WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ...»

-- [ Страница 3 ] --

Рисунок 4 - Зависимость между количеством пороговых циклов амплификации (Ct) установленных в ОТ-ПЦР-РВ и концентрацией инфекционных доз вируса* (lgTj, ЦД50) для ТОК Представлена регрессионная модель вида: "lgT=18,854-5,216(lnCt), где "lgT - логарифм прогнозируемой концентрации (титра) инфекционного вируса для заданного значения Ct.

Указан коэффициента детерминации (R), оценивающий адекватность модели.

*- использован штамм Н-120 вируса ИБК в составе экстраэмбриональной жидкости инфицированных СПФ-эмбрионов кур Результаты, представленные на рисунке 4 показывают, что величины lgТ и Ct имели выраженную связь. Соответствующий коэффициент корреляции R=-0,978±0,046 имел высокий уровень значимости (р0,001). Развернутой характеристикой данной связи являлось полученное методом наименьших квадратов регрессионное уравнение вида:

"lgT=18,854-5,216(lnCt), {3} где: ”lgT – логарифм прогнозируемого титра вируса для заданного значения Ct (в объеме образца 0,1мл, который тестируется в ОТ-ПЦР-РВ).

Построенная модель {3} имела высокий уровень адекватности (R=957) и могла быть использована для соответствующих прогнозов. Однако как и для модели {2}, операции прогнозирования не должны распространяться вне границ диапазона 10Ct35.

Остаточные среднеквадратичные отклонения регрессий в моделях {2} и {3} составили значения G±0,296 и G±0,375, соответственно. Рассчитанные на 61 основании указанных величин стандартные ошибки показателей "lgT в границах принятого для прогноза диапазона Сt не превосходили значение ±0,27. Эта величина была вполне сопоставима со стандартными ошибками логарифмических показателей инфекционных титров, установленных при обычной процедуре титрования как на СПФ-эмбрионах, так и на ТОК, где соответствующие оценки находились в границах от ±0,13 до ±0,29.

При постановке данного варианта ОТ-ПЦР-РВ использованные праймеры были ориентированы на амплификацию участка вирусного генома, который кодирует область капсидного белка S1. Поскольку указанный участок является идентичным для всех штаммов вируса ИБК, то считали возможным использовать построенные модели {2} и {3} для прогноза величины инфекционного титра не только для штамма Н-120, но и для других вариантов данного вируса.

3.2 Изучение развития вируса ИБК в организме куриного эмбриона Задачей настоящего этапа работы являлось исследование динамики накопления вируса ИБК в различных частях инфицированного эмбриона. Кроме этого, планировали провести сравнение опосредованных оценок инфекционного титра вируса на основе показателей Ct по уравнению {3} и фактически установленных значений инфекционного титра для ТОК.

С этой целью вирусом ИБК штамм Н-120 инфицировали группу из 50 СПФэмбрионов. При этом 10 интактных эмбрионов инкубировали совместно в качестве контроля. В продолжение 96 часов, каждые 4 часа, от двух произвольно выбранных инфицированных эмбрионов отбирали образцы следующих биоматериалов:

- ткань тела эмбриона (ТЭ);

- ткань хориаллантоисной оболочки (ХАО);

- амниотическую жидкости (АЖ);

- смеси амниотической и аллантоисной жидкостей (экстраэмбриональную жидкость -ЭЭЖ).

Из тканевых образцов на физиологическом растворе готовили суспензии:

ТЭ и ХАО Приготовленные суспензии осветляли

- 10% - 50%.

центрифугированием при 1500g.

Полученные образцы биоматериалов использовали для исследования в ОТ-ПЦР-РВ, где определяли значения Ct, и - для титрования в ТОК, где оценивали величину lgT (ЦД50).

Установленные величины Ct использовали для расчета прогнозируемых показателей по уравнению При этом значения для "lgT {3}. "lgT суспендированных материалов, корректировали на величину разбавления ткани в суспензии. Полученные результаты соответственно типам тестируемых образцов и времени их отбора в виде диаграмм представлены на рисунке 5.

Данные, приведенные на рисунке 5, позволяют сделать ряд заключений. Во всех исследуемых образцах профили распределений фактических и прогнозируемых показателей инфекционных титров (lgT и "lgT) по параметру времени демонстрировали очевидное подобие. Средняя разность (часы) хронологически соответствующих величин (T= lgT - "lgT) по изученному диапазону для образцов ТЭ, ХАО, АЖ и ЭЭЖ составила статистически незначимые величины: и 0,19±0,16, -0,06±0,17, -0,11±0,09 -0,07±0,18, соответственно. Следовательно, использование уравнения {1} для расчетов прогнозируемых величин инфекционных титров вируса в биоматериалах было допустимо.

Динамика фактической и прогнозируемой инфекционной активности вируса во всех биоматериалах имела в той или иной мере выраженные три фазы. Фазу роста, которая для образцов ХАО и ЭЭЖ заканчивалась к 20 часам, а для образцов ТЭ и АЖ - к 50 часам культивирования вируса, фазу стабилизации, продолжавшуюся для большинства образцов до 7080 часов, и далее фазу угасания, где, за исключением образца ТЭ, происходило видимое снижение показателей инфекционности.

–  –  –

Рисунок 5 - Динамика накопления вируса ИБК (lgT) в различных частях инфицированного эмбриона соответственно времени культивирования (часы) Представлены данные титрования в органной культуре трахеи цыпленка () и прогнозируемые значения титра вируса (), рассчитанные по уравнению"lgT=18,854-5,216(lnCt) на основе оценок пороговых циклов (Ct), уставленных в ОТ-ПЦР-РВ По абсолютным значениям фактических титров (6,36,5 lgЦД50/0,1см) на фазе стабилизации, после 20 часов культивирования, наибольшее накопление вируса было показано в образцах ХАО и ЭЭЖ. В образцах АЖ максимум накопления 6,48 lgЦД50/0,1мл наблюдали только после 60 часов. В образцах ТЭ накопление не превышало 5,5 lgЦД50/0,1мл.

Результаты исследования динамики накопления вируса в различных частях эмбриона свидетельствуют, что наиболее вероятным местом репродукции возбудителя является ткань хориоаллантоисной оболочки. Далее вирус диффундирует в аллантоисную полость и, в интервале часов культивирования, в наибольшем титре (до 6,5 lgЦД50/0,1мл) накапливается в экстраэмбриональной жидкости, где, без значимой потери активности, может сохраняться. до 60 часов. В амниотическую полость диффузия вируса происходит значительно медленнее. В тканях тела эмбриона вирус присутствует в наименьшей концентрации.

3.3 Изучение инфекционных свойств различных штаммов вируса ИБК для СПФ-эмбрионов и ТОК Исследовали инфекционную активность вируса ИБК штаммов Н-120, М-41 и D-274 в тест-системах СПФ-эмбрионов кур и переживающих эксплантантах ТОК. Вирусные материалы находились в составе экстраэмбриональной жидкости, полученной от инфицированных СПФ-эмбрионов. Для обеих чувствительных систем использовали стандартные методы титрования последовательными разведениями. Испытание каждого разведения в обеих системах проводили на 4 тест-объектах. Величину инфекционного титра вируса рассчитывали по Керберу и выражали в ЭИД50/0,1см при титровании на эмбрионах и - в ЦД50/0,1см при титровании на ТОК. Полученные результаты представлено в таблице 3.

Анализ данных представленных в таблице 3 позволил сделать следующие заключения. Все изученные штаммы, не зависимо от абсолютных средних значений титра (Т), имели относительно большую инфекционную активность при титровании на СПФ-эмбрионов (lgT1), чем в отношении ТОК (lgT2).

–  –  –

Различия между соответствующими оценками (d=lgT1- lgT2) для штаммов Н-120, М-41 и D-274 составили 0,52±0,16 (p0,02), 0,50±0,18 (p0,05) и 0,85±0,17 (p0,002), соответственно.

В биологическом смысле показатель d мог быть обусловлен следующими причинами: а) присутствием в составе изучаемых популяций вируса ИБК компонентов, которые различаются по своему тропизму; б) - меньшей чувствительностью тест-системы ТОК по сравнению с СПФ-эмбрионами (не полным выявлением инфекционного вируса).

Поскольку установленные значения d не имели статистических различий, была определена средняя величина логарифмической разницы инфекционных титров вируса в тест-системах СПФ-эмбрионов и ТОК, которая составила значение 0,62±0,10. Данная оценка была принята в качестве корректирующего коэффициента.

Следует отметить, что использование эксплантантов ТОК для определения инфекционного титра вируса ИБК в сравнении с СПФ-эмбрионами имеет существенные экономические преимущества, поскольку от одного эмбриона в возрасте 20 сут может быть получено не менее 15 эксплантантов.

66

3.4 Патогенез вируса инфекционного бронхита кур 3.4.1 Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам ПЦР Изучение патогенеза заразных болезней практически невозможно без выявления путей проникновения микроорганизма и его распространения в организме хозяина.

Классическое представление о патогенезе ИБК [88] предполагает, что репликация вируса, попавшего в организм респираторным путем, осуществляется в эпителиальных клетках трахеи. Далее происходит генерализация инфекционного процесса, и вирус по лимфатической и кровеносной системам распространяется (диссеминирует) по организму птицы, поражая различные органы.

Однако очевидно, что на характер патогенеза заболевания существенное влияние может оказывать тропизм, присущий данному варианту возбудителя. В отношении вируса ИБК различия тропности штаммов [81, 88], вероятно, могут определять особенности патогенетической картины болезни.

Задачей настоящего этапа работы было сравнительное исследование хронологической диссеминации различных штаммов вируса ИБК (Н-120, QX и 4/91) в организме цыплят. Оценочным показателем тропности возбудителя считали его накопление в тканях определенных органов. Величину накопления вируса определяли опосредовано по уравнению {2} на основании оценки концентрации вирусного генома (Ct}, установленной в ОТ-ПЦР-РВ В качестве подопытной птицы использовали выведенных из СПФэмбрионов кур клинически здоровых цыплят в возрасте 15 сут. Птиц содержали в клетках, оборудованных кормушками и поилками. Рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц данной возрастной категории.

Соответственно исследуемым штаммам вируса были сформированы опытные группы цыплят (Н-120; 4/91 и QX) по 50 голов и одна контрольная группа (30 голов). В опытных группах провели окуляро-назальное заражение. Для всех штаммов была принята одинаковая заражающая доза: 104 ЭИД50 в объеме 1 см. В контрольной группе заражение не проводили. Во всех группах проводили ежедневны клинической осмотр птицы.

Через заданные интервалы времени из опытных групп отбирали по 3 цыпленка, а также по одному цыпленку из контрольной группы. Цыплят после эвтаназии подвергали патологоанатомическому исследованию.

При вскрытии у каждого цыпленка асептически отбирали образцы тканей дыхательной системы (трахеи и легкие), почки, миндалины слепой кишки и репродуктивных органов. Пробы заморажавали при -35С и использовали для детекции вирусного генома в ПЦР.

Клинические наблюдения. На 5-7 сут. после заражения во всех опытных группах наблюдали признаки респираторной патологии (кашель, трахеальные хрипы и носовые выделения). В группе QX у цыплят присутствовала слабость, заметное снижение аппетита и гибель 2 птиц на 5 сут после заражения.

Исследование диссеминации вируса в организме. На основании данных ПЦР исследовали распространение вируса в организме подопытных цыплят. В полученных образцах тканей различных органов, соответственно испытанным штаммам, в динамике определяли показатели и проводили расчет Ct прогнозируемых величин“lgT в размерности ЭИД50. Полученные результаты в виде диаграмм приведены на рисунке 6.

Представленные диаграммы иллюстрируют, что инфекционный процесс у всех исследуемых штаммов в большинстве случаев имел схожие черты.

Прослеживалась начальная фаза (рост инфекционного титра), фаза максимального накопления и фаза снижения концентрации возбудителя (регрессия титра).

Однако, при сохранении общей картины, по количественным показателям штаммы имели различия. Вирус штамма Н-120 наиболее эффективно репродуцировался в респираторной системе. В других органах его воспроизводство было менее интенсивно. Особенно указанное отставание было заметно в тканях миндалин слепой кишки.

–  –  –

0

-2

-2 Рисунок 6 - Динамика накопления вируса ИБК (прогнозируемая величина титра по данным ПЦР, T) в пробах тканей различных органов птиц соответственных штаммов ("Н-120"- —, "4/91" - и "QX" - ) и времени после заражения (сут) Штамм 4/91 в респираторной системе хронологически достигал максимума своего накопления менее чем за 5 сут, однако его наибольший титр был примерно на порядок ниже, чем у штамма Н-120. Эффективность развития штамма QX в респираторных органах была несколько ниже, чем у штамма Н-120, но в период с 5 по 10 сут заметно превышала репродукцию штамма 4/91.

В почках после 7 сут постоянным превосходством обладал штамм QX. В миндалинах слепой кишки и репродуктивных органах интенсивность развития штаммов QX и 4/91 была приближенно одинаковой.

Возможно допустить, что у всех штаммов прогрессивные фазы инфекционного процесса в большей степени были зависимы от адаптированности вируса к данному типу ткани. Например, Н-120 явно доминировал в респираторных органах. При этом для QX более благоприятной зоной развития была ткань почек. Очевидно, что вариант QX, как и другие штаммы, начинал развитие в трахее, далее, достигнув тканей почек, там продемонстрировал наибольший пик накопления.

Регрессия прогнозируемых титров вируса, наблюдаемая для всех штаммов в основном через 7 сут после инфицирования, вероятно, являлась результатом развития иммунной реакции со стороны организма.

Исключение составляют процессы, зарегистрированные в миндалинах слепой кишки. В указанных органах количество генетического материала штаммов QX и 4/91 на протяжении всего эксперимента превосходило концентрацию продуктов репродукции штамма Н-120. При этом ожидаемые различия инфекционных титров относительно отмеченного штамма в среднем должны составлять более 2 порядков.

Анализ приведенных результатов показал, что для всех исследуемых штаммов вируса ИБК ткани респираторной системы птиц в начальной фазе развития инфекционного процесса являются наиболее благоприятной (элективной) зоной. В данной области организма на 5 сут после инфицирования ожидаемые по накоплению генетического материала прогнозируемые величины "lgT составили от 3,95 у штамма QX, до 5,00 у штамма Н-120.

Последующий процесс вирусной диссеминации, очевидно, происходил как вторичное явление. Во всех остальных тканях максимальные оценки титров приходились на 7-е или 10-е сут.

По эффективности развития вне респираторной системы очевидным лидером следует считать штамм QX, который через 7 - 9 сут имел показатель "lgT до 4,33, 4,15 и 3,85 в почках, в миндалинах слепой кишки и в тканях репродуктивных органов, соответственно. При этом распространение в организме птицы штамма Н-120 было значительно менее выражено. В отмеченном временном интервале аналогичные оценки составили 3,29, 2,52 и 2,08.

Промежуточное положение занял штамм 4/91.

Провели сравнительный анализ тропности исследуемых штаммов по отношению к изученным видам тканей. В качестве условного показателя, характеризующего относительную адаптированность штамма к определенному виду ткани, приняли величину логарифмической разности между ожидаемыми титрами вируса штамма H-120 (референтный штамм) и хронологически соответствующим аналогом другого штамма. Соответствующий расчет проводили по формуле {4}:

dj="lgTj - "lgT0, {4} где dj - коэффициент изучаемого штамма на данном интервале времени (j);

"lgTj и "lgT0 - хронологически совпадающие оценки титров изучаемого штамма и штамма Н-120 (референта), соответственно.

Результирующей оценкой адаптированности штамма (i) по референту приняли медиану ('di) хронологической выборки величин dji. При этом положительное значение коэффициента ('d0) рассматривали как тенденцию к большей адаптированности штамма относительно референта, отрицательное значение ('d0) считали оценкой меньшей адаптированности. Полученные результаты представлены в таблице 4.

–  –  –

В биологическом смысле это означало, что ожидаемое накопление штамма 4/91 превосходило референтный вирус в зависимости от вида ткани в диапазоне от 2,4 до 65 раз. При этом развитие штамма QX при аналогичном сопоставлении было интенсивнее референтного вируса в диапазоне от 11 до 324 раз.

Важно отметить, что значительное превышение титров штаммов 4/91 и QX по отношению к референтному, установленное в миндалинах слепой кишки, может указывать на тропизм отмеченных возбудителей к лимфоидной ткани.

Полученные в ходе исследований результаты позволили сделать ряд заключений.

Показали, что примененный способ опосредованной оценки эффективности накопления вирусного генома с помощью ПЦР позволил установить различия концентрации продуктов репродукции вируса в различных тканях и, вероятно, может быть использован как средство оценки адаптированности инфекта.

Сопоставление прогнозируемых оценок накопления вируса относительно референтного штамма ("Н-120") показало, что различия в титрах вируса (как степени адаптированности) в зависимости от вида тканей может достигать 324 раз.

3.4.2 Патологоанатомические и гистологические изменения в почках и трахеи птиц, вызванные различными штаммами вируса ИБК Клинические наблюдения, установленные за цыплятами, полученными из СПФ-яиц, инфицированых вирусом ИБК штамм Н120, 4/91 и QX (дозы 104 ЭИД50), показали, что на 3 день после заражения у птиц присутствовала одышка, кашель, трахеальные хрипы и носовые выделения. При этом в группе QX признаки переболевания были выражены ярче. Перечисленные симптомы исчезали в течение 7-8 дней.

В опытных и контрольной группах птиц на фазе максимального развития клинической картины параллельно с отбором проб для ОТ-ПЦР-РВ получали образцы тканей для гистологических исследований и проводили патологоанатомический анализ.

Наиболее выраженные патологоанатомические изменения обнаруживали в группах цыплят, инфицированных штаммами QX и 4/91. В группе QX на 3 день после заражения в трахее обнаруживали гиперемию слизистой оболочки, скопление серозно-слизистого экссудата.

В группе цыплят, инфицированных штаммом QX, в трахее обнаруживали гиперемию слизистой оболочки, скопление серозно-слизистого экссудата на 3 день после заражения. У цыплят, инфицированных штаммами QX и 4/91, со стороны почек обнаруживали одинаковые поражения, заключающиеся в следующем: в почках отмечали анемию и нефрито-нефрозный синдром на 7 сут после заражения, а также отложение большого количества мочекислых солей в почках и в мочеточниках (рисунок 7).

Гистологические изменения. У цыплят инфицированных штаммами Н-120, QX и 4/91Через сутки после заражения в трахее наблюдали слабое утолщение слизистой оболочки за счет отека, лимфоидной инфильтрации, потерю ресничек и десквамацию эпителиальных клеток. Через 3 сут после заражения почти все реснички исчезали с поверхности эпителия. Слизистая и подслизистая оболочки сильно инфильтрированы лимфоцитами и псевдоэозинофилами. Местами слизистая оболочка покрыта пленками фибрина. А также наблюдали гиперплазию эпителия трахеи. К 8-9 сут начиналось восстановление реснитчатого эпителия и заканчивалось к 11-14 сут после заражения (рисунок 8).

–  –  –

Рисунок 7 - Макроскопические изменения в почках цыплят, инфицированных вирусом ИБК штамм 4/91 и QX Почечные поражения, связанные с ИБК. Воспаление почек с канальцами и мочеточниками, заполненными уратами A- почки анемичные и отёчные;

B- почечные канальцы и мочеточники заполнены уратами;

C- анемичные почки;

D – морфология нормальных почек (контрольная группа) А В

–  –  –

Рисунок 8 - Микроскопические изменения в трахее цыплят, инфицированных вирусом ИБК штамм Н-120, 4/91 и QX A - без признаков патологии;

B - легкая гиперплазии эпителия и незначительная субэпителиальная лимфоидная инфильтрации, слабое утолщение слизистой оболочки за счет отека;

C - умеренная гиперплазии эпителия с потерей ресничек и умеренная субэпителиальная лимфоидная инфильтрация, умеренное утолщение слизистой оболочки;

D - тяжелая гиперплазия эпителия и сильная субэпителиальная лимфоидная инфильтрация, умеренное утолщение слизистой оболочки. Все реснички исчезают с поверхности эпителия и произошла десквамация эпителиальных и секретирующих клеток слизистой оболочки Гистологические изменения в почках наблюдали через 3-е сут. после заражения. Вирус ИБК штамм 4/91и QX вызывал дистрофию, вакуолизацию и десквамацию в эпителии почечных канальцев. Изменения наблюдались в основном в собирательных протоках, прямых канальцах и в дистальных извитых канальцах мозгового вещества почки. Между 4-ми и 5-ми сут после заражения изменения были более генерализоваными и захватывали кору и мозговое вещество. Дегенерация клеток и некрозы обнаруживали в канальцах и в протоках коркового и мозгового вещества и особенно в собирательных протоках, прямых канальцах и в дистальных извитых канальцах. А также наблюдали интерстициальный отек с инфильтрацией из лимфоцитов и макрофагов (рисунок 9).

контроль опыт Рисунок 9 - Микрофотографии образцов мозговой ткани почек, взятых в контрольной и опытной, инфицированных вирусом ИБК штамм 4/91 и QX У инфицированных птиц присутствует интерстициальный отек почечных канальцев с выраженной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами Определение цилиарной активности в ТОК проводили в соответствии с методикой Чупиной О.А. [26, 27].

Для оценки состояния эпителиальных ресничек в образце одной трахеи, в точках, равноудаленных от краев препарата, готовили не менее 4 кольцевых срезов (эксплантантов) толщиной около 1 мм. Срезы от каждого образца трахеи помешали в лунки пластиковых панелей в среде ПСС и исследовали на инвертированном оптическом микроскопе при инструментальном увеличении х 64 и 140.

Индикацию инфекционного действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза. Степень распространения цилиостаза оценивали в условных баллах, которые характеризовали процент неподвижных (или десквамированных) ресничек, наблюдаемый по окружности (периметре) внутренней поверхности среза трахеи.

Была принята следующая шкала оценок (баллы): 4- цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра; 3- цилиостаз присутствует на протяженности не менее 1/4 периметра; 2- охват цилиостазом не менее 1/2 периметра; 1 - охват цилиостазом не менее 3/4 периметра; 0- охват более 3/4 периметра.

Соответственно изученным штаммам и времени после инфицирования определяли средние оценки цилиостатической активности по результатам имерений не менее 4 эксплантантов (n4). Исследование проводили в период 1 - 21 сут. после инфицирорвания. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Анализ данных таблицы 5 показал, что независимо от штамма воздействие вируса на реснитчатый эпителий птицы имело период роста и период угасания.

Цилиостатический эффект был заметен уже через 1 сут. после инфицирования.

Пик цилиостаза наблюдали на 5 сут, и угасание процесса происходило в течение 13 сут.

Таблица 5 - Оценки* цилиарной активности, установленные в эксплантантах трахеи цыплят, инфицированных вирусом ИБК штамм Н-120, 4/91 и QX Сутки после инфицирования Штамм

–  –  –

Исследуемые штаммы вируса по воздействию на клетки трахеального эпителия имели определенные различия. Штамм Н-120 был несколько более активен, но при этом уже через 9 суток не проявлял цилиостатического воздействия. Тогда как штамм QX был менее активен в начале, однако продолжительность воздействия данного варианта вируса была наибольшей.

Цилиостатический эффект, обусловленный данным вариантом вируса, регистрировали в течение 13 сут. Штамм 4/91 занимал промежуточное положение.

Возможно, что отмеченные различия в цилиарном воздействии изученных штаммов являются следствием их не одинакого тропизма по отношению к клеткам реснитчатого эпителия трахеи.

3.4.3 Патогенетическое действие и репродукция вируса ИБК штамм QX в организме цыплят при различных способах заражения Известно, что вирус ИБК был выделен из клоакальных мазков и тканей кишечника. При этом рассматривалась возможность инфицирования цыплят вирусом ИБК клоакальным способом [88].

Задачей данного этапа работы являлось сравнение патогенного действия штамма QX вируса ИБК для СПФ-цыплят при окулярно-назальном и клоакальном способах инфицирования.

Были сформированы две подопытных группы (А, В) по 50 цыплят в каждой и контрольная группа птиц в количестве 30 голов. Цыплят за сутки до заражения не кормили. Группа А была заражена вирусом ИБК окулярно-назальным способом. Заражение выполняли с помощью дозатора в дозе в 104 ЭИД50 в объеме 0,1см. Группу В инфицировали в клоаку с помощью катетера в дозе в 104 ЭИД50 в объеме 0,1см. Во всех группах проводили ежедневны клинической осмотр птицы.

Через заданные интервалы времени из групп А и В отбирали по 3 цыпленка, а также по одному цыпленку из контрольной группы. Отобранных цыплят после эвтаназии подвергали патологоанатомическому исследованию.

При вскрытии у каждого цыпленка асептически отбирали дыхательные органы (трахею и легкие), миндалины слепой кишки, почки, репродуктивные органы. Отобранные пробы замораживали при температуре минус 35С и использовали для выделения вирусного генома в ПЦР, а другие кусочки органов фиксировали в формалине и проводили гистологические исследования.

Было установлено, что проявление клинических признаков болезни у птиц в зависимости от способа заражения различались.

В группе А через трое суток после заражения наблюдали характерный для ИБК респираторный симптомокомплекс. На сут регистрировали 7-8-е слабовыраженную патологию почек (отечность и анемию).

В группе В признаков респираторного синдрома не наблюдали. Однако на 5-е сут. после заражения у цыплят при диагностическом вскрытии регистрировали нефрозо-нефриты.

Гистологические изменения в почках наблюдали на третьи сут после заражения Вирус вызывал дистрофию, вакуолизацию и (рисунок 10).

десквамацию эпителия канальцев. Поражения происходили в основном в собирательных протоках, прямых канальцах и дистальных извитых канальцах мозгового вещества почки.

К 5-м сут поражения почек были более выражены как в коре, так и в мозговом веществе органа. Дегенерацию клеток и некрозы обнаруживали в канальцах и в протоках коркового и мозгового вещества. Также наблюдали интерстициальный отек с инфильтрацией из лимфоцитов и макрофагов.

Контроль Опыт

Рисунок 10 - Микрофотографии образцов мозговой ткани почек, взятых в контрольной и опытной (клоачное заражение, 7 сут) группах цыплят У инфицированных птиц присутствует интерстициальный отек почечных канальцев с выраженной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами С целью изучения диссеминации вируса в органах птиц при разных способах заражения применяли разработанную методику опосредованной оценки титра инфекционного вируса по результатам ПЦР в реальном времени.

Величину накопления вируса определяли опосредовано по уравнению {2} на основании оценки концентрации вирусного генома (Ct), установленной в ОТПЦР-РВ Полученные результаты, представлены в виде диаграмм на рисунке 11.

Наиболее высокий ожидаемый титр вируса для данного типа ткани почти во всех случаях приходился на 4-6 сут после заражения. При обоих способах инфицирования величины максимальных титров были близкими.

–  –  –

Рисунок 11 - Динамика накопления вируса ИБК (прогнозируемая величина титра по данным ПЦР, T) в пробах тканей различных органов птиц соответственно способов заражения (окулярно-назальный - и клоакальный - ) и времени после заражения (сут) Однако в зависимости от использованного способа заражения, присутствовали определенные различия. При окулярно-назальном способе вирус интенсивнее развивался в респираторной системе и кишечнике. Тогда как проникновение агента в почки и яичники птицы, в сравнении с другим способом, происходило медленнее.

При клоачном способе агент интенсивнее диссеминировал в почки и репродуктивную систему птицы. При этом накопление в тканях почек было заметно выше.

Продолжительность присутствия вируса в титрах, превосходящих 0,5 lg, в респираторной и репродуктивной системах при обоих способах заражения составляло около 20-25 сут. При этом присутствие агента в почках (клоачный способ заражения) и кишечнике за аналогичный период соответствовало более высоким титрам. Например, в почках при клоачном способе на 25-е сут ожидаемый титр вируса составлял не менее 2 lg, в миндалинах слепой и толстой кишок - более 3 lg.

Заслуживает внимания тот факт, что при одинаковой интенсивности развития возбудителя в тканях респираторного тракта клиническая картина процесса, в случае окулярно-назального заражения, была более выражена.

Патологоанатомические изменения в почках, наблюдаемые в большей степени при клоачном заражении, совпадали с хронологией накопления инфекта в тканях указанных органов.

Рассмотренные результаты свидетельствуют, что исследуемый вирус имеет явные признаки пантропного инфекта, который способен к репродукции в клетках, по крайней мере четырех типов исследованных тканей, примерно с одинаковой эффективностью.

Очевидно, что начало периода регрессии вирусной репродукции приходится приблизительно на 7-е сут. Это обстоятельство хорошо согласуется с началом системной иммунной реакции организма.

Также следует указать, что развитие агента, продолжающееся более 25-ти сут., в миндалинах слепой кишки указывает на возможный тропизм его к клеткам иммунной системы.

Анализ полученных в ходе исследований результатов позволил сделать вывод, что вирус инфекционного бронхита кур штамма «RF08-10» генотипа QX способен обусловить в организме птицы инфекционный процесс, сопровождающийся тяжелыми клиническими симптомами, имеет выраженый тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок, вирус эффективно развивается в организме как при окулярно-назальном, так и при клоачном способе инфицирования.

Вероятно, возбудителю также свойственен тропизм к клеткам иммунной системы, о чем свидетельствуют длительное присутствие и высокое накопление агента в лимфатической системе кишечника.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Инфекционный бронхит кур является на сегодняшний день одной из самых экономически значимых болезней промышленного птицеводства. Ущерб от ИБК складывается из снижения продуктивного мясного поголовья и вынужденной выбраковки молодняка, снижения качественных и количественных показателей яйценоскости, повышения восприимчивости птиц к другим заболеваниям.

Например, если в стаде кур-несушек циркулирует вирус ИБК, который имеет средний уровень патогенности, то в течение 12 месяцев будет наблюдаться до 5 циклов активизации возбудителя. Продолжительность цикла до 30 сут.

Средняя потеря продуктивности стада в период активного цикла болезни составляет приближенно 12%.

Приняв за основу стандартную схему расчета экономического ущерба для сельскохозяйственного предприятия от снижения продуктивности животных доля недополученной от плана {http://www.studfiles.ru/preview/1155969/}, продукции за календарный год может быт вычислина по формуле:

–  –  –

Применительно к описанным условиям Сpr = (1500,12)/365 0,05, т.е.

прямые потери продукции приближенно составят 5%.

Таким образом, если плановый выход продукции за год от одной производственной единицы (курицы-несушки) составляет 300 яиц, то ожидаемая среднегодовая потеря составит 300х0,05=15 яиц.

Это означает, что птицефабрика яичного направления, имеющая производственное стадо 250 000 голов, в год недополучит 3 750 000 яиц. Если принять, что в настоящее время средняя закупочная цена 10 яиц составляет 0,83 $, то прямой убыток предприятия будет равен 311 250 $.

Здесь следует отметить, что в качестве примера была рассмотрена хозяйственная модель, где фигурировал "умеренно патогенный" штамм ИБК, суммарное время активизации которого в течение года составляло 150 сут.

Контроль над ИБК осложняется тем, что возбудитель болезни коронавирус, в природе проявляет высокую изменчивость, ведущую к появлению штаммов, обладающих новыми фенотипическими свойствами. В этой связи важной проблемой является возникновение вирусных вариантов с измененным тропизмом, которые кроме тканей трахеи способны поражать клетки других органов птицы.

Анализ современных научных публикаций по проблеме ИБК показывает, что выбранная тема "Патогенетические свойства вируса инфекционного бронхита кур" является актуальной.

Методологический аспект. Использование в качестве чувствительной тестсистемы развивающихся эмбрионов кур категории СПФ, а также полученных от них эксплантантов трахеи, и выведенных цыплят, предоставило возможность исследовать развитие вируса ИБК, исключая влияние каких-либо посторонних вертикальных инфектов или трасовариальных антител.

При этом следует подчеркнуть, что СПФ-цыплята, являясь "абсолютно восприимчивой" моделью, с одной стороны позволили наблюдать естественную диссеминацию вируса в организме птицы и различать тропизм штаммов, с другой стороны, демонстрировали патологии, которые в естественных условиях в определенной степени могли быть компенсированы неспецифическими механизмами иммунитета.

На этом основании результаты исследований патогенеза вирусной инфекции, полученные на СПФ-птице, вероятно, не следует рассматривать как абсолютную аналогию природным процессам. Отсутствие необходимого уровня защитных реакций у подопытных цыплят в определенной степени могло усилить патогенное действие даже вакцинных штаммов вируса ИБК. Однако принципиальных различий между поведением вируса на коммерческой и СПФптице, очевидно, быть не могло. В связи с этим представляется возможным считать, что результаты, полученные в ходе проведенной работы, объективно отражают процессы, происходящие в естественных условиях.

Применение ОТ-ПЦР-РВ для опосредованной оценки инфекционого титра вируса ИБК. При проведении вирусологических исследований, а также при выполнении различных работ, связанных с биологическим производством, оценка титра вируса является необходимым методическим приёмом.

Традиционно для титрования вируса ИБК в качестве чувствительных тестсистем используются развивающиеся эмбрионы кур или трахеальная органная культура. Обе системы позволяют с достаточной точностью определять титр инфекционного вируса в тестируемой пробе, однако являются длительными, трудоемкими и дорогостоящими.

Например, для корректной оценки титра инфекционного вируса на эмбрионах кур требуется не менее 30 тест-объектов (25 - для испытания не менее 5-ти разведений материала и 5 - для контроля). При этом эмбрионы должны содержаться в специально оборудованном термостате (при 37С и 60% влажности). Стоимость одного эмбриона СПФ-категории от компании "Valo Biomedic" (Germany) в настоящее время приблизительно составляет $2. Таким образом, себестоимость исследования одной пробы вируссодержащего биоматериала только по затратам на тест-систему (без учета энерго- и трудозатрат) составит не менее $60. Продолжительность испытания не менее 7 сут.

При использовании в качестве тест-системы трахеальной органной культуры, где эксплантанты трахеи готовят также из эмбрионов SPF-категории, которых предварительно выращивают в течение 20 сут., приближенная оценка себестоимости одного исследования составит не менее $40. Продолжительность испытания не менее 5 сут.

На основание выше сказанного, целесообразно использовать ОТ-ПЦР-РВ для опосредованной оценки концентрации возбудителя по накоплению его генетического материала в тестируемой пробе. Данный вариант реакции позволяет регистрировать количество циклов амплификации, произошедших до достижения пороговой оптической отметки (Ct-пороговый цикл). В свою очередь величина Ct обратно пропорциональна исходной концентрации вирусного генома.

При этом продолжительность проведения реакции составляет всего 4-6 часов.

Себестоимость испытания одной пробы около $15.

На основании результатов проведенных исследований был сделан ряд выводов.

Оценки титра инфекционного вируса (lgT, ЭИД50), полученные на куриных эмбрионах, и значения пороговых циклов амплификации (Ct), параллельно установленные в тестируемых вируссодержащих образцах в ОТ-ПЦР-РВ, показали высокий уровень связи. Соответствующий коэффициент корреляции имел высокую достоверность (p0.001) и составил величину R=(-0,987)±0,088.

Развернутой характеристикой зависимости параметров lgT и Ct явилась регрессионная модель вида{2}: "lgT=-0,2654(Ct)+9,336, которая позволяла в диапазоне 10Ct35 прогнозировать ожидаемую оценку инфекционного титра ("lgT) на основании фактического значения Ct.

Связь между оценками титра 50%-х цилиостатических доз вируса (lgT, ЦД50), установленных для переживающей трахеальной органной культуры (TOK), и Ct - показателями, зарегистрированным для данного образца в ОТ-ПЦР-РВ, была охарактеризована коэффициентом корреляции R=(-0,978)±0,046, имеющим высокий уровень значимости (p0,001). Соответствующая регрессионная модель имела вид {3}: "lgT=18,854-5,216(lnCt), где: ”lgT – логарифм прогнозируемого титра вируса для заданного значения Ct.

Построенные для обоих вариантов чувствительных тест-систем регрессионные модели имели ошибку прогноза, сопоставимую с величиной ошибки, получаемой в эксперименте с непосредственным титрованием образца на чувствительной системе.

Следует указать, что при постановке данного варианта ОТ-ПЦР-РВ амплифицируемый участок генома является идентичным для всех штаммов вируса ИБК, что позволяет использовать указанные регрессионные модели для прогноза величины инфекционного титра для различных вариантов данного вируса.

Однако важно отметить, что соотношение между величиной инфекционного титра вируса и концентрацией вирусного генетического материала в тестируемом образце теоретически может быть произвольным. Например, в случае повреждений не амплифицируемых участков генома, ПЦР может дать положительный результат, но сборки полноценного вируса не произойдет, и инфекционный титр не будет зарегистрирован.

Учитывая приведенное обстоятельство, необходимо сделать уточнение, что соотношение между lgT и Ct может быть рассмотрено только по одностороннему принципу: "количество вирусного генома не может быть меньше, чем концентрация инфекционного вируса". При этом любые прогностические модели для системы "lgTCt" могут быть действительными только при определенных и строго регламентированных условиях.

В доступной литературе не было встречено публикаций, специально посвященных анализу корреляции между данными ПЦР и оценками титра инфекционного вируса ИБК. Однако работы, где этот вопрос затрагивался и имел положительное решение, были проведены с другими вирусами птиц.

Изучение развития вируса ИБК в организме куриного эмбриона. Данный этап работы был посвящен изучению динамики накопления вируса ИБК в различных частях инфицированного эмбриона. Кроме этого, планировали провести сравнение прогнозируемых по уравнению {3}оценок "lgT и фактически установленных значений lgT для ТОК.

В эксперименте использовали штамм Н-120. Были исследованы образцы вируссодержащих материалов, полученные через заданные интервалы времени из различных частей инфицированных эмбрионов.

Исследовали образцы ткани тела эмбриона (ТЭ), ткани хориаллантоисной оболочки (ХАО), амниотической жидкости (АЖ) и экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ).

Были получены хронологически соответствующие выборки текущих оценок "lgT и lgT, на основе которых были построены диаграммы (рисунок 2), отражающие динамику прогнозируемого и фактического накопления инфекционного вируса в исследованных частях эмбриона.

Установили, что во всех тестируемых образцах биоматериалов профили распределений фактических и прогнозируемых показателей инфекционных титров демонстрировали очевидное подобие. Рассчитанные по изученному временному диапазону разности хронологически соответствующих значений (T= lgT - "lgT) позволили определить их средние оценки ('Т), которые для образцов ТЭ, ХАО, АЖ и ЭЭЖ составили статистически незначимые величины:

0,19±0,16, -0,06±0,17, -0,11±0,09 и -0,07±0,18, соответственно.

Статистическая неопределенность средних величин 'Т свидетельствовала о том, что текущие отклонения между фактическими и теоретическими оценками были равноудаленными как в отрицательную, так и в положительную области.

Таким образом, средние оценки 'Т±m во всех случаях стремились к статистическому нулю. На этом основании был сделан вывод, что регрессионная модель {3} может быть использована для расчетов прогнозируемых величин инфекционных титров вируса в биоматериалах.

На данном этапе исследований эмбрионы кур использовали в качестве модели, на которой был отработан и обоснован способ опосредованного определения накопления вируса ИБК. При этом была изучена и диссеминация возбудителя в различных частях эмбриона.

Установили, что инфекционная активность всех биоматериалов имела в той или иной мере выраженные три фазы. Фазу роста, которая для образцов ХАО и ЭЭЖ заканчивалась к 20 часам, а для образцов ТЭ и АЖ - к 50 часам культивирования вируса, фазу стабилизации, продолжавшуюся для большинства образцов до 7080 часов, и далее фазу угасания, где, за исключением образца ТЭ, происходило видимое снижение значений инфекционности.

Наибольшее накопление вируса было показано в образцах ХАО и ЭЭЖ, по абсолютным значениям титров после часов (6,36,5 lgЦД50/0,1см) 20 культивирования. В образцах АЖ максимум накопления (6,48 "lgЦД50/0,1мл) наблюдали только после 60 часов. В образцах ТЭ накопление не превышало 5,5 lgЦД50/0,1мл.

Однако после 35 часов в ткани ХАО концентрации вируса снижалась, а в ЭЭЖ концентрации вируса увеличивалась. Отсюда было сделано заключение, что вирус начал покидать клетки ХАО и накапливаться в ЭЭЖ.

Таким образом, было установлено, что вероятной элективной зоной развития вируса ИБК в эмбрионе является ткань хориоаллантоисной оболочки. В этом случае «резервуаром» накопления вируса является экстраэмбриональная жидкость. Ткани тела эмбриона, очевидно, не являются элективной зоной развития данного типа вируса.

Важно отметить, что развитие вируса в ткани ХАО эмбриона (в том числе на пике накопления) не сопровождается видимыми макроскопическими изменениями структуры самой ткани. При этом вирус заметно воздействует на морфологию тела эмбриона ( рисунок 1). В биологическом смысле это означало, что, по крайней мере, начальные процессы репродукции вируса в эмбрионе не связаны с цитопатическими процессами в ткани ХАО.

Поскольку для культивирования вируса ИБК чаще всего используют развивающиеся эмбрионы кур, вопрос о месте развития вируса ИБК в эмбрионе является важным как в научном плане для понимания тропизма вируса ИБК, а также и в технологическом - для понимания того, какой вируссодержащий материал лучше использовать для изготовления биопрепаратов (вакцин или диагностикумов).

В практическом аспекте полученные в ходе проведенных исследований результаты позволили обоснованно судить об оптимизации процедуры культивирования вируса ИБК на СПФ-эмбрионах кур. А именно было доказано, что наибольшее количество вирусного материала будет находиться в составе экстраэмбриональной жидкости через 40 часов культивирования.

Изучение инфекционных свойств различных штаммов вируса ИБК для СПФ-эмбрионов и тест-системы ТОК. В задачу данного этапа работы входило исследование инфекционных свойств нескольких штаммов вируса ИБК по отношению к различным чувствительным тест-ситемам. С этой целью определяли инфекционную активность вируса ИБК штаммов Н-120, М-41 и D-274 в тестсистемах СПФ-эмбрионов кур и переживающих эксплантантов ТОК.

Установили, что все изученные штаммы, не зависимо от абсолютных средних значений титра (Т), имели относительно большую инфекционную активность в отношении СПФ-эмбрионов (lgT1), чем в отношении ТОК (lgT2).

Различия в инфекционной активности штаммов по отношению к исследуемым тест-системам оценивали показателем d=lgT1 - lgT2. Данная величина рассматривалась как показатель относительной инфекционности вируса.

Для штаммов Н-120, М-41 и D-274 оценки d составили статистически достоверные значения 0,52±0,16 (p0,02), 0,50±0,18 (p0,05) и 0,85±0,17 (p0,002), соответственно. Однако между собой приведенные величины достоверно не различались. На этом основании был сделан вывод, что относительная инфекционность вирусных штаммов была приблизительно одинаковой.

Cредняя величина логарифмической разницы инфекционных титров вируса для СПФ-эмбрионов и тест-системы ТОК составила значение 'd±m=0,62±0,10. Указанная оценка была принята в качестве корректирующего коэффициента.

Отсутствие статистической разницы в оценках относительной инфекционности штаммов и установленный средний корректирующий коэффициент 'd позволяли считать, что как СПФ-эмбрионы кур, так и эксплантанты ТОК могут быть использованы в качестве чувствительных тестсистем при работе со всеми изучаемыми штаммами вируса ИБК.

Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам ОТ-ПЦР-РВ. Стандартная схема патогенеза заразных болезней описывает следующие этапы: путь проникновения возбудителя в организм хозяина ("ворота инфекции"), распространение (диссеминации) инфекта в организме и патологии в поражаемых органах (органах-мишенях).

Патогенетическая картина при ИБК [88] предполагает, что проникновение вируса в организм птицы преимущественно происходит аэрогенно и первичная атака возбудителя направлена на эпителиальные клетках трахеи. Далее происходит генерализация инфекционного процесса и вирус по лимфатической и кровеносной системам распространяется (диссеминирует) по организму птицы, поражая различные органы.

При этом на характер патогенеза заболевания существенное влияние может оказывать тропизм, присущий данному варианту возбудителя. В отношении вируса ИБК различия тропности штаммов [81, 88], вероятно, могут определять особенности патогенетической картины болезни.

На данном этапе работы было проведено сравнительное исследование хронологической диссеминации различных штаммов вируса ИБК (Н-120, QX и 4/91) в организме цыплят. Оценочным показателем тропности возбудителя считали его накопление в тканях определенных органов. Величину накопления вируса определяли опосредовано по уравнению {2} на основании оценки концентрации вирусного генома (Ct}, установленной в ОТ-ПЦР-РВ.

Эксперимент проводили на клинически здоровых цыплятах, выведенных из СПФ-эмбрионов кур в возрасте 15 сут. В подопытных группах провели окуляроназальное заражение. Для всех штаммов была принята одинаковая заражающая доза: 104 ЭИД50 в объеме 1 см.

Было установлено, что через 5-7 сут после заражения во всех опытных группах наблюдали признаки респираторной патологии (кашель, трахеальные хрипы и носовые выделения). В группе QX клинические признаки были более выражены: у цыплят присутствовала слабость, существенное снижение аппетита.

На 5 сут после заражения отмечена гибель 2 птиц.

Исследование распространения и накопления вируса в тканях избранных органов показало, что в первые сутки после заражения выявлен рост количества возбудителя во всех исследуемых органах. Далее к восьмым суткам происходило значительное снижение титра вируса и стабилизация процесса накопления.

Снижение инфекционного титра наблюдалось через 7-8 сут после заражения почти во всех органах, что, вероятно, связано с включением системной иммунной реакции организма.

Также установлено, что для всех исследуемых штаммов вируса ИБК ткани респираторной системы птиц в начальной фазе развития инфекционного процесса являются наиболее благоприятной (элективной) зоной. В данной области организма на 5 сут. после инфицирования ожидаемые по накоплению генетического материала инфекционные титры возбудителя ("lgЭИД50) составили от 3,95 у штамма QX, до 5,00 у штамма Н-120.

Последующий процесс вирусной диссеминации, очевидно, происходил как вторичное явление. Во всех остальных тканях максимальные оценки титров приходились на 7-е или 10-е сут. Схожие результаты в отношение штамма QX были получены Mohammed M.H и другими [159]. По эффективности развития вне респираторной системы очевидным лидером следует считать штамм QX, который через 7 - 9 сут. накапливался ("lgЭИД50) до 4,33, 4,15 и 3,85 в почках, в миндалинах слепой кишки и в тканях репродуктивных органов, соответственно. Аналогичные выводы по накапления вируса в разлычных органов сделала Mohammed M.H [159]. При этом распространение в организме птицы штамма Н-120 было значительно менее выражено. В отмеченном временном интервале аналогичные оценки составили 3,29, 2,52 и 2,08. Промежуточное положение занял штамм 4/91.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНУРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор с.-х. наук, профессор КАХАРОВ К.Х. Душанбе, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ...»

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (род CLETHRIONOMYS) СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Е. Докучаев Магадан – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. МАТЕРИАЛ И...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.