WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Щепитова Наталья Евгеньевна

Биологические свойства фекальных изолятов

энтерококков, выделенных от животных

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Сычва Мария Викторовна ОРЕНБУРГ – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………..

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………….……………………………..

1.1 Общая характеристика бактерий рода Enterococcus…….……….…

1.2 Экология бактерий рода Enterococcus….…………………………… 1.2.1 Распространнность бактерий рода Enterococcus в кишечном биотопе

1.2.2 Распространнность бактерий рода Enterococcus в окружающей среде…………

1.3 Биологические свойства бактерий рода Enterococcus…….………...

1.3.1 Антагонистическая активность бактерий рода Enterococcus…... 19 1.3.2 Факторы патогенности и персистенции бактерий рода Enterococcus…………………………………………………………………..

1.3.3 Антибиотикорезистентность бактерий рода Enterococcus…...…

1.4 Практическое применение бактерий рода Enterococcus

II СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………..

2.1 Материалы и методы исследований…………………………….…… 37 2.1.1 Выделение и идентификация бактерий рода Enterococcus………………………………………………………………….. 37 2.1.2 Методы изучения биологических свойств бактерий рода Enterococcus

2.1.2.1 Определение факторов патогенности бактерий рода Enterococcus…………………………………………………………………..

2.1.2.2 Определение факторов персистенции бактерий рода Enterococcus

2.1.2.3 Определение антибиотикочувствительности бактерий рода Enterococcus.....……………………………………………………………....

2.1.2.4 Определение антагонистической активности бактерий рода Enterococcus.................……………………………………………………… 2.1.3 Метод воспроизведения листериозной экспериментальной инфекции……………………………………………………………………...

2.1.4 Статистическая обработка результатов……….………………….

2.2 Видовой состав фекальных изолятов энтерококков

2.3 Характеристика факторов патогенности фекальных изолятов энтерококков…………………………………………………................……

–  –  –

ВВЕДЕНИЕ

Бактерии рода Enterococcus широко распространены в природе и занимают разнообразные экологические ниши. Энтерококки различных видов являются представителями нормальной микрофлоры пищеварительного тракта млекопитающих, птиц, рептилий и насекомых (Aarestrup F.M. et al., 2002; Gilmore M.S. et al., 2013). Данные микроорганизмы высоко устойчивы к экологическим стрессам и хорошо адаптируются к различным условиям внешней среды, выживая в таких местообитаниях как почва, донные отложения, вода, растения (Badgley B.D.

et al., 2010; Ran Q.H. et al., 2013; Staley C. et al., 2014). Являясь типичными молочнокислыми микроорганизмами, энтерококки применяются в производстве традиционных ферментированных продуктов питания (Giraffa G., 2002; Franz C.M. et al., 2003; Ben Omar N. et al., 2004).

Вследствие широкого распространения в природе и наличия целого ряда полезных свойств для макроорганизма (высокая антагонистическая активность в отношении патогенной микрофлоры, обеспечение формирования и поддержания иммунитета, участие в процессах пищеварения, противовоспалительные свойства, витаминообразование), энтерококки зачастую используются в медицине и ветеринарии в качестве пробиотиков (Бондаренко B.M., Суворов A.H., 2007; Gagga F. et al., 2010;

Franz C.M. et al., 2011).

Непатогенные варианты энтерококков участвуют в колонизационной резистентности кишечного биотопа, продуцируя ряд биологически активных веществ, в том числе бактериоцины (энтероцины) (Foulqui Moreno М.R.

Возросший интерес к бактериоцинпродуцирующим et al., 2006).

энтерококкам обуславливается свойствами этой группы соединений:

широким спектром антимикробного действия (Svetoch E. et al., 2008);

активностью в отношении бактериальных патогенов в наномолярных концентрациях (Sang 2008); медленным развитием Y., Blecha F., резистентности к бактериоцинам у микроорганизмов (Lawton E.M. et al., 2007); индукцией иммунных реакций макроорганизма, повышающих его неспецифическую резистентность к инфекционным агентам (Duc le H. et al., 2004).

В то же время бактерии рода Enterococcus являются представителями группы условно-патогенных микроорганизмов и выступают в качестве этиологического фактора многих инфекционно-воспалительных заболеваний человека и животных (Arias C.A., Murray B.E., 2008; Hollis A.R. et al., 2008;

Poulsen L.L. et al., 2012). Развитию энтерококковых инфекций способствует наличие у изолятов факторов вирулентности, персистенции и антибиотикорезистентности (Бухарин О.В., Валышев А.В., 2012; Hamilton E.

et al., 2013; Di Cesare A. et al., 2014; Liu Y. et al., 2014; Soheili S. et al., 2014).

Вместе с тем многие из этих факторов являются необходимым условием обеспечения жизнедеятельности данных бактерий, повышающие их шансы выжить в свойственном им экотопе (Бухарин О.В. и др., 2002).

Таким образом, энтерококки кишечной микрофлоры, с одной стороны, могут вызывать развитие инфекций, а с другой стороны, проявлять антагонистическую активность в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, поэтому комплексное изучение биологических свойств фекальных энтерококков, изолированных от животных, представляется актуальным.

Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

Изучить видовой состав энтерококков, выделенных из фекалий 1.

здоровых сельскохозяйственных животных.

Охарактеризовать факторы патогенности, персистенции и 2.

антибиотикорезистентности бактерий рода Enterococcus на уровне фено- и генотипа.

Определить антагонистическую активность и гены 3.

бактериоциногении у штаммов энтерококков, оценить влияние факторов макроорганизма на антагонистическую активность культур Enterococcus sp.

in vitro.

Изучить антагонистическую активность культур энтерококков in 4.

vivo.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна исследований. Проведн сравнительный анализ видового разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кишечника здоровых животных разных видов. Установлено, что фекальные изоляты энтерококков характеризуются большим разнообразием видов у моногастричных животных, чем у жвачных. Доминирующим видом у полигастричных животных является E. durans, у лошадей и свиней – E. faecium.

Впервые дана комплексная характеристика биологических свойств фекальных изолятов энтерококков животных по факторам вирулентности, персистенции и антибиотикорезистентности с использованием методов бактериологии и молекулярной биологии. Установлено, что распространнность и выраженность изученных биологических свойств варьирует в зависимости от видовой принадлежности Enterococcus sp.

Установлено, что в популяции фекальных энтерококков широко распространена антагонистическая активность в отношении бактерий родов Listeria и Enterococcus, напрямую коррелирующая с наличием генов бактериоциногении.

На модели экспериментальной инфекции показана возможность использования антагонистически активных энтерококков фекального происхождения в качестве эффективного средства защиты от листериоза.

Создана коллекция антагонистически активных культур Enterococcus sp., представляющих практический интерес в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности.

Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах бактерий рода Enterococcus, выделенных из кишечника здоровых животных.

На основании комплексной характеристики факторов вирулентности, персистенции и антагонизма in vitro и in vivo из коллекции культур энтерококков отобран штамм Enterococcus faecium Ef79OSAU, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Габричевского» Роспотребнадзора в качестве перспективного для производства биопрепаратов (справка № 63 от 14 февраля 2014 г.) (приложение А). В настоящее время культура Enterococcus faecium Ef79OSAU проходит процедуру патентования.

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Биологические свойства условно-патогенной и нормальной микрофлоры организма животных в норме и при патологии»

(№ государственной регистрации 0120.1450283).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на:

Международной научно-практической конференции IV «Проблемы устойчивости биоресурсов: теория и практика» (Оренбург, 2013);

Всероссийской научно-практической конференции с II международным участием «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии – в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014);

Всероссийской научно-практической конференции с VIII международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014);

II Всероссийской молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах»

(Оренбург, 2014);

Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в развитии овцеводства и козоводства» (Оренбург, 2014);

ежегодной областной научно-практической конференции «Молодые ученые Оренбуржья – науке XXI века» (Оренбург, 2014).

Итоги проведнных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 15 от 21 мая 2015 года).

Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 6 – в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Фрагменты работы были представлены на открытом конкурсе для субъектов малого предпринимательства по программе «СТАРТ-2013»

(Ижевск, 2013), на Молодежном инновационном конкурсе «УМНИК-2014»

(Оренбург, 2014) (приложение Б), на областном конкурсе научноисследовательских работ и отмечены премией Губернатора Оренбургской области для талантливой молодежи (2014) (приложение В).

Материалы диссертации были представлены на II и III этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых учных высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ (Киров, 2015; Оренбург, 2015) и отмечены дипломами I степени (приложения Г, Д).

Научные положения, выносимые на защиту.

Кишечный биотоп продуктивных животных разных видов 1.

характеризуется особенностями видового состава бактерий рода Enterococcus.

Энтерококки, изолированные из желудочно-кишечного тракта 2.

сельскохозяйственных животных разных видов, обладают специфичным биопрофилем.

Авирулентные, антагонистически активные энтерококки, 3.

выделенные из кишечника животных, могут быть использованы в качестве биопрепаратов для защиты от листериоза.

Объм и структура диссертации.

Работа изложена на 152 страницах компьютерной врстки, содержит 5 таблиц и 21 рисунок. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, библиографического списка, который включает 308 наименований, в том числе 275 работ иностранных авторов.

–  –  –

1.1 Общая характеристика бактерий рода Enterococcus Название «энтерококк» впервые было применено M.E. Thiercelin (1899) для обозначения грамположительного диплококка кишечного происхождения. F.W. Andrewes и T.J. Horder (1906) впервые выделили этот микроорганизм от больного эндокардитом и предложили название Streptococcus faecalis.

В последующее десятилетие различные авторы изучали и описывали выделенные ими штаммы так называемого S. faecalis, но в 1919 г. S. OrlaJensen при характеристике штаммов S. glicerinaceus и S. faecium применил понятие «энтерококк». J.M. Sherman подчеркнул, что термин «энтерококк»

используется для обозначения разных микроорганизмов – начиная от наименования любого фекального стрептококка, до определения организмов, которые оказались идентичны S. faecalis (Murray B.E., 1990). Первую схему классификации рода Streptococcus, в который входили энтерококки, предложил J.M. Sherman. Согласно его классификации данные микроорганизмы были разделены на четыре группы: пиогенные (pyogenic), зеленящие (viridans), молочные (lactic) и энтерококки (enterococcus).

Энтерококками считали микроорганизмы, способные расти при 10 и 45 °C, в 6,5% NaCl и при значении pH 9,6, которые выживали при 60 °C в течение 30 минут. В соответствии с серологической классификацией R.C. Lancefield (1933), энтерококки агглютинировались антисыворотками группы D.

Применение молекулярно-генетических методов (гибридизация нуклеиновых кислот) позволило К.Н. Schleifer и R. Kilpper-Blz в 1984 году показать только отдалнное сходство S. faecalis со стрептококками. В 1984 г.

было предложено выделить стрептококки, определяемые классификацией J.M. Sherman как энтерококки, в отдельный род Enterococcus.

Первые виды, которые на основании филогенетических доказательств, полученных в результате секвенирования 16S рРНК, были отнесены к новому роду – Streptococcus faecalis и Streptococcus faecium обозначенные, соответственно, как Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium (Schleifer K.H., Kilpper-Blz R., 1984). Дальнейшие исследования доказали, что многие штаммы стрептококков могут считаться отдельными видами рода Enterococcus на основании родства нуклеиновых кислот (Collins M.D. et al., 1984).

Энтерококки принадлежат к домену Bacteria, типу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Lactobacillales, к семейству Enterococcaceae (Ludvig W. et al., 2009).

Род представлен грамположительными, Enterococcus неспорообразующими, факультативно анаэробными бактериями, которые имеют яйцевидную или сферическую форму и могут располагаться в мазках короткими цепочками, парами или отдельными клетками. Размер клеток составляет 0,6-2,00,6-2,5 мкм. Чтких капсул энтерококки не образуют, культуры отдельных видов подвижны за счт редких жгутиков. По типу питания относятся к хемоорганотрофам. Для энтерококков характерен метаболизм бродильного типа. Бактерии осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение разнообразных углеводов с образованием L(+)молочной кислоты, но не газа, в связи с чем их относят к молочнокислым микроорганизмам. Энтерококки могут синтезировать длинноцепочечные жирные кислоты насыщенного неразветвленного или мононасыщенного типа. Пептидогликан построен по типу Lys-D-Asp или Lys-Ala2-3.

Содержание в ДНК G+C варьирует в пределах от 35 до 45% (vec P., Devriese L.A., 2009).

Большинство штаммов реагирует с антисывороткой группы D, и некоторые реагируют с антисывороткой группы Гидролиз Q. Lпирролидонил--нафтиламида является характерной особенностью.

12 Способны расти при концентрации NaCl до 6,5% и жлчи до 40%, при значении pH 9,6, в диапазоне температур 10-45 °C, устойчивы к 0,4% азиду натрия. Оптимальные условия культивирования энтерококков: 35-37 °C, pH 7,5 (Определитель бактерий Берджи, 1997).

В настоящее время данный род представлен гетерогенной по фенотипическим свойствам группой бактерий, включающей более 40 видов микроорганизмов.

1.2 Экология бактерий рода Enterococcus

Энтерококки проявляют широкую экологическую пластичность.

Высокая устойчивость позволяет им заселять различные места обитания (почва, вода, растения, пищевые продукты). В то же время эти микроорганизмы представляют собой часть нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека и животных.

1.2.1 Распространнность бактерий рода Enterococcus в кишечном биотопе

Энтерококки являются комменсалами желудочно-кишечного тракта многих организмов, от насекомых до человека. Численность и видовой состав кишечных представителей специфичны и сильно варьируют в зависимости от вида хозяина (Koneman E.W. et al., 1997).

В 1946 году M. Ostrolenk и A.C. Hunter в небольших количествах выделили бактерии рода Enterococcus из 51 образца фекалий различных видов животных (кошка, мышь, морская свинка, кролик, собака, крыса, курица, обезьяна) и человека.

J.O. Mundt (1963) изучил распространнность фекальных энтерококков у животных в дикой природе. Энтерококки были обнаружены в фекалиях млекопитающих (71% случаев), рептилий (86%) и птиц (32%). При этом от травоядных млекопитающих энтерококки выделялись спорадически, а от хищных млекопитающих, таких как лисы, медведи, кабаны – в большинстве случаев.

В своей работе (1987) выделили и L.A. Devriese et al.

идентифицировали 255 штаммов энтерококков из кишечника животных. Они показали, что наиболее часто выделяемыми видами энтерококков являлись E. hirae и Е. faecium. Культуры Е. durans и Е. gallinarum были найдены ими только в кишечнике домашней птицы, штаммы E. avium выделены от коров и свиней, но не от птицы.

По данным V. Kolodjieva et al. (2006), E. faecalis является наиболее частым изолятом из кишечника человека, обнаруживается в кишечнике домашней птицы, собак и некоторых сельскохозяйственных животных.

E. faecium выявляется в кишечнике людей, разных видов животных, более резистентен к антимикробным препаратам, чем E. faecalis. E. avium выделяют из кишечника птиц, собак, человека. Бактерии видов E. durans, E. hirae, E. gallinarum и E. flavescens известны как редкие кишечные изоляты.

Видовой состав бактерий Enterococcus sp. в образцах фекалий животных и человека c использованием полимеразной цепной реакции изучили B.A. Layton et al. (2010). Ими отмечено, что наиболее часто обнаруживаемыми видами энтерококков были E. faecium и E. faecalis.

E. hirae выделяли из 44% проб фекалий. Из всех проб фекалий лошадей были изолированы штаммы E. hirae, но отсутствовал вид E. faecalis. Распределение видов E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. hirae существенно зависело от видовой принадлежности организма-хозяина.

Некоторые виды энтерококков являются специфичными для своих хозяев. Так, в кишечной микрофлоре домашних голубей был обнаружен новый вид E. columbae (Devriese L.A. et al., 1990). При исследовании микрофлоры слепой кишки ослов A. de Vaux et al. (1998) изолировали штамм энтерококков, который был определн как новый вид E. asini, вошедший в род Enterococcus.

Доминирующие виды энтерококков, обитающие в кишечнике млекопитающих, зачастую представлены культурами E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. durans, другие виды встречаются реже (Devriese L.A., De Pelsmaecker K., 1987).

Бактерии рода Enterococcus присутствуют в кишечном биотопе крупного рогатого скота. Наиболее разнообразная энтерококковая микрофлора представлена у телят. В е составе обнаруживались виды E. avium, E. cecorum, E. durans, E. faecalis, E. faecium и E. hirae. Взрослые коровы характеризовались меньшим видовым разнообразием энтерококков (Devriese L.A. et al., 1992). С поверхности миндалин телят были выделены виды E. faecalis и E. raffinosus.

У лошадей обнаружены фекальные изоляты E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. hirae (Thal L.A. et al., 1995).

Установлено, что из кишечника свиней чаще всего изолируются энтерококки видов E. faecalis и E. faecium, при этом E. faecium выделяется в небольших количествах (Devriese L.A. et al., 1994). Согласно другим исследованиям, в кишечнике свиней обитают бактерии видов E. hirae и E. cecorum (Devriese L.A., Haesebrouck F., 1991).

Изучение микрофлоры кишечника кошек и собак позволило выявить в е составе микроорганизмы рода Enterococcus. По данным L.A. Devriese et al.

(1992), культуры E. faecalis чаще всего встречались в кишечнике этих видов животных, однако E. hirae был изолирован от собак примерно в том же проценте случаев, что и E. faecalis. Для энтерококковой микрофлоры кишечника кошек в большей степени характерен вид E. cecorum.

A. Ghosh et al. (2012) выделили из фекалий здоровых кошек бактерии рода Enterococcus в концентрации от 1,1·105 до 6,0·108 КОЕ/г. Доминировали виды E. hirae, E. faecium и E. faecalis.

Новые виды энтерококков E. canis и E. canintestini были выделены из кишечника здоровых собак (de Graef E.M. et al., 2003; Naser S.M. et al., 2005).

Исследование H. Ryu et al. (2013) позволило установить при помощи ПЦР-анализа распространнность бактерий рода Enterococcus в пробах фекалий домашних и диких животных, а также птиц. Так, энтерококки изолировались в 100% случаев из фекалий свиней, коз, лошадей, обезьян и птиц (куры, утки, цесарки, пеликаны, лебеди, индейки). Наиболее распространнными видами энтерококков были E. faecalis, E. faecium и E. casseliflavus.

Энтерококки также были выделены от диких кабанов, куропаток, рыб (Almeida T. et al., 2011), лисиц (Radhouani H. et al., 2011), диких кроликов (Silva N. et al., 2010), крупного рогатого скота (Bekele B., Ashenafi M., 2010).

Микроорганизмы рода способны колонизировать Enterococcus желудочно-кишечный тракт птиц. Результаты работы H. Radhouani et al.

(2012) показали, что E. faecalis являлся наиболее распространнным фекальным изолятом энтерококков, выделенным от диких птиц (канюки). В другом исследовании из фекалий диких птиц были изолированы энтерококки видов Е. faecium, E. durans, и E. gallinarum (Silva N. et al., 2011).

Энтерококки обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте насекомых (Martin J.D., Mundt J.O., 1972; Broderick N.A. et al., 2004; vec P.

et al., 2006), рептилий (Mundt J.O., 1963).

Таким образом, в течение многих лет энтерококки развивались как высоко адаптированные члены микробного консорциума желудочнокишечного тракта широкого спектра хозяев: млекопитающих, птиц, рептилий и насекомых. Приспосабливаясь к выживанию в пищеварительном тракте, данные бактерии получили ряд селективных преимуществ, заключающихся в сложных метаболических процессах. Приобретение энтерококками механизмов защиты от экологических стрессорных воздействий, изменяющихся в зависимости от условий среды, способствовало их распространению во вторичных местообитаниях в окружающей среде.

1.2.2 Распространнность бактерий рода Enterococcus в окружающей среде Исследования последних десятилетий показали, что бактерии рода Enterococcus широко распространены в окружающей среде, включающей такие внекишечные биотопы, как водные источники, почва и донные отложения, растительность.

Энтерококки используются в качестве индикаторов фекального загрязнения окружающей среды. Однако не до конца остается изученной степень отражения энтерококками загрязнения окружающей среды человеческими отходами или продуктами животноводства (Fleisher J.M. et al., 2010; Sinigalliano C.D. et al., 2010).

Находясь в гетеротермичной окружающей среде, энтерококки могут подвергаться различным стрессорным воздействиям: ультрафиолетовому облучению, солности, перепаду температур, недостатку питательных веществ (Byappanahalli M.N. et al., 2012).

Обнаруживаются микроорганизмы рода Enterococcus как в пресных (Fujioka R.S. et al., 1988), так и в морских водах (Boehm A.B. et al., 2002;

Korajkic A. et al., 2011).

I. Khn et al. (2003) в свом исследовании установили наличие в пробах поверхностных вод различных видов энтерококков (E. casseliflavus, E. faecium, E. mundtii, E. gallinarum, E. dispar, E. hirae, E. durans, E. flavescens), и в том числе преобладающего вида E. faecalis.

Многочисленные новые представители рода Enterococcus были впервые выделены из воды. В результате применения Р. vec et al. (2001) полифазного таксономического подхода для изучения атипичных изолятов энтерококков поверхностных вод, в род Enterococcus добавлены два новых вида – E. haemoperoxidus и E. moraviensis.

Из морской воды Р. vec et al. (2005) были изолированы два штамма энтерококков, представляющих собой новый вид, получивший название Enterococcus aquimarinus. Из воды выделены новые виды Enterococcus ureasiticus, Enterococcus quebecensis, Enterococcus rivorum (Niemi R.M. et al., 2012; Sistek V. et al., 2012).

Частота встречаемости в воде разных видов энтерококков существенно различается. Например, в работе B.L. Mote et al. (2012) показано, что наиболее распространнными видами энтерококков являлись Е. faecalis (31%), Е. mundtii (31%) и E. casseliflavus (16%). D.F. Moore et al. (2008) и P. Grammenou et al. (2006) выделили бактерии рода Enterococcus из проб поверхностных, океанических и рекреационных вод, при этом E. faecalis и E. faecium явились наиболее распространнными видами изолятов.

Энтерококки встречаются в почвах (Hardina C.M., Fujioka R.S., 1991;

Fujioka R.S. et al., 1999). В донных отложениях были обнаружены E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. casseliflavus и E. mundtii (Ferguson D.M. et al., 2005), из песка пресноводных и морских пляжей были выделены E. faecium, E. casseliflavus, Е. durans (Yamahara K.M. et al., 2007).

В работе R.L. Whitman et al. (2003) была показана способность энтерококков колонизировать водоросли Cladophora. Данные бактерии обнаруживались в 97% случаев, при этом культуры энтерококков оставались жизнеспособными в образцах водорослей, хранившихся в высушенном состоянии более шести месяцев.

Исследования зарубежных авторов показывают, что резервуарами для энтерококков могут служить бурые водоросли фукус (Imamura G.J. et al., 2011), глубоководная растительность (Badgley B.D. et al., 2010).

Распространнность энтерококков на поверхности цветковых растений была изучена J.O. Mundt (1961, 1963). Энтерококки были выделены из цветков несельскохозяйственных растений в 34% случаев, из сельскохозяйственных двудольных растений – в 32,2%, из трав и зерновых культур – в 10,4%. В видовом составе энтерококков преобладал E. faecalis.

Бактерии рода Enterococcus способны колонизировать ризоплану растений. Так, при исследовании микрофлоры силоса Y. Cai (1999) выделил и идентифицировал энтерококки видов E. hirae, E. faecalis, E. casseliflavus и Е. mundtii. T. Mller et al. (2001), изучая микрофлору кормовых трав, изолировали с поверхности растений культуры E. faecium, E. mundtii, E. casseliflavus, E. faecalis и E. sulfureus.

Сходные данные по видовому составу энтерококков эпифитной микрофлоры кормовых трав получили E.M. Ott et al. (2001). Они выделили энтерококки, принадлежащие к видам E. faecalis (7,9%), E. mundtii (7,9%), E. casseliflavus (5,5%), E. faecium (5,2%) и E. sulfureus (0,1%), при этом 18,4% изолятов энтерококков проявили антагонистическую активность в отношении грамположительных микроорганизмов.

(2012) изучили генетическое разнообразие, N. Klibi et al.

антибиотикорезистентность и бактериоциногению изолятов энтерококков, выделенных из ризосферы растений. Установлено наличие только двух видов энтерококков – E. faecium (97%) и E. durans (3%), среди которых отмечен высокий процент штаммов, резистентных к ципрофлоксацину (44,5%).

Антимикробной активностью обладал 41% культур E. faecium.

Из растений выделены и охарактеризованы новые виды энтерококков – E. plantarum, E. rotai, E. ureilyticus (vec P. et al., 2012; Sedlek I. et al., 2013).

Вс вышеуказанное свидетельствует о том, что среди многочисленных представителей рода Enterococcus наблюдается различная приуроченность их к месту обитания. Некоторые виды энтерококков обнаруживаются только в кишечном биотопе, другие адаптировались к выживанию в сложных условиях внешней среды, третьи – распространены повсеместно.

Присутствие Enterococcus sp. в окружающей среде может являться 19 следствием их обитания в желудочно-кишечном тракте человека и животных.

1.3 Биологические свойства бактерий рода Enterococcus В последнее время внимание ученых привлекает изучение биологических свойств бактерий рода Enterococcus и оценка их роли в физиологии и патологии человека и животных. Наряду с другими молочнокислыми бактериями энтерококки, колонизуруя желудочнокишечный тракт, оказывают в целом благоприятное воздействие на макроорганизм, обеспечивая колонизационную резистентность слизистых оболочек, участвуя в метаболических процессах пищеварения, стимулируя иммунную систему. Но, тем не менее, при определнных условиях эти микроорганизмы способствуют развитию серьзных заболеваний, поскольку обладают так называемыми факторами патогенности (в большинстве случаев генетически детерминированными), а также приобретают и передают другим штаммам гены резистентности к антибактериальным препаратам.

Многочисленны исследования, посвящнные изучению биологической активности энтерококков, факторов вирулентности, антибиотикорезистентности и механизму их действия (Leavis H.L. et al., 2006; Fisher K., Phillips C., 2009; Cebrin R. et al., 2012; Jimnez E. et al., 2013; Perin L.M. et al., 2014; Laukov A. et al., 2015).

1.3.1 Антагонистическая активность бактерий рода Enterococcus

Антагонизм представляет собой биологический феномен, широко распространнный среди микроорганизмов. Антагонистические свойства молочнокислых бактерий хорошо известны, они обусловлены продукцией антибактериальных веществ неспецифического действия, в частности молочной кислоты, подавляющей рост многих микроорганизмов за счт снижения рН среды (Гармашева И.Л., Коваленко Н.К., 2011). Однако молочнокислые бактерии рода Еnterococcus обладают низкой кислотопродукцией (Giraffa G., 2003), и поэтому механизмы антагонистической активности энтерококков активно изучаются (Chen Y.S.

et al., 2013; Kaur G. et al., 2014; Tiwari S.K. et al., 2015).

Антимикробные вещества, подобные бактериоцинам, впервые были выделены у стрептококков группы D (энтерококков) (Kjems E., 1955).

H. Brandis и U. Brandis (1962) назвали бактериоциноподобное вещество, синтезируемое штаммом Streptococcus faecium, энтероцином.

Бактериоцины энтерококков (энтероцины) представляют собой экскретируемые за пределы бактериальной клетки антимикробные вещества, обеспечивающие регуляцию популяции бактерий и поддержание колонизационной резистентности биотопа (Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., 2011).

Энтероцины представлены пептидами, комплексами пептидов или белками с различной молекулярной массой, физико-химическими характеристиками и биологическими свойствами (Ермоленко Е.И., 2009).

Установлено, что индивидуальный спектр антимикробного действия бактериоцинов зависит от наличия поверхностных рецепторов у микроорганизмов для связывания с бактериоцинами (Блинкова Л.П. и др., 2007).

Klaenhammer (1993) классифицировал бактериоцины T.R.

молочнокислых микроорганизмов на 4 класса. В 1996 году I.F. Nes et al.

более детально систематизировали бактериоцины класса II, в соответствии с чем энтероцины отнесли к подклассу IIа.

В настоящее время большинство авторов объединяют энтероцины в три класса: I, II, III (Oscariz J.C., Pissabarro A.G., 2001; De Vuyst L., Leroy F., 2007), некоторые авторы выделяют подкласс IId в отдельный IV класс энтероцинов (Nes I.F. et al., 2007).

Энтероцины первого класса представлены лантибиотиками – низкомолекулярными катионными, гидрофобными, термостабильными пептидами. К синтезируемым энтерококками лантибиотикам относятся только два известных пептида – цитолизин и энтероцин W (Gilmore M.S.

et al., 1994; Sawa N. et al., 2012).

Гемолитический бактериоцин (цитолизин) является дипептидом, состоящим из двух субъединиц – CylL и CylS (Coburn P.S. et al., 1999).

Известно, что цитолизин обладает антимикробной активностью в отношении широкого спектра грамположительных бактерий (Listeria sp., Pediococcus sp., sp.), а также способен разрушать Enterococcus sp., Lactococcus эукариотические клетки (эритроциты, полиморфноядерные лейкоциты, эпителиальные клетки кишечника, клетки сетчатки глаза человека), поэтому данный лантибиотик часто упоминается как гемолизин (Coburn P.S., Gilmore M.S., 2003).

Изучена зависимость экспрессии цитолизина и тяжести течения энтерококковых инфекций человека и животных, при этом доказано, что цитолизин вносит большой вклад в патогенность энтерококков (Elsner H.A.

et al., 2000; Van Tyne D. et al., 2013).

Вторым, сравнительно недавно изученным, лантибиотиком является энтероцин W, обладающий сильным сродством к плантарицину W (бактериоцину, синтезируемому Lactobacillus plantarum) (Sawa N. et al., 2012). Энтероцин W антагонистически активен в отношении некоторых грамположительных бактерий, его антимикробная активность достигается в эквимолярных концентрациях.

К бактериоцинам класса относятся немодифицированные II низкомолекулярные катионные термоустойчивые пептиды. Большинство энтероцинов принадлежит к бактериоцинам II класса. Данные пептиды способны повреждать цитоплазматическую мембрану многих грамположительных и грамотрицательных бактерий (Line J.E. et al., 2008).

Энтероцины II класса синтезируются многими видами энтерококков, к наиболее распространнным видам относятся E. faecium, E. mundtii, E. avium, E. hirae и E. durans. Эта группа энтероцинов обладает наиболее сильным антилистериозным эффектом (Drider D. et al., 2006). Наиболее полно изученными энтероцинами II класса являются энтероцины А, Р, В, L50.

Энтероцин А представляет собой высокостабильный педиоциноподобный пептид с молекулярной массой 4,8 кДа, состоящий из 47 аминокислотных остатков. T. Aymerich et al. (1996) впервые обнаружили продукцию данного энтероцина штаммом Enterococcus faecium CTC492, выделенным из ферментированной испанской колбасы. В спектр антимикробной активности энтероцина А входят грамположительные (Listeria sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus sp., Carnobacterium sp., Lactococcus sp., Clostridium sp.) и грамотрицательные (Salmonella sp., Providencia sp., E. coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp.) микроорганизмы (Ennahar S., Descamps N., 2000; Laukov A., Czikkov S., 2001).

Синтезируется энтероцин А в большинстве случаев штаммами выделенными из пищевых продуктов, таких как E. faecium, ферментированные колбасы, сыры, молочные продукты (Cocolin L. et al., 2009; Giannou E. et al., 2009; Rehaiem A. et al., 2010).

Энтероцин Р является термоустойчивым пептидом с молекулярной массой 5 кДа, состоящим из 44 аминокислот. Впервые обнаружен был в супернатантах штамма Enterococcus faecium P13, выделенного из испанской сухой ферментированной колбасы (Cintas L.M. et al., 1997). Энтероцин Р ингибирует рост многих патогенных грамположительных бактерий, в том числе бактерий, вызывающих порчу пищевых продуктов: Listeria sp., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, C. botulinum. Данный энтероцин проявляет ярко выраженную антилистериозную активность (Gutirrez J. et al., 2005).

Энтероцин В состоит из 53 аминокислот, представлен непедиоциноподобным пептидом с молекулярной массой 5,4 кДа. P. Casaus et al. (1997) первоначально выявили этот энтероцин у штамма E. faecium T136. Показано, что энтероцин В часто экспрессируется с энтероцином А и обладает синергидным эффектом (Franz C.M. et al., 1999). Энтероцин В способны продуцировать штаммы E. faecium, E. faecalis и E. durans.

Энтероцин L50 состоит из двух отдельных пептидов L50А и L50В, включающих 44 и 43 аминокислотных остатка, соответственно. Обнаружен в культуральной жидкости штамма E. faecium L50 (Cintas L.M. et al., 1998). Оба бактериоцина обладают отдельной антимикробной активностью, тогда как вместе проявляют синергизм. Антагонистическая активность проявляется в отношении Enterococcus sp., Lactobacillus sp., L. monocytogenes, B. cereus (De Vuyst L. et al., 2003).

Энтероцин AS-48 представляет собой катионный циклический пептид, состоящий из 70 аминокислотных остатков, молекулярная масса 7,2 кДа.

Впервые был выделен A. Glvez et al. (1986) во время экспоненциального роста штамма Enterococcus faecalis AS-48. Позднее были охарактеризованы варианты энтероцина AS-48 – энтероцин EFS2, энтероцин 4 и бактериоцин 21, выявленные у культур E. faecalis (Joosten H.M. et al., 1996;

Maisnier-Patin S. et al., 1996; Tomita H. et al., 1997), а также E. faecium 7C5 (Folli C. et al., 2003). Бактериоцин проявляет антагонистическую активность в отношении Bacillus sp., Clostridium sp., S. aureus, Listeria sp. (Glvez A. et al., 1989; Mendoza F. et al., 1999).

Энтеролизин A был охарактеризован как бактериоцин III класса, продуцируемый штаммами E. faecalis DPS5280 и LMG2333 (Hickey R.M.

et al., 2003; Nilsen T. et al., 2003). Является термолабильным антимикробным белком с молекулярной массой 35 кДа. Энтеролизин А ингибирует рост энтерококков, педиококков, лактококков и лактобактерий.

Бактериоциногенные штаммы энтерококков изолированы из широкого круга местообитаний. Пищевые продукты являются распространнным источником культур энтерококков, синтезирующих энтероцины (Hugas M.

et al., 2003). В то же время, продуцирующие бактериоцины штаммы были выделены из пищеварительного тракта человека и животных (Kang J.H., Lee M.S., 2005; Strompfov V., Laukov A., 2007) и из окружающей среды (Marekov M. et al., 2007).

Многие изоляты энтерококков способны продуцировать несколько энтероцинов (Nilsen T. et al., 1998; Cintas L.M. et al., 2000). Установлено, что генетические детерминанты, кодирующие синтез бактериоцинов энтерококков, могут располагаться на бактериальной хромосоме и конъюгативных плазмидах, обеспечивающих горизонтальный перенос генов (Tomita H. et al., 2008).

Продукция бактериоцинов обеспечивает конкурентное преимущество энтерококкам в определнных экологических нишах, способствует селекции наиболее жизнеспособных штаммов, успешной колонизации биотопа (Eijsink V.G. et al., 2002).

В настоящее время активно рассматривается вопрос использования бактериоцинов энтерококков в качестве консервантов пищевых продуктов животного и растительного происхождения (Khan H. et al., 2010).

Энтероцины считаются наиболее подходящей альтернативой химическим консервантам, поскольку являются безвредными для эукариотических клеток, устойчивыми к изменениям рН среды, легко расщепляются протеолитическими ферментами в желудочно-кишечном тракте (Glvez A.

et al., 2007).

Таким образом, бактериоциногения является широко распространнным свойством микроорганизмов рода Enterococcus.

25 Актуальным вопросом представляется перспектива использования энтероцинов в терапии инфекционных патологий, а также в качестве биоконсервантов пищевых продуктов.

1.3.2 Факторы патогенности и персистенции бактерий рода Enterococcus Бактерии рода Enterococcus могут синтезировать целый спектр факторов патогенности, на основании чего они были помещены в группу условно-патогенных микроорганизмов. Ключевым критерием при дифференцировке безопасных представителей рода от Enterococcus патогенных является наличие или отсутствие у штамма факторов вирулентности (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., 1997).

Факторы патогенности бактерий являются генетически детерминированными признаками. Некоторые из генов вирулентности располагаются на генетических элементах внехромосомной локализации, так называемых «островах» патогенности, которые способны передаваться от одного штамма другому, интегрируясь в геном бактериальной клетки (Бондаренко В.М., 2001).

Первым этапом взаимодействия микроорганизмов с организмом хозяина является их адгезия на клетках макроорганизма. Имеются сведения о нескольких факторах, обуславливающих адгезию энтерококков к тканям.

Основное значение в данном процессе имеет субстанция агрегации (AS) (Jett B.D. et al., 1994). Субстанция агрегации – это поверхностный гликопротеин, кодируемый генами бактериальной плазмиды и индуцируемый наличием в клетке феромонов (Chandler J.R. et al., 2005).

Данные поверхностные пептиды выступают в качестве адгезина, осуществляют интернализацию клеток E. faecalis в энтероциты, способствуя их транслокации через стенку кишечника, а также вносят существенный вклад в процесс уклонения энтерококков от фагоцитов (Rakita R.M. et al., 1999; Sartingen S. et al., 2000). Установлено, что гены AS более распространены среди фекальных и клинических изолятов энтерококков, чем среди штаммов, изолированных из объектов окружающей среды (Coque T.M.

et al., 1995).

Адгезия также может быть обусловлена липотейхоевой кислотой и адгезинами гликопротеиновой природы. Адгезины энтерококков кодируются конъюгативными плазмидами, несущими одновременно гены феромонов, которые способствуют контакту между бактериальной клеткой донора и клеткой реципиента, а также контакту бактериальной и эукариотической клеток (Johnson A.P., 1994).

Липотейхоевая кислота энтерококков выполняет функцию скрепляющего лиганда для субстанции агрегации бактериальных клеток (Waters C.M. et al., 2004). Липотейхоевая кислота оценивается как фактор, способствующий модуляции воспалительной реакции в тканях хозяина, стимулирующий комплемент-зависимый лизис клетки и продукцию цитокинов (Theilacker C. et al., 2006).

Энтерококковый поверхностный белок был первоначально Esp определн у гентамицинрезистентных штаммов E. faecalis, изолированных при бактериемии (Shankar V. et al., 1999). Белок Esp – поверхностный белок с молекулярной массой 202 кДа, обладающий структурными особенностями (повторяющиеся последовательности транспортных сигналов), характерными для грамположительных поверхностных протеинов. Высокая идентичность белков Esp у видов E. faecalis и E. faecium, по данным H. Leavis et al. (2004), свидетельствует о сходных функциях данных соединений в процессе прикрепления бактерий к колонизируемой поверхности. Кроме первоначальной адгезии данный протеин участвует в образовании биоплнок, что определяется, в первую очередь, его N-концевым доменом (Heikens E. et al., 2007; Van Wamel W.J. et al., 2007).

генетических детерминант факторов вирулентности Cкрининг энтерококков, выделенных из клинического материала, пищевых продуктов и заквасок, выявил преобладание гена esp, кодирующего поверхностный белок, в геноме клинических изолятов (Eaton T.J., Gasson M.J., 2001).

Не менее важным фактором адгезии являются специфические энтерококковые фимбрии (пили). Белковые субъединицы пилина экспрессируются с хромосомных оперонов ebp, количество которых варьирует в зависимости от вида энтерококка (Nallapareddy S.R. et al., 2006).

Установлено, что фимбрии Ebp играют важную роль не только в адгезии, но и в биоплнкообразовании, что увеличивает селективные возможности бактерий при взаимодействии с макроорганизмом (Hendrikx A.P. et al., 2008).

На поверхности клеточной стенки энтерококков располагаются мембранные гликолипиды, которые также принимают участие в адгезии к тканям хозяина. Установлено, что данные соединения специфически распознают и связывают поверхностные гликопептиды, представляя собой важную молекулярную структуру в адгезии бактериальной клетки к колонизируемой поверхности (Sava I.G. et al., 2009).

К секретируемому фактору вирулентности энтерококков относят цитолизин (гемолизин/бактериоцин), представляющий собой низкомолекулярный катионный, гидрофобный, устойчивый к нагреванию пептид, обладающий токсической и бактериоциногенной активностями, кодируемый восьмью генами, располагающимися на плазмидах или бактериальной хромосоме (Haas W., Gilmore M.S., 1999; Shankar N. et al., 2002). Вклад цитолизина в патогенность энтерококков хорошо продемонстрирован на примерах экспериментальных моделей энтерококковых инфекций у животных (Jett B.D. et al., 1992; Garsin D.A. et al., 2001).

Бактериоцинная активность цитолизина может играть особую роль в колонизации энтерококками желудочно-кишечного тракта за счт конкурентного преимущества цитолитических штаммов энтерококков над нецитолитическими или другими грамположительными бактериями (Brock T.D., Davie J.M., 1963).

У бактерий рода Enterococcus изучен спектр ферментов защиты и агрессии. Одним из таких ферментов является желатиназа, относящаяся к классу металлоэндопептидаз. Подробная характеристика активности фермента была представлена P.L. Mkinen et al. (1989) и включала целый спектр белковых субстратов. Выраженная специфичность энтерококковой желатиназы к биологически активным пептидам и коллагену свидетельствует о е важном значении как фактора патогенности.

(1991) была секвенирована нуклеотидная Y.A. Su et al.

последовательность, кодирующая предполагаемую сериновую протеазу, названную SprE из-за сходства с протеазой V8 Staphylococcus aureus.

X. Qin et al. в 2000 году, используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, продемонстрировали совместную локализацию и транскрипцию гена gelE и Выявлено, что ген кодирует высокоспецифичную sprE. gelE глутамилэндопептидазу серинового типа (Kawalec M. et al., 2005).

Для некоторых энтерококков характерна способность к расщеплению гиалуроновой кислоты посредством фермента гиалуронидазы (Rosan B., Williams N.B., 1964). Данный фермент способствует распространению бактерий и их токсинов в тканях макроорганизма (Kayaoglu G., rstavik D., 2004).

Одной из основных стратегий длительного сохранения и выживания бактерий в экотопе (персистенция микроорганизмов) является формирование биоплночных структур, представляющих собой скопление микроорганизмов, ассоциированных с полисахаридным внеклеточным матриксом и фиксированных на биотических или абиотических поверхностях (Flemming H.C., Wingender J., 2010). Образование энтерококками биоплнок в большинстве случаев рассматривается как важный фактор их патогенности при развитии энтерококковых инфекций. Однако, за счт работы сигнальных систем в популяции биоплнки постоянно происходит положительная селекция штаммов с выгодными свойствами и элиминация штаммов с «ненужными» фенотипами, и как результат, успешная колонизация кишечного биотопа.

Показано, что штаммы E. faecalis образуют биоплнки чаще, чем изоляты других видов. Так, в работе L. Baldassarri et al. (2001) способность формировать биоплнки была выявлена у 80% культур E. faecalis и 48% культур E. faecium. Аналогичные данные получены I. Dupr et al. (2003), в исследовании которых 87% штаммов E. faecalis и 16% штаммов E. faecium обладали способностью к биоплнкообразованию.

Выживание энтерококков в пищеварительном тракте во многом обусловлено наличием у них способности противостоять антимикробным пептидам организма хозяина. У кишечных изолятов Е. faecalis и Е. faecium выявлено наличие антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой, антитромбоцитарной катионно-белковой и антибетализиновой активностей (Билимова С.И., 2000; Черданцева Г.А., Билимова С.И., 2000). Установлено, что фекальные штаммы Е. faecalis способны инактивировать лизоцим, лактоферрин, белки гистоны, причм показатели активностей увеличивались после соинкубирования с простейшими, что может свидетельствовать о реализации межмикробных взаимодействий, позволяющих энтерококкам длительно сохраняться в организме (Бугеро Н.В., Потатуркина-Нестерова Н.И., 2012).

Таким образом, описанные факторы вирулентности и персистенции энтерококков способствуют развитию инфекционного процесса, однако не являются обязательным условием для выживания бактерий в биотопе. В то же время многие из этих свойств обеспечивают существование энтерококков в их естественных местообитаниях, так, например, для нормальной колонизации желудочно-кишечного тракта энтерококкам необходимы адгезины. Являясь условно-патогенными микроорганизмами, энтерококки обладают преимуществами выживания в сложных условиях среды по сравнению с другими бактериями.

1.3.3 Антибиотикорезистентность бактерий рода Enterococcus

–  –  –

L.A. Devriese et al. (1996) выявили широкую распространнность резистентности к ванкомицину среди культур энтерококков, изолированных от сельскохозяйственных и домашних животных. Ванкомицинрезистентные изоляты E. faecium обнаружены в кишечнике лошадей и собак (8%), кур (7%), свиней (6%), резистентные штаммы E. durans, E. gallinarum и E. faecalis выделены из фекалий кур, фазана и лошади, соответственно.

(2011) охарактеризовали спектр C.L. Tremblay et al.

антибиотикорезистентности культур E. faecalis и E. faecium, изолированных из содержимого слепой кишки цыплят-бройлеров и индюшат. Большинство штаммов энтерококков проявили устойчивость к бацитрацину, эритромицину, канамицину, линкомицину, хинупристин/дальфопристину, стрептомицину, тетрациклину, в то время как сохраняли чувствительность к хлорамфениколу, линезолиду и ванкомицину.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 ЭКОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доцент Семенова Е.А. БЛАГОВЕЩЕНСК –...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«ЕРМОЛАЕВ Антон Игоревич ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ МЕЛКИХ СОКОЛОВ В ДОЛИНЕ МАНЫЧА 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«Жабина Виктория Юрьевна Экспериментальная и производственная оценка элективных питательных сред и дезинфектантов при туберкулезе крупного рогатого скота 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.