WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ...»

-- [ Страница 2 ] --

1.6 Иммунитет при ИБК Большинство вспышек ИБК наблюдали на вакцинированном поголовье, что указывает на то, что вирус быстро эволюционирует, и традиционно используемые вакцины не всегда адекватны эпизоотической обстановке.

Борьба с ИБК значительно осложняется антигенным многообразием вируса, а иммунитет, приобретённый к одному серотипу вируса при иммунизации или после переболевания, не защищает от заражения другим [30]. Это обуславливает проведение исследований, направленных на изучение эпизоотической ситуации по ИБК, изучение антигенного родства используемых для профилактики штаммов вируса с полевыми изолятами. Одним из перспективных направлений в профилактике ИБК является применение инактивированных полиштаммых вакцин. Комбинация нескольких инактивированных штаммов вируса, адекватных эпизоотической обстановке в конкретном регионе, в одном препарате позволяет предотвращать или ликвидировать вспышку заболевания.

Комбинировать несколько штаммов вируса в одном препарате можно в составе живых вакцин, и это позволяет получать более напряжённый иммунный ответ, но возникает серьезная проблема, связанная с риском появления новых штаммов вируса в результате рекомбинации генетического материала [24, 31].

1.7 Формирование иммунного ответа при ИБК 1.7.1 Иммуногенные белки вируса ИБК Вирус ИБК обладает положительно-цепочечной РНК и имеет три структурных белка. Спайковый S гликопротеин локализуется на поверхности 32 вириона и состоит из двух субъединиц - S1 и S2. Мембранный М гликопротеин частично находится на поверхности вириона, и нуклеокапсидный N белок размещается внутри [28, 83].

Гликопротеин S1 вызывает нейтрализацию вируса и гемагглютинацию антител [135, 139] и считается наиболее вероятным стимулятором защиты, но белки S2 и N могут также быть важными, поскольку они содержат эпитопы для индукции перекрестной реакции антител [129]. Показано, что время появления S1, S2 и N в ИФА одинаково, детектируется через 2 недели после введения живой вакцины против ИБК [197]. Это совпадает с появлением нейтрализующих антител [121, 100]. Эпитопы на белках N и S2, которые дают повышение перекрестной реакции антител, являются в одинаковой степени консервативными, в то время как показано, что эпитопы белка S1 гораздо менее консервативны [129].

Обнаружено, что клеточный иммунный ответ, вызванный живой вакциной, представлял собой перекрестную реакцию, и величина ответа отличалась в зависимости от серотипа вируса ИБК, использовавшегося для стимуляции in vitro [105].

1.7.2 Врожденный иммунитет Иммунитет может быть врожденным, и приобретенным. Врожденный обеспечивает защиту от внешних агентов например, кожа – внешний барьер;

гранулоциты, макрофаги и естественные клетки-киллеры, комплемент внутренний барьер[52, 183]. Основными особенностями врожденного иммунитета являются отсутствие специфичности и иммунологической памяти.

Нейтрофилы образуют "первую линию защиты" против инфекционных агентов и являются первыми клетками, локализующими место инфицирования, вследствие инициации воспалительной реакции. Нейтрофилы занимают наибольшим числом клеток в респираторных жидкостях на ранней стадии воспалительного процесса, у кур, инфицированных вирусом ИБК [115]. Изучено значение этих клеток в ограничении репликации вируса ИБК, и установлено, что 33 они не воздействуют на размножение вируса и фактически содействуют поражению эпителия трахеи [106, 141].

Роль макрофагов в заражении вирусом ИБК неизвестна, изменения в активности естественные клетки-киллеров вследствие заражения вируса ИБК не обнаружены [194].

1.7.3 Приобретенный иммунитет Приобретенный иммунитет активизирует антигенспецифические эффекторные механизмы, включая В-клетки Т-клетки (гуморальный), (клеточный) и макрофаги, и продуцирует клетки памяти.

Гуморальные антитела. При получении подходящего стимула В-клетки видоизменяются из клеток плазмы в секретирующие антитела, и в присутствие (Тзависимый антиген), и в отсутствие (Т-независимый антиген) Т-хелперных (Тх) клеток. У кур развивается выраженный гуморальный ответ на инфицирование вирусом ИБК, определяющийся твердофазным иммуноферментным методом (ИФА), торможением гемагглютинации (РТГА) или реакцей нейтрализации (РН) [47, 103]; тем не менее отсутствует корреляция между титрами циркулирующих антител и устойчивостью к инфекции [47].

Иммуноглобулин основной циркулирующий является G (IgG), Ig, антителом, детектируемым РТГА и ИФА, проявляющим при измерении большую чувствительность. IgG, полученные на вирус ИБК, могут быть обнаружены на день после заражения, и достигают пика приблизительно на 21 день после заражения, но титры могут оставаться высокими в течение многих недель.

Используется общепринятыми серологическими методами для мониторинга заболевания или для определения эффективности вакцинации.

Иммуноглобулин М (IgM), присутствующий в небольшой промежуток времени после инфицирования, достигает пика концентрации примерно к 8 дню после заражения вирусом ИБК, и уровень его затем снижается. Хотя показано его использование для диагностики инфекций IgM-специфического ИФА, эти антитела необходимо было выделить центрифугированием с сахарозным градиентом, или колоночной хромотографией перед выполнением ИФА.

Доступность ИФА, выявляющего антитела IgM, специфические к вирусу ИБК могла бы упростить диагностику ИБК, когда обнаружение вируса требует много времени[157].

Значение В-клеток в инфекциях ИБК изучалось в экспериментах по истощению с использованием гормона пропионата тестостерона [91], химического циклофосфамида, хирургической бурсэктомии [93]. Куры, которые получали циклофосфамид, показали более выраженные клинические симптомы и более серьезные гистологические поражения почек, что является отличительной чертой длительной персистенции вируса. Заражение ИБК бурсоэктамированной хирургическим путем устойчивой линии кур повлекло за собой повышение тяжести и продолжительности клинической инфекции, но без летальности [93].

Однако гуморальные антитела осуществляли защиту эпителия трахеи после вторичного заражения. Присутствие высоких титров гуморальных антител хорошо коррелирует с отсутствием выхода вируса из почек и полового тракта [47, 158] и защитой от снижения яйценоскости [73]. Антитела, специфические к вирусу ИБК, вероятно, предотвращают распространение вируса из трахеи к другим чувствительным органам, таким, как почки и яичники.

Исследования по разработке вакцин против ИБК всегда фокусировались на гуморальном иммунном ответе, и оценка препаратов осуществлялась по уровню защите. Тем не менее отсутствие корреляции между антителами и устойчивостью, несоответствие в дифференциации штаммов по вируснейтрализующим антителам (VN), тестам in vitro и результатами перекрестной защиты in vivo, выделение вируса в присутствии высоких титров циркулирующих антител - все наводит на мысль, что, помимо гуморальных антител, играющих роль в выздоровлении от ИБК, другие иммунологические механизмы также имеют место [100].

Материнские антитела (МАТ). Антитела, унаследованные от матери могут обеспечивать защиту против ИБК, но они являются (МАТ), короткоживущими [96, 100]. Присутствие МАТ не влияет на эффективность живых вакцин против ИБК, введенных в суточном возрасте [96, 101].

Унаследованные от матери IgG обнаруживаются в трахеальных смывах.

Местный иммунитет. Местный иммунитет в респираторном тракте имеет существенное значение для защиты против ИБК. Это пример использования модели контрольного заражения с применением ТОК из in vitro иммунизированных кур для изучения перекрестной защиты. ИБК-специфические IgA и IgG обнаруживаются в трахеальных смывах инфицированных кур, и в трахеальных сегментах обнаружены клетки, секретирующие антитела [109, 164].

Показано, что вирусоспецифические IgG и IgA в смывах из яичников инфицированных кур демонстрируют местный иммунитет на уровне яичника [109]. Позднее в ходе заболевания, антитела также выявлялись в сыворотке крови но их значение в защите яичников не определено. Установлено, что у цыплят местные антитела в яичнике обладали меньшей защитной способностью в сравнении с трахеей при использовании для заражения in vitro ПККЯ (первичная культура клеток из яйцевода), приготовленной из вакцинированных кур [110].

Хотя и показано размножение вируса ИБК в кишечнике [49, 153], Lutticken et al. [155] не смогли обнаружить никаких антител при промывании кишечника после вакцинации однодневных цыплят вакциной штамм H120, инактивированным вирусом ИБК штамм М41 в масляной эмульсии или инактивированным вирусом штамм М41 с эвридиновым адъювантом. Напротив, показали выработку местных антител в Dhinakar Raj et al. [109] двенадцатиперстной кишке и миндалинах слепой кишки у 16-суточных курочек, инфицированных энтеротропным штаммом вируса ИБК (штаммом G). Неясно, связано ли появление этих антител со штаммом, и необходимо узнать об их роли в ограничении репликации вируса ИБК в кишечнике.

Гардерова железа кур содержит в себе большую, в зависимости от возраста, популяцию клеток плазмы и является источником иммуноглобулинов в слезной жидкости [53]. Это играет важную роль в развитии вакцинального иммунитета после применения вакцин, введенных в основном спреем или закапыванием в глаз. Davelaar & Kouwenhoven [101] сообщили, что защита против ИБК суточных окулярно вакцинированных цыплят была локализована, главным образом, в окулярно-назальной слизи, и удаление гардеровой железы вызывало пониженный уровень защиты [101]. ИБК-специфические IgA обнаружены в слезной жидкости, и показан их синтез в гардеровой железе [95, 186]. IgG в слезную жидкость попадают, главным образом, из крови [188]. Уровень IgA в слезной жидкости, повидимому, лучше коррелировал с устойчивостью к повторному заражению вирусом ИБК, чем уровни антител в сыворотке, и их выявление рекомендовано для анализа спектра антител в куриных стадах [187].

Cook et al. [95] нашли больше вирусспецифических IgA в слезной жидкости линий кур, устойчивых к ИБК, в то время как титры антител в трахеальных смывах были одинаковы. Различия в уровнях IgG, специфических к вирусу ИБК, в сыворотке и уровнях IgA в слезной жидкости также обнаружены у разных линий кур после окулярной вакцинации против ИБК [188]. Установлено, что курынесушки белый леггорн имели более выраженный ответ и больше гомогенных IgG в сыворотке между 5 и 9 днями после заражения и IgA в слезной жидкости между 5 и 14 днями после заражения, чем бройлеры или куры, несущие коричневые яйца.

Клеточный иммунитет. Мало сообщений, касающихся роли клеточного иммунитета, в защите против ИБК. Обнаружена антигенспецифическая пролиферация Т-лимфоцитов у инфицированных вирусом ИБК или вакцинированных кур. Для некоторых кур показана позитивная корреляция между лимфопролиферативной реакцией и устойчивостью к заражению.

Описаны мышиные моноклональные антитела (Мао), отличающиеся от куриных Т-лимфоцитов [89]. Антигены CD4 и CD8 находятся в двух основных популяциях Т-клеток, Т-хелперных (Тх) и Т-цитотоксических / супрессорных (Tц/с) клетках, соответственно.

Janse et al. [132] настаивали на том, что местный иммунитет к ИБК в трахеях связан с Т-клетками. CD4 и CD8 клетки были обнаружены в сегментах трахеи и легкого кур, инфицированных вирусом ИБК [108, 132]. Однако не ясно, какие из этих клеток более важны в элиминации вируса, поскольку Janse et al. [132] установили рост CD4 клеток, в то время как Dhinakar Raj & Jones [108] обнаружили более высокое соотношение CD8 клеток. Различия могут быть отнесены к использованным штаммам вируса ИБК.

Когда куры получали циклоспорин A (ЦА) для супрессии Т-клеток, вирусные титры в почках были на 1-3 lg выше средней цилиостатической дозы (CD50), чем у птиц, не получавших препарат [107]. Таким образом, Т-клетки могут также играть роль в ограничении вирусной репликации в почках.

Chubb et al. [91] показали присутствие цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) в селезенке и периферической крови вследствие ИБК. Однако Wakenell et al. [192] не смогли обнаружить ЦТЛ, используя клетки почек как мишени, и традиционный метод хроматографии. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) возникала в ответ на живой вирус ИБК [91] и на аффинно очищенные белки S I, S2, N и М [129].

Таким образом, целый ряд вопросов, касающихся развития иммунитета у птиц к инфекционному бронхиту кур, остается неизученным.

1.8 Патологическая анатомия и гистология в диагностике ИБК Патологоанатомические изменения зависят от формы и течения болезни.

При поражении респираторных органов отмечают гиперемию слизистых оболочек носовой полости, трахеи, серозное и серозно-фибринозное воспаление бронхов, воздухоносных мешков, очаговую пневмонию. Почки набухшие, с выраженной дольчатостью. В мочеточниках и извитых канальцах отмечают отложение мочекислых солей [32, 39].

При исследовании регенерации эпителия собирательных протоков и мочеточников при интерстициальном нефрите после инокуляции вируса ИБК отмечали следующие стадии: на 3-4-й день после заражения обнаруживали серьезные дегенеративные изменения эпителия почек, гиперплазию и гипертрофию на 8-й день и возвращение к норме на 10-й день после заражения [39, 190].

У кур с респираторным заболеванием, вызванным вирусом ИБК, основные гистологические изменения находят в трахее. Однако данные изменения не являются патогномичными для ИБК. Вирус, реплицируясь в эпителиальных клетках, вызывает потерю ресничек, эдему, десквамацию, гиперплазию и клеточную инфильтрацию мононуклеарными лейкоцитами подслизистого слоя.

Данные изменения наблюдаются между 3-м и 9-м днями после заражения.

Регенерация трахеального эпителия продолжается приблизительно 10-14 дней после заражения. При репродуктивном синдроме по причине ИБК в яйцеводах уменьшается высота эпителиальных клеток, и это сопровождается уменьшением числа или полной потерей ресничек. Эпителиальные клетки, особенно бокаловидные клетки, становятся кубической формы. После заражения нефропатогенным штаммом вирусная репликация сначала происходит в трахее, вызывая гистологические повреждения, идентичные респираторным штаммам.

Путь распространения в почки неизвестен. В почках цитопатические изменения проявляются, начиная с эпителия канальцев. В результате развивается интерстициальная воспалительная реакция, можно видеть полиморфноядерные лейкоциты, вначале в области мозгового вещества, а за тем в коре. Затем следуют обширная деградация канальцев и некроз, и это наиболее заметно в период между 5-м и 10-м днем после инфекции. В почках и мочеточниках появляются фокальные области осаждения мочевой кислоты. Не наблюдалось корреляции между степенью поражения почек и процентом смертности на пораженном поголовье. Восстановительный процесс в почках занимает 11 дней после инфекции [39, 127].

При инфицировании однодневных СПФ-цыплят интраназально и интраокулярно вирусом ИБК (штамм G) 6 из 30 цыплят погибли от нефрита через 5-10 дней после заражения. Наиболее выраженными были повреждения почек.

Гистологические исследования выявили воспаление в трахее, почках и прямой кишке. Высокие титры вируса выявляли в трахеях, почках и тканях кишечника, за исключением двенадцатиперстной кишки. Относительно высокие титры вируса через 14 дней все еще отмечались в почках, железистом желудке, кишечных миндалинах, тонком кишечнике, прямой кишке, фабрициевой сумке. Вирусные антигены были выявлены методом иммунофлуореценции в эпителиальных клетках трахеи и канальцев почек [39, 49].

39 Некоторые вариантные штаммы вируса ИБК вызывают патологические изменения, дополняющие или отличающиеся от описанных. Штамм 793/В ассоциировался с билатеральной миопатией глубокой и поверхностной грудных мышц у бройлеров [39]. По устны сообщениям, штаммы серотипа Delaware 072 вызывают тяжелые аэросаккулиты в отсутствие вторичной бактериальной инфекции [39, 128].

1.9 Специфическая профилактика ИБК Для специфической профилактики ИБК используют живые и инактивированные вакцинные препараты.

Живые вакцины против инфекционного бронхита применяются в США, Нидерландах, Италии, Франции, Германии, Чехии и многих других странах мира.

Готовят эти вакцины из аттенуированных штаммов вируса инфекционного бронхита, относящихся к серотипам Массачусетс и Коннектикут. К серотипу Массачусетс относятся 4 вакцинных штамма: Н-120, адаптированный к куриным эмбрионам в результате 120 серийных пассажей; Н-52, пассированный на эмбрионах в течение 52 пассажей; NIAC и 82828. К серотипу Коннектикут относится слабопатогенный вакцинный штамм L-2 [6, 8, 9, 14].

Для изготовления живых вакцин используют штаммы вируса, ослабленные пассированием в эмбрионах кур. Все живые вакцины различают по степени и стабильности аттенуации. Длительное пассирование вируса в эмбрионах кур снижает его вирулентность, реактогенность и иммуногенность. Однако некоторые штаммы вируса способны восстанавливать свою вирулентность при пассировании на цыплятах, что должно приниматься во внимание при разработке живых противовирусных вакцин. Живые вакцины применяют для создания раннего и непродолжительного иммунитета, с учётом продолжительности производственного цикла, в основном на бройлерах и для первичной вакцинации молодняка яичных и родительских стад [2, 6, 14, 37]. Живые вакцины применяют интраназально, интраокулярно, с питьевой водой, методом крупнокапельного распыления, аэрозольно.

Однократная вакцинация не предохраняла цыплят от заражения вирулентным вирусом. Двукратная вакцинация обеспечивала частичную устойчивость цыплят к заражению инфекционным бронхитом [14, 156].

Используемые в составе инактивированных вакцин штаммы вируса должны быть менее аттенуированы и индуцировать выработку более прочного и продолжительного иммунитета, их применяют для повторных вакцинаций яичных и родительских стад. Инактивированные вакцины различаются по способу инактивации, компонентному составу и используемому адъюванту [10, 14, 20].

С целью специфической профилактики ИБК применяют комплексную систему, основанную на 2-3 - кратной иммунизации живой вакциной цыплят в возрасте 1-14 недель, срок первой иммунизации зависит от уровня материнских гуморальных антител, и однократной прививки инактивированной вакциной в возрасте 14-18 недель. Для борьбы с инфекцией в неблагополучных хозяйствах используют метод, основанный на многократном применении (1 раз в месяц) живой вакцины из штамма «Н-120».

В связи с высоким антигенным многообразием вируса штаммы, используемые для иммунизации, должны отбираться с учётом эпизоотической обстановки в регионе. Во многих птицеводческих хозяйствах США, Франции, Голландии, Германии используют последовательную иммунизацию поголовья живыми вакцинами из разных серотипов вируса, максимально увеличивая спектр иммунной защиты у птиц, однако при этом увеличивается риск возникновения новых штаммов вируса в результате их одновременной циркуляции в хозяйстве и рекомбинации генетического материала между ними.

Вакцины против ИБК из штаммов серотипа Массачусетс используют наиболее широко. К ним относятся такие вакцинные штаммы, как «Н-120», «НМа5» «М-33», «82828», «NIAC» [14, 33].

В Российской Федерации наиболее часто для изготовления живых вакцин используют штамм «Н-120», а штаммы «Н-52», «М41», «Чапаевский» - для изготовления инактивированных вакцин. Из числа применяемых моновакцин вакцины на основе штаммов серотипа Массачусетс имеют наиболее широкий спектр антигенной активности и индуцируют выработку напряжённого иммунитета [1, 14, 22].

Живые вакцины, изготовленные на основе штамма «Н-120», обладают рядом преимуществ, к которым относятся: высокая иммуногенная активность, ареактогенность, авирулентность, широкий спектр антигенной активности.

Штамм «Н-52» более иммуногенен, т. к. менее аттенуирован, обладает более выраженной реактогенностью, вследствие чего его используют для повторной вакцинации в составе живой вакцины или в составе инактивированных вакцин [14, 52].

За рубежом широко используют бивалентные аттенуированные вакцины, сочетающие в себе штаммы вируса различных серотипов, которые обладают более широким спектром антигенной активности и стимулируют выработку более напряжённого и продолжительного иммунитета. Вместе с тем многие исследователи считают, что комбинирование в одном препарате нескольких живых штаммов вируса может вызывать рекомбинацию их генетического материала и приводить к возникновению новых штаммов вируса, обладающих оригинальными антигенными свойствами, не поддающимися специфической профилактике с помощью используемых вакцин [57].

В последние годы инактивированные вакцины находят всё большее применение. Применение инактивированного препарата позволяет полностью исключить возможность вспышки заболевания в результате реверсии аттенуированного вируса к исходному состоянию, избежать поствакцинальных осложнений, точно рассчитать дозу вводимого антигена, индуцировать и поддерживать определенный уровень гуморального иммунитета в течение периода роста птицы. Чаще используют эмульсионные и сорбированные инактивированные вакцины, их применяют индивидуально [14, 47].

Особенно широкое применение нашли ассоциированные инактивированные вакцины, содержащие в своём составе до 4 различных антигенов [14, 49]. Кроме вируса ИБК они могут включать в себя вирусы ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости-76, болезни Гамборо и других возбудителей.

За рубежом проводятся работы по созданию генно-инженерной вакцины 42 против ИБК.

В течение ряда лет применение этих препаратов позволяло предотвращать вспышки заболевания. Однако в последние годы на ряде птицефабрик появились случаи заболевания ИБК вакцинированной птицы, что объясняется появлением новых, так называемых вариантных штаммов, антигенно отличающихся от используемого вакцинного штамма, а также усилением вирулентности вируса в процессе многократного одновременного пассирования на восприимчивом поголовье птиц [4, 5, 14].

В связи с большим антигенным разнообразием вируса ИБК применяемые на данный момент вакцины не могут обеспечить полной защиты восприимчивого поголовья от заражения вариантными штаммами вируса. Поэтому проводятся работы по выделению циркулирующих на территории России антигенно отличных от вакцинных штаммов вируса и созданию на их основе инактивированных полиштаммных вакцин. Использование инактивированных вакцинных препаратов, имеющих в своём составе несколько антигенно различных штаммов вируса, позволит существенно расширить спектр иммунной активности препарата.

Использование в составе вакцины инактивированных вирусов позволит избежать рекомбинации генетического материала между ними и возникновения новых штаммов вируса.

1.10 Диагностика ИБК Диагностика вируса ИБК лабораторными методами в настоящее время имеет главное значение в постановке диагноза на данную болезнь.

Для целей диагностики и проведения научных исследований по проблеме ИБК наибольшее использование получили методы молекулярно—биологические (ПЦР, нуклеотидное секвенирование, ПЦР в реальном времени), серологические (ИФА, РН и др,), вирусовыделение в КЭ, в ТОК и иммунологические (реакцию нейтрализации, реакцию торможения гемагглютинации, проводят анализ клинической картины и патологоанатомических признаков, а также титров сывороточных антител [28, 35].

43

–  –  –

Методы выявления генома вируса ИБК не делают отличий между инфекционными и неинфекционными вирусными частицами. Выявление геномной РНК вируса ИБК обычно проходит в 3 этапа. Первый этап заключается в репликации вируса в РКЭ или ТОК. Затем проводят реакцию обратной транскрипции для получения кДНК с геномной РНК вируса ИБК, фрагмент которой амплифицируют в ПЦР. Последний этап заключается в определении нуклеотидной последовательности выявленного изолята вируса ИБК и его принадлежности к определенному генотипу.

Метод полимеразной цепной реакции один из самых (ПЦР) чувствительных и быстрых методов. Впервые об использовании ПЦР для выявления генома и типирования вируса ИБК сообщили Lin et al. [28, 149]. Для амплификации использовали 2 олигонуклеотидных праймера, фланкирующих участок гена S2 размером 400 н. Позднее были разработаны системы праймеров на фрагменты генов SI, N [28, 199] и на нетранслируемую область генома UTR [ovch]. Для повышения чувствительности реакции ПЦР используют вторую систему с внутренними праймерами [28, 87].

Для выявления генома вируса в образцах патологического материала в последнее время широко применяется реакция ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Принципиальным преимуществом данного метода является возможность осуществления детекции накопления ампликонов без открывания пробирки, что снижает риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации проб и реагентов продуктами амплификации.

Существенное уменьшение количества манипуляций с исследуемым образцом сокращает затраты времени, упрощает анализ и позволяет снизить вероятность ошибок. Применение наряду с праймерами гибридизационных зондов обеспечивает повышение специфичности анализа. Возможность независимой одновременной регистрации флуоресцентного сигнала от нескольких 44 гибридизационных ДНК-зондов допускает выявление в одном исследовании нескольких различных участков одной или различных ДНК-мишеней.

Разработано множество способов регистрации амплификации в реальном времени. В диагностических ПЦР-наборах наиболее часто применяются методики с использованием комплементарных ампликону флуорогенных зондов типа TaqMan, интенсивность флуоресценции которых изменяется пропорционально накоплению ампликона и регистрируется в реальном времени специальными приборами - амплификаторами с оптическим модулем.

В настоящее время разработаны системы выявления генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием праймеров и зондов, ориентированных на ген N [28, 90] и на нетранслируемую область генома UTR [28,77].

1.10.2 Вирусовыделение в КЭ, в ТОК, в КК.

Из полученных проб готовят суспензию, которой заражают 9-11 - суточные СПФ куриные эмбрионы или органную трахеальную культуру. Делают не менее 4-х пассажей. Для постановки диагноза на инфекционный бронхит необходимо установить типичные для данного заболевания патологоанатомические изменения эмбрионов (отставание в росте и развитии, скручивание в «шар») или снижение цилиостаза на трахеальных органных культурах.

1.10.3 ТОК в диагностике ИБК Определение степени тяжести респираторной инфекции, вызванной вирусом ИБК, всегда было проблемой в изучении его патогенности [94]. Вирус вызывает стаз трахеальных ресничек как in vivo, так и in vitro, и этот параметр использовался для определения тяжести респираторной инфекции. Но Otsuki et al.

[93] при изучении устойчивости двух линий кур к вирусу ИБК, оценивая цилиарную активность после заражения штаммом М41 разных линий кур, обнаружили, что она значительно различалась. Зарубежные авторы предложили использовать этот метод для сравнения патогенности различных штаммов или чувствительности разных пород к вирусу ИБК. Cubillos et al. [98] установили, что 45 цилиарная активность у птиц зараженных четырьмя разными изолятами ИБК, различается, что говорит об отличиях в вирулентности штаммов ИБК.

Несмотря на то, что для культивирования и испытания ИБК широко используется трахеальная органная культура явных различий в (ТОК), вирулентности среди разных штаммов ИБК в системе in vitro не наблюдалось.

Cook et al. [94], несмотря на стандартизацию ТОК для выделения и исследования вируса ИБК, при сравнении трех его штаммов, по их воздействию на трахеальные цилии, нашли незначительные различия. Dhinakar Raj & Jones [104] также отметили небольшие отличия между семью штаммами ИБК, использовав метод оценки цилиарной активности как критерий повреждения эпителия трахеи. При сравнении в ТОК Cubillos et al. [98], обнаружили, что два из девяти штаммов вызывали лишь гиперплазию, представляющую собой единственное отличие.

В последние десятилетия появились штаммы вируса ИБК, вызывающие нетипичные для данной болезни клинические признаки и патологоанатомические изменения.

1.11 Заключение по обзору литературы Анализ литературных данных, посвященных изучению инфекционного бронхита кур, в частности, биологических особенностей возбудителя, вариабельного тканевого тропизма, клинических проявлений болезни, природного иммунного ответа при данной инфекции, проблем распространения и профилактики заболевания, показывает, что исследование данного заболевания остается актуальным. Инфекционный бронхит кур имеет широкое распространение практически во всех странах мира с развитым промышленным птицеводством.

Несмотря на существенные успехи в борьбе с данным заболеванием нерешёнными остаются многие задачи.

Вирус ИБК исключительно разнообразен и имеет большое количество серотипов и вариантов, при возникновении заболевания происходит быстрое инфицирование всего поголовья.

Тропность и место первичной репликации зависит от штамма вируса ИБК и, возможно, является результатом природной селекции. Штаммы ИБК обладают широким тканевым тропизмом, и клинические проявления болезни могут быть разнообразными.

Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций. Известно большое количество серотипов вируса, при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, не дает перекрестной защиты от заражения другим серотипом, что значительно осложняет профилактику ИБК.

В данном исследовании мы изучали патогенез инфекционного бронхита кур в организме птиц и разработали методику оценки инфекционного титра вируса ИБК с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Данный метод менее трудоёмок, чем традиционное титрование на куриных эмбрионах, более экономичен, а оценка титра может быть проведена в течение 1 сут.

47

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы 2.1.1 Вирус ИБК В работе использовали следующие штаммы вируса ИБК: вакцинный штамм «Н-120» серотипа Массачусетс; вакцинный штамм «4/91» серотипа 793/В; штамм «Д274» серотипа Д207, штамм «М41» серотипа Массачусест, штамм RF08-10 генотипа «QX» (штамм QX).

В исходном виде вирусные штаммы представляли собой лиофилизированные вирусные препараты. Величина инфекционного титра лиофилизированных вирусных препаратов находилась в диапазоне 6,77,0 lgЭИД50/см. Для экспериментальных работ использовали вирусные расплодки исходных вирусных препаратов в виде нативых экстраэмбриональных суспензий, полученных после однократного пассирования исходных вирусных препаратов в КЭ.

2.1.2 Эмбрионы кур Для получения эмбрионов использовали яйца категории СПФ фирмы Valo Biomedic (Германия).

Использовали биологически полноценные яйца весом не менее 52 г. Перед закладкой в инкубатор яйца дезинфицировали методом орошения 70%-м спиртовым раствором йода.

Эмбрионы инкубировали при температуре (37±0,5)°С и относительной влажности воздуха 60%.

2.1.3 Подопытная птица В качестве подопытной птицы использовали клинически здоровых цыплят породы белый леггорн, выведенных из СПФ-эмбрионов кур, в количестве свыше 500 голов. Эксперименты с птицей проводили на базе вивария ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Птицу содержали по 10-20 голов в клетках, оборудованных кормушками и поилками. Рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц.

48 В экспериментах использовали птицу серонегативную к вирусу ИБК.

2.1.4 Патологический материал Для патологических исследований отбирали пробы трахей, легких, почек, репродуктивных органах и миндалин слепого отдела кишечника.

2.2 Методы исследований 2.2.1 Культивирование вируса Штаммы вируса ИБК культивировали в эмбрионах СПФ-кур 9-11 суточного срока инкубации.

Эмбрионы заражали в аллантоисную полость. Для заражения, при просвечивании под овоскопом, отбирали только хорошо развитые, подвижные, жизнеспособные эмбрионы.

У отобранных для заражения эмбрионов карандашом очерчивали границу воздушной камеры и отмечали место для заражения (бессосудистое пространство). Отобранные эмбрионы размещали на металлических подставках с ячейками воздушной камерой вверх, протирали эту область 96о спиртом и фламбировали. Затем стерильным стилетом прокалывали отверстия в области воздушной камеры и в месте для заражения (на 3-5мм ниже границы пуги).

Вируссодержащий материал вносили шприцом с тонкой короткой иглой в аллантоисную полость в объеме 0,2 см3. После заражения оба отверстия в скорлупе заливали стерильным парафином.

Зараженные эмбрионы кур помещали в термостат при температуре 37,0±0,5оС и относительной влажности воздуха 60%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили через 24 часа после заражения, затем с интервалом не более 6 часов. Гибель эмбрионов до 24 часов считали неспецифической. По окончании инкубации, ограниченной 72 - часовым сроком, эмбрионы помещали в холодильные камеры при температуре 2-6С на 6-18 часов. Перед вскрытием эмбрионы выдерживали 2-3 часа при комнатной температуре до испарения конденсата на скорлупе.

49 После охлаждения куриные эмбрионы вскрывали в стерильных вирусологических боксах, соблюдая правила асептики. Для сбора ЭЭЖ.

2.2.2 Определение инфекционной активности вируса Инфекционную активность вируса ИБК определяли титрованием в эмбрионах СПФ-кур 9-11 - суточного срока инкубации.

Разведения вирусных материалов готовили непосредственно из вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости эмбрионов кур. Для титрования вируса готовили десятикратные разведения от 10-1 до 10-8. Каждым разведением заражали по 6 эмбрионов в аллантоисную полость в объеме 0,2 см3.

Не менее 6 эмбрионов оставляли в качестве контроля.

Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 7 сут. при температуре 37,0±0,5 С и относительной влажности 60%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили с интервалом 6 часов.

Эмбрионы, павшие в первые 24 часа после заражения, уничтожали, считая их гибель неспецифической. Гибель эмбрионов в последующие часы относили за счет действия вакцинного вируса. Через 7 сут. все эмбрионы вскрывали.

При определении титра вируса ИБК учитывали гибель эмбрионов, а также изменения эмбрионов, характерные для действия этого возбудителя (отставание в росте, "карликовость", скрученность).

Титр вируса рассчитывали по методу Кербера и выражали в эмбрионинфицирующих дозах (ЭИД50).

2.2.3 Вскрытие птиц и отбор проб патологического материала Вскрытие и отбор проб патологического материала у цыплят производили в спинном положении, зафиксировав путем вылущивания бедренных костей из суставов в стерильных вирусологических боксах. После обработки перьевого покрова йодно-спиртовым раствором выполняли срединный разрез кожи от клюва до клоаки, потом методом тупого препарирования отделяли подкожную клетчатку и кожу. После визуализации всех анатомических структур в области шеи отбирали пробы трахеи. Грудобрюшную полость вскрывали путем проведения 50 разреза брюшной стенки от клоаки до острия грудной кости, затем двумя разрезами в обе стороны до подреберья. Далее приступали к отбору проб внутренних органов. В первую очередь отбирали кусочки трахеи и легких, почки, затем репродуктивные органы и наконец миндалины слепого отдела кишечника.

Пробы органов помещали в пробирки эппендорфа и замораживали (для ПЦР), дополнительные пробы почек и трахеи фиксировали в 10%-м растворе формалина (для гистологического исследования). Отбор проб у опытных цыплят выполняли через 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, и 27 сут после заражения, путем эвтаназии по 3 головы в каждый срок. При выполнении отбора проб у цыплят, отбирали сыворотку крови, также учитывали патологические изменения.

2.2.4 Полимеразно-цепная реакция Использовали вариант ПЦР в режиме реального времени. Объем единичной испытуемой пробы составлял 0,1 см. Нуклеиновую кислоту выделяли на роботизированной станции Tecan Freedom EVO-100 из 0,1 мл образца суспензии с помощью набора для выделения нуклеиновой кислоты с магнитными частицами “Magna DNA Prep 100” (ООО БиоКом, г. Москва) согласно инструкции изготовителя. Полученный раствор РНК использовали для проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени. В реакции использовали 3 праймера GU391, GL533 и zUTR. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации.

Растворы и реактивы для проведения ПЦР. В работе использовали следующие ферменты и реактивы: набор для выделения нуклеиновой кислоты “Magna DNA Prep 100” (ООО БиоКом, г. Москва); набор GoTaq Flexi Taq-ДНКполимераза (Promega); дНТФ 10mM (Fermentas); деионизованная вода; спирт этиловый 96%; праймеры и зонд предложены Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie – Italy и синтезированы Синтол, г. Москва [25].

51 2.2.5 Органная культура трахеи Приготовление и поддержание ТОК проводили по стандартной методике [26, 27]. Для её приготовления использовали СПФ-РКЭ сроком инкубации 19, 20, 21 сут. Кольца трахеи препарировали при помощи скальпеля, ножниц, бритвенного лезвия.

Для подготовительных работ и культивирования ТОК использовали готовые поддерживающие питательные среды ПСС, ПСП. Трахеальные кольца помещали в лунки пластиковых планшетов и культивировали в условиях СО2-инкубатора при температуре 37,6±0,3°С.

Определение инфекционного титра вируса для ТОК. Использовали стандартный способ последовательных разведений вируссодержащего материала на поддерживающей среде. Материал вносили в лунки с ТОК в объеме 0,1 мл. В качестве положительного результата считали наличие полного цилиостаза внутренней поверхности трахеи. Расчет величины титра вируса проводили по методу Кербера и выражали в 50% цилиостатических дозах (ЦД50) [37].

2.2.6 Оценка патогистологических изменений в трахеи и в почках Проводили гистологические исследования почек и трахей инфицированных цыплят. Для этого у цыплят после эвтаназии извлекали почки и трахеи и фиксировали в 10%-ом растворе формалина. После фиксации вручную нарезали тонкие срезы ткани почки и трахеи (толщиной 2-3 мм). Данные срезы помещали в специальные кассеты и закрывали. Затем заливали парафином. Кассеты с залитыми в парафине образцами тканей почек и трахеи закрепляли в микротоме, плавно нарезали срезы толщиной по 5 мкм и помещали на предметные стекла.

После этого срезы вручную окрашивали гематоксилином и эозином. После окрашивания срезы высушивали при комнатной температуре и только после этого на срез наносили каплю канадского бальзама. Затем срез покрывали покровным стеклом и исследовали в световом микроскопе.

Для оценки патогистологических изменений структуры трахеи использовали 4 балльную шкалу, представленную ранее Alvarado et al.[48]:

1 балл – отсутствие признаков патологии;

52 2 балла – наличие легкой гиперплазии эпителия и мягкой субэпителиальной лимфоидной инфильтрации, с слабым утолщением слизистой оболочки в результате отека;

3 балла – наличие умеренной гиперплазии эпителия с потерей ресничек и умеренной субэпителиальной лимфоидной инфильтрацией с умеренным утолщением слизистой оболочки;

4 балла – наличие тяжелой гиперплазии эпителиальных и субэпителиальной ткани, наличие лимфоидной инфильтрации с умеренным утолщением слизистой оболочки, все реснички исчезают с поверхности эпителия и наступает десквамация эпителиальных и секретирующих клеток слизистой оболочки.

2.2.7 Обработка результатов экспериментов Использовали общепринятые в биологии методы статистической обработки данных, для проведения расчётов использовали приложение «Exel» операционной системы Microsoft Windows XP.

53

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционого титра вируса ИБК При проведении научных исследований, а также при выполнении работ на биологических предприятиях постоянно возникает необходимость определения титра (концентрации) вируса в том или ином материале.

Для титрования инфекционного вируса ИБК в качестве чувствительных тест-систем используют развивающиеся эмбрионы кур (РКЭ) или трахеальную органную культуру (ТОК) в виде переживающих эксплантантов. Каждая из указанных систем имеет свои преимущества и недостатки.

К основным недостаткам использования РКЭ относятся продолжительность титрования, связанная с временем развития инфекционного процесса (не менее 7 суток), достаточно высокая степень субъективности при оценке результатов и в целом высокая себестоимость процедуры.

Использование ТОК требует строгого соблюдения асептики и высокой квалификации исполнителей при приготовлении эксплантантов. Кроме этого, экспозиция инфицированных эксплантантов должна происходить в термостатах, снабженных устройствами для поддержания СО2- атмосферы.

В связи с этим считали целесообразным провести поиск опосредованного метода оценки инфекционного титра вируса на основе ПЦР с учетом количества циклов амплификации, т.е. использовать ПЦР в реальном времени с применением обратной транскрипции м-РНК (ОТ-ПЦР-РВ). В данном варианте постановки реакция является зависимой от исходной концентрации генетического материала вируса в тестируемом образце. На этом основании количество произошедших циклов амплификации, необходимое для достижения заданного уровня флюоресцентной метки (т.е. величина прогового цикла реакции), должно иметь отрицательный коэффициент корреляции с исходным титром вируса.

При этом одним из наиболее важных преимуществ ОТ-ПЦР-РВ является быстрота постановки теста, которая составляет не более 4 часов. Данное обстоятельство дополнительно указывало на актуальность выбранного направления.

Целью данного этапа исследований являлось изучение возможности использования ОТ-ПЦР-РВ для опосредованного определения инфекционного титра вируса ИБК.

Методика экспериментов по выявлению связи между титром вируса на РКЭ и результатами ОТ-ПЦР-РВ сводилась к следующему. В качестве вируссодержащего материала использовали экстраэмбриональную вируссодержащую жидкость. Готовили ряд последовательных десятикратных разведений вирусного материала, из каждого полученного разведения отбирали две пробы: одну - для определения значения порогового цикла (Ct) в ОТ-ПЦР-РВ, другую - для заражения РКЭ (n5). Объём инокулята составлял 0,1 см на эмбрион. Таким образом, получали систему для параллельной оценки исходной концентрации вирусного генома и величины инфекционного титра вируса в тестируемом образце. В контрольной группе в объеме 0,1 см на эмбрион вводили физраствор.

В группах подопытных эмбрионов проводили клинические наблюдения.

Соответственно разведениям вирусного материала, которые использовали для заражения РКЭ, учитывали гибель эмбрионов и/или - морфологические изменения, характерные для инфекционного процесса, обусловленного вирусом ИБК. Результаты клинических наблюдений представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Морфологические изменения эмбрионов*, инфицированных последовательными десятикратными разведениями материала**, содержащего вирус ИБК штамм Н-120

–  –  –

Представленные в таблице 1 результаты позволили сделать ряд заключений.

Развития инфекционного процесса, обусловленного вирусом ИБК, были обнаружены в виде:

- значительного отставания роста эмбрионов (карликовости) и снижения массы тела более чем на 50% по сравнению с эмбрионами контрольной группы; - свертывания в клубок инфицированных зародышей и уплотнения их консистенции; утолщения амниотической оболочки и присутствия фиброзных налетов; - перекручивания шеи и прилипания лапок к голове эмбриона. При этом степень проявления перечисленных признаков зависела от введенной дозы инфекционного вируса.

Наличие какого-либо из перечисленных морфологических признаков, который отличался от контроля, считали положительной реакцией чувствительного тест-объекта. Для каждого испытанного разведения вирусного материала определяли долю положительных реакций и, по методу Кербера, проводили расчет величины инфекционного титра вируса (lgT, ЭИД50).

На основании оценки соответственно величинам испытанных lgT, разведений (j), вычисляли частные значения lgTj (оценки концентрации вируса в j-разведении). После проведения ОТ-ПЦР-РВ получали выборки параллельно установленных показателей lgTj и Ctj. Реакцию считали отрицательной (геном вируса не выявлен) если Ctj35, Однократный эксперимент, в котором отражен порядок параллельного получения отмеченных показателей, в качестве примера, представлен в таблице 2.

Эксперимент повторяли шесть раз (h=6). Полученные данные использовали для построения модели связи (регрессионной модели), где параметр Ct рассматривали как фиксированный, при этом параметр lgT считали зависимым.

Соответствующие результаты представлены в виде диаграммы на рисунке 3.

Рисунок 3 демонстрирует, что между концентрацией инфекционного вируса (lgT) и пороговым циклом амплификации (Ct) присутствовала выраженная связь.

Соответствующий коэффициент корреляции составил:

R = -0,987±0,088.

–  –  –

10 +++++ 5/5** 10,55 6,10 10 +++++ 5/5 15,11 5,10 10 +++++ 5/5 20,19 4,10 10 +++++ 5/5 23,47 3,10 105 +++++ 5/5 27,43 2,10 10 +++++ 5/5 31,17 1,10 107 +++ - - 3/5 33,93 0,10 10 ----- 0/5 37,23*** -1,00 Оценка титра инфекционного вируса в образце по Керберу: lgT=7,1 ЭИД50/0,1см3

Примечания:

* - "+"- положительная реакция (инфекционный процесс присутствует), "" - отрицательная реакция (инфекционный процесс отсутствует);

** - a/b, где: a - число положительно реагирующих тест-объектов; b - общее количестве тест-объектов, использованных для испытания данного разведения;

*** - реакция отрицательна (Ct35);

# - значение, вычисленное на основании величины инфекционного титра вируса в образце, которая была расчитана по Керберу (lgТj= lgT-lgj) Развернутой характеристикой связи указанных параметров явилось регрессионное уравнение вида:

lg"T=0,0002(Ct)3-0,0178(Сt)2+0,1499(Сt)+6,3648, {1} где: lg"T - прогнозируемая величина концентрации (титра) инфекционного вируса для заданного значения Ct. Уравнение {1} было построено для всех экспериментальных точек, показывало высокую адекватность (R=0,972) и позволяло проводить прогноз в том числе и вне экспериментального диапазона.

Однако очевидно, что практическое использование такой модели затруднено ввиду сложности вычислительных операций. Кроме этого, прогнозирование «крайних» значений параметров (например, величины lgT при C=0) не имело практической значимости. В связи с этим был проведен поиск более простой модели.

–  –  –

Рисунок 3 - Зависимость между количеством пороговых циклов амплификации (Ct) установленных в ОТ-ПЦР-РВ и концентрацией инфекционных доз вируса (lgTj, ЭИД50) для СПФ-эмбрионов кур Представлены: регрессионная модель вида "lgT=0,0002(Ct)3-0,0178(Сt)2+0,1499(Сt)+6,3648, построенная для всего исследованного диапазона (А); регрессионная модель вида "lgT=-0,2654(Ct)+9,3363, построенная на линейном участке эмпирических точек (B), где:

"lgT - логарифм прогнозируемой концентрации (титра) инфекционного вируса для заданного значения Ct. Указаны коэффициенты детерминации (R), оценивающие адекватность моделей.

*- использован штамм Н-120 вируса ИБК в составе экстраэмбриональной жидкости инфицированных СПФ-эмбрионов кур Для расчетов использовали значения lgTj, установленные только в диапазоне 10Ct35 (на отмеченном отрезке зависимость lgTj от Ct была близка к линейной). В результате была построена простая линейная модель вида:

lg"T=-0,2654(Ct)+9,336 {2} Модель {2} имела высокий уровень адекватности (R=969) и могла быть использована для прогноза величины инфекционного титра вируса по результатам ОТ-ПЦР-РВ. Единственным обязательным условием использования данной модели являлись границы отмеченного выше диапазона показателей Ct, соответствующему "линейному" участку значений зависимого параметра lgTj.

Целью следующего этапа работы было исследование связи между величиной инфекционного титра вируса, установленного по цилиостатическому эффекту в переживающей органной культуре трахеи (ТОК), и Ct - показателем, зарегистрированным для данного образца в ОТ-ПЦР-РВ.

Оценкой положительной реакции эксплантанта ТОК считали полную останову движения ресничек мерцательного эпителия (100%-й цилиостаз). Для испытания каждого разведения вирусного материала использовали не менее 4 эксплантантов. Таким образом определяли долю положительных реакций в данной группе. Далее по всему диапазону испытанных разведений, используя метод Кербера, рассчитывали величину титра 50%-ных цилиостатических доз вируса (lgT, ЦД50).

Последующая процедура проведения эксперимента полностью совпадала с ранее описанной методикой с использованием СПФ-эмбрионов (см. таблицу 1), где для каждого тестированного разведения (j) вычисляли фактическую концентрацию инфекционного вируса (lgTj) и параллельно установленную оценку Ct.

Эксперимент повторяли 3 раза. После проведения ОТ-ПЦР-РВ получали выборки параллельно установленных показателей lgTj и Ctj. Реакцию считали отрицательной (геном вируса не выявлен), если Ctj35. Полученные результаты в графическом виде приведены на рисунке 4.

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 ЭКОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доцент Семенова Е.А. БЛАГОВЕЩЕНСК –...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Шестакова Вера Владимировна МОРФО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS MILL. К КОККОМИКОЗУ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.