WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте ...»

-- [ Страница 2 ] --

Многочисленные исследования показали роль сигнального пути VEGFVEGFR в физиологическом ангиогенезе от эмбрионального периода до глубокой старости. Экспериментальным путем на лабораторных мышах установлено, что выключение даже одного аллеля в гене VEGF приводит к летальному исходу ввиду неправильного формирования сосудистой сети [9], а выключение любого из генов рецепторов VEGFR ведет к смерти ввиду избыточной васкуляризации в эмбрионе [48]. In vitro на модели культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека и фибробластов человека показано, что VEGF играет центральную роль в ангиогенезе, поскольку VEGF-блокирующие агенты, такие как sFlt-1 и антитела, нейтрализующие анти-VEGF, подавляют ангиогенез и формирование трубчатой системы сосудов даже в присутствии других ангиогенных факторов, таких как фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов и ангиопоэтин-1 [213].

Недавние исследования продемонстрировали, что передача сигналов VEGFR также играет важную роль в нейронной системе, в обоих сенсорных и моторных нейронах. Таким образом, система VEGF-VEGFR может быть привлекательной мишенью для лечения заболеваний нервной системы, таких как боковой амиотрофический склероз [174]. Помимо этого, сигнальный путь VEGFVEGFR вовлечен в ряд хронических воспалительных заболеваний, например, ревматоидный артрит [227], ретинопатия [257].

Тем не менее наиболее изучена роль системы VEGF-VEGFR в процессе опухолевого ангиогенеза [17, 110]. Еще в 1970-х годах Фолькман в своих исследованиях предположил, что опухолевой ангиогенез является перспективным направлением в лечении онкологических заболеваний [129]. Начиная с 1980-х годов до настоящего времени получено достаточно данных о ведущей регуляторной роли системы VEGF-VEGFR в ангиогенезе опухоли [220]. Внутри опухоли создаются условия для развития гипоксии вследствие быстрого роста опухолевых клеток. Одним из индукторов VEGF является гипоксия, действующая через стабилизацию и активацию фактора транскрипции HIF-1, рецепторы VEGFR, в частности VEGFR-2, также активируются в условиях гипоксии [217].

На лабораторных животных показано, что антитела против человеческого VEGF эффективно подавляют рост ксенотрансплантатов опухоли человека, пересаженных в иммунно-дефицитных мышей [143]. В настоящее время широко применяется таргетная терапия VEGF-нейтрализующими антителами для лечения рака прямой кишки, легких, молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы.

Механизм действия таргетной терапии связан либо с прямым непосредственным подавлением ангиогенеза, либо с поддержанием уже имеющегося апоптоза эндотелиальных клеток опухоли, либо с восстановлением нормальной проницаемости сосудов [220].

Таким образом, проанализировав имеющуюся медицинскую литературу о роли VEGF в ангиогенезе, мы не нашли данных о значении VEGF в возрастном уменьшении численности кровеносных сосудов в дерме. Все многочисленные исследования были в основном направлены на изучение функции системы VEGFVEGFR при различных заболеваниях, непосредственно связанных с изменением в системе кровообращения (опухоли, системные заболевания соединительной ткани, ретинопатия). Следует отметить, что в современной литературе отсутствуют данные о возрастном изменении степени экспрессии VEGF от антенатального периода до глубокой старости.

1.5.2. Дельтаподобный лиганд 4 (Dll4) и Jagged-1 (Jag-1)

Современной науке известно несколько путей регуляции ангиогенеза.

Помимо наиболее изученного пути VEGF-VEGFR существенную роль в данном процессе играет сигнальный путь Notch [142]. Регуляторный Notch путь является эволюционно консервативной сигнальной системой, которая контролирует судьбу и дифференцировку клеток во время развития разных тканей, а также играет важную роль в образовании новых сосудов у взрослых [114, 183]. У млекопитающих, в том числе и у человека, сигнальный путь Notch состоит из комплекса рецепторов и лигандов. Выделяют четыре рецептора Notch (Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4) и шесть лигандов: Jag-1, Jag-2 и Dll1, Dll2, Dll3, Dll4.

Notch 1 экспрессируется в различных типах клеток, тогда как Notch 4 преимущественно в клетках эндотелия сосудов, Notch 3 в эндотелии легких [250].

Все рецепторы и лиганды являются трансмембранными белками [161]. Notch рецепторы синтезируются в виде одноцепочечных предшественников, которые затем расщепляется на внеклеточную и трансмембранную субъединицу в комплексе Гольджи. Эти две субъединицы удерживаются вместе на клеточной мембране посредством нековалентных связей [250].

Взаимодействие рецепторлиганд вызывает протеолитическое расщепление рецептора, удаление внеклеточной субъединицы, ведущее к освобождению внутриклеточного домена Notch из клеточной мембраны. Внутриклеточный домен транслоцируется в ядро, где он связывается с ДНК-связывающим протеином CSL, вытесняя комплекс гистондезацетилазы-ко-репрессор из CSL белка. Это приводит к активации транскрипции Notch-зависимых генов [156]. Данный механизм считается каноническим путем активации системы Notch [127]. В последнее время получены данные о неклассическом CSL-независимом пути активации системы опосредованном внутриклеточным медиатором Notch-зависимой Notch, антиапоптической фосфатидил-инозитол-3 киназой [182], также системой VEGFA-VEGFR-2 в нейронных клетках [145].

Регуляторный путь сигнализации Notch играет важную роль в сердечнососудистой системе: контролирует дифференцировку кардиомиоцитов, образование клапанов сердца и сосудов. Таким образом, доказано, что мутация Notch рецепторов или его лигандов приводит к развитию врожденных сердечнососудистых заболеваний, таких как синдром Алажиля, церебральная аутосомнодоминантная артериопатия с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией, двустворчатый аортальный клапан, артериовенозная мальформация сосудов головного мозга [177].

В литературе имеются данные, что VEGF способен индуцировать синтез Dll4 в эндотелиальных клетках [173]. Это взаимодействие приводит к формированию так называемых tip клеток, которые локализуются в терминальном участке вновь формируемого сосуда [145]. На модели клеточной культуры человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены было показано, что Notch система подавляет ветвление tip клеток. Подавление Notch сигнализации приводит к делению tip клеток, при этом обе дочерние клетки схожи с исходной.

Так представлен бифуркационный механизм ветвления сосудов [125]. Tip клетки способны продуцировать Dll4, который действует на рецепторы Notch 1 и Notch 4, расположенные на соседних эндотелиоцитах, что приводит к резкому уменьшению количества рецепторов VEGFR-2. Таким образом образуются так называемые stalk клетки. Stalk клетки располагаются позади tip клеток. Их функция заключается в формировании эндотелиальной выстилки ствола нового кровеносного сосуда. Лиганд Jag-l в эндотелиальных stalk клетках инициирует синтез Notch 3 в клетках, расположенных глубже. Впоследствии происходит дифференцировка этих клеток в перициты и гладкомышечные клетки [145].

Экспериментальным путем на лабораторных мышах показан диаметрально противоположный эффект Notch-лигандов Dll4 и Jag-1 в регуляции ангиогенеза [181]. Установлено, что ингибирование Dll4 в клетках эндотелия индуцирует экспрессию Jag-1. Лиганд Jag-1, когда выключен путь активации Dll4 через Notch 1, способствует экспрессии VEGF и росту эндотелиальных клеток. Jag-1 также инициирует созревание новообразованных сосудов, возможно, путем связывания и активации рецептора Notch 4 [103].

Лиганд Dll4 рецепторов Notch 1 и Notch 4 играет одну из ключевых ролей в регуляции процесса образования новых сосудов. Этот факт подтверждается преимущественной экспрессией Dll4 эндотелиальными клетками сосудов [39].

Однако в последнее время Dll4 находят и в других тканях [185]. Установлено, что у большинства линий мышей делеция одного из аллелей Dll4 приводит к нарушению в развитии сосудистой системы в период раннего эмбрионального развития и к гибели эмбриона [130]. Также известно, что нарушение экспрессии эндотелиальными клетками протеина Dll4 имеет парадоксальный эффект в процессе образования новых сосудов. С одной стороны, это приводит к чрезмерному образованию сосудистой сети, с другой – формируются дефектные сосуды с малым диаметром просвета или полным его отсутствием. Также происходит нарушение перфузии, изменение в строении перицитов как у эмбрионов, так и взрослых мышей [141].

Регуляторный Notch путь вовлечен в опухолевый ангиогенез. Его роль зависит от взаимодействия с другими сигнальными системами [86]. Notch 1 может выступать как в роли онкогена, например, при остром лимфобластном лейкозе у детей [165], так и быть опухолевым супрессором на мышиных моделях кожи, активируя waf1 и тем самым подавляя передачу сигнала Shh и Wnt [204].

Исследователями доказано, что экспрессия Dll4 в физиологических условиях в организме здорового человека низкая, однако она значительно повышается в опухолевых сосудах [87]. При этом экспрессия Dll4 в эндотелиоцитах зависит от уровня VEGF и FGF [254]. Высокий уровень Dll4 негативно коррелирует со степенью злокачественности рака молочной железы, мочевого пузыря [246], он также является предиктором выживаемости при раке яичников [40]. На лабораторных животных экспериментально было показано, что экспрессия Dll4 значительно повышается в эндотелиальных клетках капилляров кожи в условиях ишемии [248].

В недавних исследованиях Jag-1 идентифицирован как физиологический лиганд для CD46. Связывание Jag-1 с доменом DSL приводит к активации фактора комплемента CD46, что определяет функциональность Т-хелперов. Это наблюдение позволяет предположить, что лиганд Jag-1 играет роль в иммунных реакциях [240]. Установлено, что Jag-1 принимает участие в формировании гладкой мускулатуры сосудов, а также в обеспечении взаимодействия между эндотелиальными и периваскулярными клетками. Элиминирование Jag-1 из эндотелия сосудов приводит к серьезным дефектам в их строении и гибели организма [247]. Jag-1 играет роль в нескольких аспектах биологии рака, в частности, в опухолевом ангиогенезе, опухолевом росте клеток, трансформации эпителиальных клеток в мезенхимальные, метастатизировании, а также определяет устойчивость к терапии некоторых видов рака [20, 150, 151, 166, 176, 205, 234, 236, 252].

Возрастные изменения в кровоснабжении кожи были изучены на модели индуцированного старения под действием ультрафиолетового света.

Исследователями было установлено, что ультрафиолетовое облучение повышает активность некоторых ангиогенных факторов, в частности VEGF, фактора роста фибробластов, интерлейкин-8 [214]. Наряду с этим было отмечено снижение экспрессии антиангиогенных цитокинов, таких как интерферон- и тромбоспондин-1. Эти наблюдения послужили основанием считать, что VEGF, продуцируемый кератиноцитами, является главным ангиогенным фактором в коже [214]. Тем не менее роль Notch-лигандов — Dll4 и Jag-1 в кровоснабжении дермы человека в возрастном аспекте остается неизученной.

1.5.3. Фактор роста соединительной ткани (CTGF)

CTGF представляет собой протеин, богатый цистеином, принадлежащий к семейству CCN факторов [57, 61]. Члены семейства CCN сначала были идентифицированы как секретируемые белки, синтез которых индуцировался митогенными факторами роста или онкогенами. Первоначально был описан белок CYR 61 (богатый цистеином белок 61 — CCN1) [108], CTGF (CCN2) [67], NOV (CCN3) [201]. CCN4 (WISP1), CCN5 (WISP2) и CCN6 (WISP3) впоследствии были идентифицированы как Wnt-индуцируемые секретируемые белки [262]. Все вместе они составляют семейство шести гомологичных богатых цистеином белков. CCN белки имеют уникальную модульную структуру [57]. Функция белков семейства CCN в организме позвоночных многообразна. CCN1 и CCN2 играют важную роль в общем развитии, ангиогенезе и клеточной адгезии, в то время как CCN3 имеет решающее значение для развития скелетной и сердечной мускулатуры. CCN4, CCN5 и CCN6 рассматриваются как ингибиторы клеточного роста [239]. Установлено, что они участвуют в процессе регенерации, заживления ран, занимают одно из звеньев в патогенезе фибропролиферативных заболеваний, рака. Протеины семейства CCN способны активировать апоптоз в качестве молекул клеточной адгезии, определять цитотоксичность фактора некроза опухоли-, участвовать в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток [189].

CTGF является так называемым клеточно-внеклеточным протеином.

Функциональная особенность таких клеточно-внеклеточных протеинов заключается в том, что они способны связывать структурные компоненты внеклеточного матрикса и факторы роста, цитокины и протеазы.

Реализация функции CTGF осуществляется через интегрирование различных веществ, локализующихся во внеклеточном матриксе. Это приводит к формированию биологического ответа клетки. Молекулярная структура CTGF позволяет ему связывать различные факторы роста, такие как VEGF, трансформирующий фактор роста-, костный морфогенетический протеин-4 [61]. Связывание этих веществ с CTGF приводит к изменению их функциональной активности через трансформирование во взаимодействии с рецепторами. Помимо этого, CTGF связывается с белками внеклеточного матрикса и белками, локализующимися на наружной поверхности клеточной мембраны, такими как интегрины [118], фибронектин [49], синдеканы и перлекан [57, 73]. Интегрирование с этими белками позволяет CTGF участвовать в регуляции взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, клеточной подвижности, адгезии и сигнализации [224].

Синтез индуцируется различными факторами роста, гипоксией, CTGF биомеханическим растяжением ткани, воздействием ультрафиолетового света [71]. Активация секреции CTGF под действием трансформирующего фактора роста- опосредована Smad- регуляторным путем [10].

Большинство исследований о функции CTGF в физиологических условиях касались его участия в фиброзировании тканей как основного стимулятора образования экстрацеллюлярного матрикса [224]. Известно, что CTGF избыточно экспрессируется при всех фиброзных состояниях, индуцируя синтез коллагена I типа [45]. И наоборот, потеря фибробластами способности синтезировать CTGF приводит к снижению накопления коллагена и резистентности к внешнему повреждению [51].

Известно, что VEGF индуцирует продукцию CTGF опосредованно KDR и Flt рецепторами и фосфатидил-инозитол-3-киназным путём [256]. Принимая во внимание факт, что CTGF взаимодействует с VEGF, становится очевидным его участие в ангиогенезе. Доказано, что CTGF обладает мощной ангиогенной активностью. Проангиогенный эффект CTGF связан не с прямой стимуляцией клеток, а с регулированием клеточных связей, участвующих в ангиогенезе [61, 159]. CTGF усиливает адгезию, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и способствует формированию трубчатых структур [70]. CTGF также участвует в построении базальной мембраны эндотелиальных клеток, является посредником во взаимодействии эндотелиальных клеток с перицитами [50].

Имеются данные о способности CTGF привлекать CD34-позитивные стволовые клетки в эндотелий, что приводит к пролиферации эндотелия и неоваскуляризации. Тем не менее установлено, что для некоторых типов тканей CTGF не оказывает влияния на образование новых сосудов и ангиогенез [61].

Таким образом, в современных литературных источниках нет однозначного определения функции CTGF в физиологических условиях. Также не освещены вопросы о его роли в процессе ангиогенеза в дерме на протяжении жизни от эмбрионального периода до старости.

1.5.4. Ангиомотин Ангиомотин представляет собой богатый глутамином протеин с молекулярной массой 72 кДа, который кодируется у человека Amot геном [25, 191]. Первоначально ангиомотин был идентифицирован как ангиостатинсвязывающий белок в клетках эндотелия [172]. Ангиомотин принадлежит к мотин-семейству каркасных белков, которое состоит из трех членов: ангиомотин, Amotl1 и Amotl2 [8, 135]. Известны две изоформы сплайсинга ангиомотина – p80 и p130, которые отличаются по составу N-концевого фрагмента. Изоформа ангиомотина р130 играет роль в определении формы клеток. Она имеет 409 аминокислот на N-концевом участке, что позволяет связываться с актиновыми волокнами [28]. Изоформа р80 в свою очередь повышает миграцию клеток.

Ангиомотин локализуется в цитоплазме клетки в свободном состоянии и в виде трансмембранногого протеина [238]. Функциональная активность ангиомотина проявляется через PDZ-связывающий домен, локализующийся в C-терминальном конце молекулы [249]. Установлено, что ангиомотин способствует формированию плотных межклеточных контактов, участвует в миграции, определении полярности клеток эндотелия [43] и позиционируется в качестве фактора, усиливающего ангиогенез [172].

Ангиомотин и другие белки семейства мотинов связаны с эволюционно консервативным сигнальным Hippo путем, который представляет собой один из ключевых компонентов регуляции таких важных процессов, как апоптоз, контактное ингибирование роста клеток, и связанного с ним контроля размеров внутренних органов [102, 135, 259, 268].

Ангиомотин играет определенную роль в патогенезе рака, реализуя свои эффекты через консервативный путь сигнализации Hippo [26, 27, 136]. На наружной поверхности клетки имеется ангиостатин-связывающий домен, который способен взаимодействовать с ангиомотином. На лабораторных животных установлено, что в ишемизированной конечности Tsk-/+ мышей происходит снижение экспрессии ангиомотина и повышение экспрессии ангиостатина. Такой сдвиг равновесия между проангиогенными и антиангиогенными белками приводил к нарушению формирования новых коллатеральных сосудов [251].

Позитивное окрашивание на ангиомотин было описано в эндотелиальных, соединительнотканных, мышечных клетках [43]. Также его идентифицировали в плаценте человека, а именно в крупных сосудах, капиллярах и в цитотрофобласте [24]. Тем не менее остается практически не изученным вопрос о локализации ангиомотина в структурах дермы человека. В литературных источниках нет данных о возрастных особенностях ангиогенного протеина, не определены соотношения уровня ангиомотина с количеством кровеносных сосудов и фибробластов в дерме.

1.5.5. Эндостатин

Эндостатин представляет собой богатый остатками аргинина протеин с молекулярной массой 20 кДа, который является С-концевым фрагментом коллагена XVIII типа. Наряду с перлеканом и агрином коллаген XVIII типа у человека представляет собой один из основных протеогликанов базальных мембран и прилегающей к ним соединительной ткани. Эндостатин был впервые выделен из кондиционированной культуральной среды неметастатических клеток мышиной гемангиоэндотелиомы линии EOMA [7, 95]. Эндостатин имеет компактную глобулярную кристаллическую структуру, содержащую две дисульфидные связи. Он связывает один атом цинка с помощью трех N-концевых гистидиновых остатков. Образование эндостатина из коллагена XVIII типа катализируется протеолитическими ферментами, в том числе катепсином L и матриксными металлопротеиназами, которые расщепляют пептидные связи на уровне С-концевого домена. Таким образом, процесс образования эндостатина из коллагена рассматривается как один из местных механизмов регуляции ангиогенеза [65]. В качестве рецепторов эндостатина описаны нуклеолин и 51 интегрин [186]. Связывание эндостатина с 51 интегрином на поверхности эндотелиоцитов приводит к снижению интегрин-зависимой клеточной миграции.

Антиангиогенное действие эндостатина также связано с ингибированием матриксной металлопротеиназой-2. Это приводит к нарушению инвазии вновь образованных клеток сосудов в матрикс соединительной ткани [168].

Хорошо изучена функция эндостатина в организме человека [184, 206, 219].

Показано, что он ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, ангиогенез и рост опухолей. Тем не менее остается много нерешенных вопросов в области молекулярного механизма действия эндостатина [94, 101]. На клеточной культуре пупочной вены человека показано, что эндостатин способен блокировать передачу сигнала по пути VEGF, взаимодействуя с рецептором VEGFR-2 эндотелиоцитов. Однако непосредственно с VEGF эндостатин не связывается [96]. Эндостатин является одним из ингибиторов киназы трансактиватора c-Jun (JNK), индуцируемой фактором некроза опухоли-. Это взаимодействие приводит к подавлению экспрессии проангиогенных генов, контролируемых JNK [97].

Имеются работы, указывающие, что результат воздействия эндостатина (про - или антиангиогенный) определяется концентрацией белка и типом эндотелиальных клеток - мишеней. Так, клетки линии HUVEC представлены зрелыми эндотелиоцитами, а клетки линии eESC имеют эмбриональный фенотип.

Эндостатин только в малой концентрации (50 нг/мл) оказывал проангиогенный эффект на эмбриональные эндотелиоциты. В то же время подобный эффект на зрелые клетки не распространялся [144].

Опубликованы сообщения о том, что эндостатин обладает АТФ-азной активностью, которая предположительно лежит в основе антиангиогенного действия на опухолевые клетки. Эндостатин с высоким содержанием АТФ-азы оказывает ингибирующее действие на пролиферацию, миграцию эндотелиальных клеток, а также формирование сосудистых трубочек [98]. Существует мнение, что антиангиогенный потенциал эндостатина обусловлен активацией околоклеточного протеолиза [261]. На модели канцерогенеза кожи мышей показано, что эндостатин может ингибировать опухолевый ангиогенез через VEGF-C сигнальный путь, снижая миграцию тучных клеток [96]. В дополнение к антиангиогенному эффекту недавние исследования на модели острого миокарда у крыс показали, что эндостатин подавляет аномальное ремоделирование тканей и рубцов [265]. Пептиды, выделенные из эндостатина, обладают сильным антифиброзивным потенциалом. Отмечено подавление фиброза, вызванного воздействием трансформирующего фактора роста- и блеомицином в коже человека и лабораторных мышей in vivo и in vitro в присутствии пептида Е4, полученного из эндостатина [264]. В лабораторных условиях на модели кожной раны уха кролика показано, что ингибирование ангиогенеза с помощью эндостатина приводит к лучшему заживлению раны и препятствует формированию гипертрофического рубца [100].

Однако, несмотря на хорошую изученность роли эндостатина в опухолевом ангиогенезе, фибропролиферативных заболеваниях, локализация его в структурах дермы человека, возрастные особенности распределения этого протеина и корреляция этих изменений с количеством кровеносных сосудов и фибробластов в дерме в настоящее время абсолютно не изучены.

1.6. Иммуногистохимические маркеры клеточной пролиферации 1.6.1. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) PCNA представляет собой вспомогательный протеин с молекулярной массой 36 кДа, участвующий в репликации и репарации ДНК, контроле клеточного цикла [233]. Пролиферация – это новобразование клеток и внутриклеточных структур, лежащее в основе роста и дифференцировки тканей.

Пролиферация осуществляется делением клетки за счет митоза. Исследование пролиферативной активности клеток является актуальной проблемой. В связи с этим существует множество способов для ее выявления: прямой подсчет митозов в препаратах, окрашенных гематоксилином, оценка сигналов нуклеотид, меченных в ДНК, проточная цитофлуометрия с определением клеток, находящихся в S-фазе [215]. Но наиболее достоверной методикой считается иммуногистохимическое определение моноклональных антител, специфичных к антигенам определенной фазы клеточного цикла [105]. С этой точки зрения широко изучается PCNA, который, наряду с белком Ki-67, является самым распространенным маркером клеточной пролиферации.

PCNA стимулирует активность ДНК-полимеразы-, тем самым повышает ее процессивность, выступая в качестве платформы, которая скользит вдоль ДНК матрицы [19]. Кроме ДНК-полимеразы- PCNA ассоциируется со множеством других белков, либо непосредственно участвуя в репликации и репарации ДНК, либо регулируя эти процессы [232]. PCNA взаимодействует с белками через специфический белок (PIP), состоящий из восьми PCNA-связывающий аминокислот. Из всех известных PIP белков р21 имеет высокое сродство к PCNA, ингибируя репликацию ДНК и клеточный рост [157]. Максимальная экспрессия PCNA достигается во время S-фазы клеточного цикла, когда формируется комплекс с ингибитором p21 [62, 85, 190, 200, 228].

1.7. Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов

1.7.1. CD31 CD31, или адгезионная молекула-1 тромбоцитов и эндотелия, представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 130 кДа, является структурной составляющей межклеточных адгезионных контактов эндотелиальных клеток [36].

Молекула регулирует подвижность нейтрофилов, хемотаксис CD31 моноцитов, проницаемость сосудистой стенки, ингибирует активацию тромбоцитов, подавляет выработку цитокинов, стимулирует образование простациклинов сосудистой стенкой [18]. CD31 выступает в качестве ключевого фактора, регулирующего барьерную функцию сосудов [197]. CD31 в больших количествах экспрессируется в эндотелиальных клетках. Также небольшие уровни CD31 определяются на поверхности неэритроидных клеток кровеносной системы — тромбоцитов, моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов [175].

Стволовые клетки костного мозга и трансформированные клеточные линии миелоидных клеток и мегакариоцитов также экспрессируют CD31. Было установлено, что CD31 участвует в воспалительных процессах, способствует взаимодействию лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется в три этапа, CD31 контролирует один из них, а именно прохождение лейкоцитов через межклеточные переходы эндотелиальных клеток сосудов [263]. Молекулы CD31 способны взаимодействовать между собой (гомофильное связывание), а также с другими молекулами (гетерофильное связывание). CD31 рассматривается как ранний маркер опухолевого ангиогенеза [37]. Также CD31 играет определенную роль в эмбриональном ангиогенезе, формировании метастазов [188]. Таким образом, комплекс имеющихся литературных данных позволяет считать специфическим CD31 иммуногистохимическим маркером кровеносных сосудов.

Таким образом, проанализировав современные литературные источники, мы пришли к выводу, что:

В современной практической медицине не существует универсальных 1.

методов, способных предотвратить старение кожи. Это связано с отсутствием данных об особенностях морфологических изменений, происходящих в коже в процессе хронологического старения, начиная с эмбрионального периода и до старости.

В современной научной литературе недостаточно освещены вопросы 2.

о пролиферативной активности фибробластов дермы, а также их количественном изменении в онтогенезе.

В литературе мало сведений о сосудистом обеспечении дермы в 3.

онтогенезе, от фетального периода и до старости.

В литературе отсутствуют сведения о содержании регуляторов 4.

ангиогенеза – VEGF, Dll4, Jag-1, эндостатина, ангиомотина, CTGF – в кровеносных сосудах дермы человека в онтогенезе. Кроме того, остается неизвестным значение этих веществ в возникновении возрастных изменений в дерме человека.

Иммуногистохимическое исследование является наиболее 5.

объективной визуализирующей методикой для получения достоверных данных о структурно-функциональных изменениях дермы в онтогенезе.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Объектом исследования служили кусочки кожи нижней части передней поверхности шеи (верхний угол стандартного разреза при аутопсии), полученные при аутопсии плодов человека, умерших от различных причин на сроке 20-40 недель беременности, и людей, умерших от различных причин в возрасте от 1 дня до 85 лет. Отобранные кусочки кожи были без видимых признаков повреждения, воспаления, наличия родимых пятен, рубцов.

Проведение исследования одобрено этическим комитетом медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И. Н. Ульянова.

Забор и первичная обработка материала 2.2.

Кусочки кожи размером 11 см тотчас после извлечения фиксировали погружением в 10%-й забуференный раствор формалина (pH 7,2-7,4) при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем образцы промывали в проточной воде в течение 24 часов. Следующим этапом мы производили обезвоживание тканей в спиртах возрастающей концентрации (70%-й, 80%-й, 90%-й, 96%-й и 100%-й этиловый спирт) по два часа в каждом. Далее последовательно выдерживали в двух порциях ксилола в течение двух часов при комнатной температуре, затем в смеси из ксилола и парафина в соотношении 1:1 при температуре 37°С в течение двух часов.

После этого исследуемые образцы последовательно погружали в две порции чистого расплавленного парафина при температуре 60°С на один час, затем заливали в парафин. Из залитых в парафин тканевых блоков при помощи микротома изготавливали поперечные срезы кожи толщиной 5-7 мкм, которые помещали на предметные стекла, предварительно смазанные раствором полилизина. Срезы на предметных стеклах затем подсушивались в термостате при температуре 37°С в течение двух суток.

Методы исследования 2.3.

Непрямым иммуногистохимическим методом мы определяли антигены, характерные для определенного типа клеток, в частности VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотин, эндостатин, CTGF, PCNA, CD31 в дерме человека.

Для исключения погрешностей, которые могли бы возникнуть в случае даже минимальных отклонений при проведении иммуногистохимической реакции, нами были учтены многие исходные параметры. Мы учитывали температуру воздуха в лабораторном помещении, так как от нее напрямую зависит температура всех используемых растворов. Все препараты по этапам иммуногистохимической реакции проводили одномоментно за один раз. Для всех препаратов использовали одни и те же буферные растворы, инкубационные смеси. В связи с одновременным проведением большого количества срезов это представляло определенную техническую трудность. После завершения основного протокола постановки иммуногистохимических реакций проводили окрашивание срезов гематоксилином.

Мы также производили окраску препаратов гематоксилином и эозином для последующего анализа фибробластов в дерме.

–  –  –

Dll4 выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. На первом этапе мы проводили регидратацию. Подготовленные срезы помещали последовательно в ксилол, 100%-й спирт и спирт, 96%-й дистиллированную воду по пять минут в каждом растворе при комнатной температуре. Следующим этапом проводили инактивацию эндогенной пероксидазы. Это достигали помещением препаратов в 0,1%-й раствор перекиси водорода на 10 минут. Далее срезы промывали, помещая последовательно (по пять минут в каждой) в дистиллированную воду и три порции 0,05 М трис-буфера с добавлением 0,15 М натрия хлорида (TBS) с рН 7,2-7,6. Затем следовала инкубация в растворе первых кроличьих антител против Dll4 (AHP1274, AbDSerotec, Великобритания). Антитела разводили на TBS с добавлением 0,1%ого тритона Х-100, в соотношении 1:100. Инкубация продолжалась в течение 12 часов при комнатной температуре. На следующем этапе промывали препараты в трех порциях TBS по 20 минут в каждой. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). На следующем этапе промывали срезы тремя порциями TBS по 20 минут в каждой. Для проведения гистохимической реакции на пероксидазу использовали (SigmaChemical, США).

3,3-диаминобензидин Первоначально мы изготавливали инкубационный раствор, включающий в себя 100 мг имидазола,50 мг 3,3-диаминобензидина и 200 мл TBS с рН 7,4. Раствор профильтровывали, затем добавляли 25 мкл 33%-ого раствора перекиси водорода и тщательно перемешивали. В приготовленный раствор помещали исследуемые препараты на 10 минут при комнатной температуре. Результатом данной процедуры было окрашивание продукта реакции в коричневый цвет. На заключительном этапе проводили докрашивание клеточных ядер гематоксилином.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов. После предварительной подготовки срезов и иннактивации эндогенной пероксидазы мы также промывали срезы в трех порциях раствора TBS с pH 7,2-7,4 по пять минут. Но затем проводили инкубацию в растворе с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1% в течение 12 часов. Последующие этапы обработки срезов не отличались от иммуногистохимического окрашивания. При использовании данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

–  –  –

Jag-1 выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения Jag-1 в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против Jag-1 (NBP1-90208, NovusBiologicalsInc., США) в разведении 1:100. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления Jag-1 были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

Выявление VEGF 2.6.

VEGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения VEGF в дерме в качестве первых антител использовали кроличьи антитела против VEGF (NBP1 -22844, NovusBiologicalsInc., США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, Дания). Иммуногистохимические DakoCytomation, методики и временные характеристики выявления VEGF были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

2.7. Выявление ангиомотина

Ангиомотин выявляли при помощи непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения ангиомотин-позитивных структур дермы в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против ангиомотина (ab85143, США). Визуализацию антигенов Abcam, проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления ангиомотина были такими же, как при выявлении Dll4.

При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

Выявление эндостатина 2.8.

Выявление эндостатина производили с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения эндостатина в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против эндостатина (ab53702, Abcam, США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления эндостатина были такими же, как при выявлении Dll4.

При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

2.9. Выявление CD31

CD31-иммунопозитивные кровеносные сосуды выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения CD31позитивных сосудов в дерме в качестве первых антител мы использовали мышиные моноклональные антитела против CD31 (M 0823, DakoCytomation, Дания). В качестве вторых антител использовали антимышиную EnVision систему, конъюгированную с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания).

Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления CD31 были аналогичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

2.10. Выявление CTGF CTGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения CTGF в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против CTGF (AHP 1278, AbDSerotec, Великобритания).

Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания).

Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

2.11. Выявление PCNA

PCNA выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения PCNA-позитивных клеток дермы в качестве первых антител использовали кроличьи антитела против PCNA (AHP1419, AbDSerotec, Великобритания). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания).

Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления были аналогичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

2.12. Выявление фибробластов в дерме

Визуализацию фибробластов проводили в препаратах, окрашенных гематокислином и эозином, а также в срезах с иммуногистохимическими реакциями, где ядра докрашивались гематоксилином. После завершающего этапа иммуногистохимической реакции (реакция выявления эндогенной пероксидазы) предметные стекла со срезами промывали в дистиллированной воде в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее препараты погружали в предварительно профильтрованный раствор гематоксилина на семь минут при комнатной температуре. Затем все стекла промывали в дистиллированной воде при постоянном помешивании в течение одной минуты. Затем проводили обезвоживание в спиртах восходящей концентрации и после просветления в ксилоле срезы заключали в канадский бальзам.

В результате окраски гематоксилином ядра клеток приобретают характерный сине-фиолетовый цвет. Для фибробластов характерна своеобразная морфология. Они выглядят как клетки с маленьким объемом цитоплазмы и веретенообразным или вытянутым угловатым ядром.

2.13. Количественная оценка результатов

Количественную оценку результатов исследования проводили с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений, включающей в себя световой микроскоп Olympus CX-21, цифровую камеру Olympus Camedia 4040z, персональный компьютер и программу SigmaScanPro 5.0 (SPSS Inc., США).

Используя световой микроскоп, находили участки дермы без волосяных фолликулов, которые фотографировали при увеличении объектива 40х [91]. Затем полученные фотографии переносили на компьютер и оценивали интенсивность окрашивания VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотина, эндостатина в кровеносных сосудах в трех - пяти случайно выбранных полях зрения в каждом срезе. Интенсивность окраски определяли вслепую без исходных данных о возрасте и половой принадлежности субъекта, у которого был взят кусочек кожи для исследования.

Интенсивность окрашивания квалифицировали по четырём степеням: без окрашивания, со слабым окрашиванием, со средним окрашиванием и с сильным окрашиванием [14, 216]. Затем данные по интенсивности окрашивания сопоставляли с возрастом и половой принадлежностью и рассчитывали процент случаев с каждой степенью окрашивания в каждой возрастной группе.

Для определения числа кровеносных сосудов дермы с положительной окраской эндотелия на антиген CD31, количества фибробластов с положительной окраской на PCNA и общего числа фибробластов, фибробластов и сосудов с положительной окраской на CTGF вычисляли площадь сфотографированных участков и подсчитывали количество сосудов или соответствующих клеток в них [5, 14]. Как минимум 10 случайно выбранных срезов фотографировались у каждого человека и три - пять полей зрения были сфотографированы в каждом срезе.

2.14. Статистическая обработка результатов

Все случаи мы группировали по возрастному принципу:

Группа 1 — плоды на сроке беременности 20-40 недель.

Группа 2— люди в возрасте от 1 дня до 20 лет.

Группа 3 — люди в возрасте 21-40 лет.

Группа 4 — люди в возрасте 41-60 лет.

Группа 5 — люди в возрасте 61-80 лет.

Для определения Dll4 исследовали 150 кусочков кожи (72 женщины и 78 мужчин): группа 1 – 24 случая, группа 2 – 41 случай, группа 3 – 33 случая, группа 4–25 случаев, группа 5 – 27 случаев.

Для выявления Jag-1 использовали 120 кусочков кожи (58 женщин и 62 мужчины): группа 1 – 21 случай, группа 2 – 25 случаев, группа 3 – 21 случай, группа 4 – 25 случаев, группа 5 – 28 случаев.

Для выявления VEGF использовали 128 кусочков кожи (59 женщин и 69 мужчин): группа 1 – 21 случай, группа 2 –31 случай, группа 3 – 26 случаев, группа 4 – 24 случая, группа 5 – 26 случаев.

Для исследования ангиомотина было использовано 115 кусочков кожи (57 женщин и 58 мужчин): группа 1 –22 случая, группа 2 – 26 случаев, группа 3 – 19 случаев, группа 4 – 21 случай, группа 5 – 27 случаев.

Для исследования экспрессии эндостатина было использовано 99 кусочков кожи (46 женщин и 53 мужчины): группа 1 – 17 случаев, группа 2 – 23 случая, группа 3 – 16 случаев, группа 4 – 20 случаев, группа 5 – 24 случая.

Для исследования CTGF было использовано 97 кусочков кожи (47 женщин и 50 мужчин): группа 1 – 18 случаев, группа 2 – 21 случая, группа 3 – 17 случаев, группа 4 – 19 случаев, группа 5 – 22 случая Для определения числа PCNA положительных клеток было изучено 139 кусочков кожи (104 мужчины и 35 женщин): группа 1– 25 случаев, группа 2 – 33 случая, группа 3 – 40 случаев, группа 4 – 26 случаев, группа 5– 15 случаев.

Для исследования кровеносных сосудов было CD31-позитивных использовано 94 кусочка кожи (60 мужчин и 34 женщины): группа 1 – 23 случая, группа 2– 14 случаев, группа 3 – 24 случая, группа 4 – 15 случаев, группа 5 – 18 случаев.

Для подсчета числа фибробластов было исследовано 357 кусочков кожи (218 мужчин и 139 женщин): группа 1 – 57 случаев, группа 2 – 55 случаев, группа 3 – 99 случаев, группа 4 – 84 случая, группа 5 – 64 случая.

Достоверность изменений интенсивности окрашивания сосудов на Dll4, JagVEGF, ангиомотин и эндостатин оценивали с помощью непараметрического критерия 2. По каждой группе данных для CTGF, CD31, PCNA и фибробластов рассчитывались средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m). Достоверность влияния возраста или пола на исследуемые параметры кожи оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Взаимосвязи между возрастом и параметрами кожи оценивались с применением непараметрического рангового корреляционного анализа Спирмена.

Корреляционный анализ проводился без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р 0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование VEGF в дерме в различные возрастные периоды В коже человека, окрашенной на VEGF, мы выявили VEGF-позитивные сосуды по всей толщине дермы у плодов и лиц во всех возрастных периодах от 0 до 85 лет. Положительно окрашивались на преимущественно VEGF эндотелиальные клетки, а другие компоненты сосудистой стенки не были окрашены. Анализ степени окрашивания сосудов проводили во всех сосудах дермы без разделения на типы. Ввиду того, что у плодов и людей в возрасте старше 60 лет стирается граница между сосочковым и сетчатым слоями дермы, анализ интенсивности окрашивания сосудов на VEGF выполняли во всей толщине дермы без разделения на слои.

Для исследования VEGF было использовано 128 кусочков кожи человека:

59 кусочков кожи от лиц женского пола и 69 кусочков от лиц мужского пола.

В антенатальном периоде (группа 1) нами был проанализирован 21 образец кожи плодов: 12 образцов от плодов женского пола и 9 – от плодов мужского пола. Исследование показало, что у плодов преобладали случаи с не окрашенными на VEGF сосудами дермы, что составило 42,86%. Доля случаев со слабой иммунореактивностью сосудов дермы на VEGF составила 33,33% (рисунок 1, А). Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF составило 19,05% (рисунок 1, Б). В антенатальном периоде доля случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF была незначительна и составила 4,76% (рисунок 1, В).

А Б В Рисунок 1 – Кровеносные сосуды со слабой (А), средней (Б) и сильной (В) степенью окрашивания на VEGF в дерме плодов 20-40 недель беременности (1-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х В группе 2 (0-20 лет) мы исследовали 31 препарат кожи человека: 14 препаратов от лиц женского пола и 17 препаратов от лиц мужского пола. В данном возрастном периоде доля случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы составила 29,03%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания кровеносных сосудов дермы на VEGF равнялось 35,48% (рисунок 2, А). Доля случаев со средней степенью окрашивания сосудов дермы на VEGF составила 22,58%. Сильная иммунореактивность сосудов на VEGF в данной группе выявлена в 12,9% случаев (рисунок 2, Б).

Таким образом, в возрасте от 0 до 20 лет преобладали случаи со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на VEGF.

А Б Рисунок 2 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 0 до 20 лет (2-я группа).

Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х При сравнении группы 1 (плоды на сроке беременности 20-40 недель) и группы 2 (0-20 лет) мы выявили уменьшение доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы в постнатальном периоде. Количество случаев со слабой и средней иммунореактивностью сосудов на VEGF было практически идентично в обеих группах. В возрасте от 0 до 20 лет отмечается увеличение в 3 раза доли случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF по сравнению с кожей плодов (рисунок 3). Отличия между группами 1 и 2 оценены статистически с помощью критерия 2. Они оказались достоверными (р0,001) по критерию 2.

–  –  –

Рисунок 3 – Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на VEGF в кровеносных сосудах дермы человека в зависимости от возраста. Достоверность отличий между группами 1 и 2 – p0,001; между группами 2 и 3 – p0,01.

Отличия между группами 3 и 4, группами 4 и 5 недостоверны (критерий 2) А Б Рисунок 4 – Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на VEGF в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа).

Непрямая иммуногистохимическая реакция на VEGF. Увеличение 40х

В возрастном периоде от 21 до 40 лет мы исследовали 26 кусочков кожи:

7 кусочков кожи от лиц женского пола и 19 кусочков от лиц мужского пола. В группе 3 доля случаев с не окрашенными на VEGF микрососудами дермы составила 19,23%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF составило 30,77% (см. рисунок 4, А). Доля случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF равнялась 34,62%. В возрасте от 21 до 40 лет сильная иммунореактивность сосудов на VEGF выявлена в 15,38% случаев (см. рисунок 4, Б).

При сравнении группы 2 (0-20 лет) и группы 3 (21-40 лет) мы наблюдали сохранение тенденции к некоторому уменьшению доли случаев с не окрашенными на VEGF сосудами дермы в старшем возрастном периоде. Доля случаев со слабой и сильной интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF в сравниваемых группах сильно не отличалась. Количество случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов дермы на VEGF в группе 3 было больше, чем в группе 2, на 34% (см. рисунок 3). При сравнении группы 2 и группы 3 были выявлены достоверные изменения по критерию 2 (р0,01).



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
 

Похожие работы:

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Улановская Ирина Владимировна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEMEROCALLIS HYBRIDA HORT. КОЛЛЕКЦИИ НИКИТСКОГО БОТАНИЧЕСКОГО САДА 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор З.К. Клименко Ялта – 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ 1. ИСТОРИЯ...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«СОКУР Светлана Александровна ОПТИМИЗАЦИЯ ИСХОДОВ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С ПОВЫШЕННЫМ УРОВНЕМ АНЕУПЛОИДИИ В СПЕРМАТОЗОИДАХ 14.01.01акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители:...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНУРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор с.-х. наук, профессор КАХАРОВ К.Х. Душанбе, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ...»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.