве контроля использовали смесь бульона Шедлера с лизоцимом в соотношении 9:1. По степени лизиса суспензии тесткультуры рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры по формуле (2):

D о V1С 1 D, (2) А k

–  –  –

где А – антилизоцимная активность, мкг инактивированного лизоцима / мл супернатанта ед. ОП;

V1 – объм раствора лизоцима исходной концентрации, мл;

V2 – объм супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма, мл;

С – исходная концентрация лизоцима, мкг/мл;

Y – оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед.

ОП;

Dо – изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с, ед. ОП;

Dk – изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с, ед. ОП.

Антикарнозиновую активность (АКрА) микроорганизмов определяли по методу О.В. Бухарина с соавт. (1999). К 0,1 мл одномиллиардной взвеси бактерий добавляли 1,7 мл бульона Шедлера и 0,2 мл раствора карнозина.

Разведение карнозина в изотоническом растворе NaCl готовили таким образом, чтобы его конечная концентрация в бульоне Шедлера с тестштаммом составляла 3 мг/мл. Параллельно с опытной пробой готовили 3 контрольные пробы. В первую вместо карнозина добавляли 0,2 мл изотонического раствора NaCl. Во второй заменили микробную взвесь 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия, а третья контрольная проба содержала 0,3 мл 0,85%-ного раствора NaCl и 1,7 мл бульона Шедлера.

После суточной инкубации при температуре 37 °С во все пробы добавляли по 0,1 мл хлороформа и выдерживали интервал времени в минут, затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут. На следующем этапе к отделнному из проб супернатанту (по 0,6 мл) добавляли 1,1 мл бульона Шедлера и 0,1 мл взвеси суточной тест-культуры M. luteus, приготовленную из 16-18-часовой агаровой культуры в изотоническом растворе хлорида натрия по стандарту мутности и разведнную десятикратно для использования. Через 24 часа замеряли оптическую плотность контрольных и опытных взвесей на спектрофотометре STAT FAX 2 (длина волны 492 нм) и рассчитывали значение АКрА исследуемой культуры по формуле (3):

D k1 D о Lс С С, (3) D D k3 k2 где Lс – антикарнозиновая активность, мг/мл;

С – исходная концентрация карнозина, мг/мл;

ODo – оптическая плотность взвеси в опыте, ед. ОП;

ODk1 – оптическая плотность взвеси в контроле 1, ед. ОП;

ODk2 – оптическая плотность взвеси в контроле 2, ед. ОП;

ODk3 – оптическая плотность взвеси в контроле 3, ед. ОП.

За высокий уровень АКрА принимали значения признака более 2 мг/мл; за средний – от 1 до 2 мг/мл, за низкий – менее 1 мг/мл.

Способность микроорганизмов образовывать биоплнки определяли фотометрически по методике G. O'Toole et al. (2000).

Биомассу исследуемых культур стандартной бактериологической петлй засевали в 4 мл бульона Шедлера и культивировали в термостате при температуре 37 °C в течение 18-24 ч. Затем готовили разведения стерильным бульоном 1:100 и разносили по лункам микропланшета. После инкубации, спустя 24 ч, планктонные бактерии удаляли из каждой лунки и промывали лунки дистиллированной водой. Затем вносили по 125 мкл 0,1%-ного раствора кристаллического фиолетового, окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее раствор удаляли и промывали лунки дистиллированной водой. Планшет высушивали на воздухе и в каждую лунку вносили по 200 мкл 95%-ного этилового спирта, инкубировали в течение 10-15 минут при комнатной температуре, а затем по 125 мкл полученной спиртовой вытяжки переносили в чистый 96-луночный полипропиленовый планшет и замеряли оптическую плотность (А) на спектрофотометре STAT FAX 2100 (длина волны 492 нм). Коэффициент биоплнкообразования (КБ) рассчитывали по формуле (4):

А492 опыт КБ, (4) А492 контроль

–  –  –

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) определяли диско-диффузионным методом (МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). Для этого использовали взвесь суточной культуры энтерококков, соответствующую по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащую примерно 1,5х108 КОЕ/мл. Стандартный инокулюм наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой – агаром Мюллера-Хинтона (HiMedia, Индия) в объеме 1 мл, равномерно распределяли по поверхности покачиванием, после чего удаляли избыток инокулюма пипеткой. После инокуляции на поверхность питательной среды наносили диски с АБП с помощью стерильного пинцета.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Учт результатов проводили после инкубации, измеряя диаметр зон задержки роста тестируемого микроорганизма с помощью штангенциркуля. Интерпретация осуществлялась на основании сопоставления результатов исследования (диаметра зоны ингибирования роста) с пограничными значениями этих параметров, отделяющих чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные от устойчивых (таблица 3).

–  –  –

При помощи ПЦР-анализа у фекальных изолятов энтерококков определяли гены, кодирующие резистентность к аминогликозидам (Vakulenko S. et al., 2003), тетрациклинам (De Leener E. et al., 2004) и гликопептидам (Dutka-Malen S. et al., 1995): высокий уровень резистентности к гентамицину – aac(6)-Ie-aph(2")-Ia, резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина) – aph(3)-IIIa, ant(4)-Ia; резистентность к тетрациклину

– tetL, резистентность к тетрациклину и миноциклину – tetM; резистентность к ванкомицину и тейкопланину – vanA, резистентность к различным концентрациям ванкомицина – резистентность к низким vanB, концентрациям ванкомицина – vanC-1, vanC-2/3. Праймеры, использованные для ПЦР, приведены в таблице 4.

–  –  –

тетрациклинам, осуществляли специфическую ПЦР по протоколу: 1 цикл – 92 °C, 4 минуты; 30 циклов – 92 °C в течение 30 с, 1 минута при 55 °C (для гена tetM) или 53 °C (для гена tetL), 1 минута при 72 °C; 1 цикл элонгации при 72 °C в течение 7 минут. Протокол мультиплексной ПЦР для выявления генов резистентности к гликопептидам включал 1 цикл – 92 °C, 4 минуты;

30 циклов – 92 °C в течение 30 с, 1 минута при 55 °C, 1 минута при 72 °C;

1 цикл элонгации при 72 °C в течение 7 минут (группы 3, 4). В реакционную смесь добавляли по 1 мкл праймеров, 0,3 мкл фермента Taq-полимеразы.

2.1.2.4 Определение антагонистической активности бактерий рода Enterococcus Наличие антагонистической активности у фекальных изолятов энтерококков определяли чашечным методом по принципу отсроченного антагонизма (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966).

Исследуемые культуры энтерококков засевали уколом в питательный агар Шедлера. После инкубации при температуре 37 °С в течение 24 часов выросшие культуры инактивировали парами хлороформа в течение одного часа. Затем чашку с убитыми культурами просушивали 30 минут на воздухе.

На поверхность агара наслаивали второй тонкий слой (4-5 мл) расплавленного и остуженного до 50 °С 0,7%-ного агара Шедлера (для листерий и энтерококков), 0,7%-ного мясо-пептонного агара (для стафилококков и энтеробактерий), 0,7%-ного агара Сабуро (для грибов рода Candida), смешанного с 0,1 мл тестируемой культуры (мутность 2 по шкале МакФарланда). В качестве тест-культур использовали патогенные и условнопатогенные бактерии: Listeria monocytogenes (n=8), L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, Staphylococcus aureus (n=5), Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis (n=5), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniaе, K. oxitoca, Enterobacter cloacae, Moraxella morganii и грибы рода Candida (n=5). Через

–  –  –

где К – коэффициент антагонистической активности;

d1 – диаметр зоны задержки роста чувствительной культуры, мм;

d2 – диаметр зоны роста штамма-продуцента, мм.

При помощи гнездовой ПЦР у энтерококков определяли гены, кодирующие синтез известных энтероцинов: энтероцин А – entA, энтероцин B – entB, энтероцин P – entP, энтероцин AS-48 – entAS-48, энтероцин L50A – entL50A, энтероцин L50В – entL50B, бактериоцин 31 – bac31, цитолизины – cylLs, cylLl (Foulqui Moreno M.R. et al., 2003). Для ПЦР-амплификации применяли известные праймеры (таблица 5).

–  –  –

В смесь для ПЦР вносили 0,5 мкл соответствующих праймеров, 1 мкл фермента Taq-полимеразы. ПЦР для выявления генов, кодирующих синтез бактериоцинов, проводили по протоколу: для генов entA, bac31 и Cyl 1 цикл – 95 °С, 5 мин; 30 циклов – 95 °С, 30 с, 58 °С, 30 с, 72 °С, 30 с; 1цикл – 72 °С, 5 мин. Для генов entB, entP, entAS-48, entL50A и entL50B температура отжига праймеров составляла 56 °С. Полученные в результате первой амплификации ПЦР-продукты генов entA и entB использовались в качестве матрицы (по 0,2 мкл) для проведения второй ПЦР с применением «вложенных» праймеров по протоколам для соответствующих генов.

Влияние факторов макроорганизма на антагонистическую активность культур энтерококков в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивали после соинкубирования штаммов Enterococcus sp. с хлороводородной кислотой и жлчью. Для этого в пробирки с бульоном Шедлера (HiMedia, Индия) добавляли концентрированную хлороводородную кислоту для получения концентрации 55 0,3% и 0,5%; концентрацию жлчи в пробирках доводили до 1% и 5%.

Суточную культуру исследуемого штамма энтерококков добавляли по 0,5 мл в каждую пробирку. Через 1 час инкубации при 37 °С определяли антагонистическую активность штаммов энтерококков в отношении тесткультур чашечным методом, описанным ранее.

2.1.3 Метод воспроизведения листериозной экспериментальной инфекции

Изучение антагонистической активности энтерококков in vivo проводили на модели экспериментальной листериозной инфекции. В качестве штамма-антагониста была выбрана культура Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающая выраженным антагонистическим эффектом в отношении бактерий рода Listeria и не имеющая факторов патогенности на фено- и генотипическом уровне.

Предварительно при помощи конъюнктивальной пробы на морских свинках была проверена вирулентность трх штаммов листерий:

L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes P14, L. monocytogenes VIMHA 004.

Для этого на конъюнктиву глаза морской свинки наносили 2 капли суточной испытуемой бульонной культуры с последующим легким массажем век ватным тампоном. Вирулентный штамм L. monocytogenes VIMHA 004 на третий день вызывал у морской свинки гнойный кератоконъюнктивит (в соответствии с рисунком 2.1.3.1).

Для воспроизведения экспериментальной листериозной инфекции использовали беспородных морских свинок обоих полов массой 200-250 г.

Все эксперименты с животными выполнены в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF), и декларацией о гуманном отношении к животным.

А Б Рисунок 2.1.

3.1 – Клиническая картина экспериментального листериоза у морских свинок: А – здоровая свинка, Б – гнойный кератоконъюнктивит у морской свинки, зараженной штаммом L. monocytogenes VIMHA 004 Для оценки антагонистической активности Enterococcus faecium Ef79OSAU in vivo животные были разделены на две равные группы: опытную (n=9) и контрольную (n=9).

Животным опытной группы в течение семи дней до заражения задавали один раз в сутки per os по 1 мл взвеси суточной культуры Enterococcus faecium Ef79OSAU в изотоническом растворе NaCl, содержащей 1·109 микробных клеток.

Для заражения животных обеих групп использовали экспоненциальную культуру Listeria monocytogenes VIMHA 004, отмытую фосфатным буфером и замороженную при -70 °С в 10%-ном глицерине. Концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) в замороженной культуре определяли предварительно по высевам последовательных разведений. Заражение осуществляли введением per os штамма в дозе 1·1010 бактерий на морскую свинку.

Инфицированные листериями морские свинки получали только культуру энтерококков по схеме опыта без применения другой терапии.

57 Наблюдение за животными проводили в течение всего времени эксперимента. Ежедневной регистрации подлежали внешний вид животных, поведенческие реакции, гибель животных. Эффективность антагонистической активности оценивали по изменению степени обсеменнности листериями внутренних органов морских свинок (печени, селезнки, тонкого кишечника и его содержимого).

Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 24 ч, трое и пять суток инфекции. Для оценки обсеменнности органов L. monocytogenes в асептических условиях морских свинок вскрывали и стерильно отбирали внутренние органы: печень с жлчным пузырм и селезнку целиком, участок тонкого кишечника вместе с его содержимым длиной 20 мм.

Для бактериологического исследования образцы органов взвешивали на весах и гомогенизировали в стерильных фарфоровых ступках со стерильным PBS-буфером (Хеликон, Россия) в соотношении 1:2. Суспензию органов вносили в количестве 1 мл на чашки с агаром для идентификации листерий (PALCAM) (HiMedia, Индия), растирали шпателем Дригальского и инкубировали при 30 °С в течение 48 ч.

При обнаружении характерного для листерий роста (мелкие сероватозелные или оливково-зелные колонии с чрным ореолом диаметром от 1 до 1,5 мм) проводили микроскопию колоний, подсчитывали число выросших колоний, рассчитывали содержание листерий в 1 г органа.

2.1.4 Статистическая обработка результатов

Полученные в ходе исследований численные материалы были обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратичного отклонения и средней ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента.

Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Лакин Г.Ф., 1990).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью автоматизированных программ «Биостатистика» и Microsoft Office Excel 2007.

59

2.2 Видовой состав фекальных изолятов энтерококков С использованием метода полимеразной цепной реакции были идентифицированы культуры энтерококков, выделенные из фекалий сельскохозяйственных животных. Так, 45 выделенных штаммов (27,8%) были отнесены к виду Enterococcus faecium, 39 культур (24,1%) – к виду Enterococcus hirae, 36 изолятов (22,2%) – к виду Enterococcus durans, 21 штамм (12,9%) – к виду Enterococcus faecalis, 15 штаммов (9,3%) – к виду Enterococcus flavescens, 6 культур (3,7%) – к виду Enterococcus casseliflavus (в соответствии с рисунком 2.2.1).

–  –  –

Рисунок 2.2.

1 – Видовой состав фекальных изолятов энтерококков Видовой состав энтерококков, выделенных из фекалий свиней, характеризовался большим разнообразием (в соответствии с рисунком 2.2.2).

В 53,0% случаев выделялись штаммы E. faecium, в 35,4% случаев – штаммы E. hirae. По три культуры энтерококков было идентифицировано как E. durans (5,8%) и E. casseliflavus (5,8%). Энтерококки микрофлоры фекалий лошадей были представлены видами E. faecium (50,0%), E. hirae (25,0%), E. flavescens (16,7%) и E. casseliflavus (8,3%). Среди культур, изолированных из фекалий крупного рогатого скота, большинство штаммов относились к видам E. durans (61,1%) и E. faecalis (33,4%). В трх случаях был выделен штамм E. flavescens (5,5%). Изоляты энтерококков из фекалий коз в 71,4% случаев принадлежали к виду E. hirae, по три изолята (14,3%) – к видам Е. flavescens и E. faecalis.

%

–  –  –

Таким образом, проведнные исследования выявили различия видового состава Enterococcus sp. у продуктивных животных: энтерококки фекальной микрофлоры моногастричных животных характеризовались большим видовым разнообразием, нежели у жвачных.

61

–  –  –

Являясь условно-патогенными микроорганизмами, энтерококки могут обладать различными факторами патогенности. Наличие у Enterococcus sp.

генов, кодирующих синтез факторов вирулентности, обуславливает их способность вызывать инфекционный процесс.

В результате проведнных исследований нами было установлено, что на фенотипическом уровне Enterococcus sp. не обладали гемолитической и желатиназной активностями.

При количественном определении протеолитической активности выявлено, что все изученные виды энтерококков обладали данным свойством. Наименьший уровень протеолитической активности выявлен у штаммов E. faecium – 0,45±0,042 мг·мл/мин, тогда как культуры E. cаsseliflavus характеризовались максимальной активностью протеаз – 0,77±0,072 мг·мл/мин (р0,01) (в соответствии с рисунком 2.3.1). У изолятов E. hirae, E. durans и E. faecalis величина изучаемого признака варьировала от 0,50±0,046 мг·мл/мин, 0,52±0,057 мг·мл/мин и до 0,56±0,100 мг·мл/мин, соответственно. Выраженность протеолитической активности у штаммов E. flavescens составляла 0,49±0,103 мг·мл/мин.

Несмотря на то, что способность микроорганизмов синтезировать протеазы рассматривается в большинстве случаев как фактор их патогенности (Ramu P. et al., 2007; Terao Y. et al., 2008), продукция протеолитических ферментов также является важной особенностью авирулентных молочнокислых бактерий, в том числе энтерококков, поскольку с их помощью происходит активное использование микроорганизмами органических субстратов, обеспечивается потребность в важных ростовых факторах – аминокислотах (El-Ghaish S., 2010).

–  –  –

* ** 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Примечание: * – достоверность различий выраженности протеолитической активности штаммов E. hirae и E. casseliflavus – (р0,05); ** – достоверность различий выраженности протеолитической активности штаммов E. faecium и E. casseliflavus – (p0,01).

Рисунок 2.3.

1 – Выраженность протеолитической активности Enterococcus sp.

Молекулярно-генетический анализ не выявил в популяции фекальных изолятов энтерококков генетических детерминант известных факторов вирулентности: cylA, cylB, cylM – цитолизинов, gelE – желатиназы, sprE – сериновой протеазы, hyl – гиалуронидазы, asa – поверхностных белков, участвующих в адгезии.

63 Таким образом, проведнные исследования не выявили у изученных культур Enterococcus sp. факторов вирулентности на фено- и генотипическом уровне.

–  –  –

Длительному переживанию энтерококков в организме хозяина способствуют факторы персистенции, направленные на инактивацию механизмов резистентности макроорганизма (Бухарин О.В., 1999). Одним из механизмов, направленных на выживание микроорганизмов в условиях макроорганизма путем преодоления механизмов неспецифической защиты хозяина, является антилизоцимная активность.

Способность деградировать лизоцим присуща многим видам микроорганизмов. Благодаря данному свойству микрофлора приобретает способность к заселению различных экониш и длительному переживанию (персистированию) в организме хозяина.

Изучение антилизоцимной активности Enterococcus sp. показало, что данный признак встречался у 100% изолятов. Уровень выраженности антилизоцимного признака характеризовался межвидовой вариабельностью (в соответствии с рисунком 2.4.1).

Средние значения АЛА штаммов E. hirae составили 1,61±0,016 мкг/мл·ед. ОП, культур E. durans – 1,59±0,024 мкг/мл·ед. ОП, изолятов E. faecium – 1,58±0,014 мкг/мл·ед. ОП. По сравнению с культурами видов E. hirae, E. durans и E. faecium достоверно меньшим уровнем АЛА обладали штаммы E. faecalis (1,15±0,217 мкг/мл·ед. ОП) (р0,001) и E. casseliflavus (1,28±0,088 мкг/мл·ед. ОП) (р0,01). Экспрессия антилизоцимной активности штаммов E. flavescens составила в среднем 1,45±0,153 мкг/мл·ед. ОП.

–  –  –

1 0,8 0,6 0,4 0,2 Примечание: ** – достоверность различий уровня антилизоцимной активности культур E. casseliflavus по сравнению с культурами видов E. hirae, E. durans, E. faecium – (p0,01); *** – достоверность различий уровня антилизоцимной активности культур E. faecalis по сравнению с культурами видов E. hirae, E. durans, E. faecium – (p0,001).

Рисунок 2.4.1 – Выраженность антилизоцимной активности Enterococcus sp.

Одним из естественных факторов защиты макроорганизма является природный дипептид карнозин. Способность бактерий к его инактивации, определяющаяся как антикарнозиновая активность (АКрА), – это важный механизм персистенции, особенно для микроорганизмов, колонизирующих слизистые оболочки.

Изучение распространнности антикарнозиновой активности среди энтерококков, выделенных из фекалий продуктивных животных, показало, что 100% изолятов обладали данным свойством (в соответствии с рисунком 2.4.2). АКрА высокого уровня была выявлена у 58,8±6,89% кишечных изолятов, среднего уровня – у 23,5±5,93% культур, низкого уровня – у 17,7±5,34% штаммов.

Среднее значение АКрА фекальных штаммов E. faecium (1,63±0,197 мг/мл) было в 1,5 раза меньше такового у штаммов E. durans (2,37±0,224 мг/мл) и E. faecalis (2,52±0,292 мг/мл) (р0,05). Экспрессия признака у культур Е. hirae составила 1,93±0,248 мг/мл, у изолятов Е. flavescens – 1,84±0,447 мг/мл. Минимальное значение активности было зарегистрировано у культур Е. casseliflavus (1,51±0,595 мг/мл).

3 2,5

–  –  –

1,5 1 0,5 Примечание: * – достоверность различий уровня антикарнозиновой активности культур E. faecium по сравнению с культурами видов E. durans и E. faecalis – (p0,05).

–  –  –

Исследование выраженности АКрА бактерий, учитывающее видовую принадлежность организма-хозяина, выявило достоверно высокий уровень АКрА энтерококков, выделенных из кишечника крупного рогатого скота, по сравнению со штаммами, изолированными из фекалий свиней и лошадей (р0,05). Так, АКрА у культур, выделенных из фекалий крупного рогатого скота, составляла 2,47±0,173 мг/мл, у изолятов из фекалий коз – 2,01±0,365 мг/мл, у изолятов из фекалий лошадей и свиней – 1,72±0,277 и 1,69±0,197 мг/мл, соответственно.

К важнейшим свойствам кишечных энтерококков, позволяющим им закрепиться в естественном экотопе, относится способность образовывать биоплнки, представляющие собой скопления микроорганизмов, включенных в общий полисахаридный матрикс и ассоциированных с биологической или небиологической поверхностью (Vu B. et al., 2009).

При определении способности энтерококков образовывать биоплнки установлено, что 20,3±3,16% штаммов формировали плнки на абиотической поверхности. Культуры E. faecium обладали данной способностью в достоверно большем проценте случаев – 40,0±7,30%, чем штаммы E. hirae и E. durans (15,3±5,76 и 16,6±6,20%, соответственно) (р0,05). Количество биоплнкоформирующих штаммов E. flavescens составило 20,0±10,32%.

Коэффициент биоплнкообразования (КБ) изолятов энтерококков варьировал от 1,2 до 1,4. Для штаммов E. faecium средний КБ составил 1,3±0,05, а для культур non-faecium видов – 1,2±0,01 (р0,05).

Наибольший процент штаммов, формирующих биоплнки, был выделен от лошадей (33,3±7,85%) и коз (28,5±9,85%). Культуры, изолированные от крупного рогатого скота, обладали данным свойством в 11,1±4,27% случаев, от свиней – в 17,6±5,33% случаев.

Известно, что поверхностный белок энтерококков, кодируемый геном esp, участвует в образовании биоплнок на абиотических поверхностях 67 (Whitman R.L. et al., 2007), однако ни у одного из изученных штаммов данный ген не обнаружен.

Таким образом, полученные результаты позволили выявить ранее неизвестное свойство фекальных энтерококков – их антикарнозиновую активность. Кроме АКрА у бактерий рода Enterococcus определялся ещ один секретируемый фактор персистенции – способность к инактивации лизоцима и способность образовывать биоплнки.

2.5 Характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов энтерококков В настоящее время бесконтрольное применение антибиотиков в медицине и ветеринарии сопровождается быстрым темпом формирования устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП).

Обладая высокой скоростью размножения, резистентные штаммы бактерий могут стать доминирующими представителями микробной популяции кишечного биотопа животных, поскольку имеют преимущество перед чувствительными штаммами. Кишечник животных может служить источником резистентных культур энтерококков, способных передаваться людям при непосредственном контакте с животными, через продукты питания и объекты внешней среды (Trivedi K. et al., 2011).

2.5.1 Фенотипическая характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов энтерококков По данным определения чувствительности энтерококков к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом установлено, что среди культур Enterococcus faecium выраженной резистентностью к энрофлоксацину характеризовались 80,0±5,96% штаммов, к ципрофлоксацину – 60,0±7,30% изолятов, к норфлоксацину – 40,0±7,30% культур (в соответствии с рисунком 2.

5.1.1). В одинаковом проценте случаев штаммы сохраняли чувствительность к ципрофлоксацину и норфлоксацину (13,3±5,06%). Более половины выделенных культур E. faecium обладали умеренной резистентностью к линезолиду (53,3±7,43%) и цефтриаксону (66,7±7,03%). У 20,0±5,96% изолятов E. faecium обнаружена резистентность к линезолиду, у 26,7±6,59% – к цефтриаксону. К ампициллину, ванкомицину и тетрациклину культуры E. faecium были чувствительны в 73,3±6,59, 80,0±5,96 и 86,4±5,06% случаев, соответственно. Резистентность к ампициллину определена у 26,7±6,59% изолятов. Ванкомицинрезистентные штаммы E. faecium не были выявлены. Уровень чувствительности фекальных штаммов E. faecium к аминогликозидам варьировал в пределах от 93,4±3,70% (к стрептомицину) до 100,0% (к гентамицину).

% Чувствительный Умеренно-резистентный Резистентный Рисунок 2.5.

1.1 – Чувствительность фекальных изолятов E. faecium к антибактериальным препаратам Наибольший процент резистентных штаммов Enterococcus hirae выявлен к линезолиду (92,3±4,26%) (в соответствии с рисунком 2.5.1.2).

%

–  –  –

Распространнность резистентности к норфлоксацину, ципрофлоксацину и энрофлоксацину среди культур E. hirae составила 23,0±6,73, 38,5±7,79 и 46,2±7,98%, соответственно. В отношении норфлоксацина изоляты E. hirae сохраняли чувствительность в 38,5±7,79% случаев, в отношении энрофлоксацина – в 7,6±4,26% случаев. Штаммы E. hirae, резистентные к цефтриаксону, обнаружены в 30,8±7,39% случаев, 69,2±7,39% штаммов проявляли умеренную резистентность к данному АБП.

К тетрациклину были чувствительны 61,5±7,79% культур E. hirae, резистентны – 15,5±5,79%. Одинаковый процент чувствительных изолятов E. hirae отмечен к ванкомицину и ампициллину – 92,3±4,26%. В 7,7±4,26% случаев штаммы проявляли умеренную резистентность к ванкомицину и резистентность к ампициллину. Аминогликозиды обладали 100% антимикробной активностью в отношении исследуемых культур E. hirae.

Спектр чувствительности к антибактериальным препаратам культур Enterococcus durans характеризовался следующими особенностями: в 100% случаев штаммы обладали чувствительностью к ванкомицину и ампициллину, в 83,3±6,21% случаев – к аминогликозидам (стрептомицин, гентамицин) (в соответствии с рисунком 2.5.1.3).

% Чувствительный Умеренно-резистентный Резистентный Рисунок 2.5.

1.3 – Чувствительность фекальных изолятов E. durans к антибактериальным препаратам Умеренной резистентностью к аминогликозидам изоляты E. durans характеризовались в 16,7±6,21% случаев. У 50,0±8,33% культур E. durans зарегистрирована резистентность к энрофлоксацину и цефтриаксону, у 25,0±7,21% штаммов – к ципрофлоксацину и тетрациклину. Умеренную резистентность к фторхинолонам и линезолиду проявляли 33,3±7,86% культур. Процент линезолидрезистентных изолятов E. durans составил 58,4±8,21%. В 8,3±4,59% случаев отмечена резистентность штаммов E. durans к норфлоксацину. Чувствительность культур E. durans в отношении тетрациклина выявлена в 66,7±7,86% случаев, в отношении цефтриаксона – в 33,3±7,86%.

Среди штаммов Enterococcus faecalis все исследуемые культуры были чувствительны к ампициллину, тетрациклину, стрептомицину и гентамицину (в соответствии с рисунком 2.5.1.4).

%

–  –  –

Доля ванкомицинчувствительных изолятов E. faecalis составила 71,4±9,86%, тогда как ванкомицинрезистентные штаммы не были обнаружены. Высокий процент резистентных штаммов E. faecalis отмечен к фторхинолонам: к норфлоксацину нечувствительны оказались 57,1±10,80% изолятов, к ципрофлоксацину – 71,4±9,86% культур, к энрофлоксацину – 85,7±7,63% штаммов. Среди фторхинолонов антимикробную активность в отношении 28,6±9,86% культур проявлял норфлоксацин.

E. faecalis Чувствительность фекальных энтерококков к линезолиду и цефтриаксону отмечена в 57,1±10,80 и 42,9±10,80% случаев, умеренная резистентность – в 14,3±7,63 и 57,1±10,80% случаев.

В результате исследования антибиотикорезистентности штаммов Enterococcus flavescens выявлен одинаковый процент культур (80,0±10,32%), резистентных к ципрофлоксацину, энрофлоксацину и линезолиду (в соответствии с рисунком 2.5.1.5).

%

–  –  –

Количество норфлоксацинрезистентных штаммов E. flavescens составило 60,0±12,64%. Большая часть (80,0±10,32%) изолятов не проявляла резистентность к ампициллину и тетрациклину. Промежуточная резистентность культур E. flavescens к фторхинолонам, тетрациклину и линезолиду определена в 20,0±10,32% случаев. Устойчивость штаммов E. flavescens к ванкомицину и аминогликозидам не обнаружена, тогда как в отношении цефтриаксона все исследуемые культуры E. flavescens оказались умеренно-резистентны.

Распространнность резистентности к ванкомицину, ампициллину, фторхинолонам и линезолиду среди изолятов Enterococcus casseliflavus составила 50,0±20,41% (в соответствии с рисунком 2.5.1.6).

%

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (род CLETHRIONOMYS) СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Е. Докучаев Магадан – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. МАТЕРИАЛ И...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.