WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ...»

-- [ Страница 2 ] --

Возможно, нужно подобрать группу пациентов с примерно одинаковой тяжестью, обширностью и характеристикой СНМ и в ней сравнить влияние полиморфизмов CFH на исход лечения ранибизумабом. При оценке толщины сетчатки в макулярной зоне по данным оптической когерентной томографии (ОКТ) значимыми оказались полиморфизмы нескольких генов-кандидатов. Основным из них является минорный аллель полиморфизма С3, который rs6660704 ассоциирован со значительным уменьшением толщины сетчатки в макулярной зоне как за 6, так и за 12 мес. на 292 m (р=0,0056) и 232 m (р=0,017) соответственно. По данным флуоресцентной ангиографии, с активностью СНМ были статистически достоверно связаны полиморфизмы нескольких генов: FLT1, FGFR2 и VEGFA. С частотой инъекций ранибизумаба были статистически достоверно ассоциированы VEGFA, FLT1 и CFH [75].

Особенности современных фармакогенетических исследований экссудативной возрастной макулярной дегенерации К сожалению, в настоящее время фармакогенетика является методом исследований, а не повседневной практикой офтальмолога. К тому же у большинства фармакогенетических исследований анти-VEGF терапии имеется ряд недостатков.

В первую очередь это недостаточное количество исследований, причем в каждом отдельном случае – малая выборка (в среднем около 80 человек). Это не позволяет с достаточной точностью выявить реальные полиморфизмы, которые можно будет использовать в рутинной практике для корректировки лечения и, соответственно, персонализации режима лечения.

Во-вторых, многие исследования являются ретроспективными, что не позволяет использовать четкие критерии включения/исключения для ограничения фенотипической гетерогенности. Результаты имеющихся исследований довольно противоречивы, что может быть следствием исходных генетических различий выборки, разных типов СНМ (например, оккультная или классическая), выбора разных конечных точек исследований (острота зрения, морфологические характеристики, требуемое количество инъекций), разных статистических методов и других факторов.

Другой проблемой является малая длительность наблюдения, так как большее время наблюдения может позволить выявить дополнительные гены, вовлеченные в ответ на лечение. К тому же результаты исследования применимы в основном к пациентам с впервые выявленной СНМ, не получавшим другой антиангиогенной терапии.

Хорошо спланированные факмакогенетические исследования с большой выборкой несут в себе большие перспективы. Специфический генетический скрининг может помочь пациентам с «хорошим» набором полиморфизмов получать меньшее количество инъекций ранибизумаба при хорошей эффективности и продлить интервал между осмотрами, тогда как пациентам с неблагоприятным генотипом назначить более частые инъекции и, возможно, дополнительные методы лечения. К тому же фармакогенетические исследования могут способствовать выявлению новых генов и белков, которые в будущем могут стать мишенями для новых лекарственных препаратов.

Развитие фармакогенетики может изменить отношение людей к медицине и использованию лекарств. Например, можно будет сократить количество побочных эффектов и, если полногеномное генотипирование станет рутинной и недорогой процедурой, определить фармакогенетический профиль человека еще до того, как ему потребуется лечение.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика клинического материала Данное исследование было проведено в 2011-2014 гг. на клинической базе ФГБНУ «Научно-исследовательского института глазных болезней» (дир. – академик РАН, проф. д.м.н. С.Э. Аветисов). Исследование включало 352 человека (376 глаз) с экссудативной формой ВМД (мужчин 104, женщин 248).

Возраст пациентов варьировал от 50 до 90 лет (средний возраст 73,35 ± 7,6 года).

Критерии включения:

Возраст пациента 50 лет и старше.

Наличие подтвержденной экссудативной формы ВМД.

Локализация СНМ в макулярной зоне.

СНМ активна по результатам флуоресцентной ангиографии глазного дне (ФАГД) и ОКТ (наличие одного из следующих признаков: субретинального кровоизлияния, субретинальной/интраретинальной экссудации и потеря остроты зрения более чем на 0,2 за последние 3 мес.).

Критерии исключения:

Возраст пациента менее 50 лет.

Наличие СНМ, вызванной причинами, не связанными с ВМД.

Невозможность проведения ОКТ и офтальмоскопии.

Наличие некомпенсированной глаукомы.

Интраокулярные хирургические вмешательства на исследуемом глазу за последние 3 мес.

Витреоретинальные операции и операции пломбирования на исследуемом глазу в анамнезе.

Наличие в анамнезе лечения СНМ лазерными методами (лазерной фотокоагуляции и фотодинамической терапии) или антиангиогенными препаратами в исследуемом глазу за последние 2 года.

Любые глазные заболевания, кроме ВМД, которые могут повлиять на изменение остроты зрения и анализ результатов.

Наличие острых или некомпенсированных системных, онкологических и других заболеваний.

Наличие психических заболеваний и ментальных расстройств, мешающих пониманию пациентом условий участия в исследовании, проведению необходимых исследований и проверке остроты зрения.

Методы офтальмологического обследования пациентов Офтальмологические методы обследования Всем пациентам проводилось традиционное офтальмологическое обследование, включающее визометрию, рефрактометрию, тонометрию, периметрию. Биомикроскопическое исследование выполняли с помощью щелевой лампы. Стекловидное тело и глазное дно исследовали в условиях максимального мидриаза с 3-зеркальной линзой Гольдмана. Основным показателем, исследуемом в анализе, была величина остроты зрения.

Распределение по группам в зависимости от исходной остроты зрения. В большинстве крупных исследований, посвященных лечению ранибизумабом, критерием включения является острота зрения от 0,05-0,1 до 0,5, что обычно формирует более-менее однородную выборку пациентов по остроте зрения и величине отека сетчатки. В НИИ глазных болезней лечение проходили пациенты с различной величиной остроты зрения, поэтому выборка по исходной остроте зрения оказалась не достаточно однородной – коэффициент вариации составил более 65%. Распределение пациентов по остроте зрения представлено на рис. 2.

Рис. 2. Гистограмма распределения пациентов по исходной остроте зрения.

Поэтому в целях дальнейшего анализа пациенты в зависимости от исходной остроты зрения были разделены на следующие группы:

1-я группа – 113 (32,1 %) пациентов (117 глаз) с остротой зрения до 0,1, средний возраст 74,9±7,2;

2-я группа - 221 (62,8 %) пациент (240 глаз) с остротой зрения от 0,11 до 0,5, средний возраст 72,5±8,2;

3-я группа - 18 (5,1 %) пациентов (19 глаз) с остротой зрения выше 0,51, средний возраст 72,8±5,1.

Полученные средние по группам практически совпадают с медианой, а коэффициент вариации приблизился к приемлемому уровню – чуть более 33% в 1-й и 2-й группах и меньше 1/3 в 3-й группе.

Таким образом, удалось выделить три однородные, но различающиеся между собой по остроте зрения группы пациентов (рис. 3).

Рис. 3. Ящичковая диаграмма остроты зрения по группам.

Специальные офтальмологические методы обследования:

А. Флуоресцентную ангиографию глазного дна (ФАГД) проводили стандартным методом на фундус-камере FF 450 plus (ФФ 450 плюс) «Карл Цейс»

(Германия) с встроенной цифровой камерой и HRT3 Heidelberg Engineering (Германия). Для FF 450 plus в качестве возбуждающего фильтра использовали фильтр Baid Atomic B4, перед объективом видеокамеры устанавливали жёлтый барьерный фильтр ЖС-13, соответствующий по характеристике Kodak Wratten No 15.

В качестве контрастного вещества использовали 10 % раствор флуоресцеина натрия (Флуоресцид) производства фирмы «Новартис»

(Швейцария), который вводили в локтевую вену в количестве 2 мл в течение 2 сек. В день проведения ФАГД зрачок максимально расширяли мидриатиками. До внутривенного введения контрастного вещества каждому пациенту делали фоновый снимок с целью контроля за псевдоаутофлюоресценцией структур глазного дна. Через 6-7 сек. от начала инъекции начинали серийную съёмку глазного дна в течение 20-25 сек. с интервалом 0,8-1 сек. Последующие кадры снимали с интервалом 5-10 сек. Поздние фазы регистрировали через 15, 30 и 60 мин.

При проведении ФАГД основное внимание обращали на состояние циркуляции флуоресцеина в зоне СНМ, ее обширность. Зону патологического очага фокусировали в центре кадра [25, 36].

Б. Оптическую когерентную томографию (ОКТ) проводили на томографе ОКТ Stratus «Carl Zeiss» (Германия) и Spectralis ОКТ «Heidelberg Engineering» (Германия) совместно с к.м.н. А.А. Плюховой. ОКТ - неинвазивный метод визуализации биологических структур, позволяющий получить in vivo двухмерное изображение поперечных оптических срезов биологических тканей с разрешающей способностью, приближающейся к клеточному уровню (10-15 мкм). Технологической основой данного метода является измерение оптической отражательной способности (рефлективности) биологических структур. Томограф позволяет проводить анализ переднего и заднего отрезка глазного яблока, в том числе параметров среза макулы с помощью одного прибора in vivo. В основе работы прибора лежит диагностическая технология, которая позволяет получить двухмерное изображение среза оболочек глазного яблока и зрительного нерва с высоким разрешением, замерить толщину их продольного сечения путем анализа светового сигнала, отраженного от границ биологических слоев [3, 7, 26].

Первым 100 пациентам ОКТ проводилось на приборе Stratus OCT. Он рассчитывает толщину сетчатки как расстояние между поверхностью и местом сопряжения внутреннего и внешнего сегмента фоторецепторов, которые находятся непосредственно над пигментным эпителием сетчатки. Алгоритмы для расчета толщины сетчатки и слоя нервных волокон используют повторяющийся процесс, при котором различные методы применяются в заданной и логической последовательности, сначала для создания оценки визуальных ограничений, а затем для применения точных значений.

Изучались анатомо-топографическое соотношение слоев сетчатки и ее толщина в макулярной зоне. Состояние центральной зоны исследовалось согласно протоколу сканирования «Macular thickness», включающему радиальное последовательное сканирование в 6 меридианах. Анализ данных выполнялся на основе протокола «Retinal thickness/ volume tabular», который позволял оценить топографию слоев и толщину сетчатки.

Последующим пациентам ОКТ проводилось на приборе Spectralis OCT, который рассчитывает толщину сетчатки как расстояние между поверхностью и комплексом внешний сегмент фоторецепторов – РПЭ – мембрана Бруха.

Сканирование проводилось по программе определения центрального макулярного объема с 25 сканами. Поскольку использовались разные приборы, то данные толщины сетчатки первых 100 пациентов корректировались под прибор Spectralis OCT, а данные общего макулярного объема (ОМО) не использовались.

Корректировка осуществлялась путем прибавления к величине толщины сетчатки, измеренной на Stratus OCT, 60 µm. Такая средняя разница при сравнении значений толщины сетчатки на двух приборах была показана во многих исследованиях [32, 56, 82, 119].

Для анализа толщины макулы в различных отделах мы использовали следующие параметры: ЦТС (average retinal thickness fovea), среднюю толщину сетчатки (average retinal thikness): височные (temporal inner/outer macula), носовые (nasal inner/outer macula), верхний (superior inner/outer macula) и нижний (inferior inner/outer macula) отделы во внутренних и внешних слоях макулы, а также ОМО (total macula volume).

Оценивали характер поражения, опираясь на данные, полученные по результатам проведения ФАГД и ОСТ:

неоваскуляризация одно- или двусторонняя; площадь поражения (до 1) 1,5 диска зрительного нерва (ДЗН), от 1,5 ДЗН до аркад, за аркадами, рис. 4);

характер рубцевания (легкая степень рубцевания - на ОКТ фиброзная 2) ткань практически не визуализируется; выраженное рубцевание – на ОКТ и ФАГД отчетливо видна субретинальная фиброзная ткань; гиперрубцевание – фиброзная ткань большую часть центральной зоны сетчатки, рис. 5) и его динамика;

наличие и динамика отслойки нейроэпителия (ОНЭ) (рис. 6) и 3) эпиретинального фиброза (рис. 7);

тип (куполообразная средняя, куполообразная высокая, плоская, более 4) 2 отслоек, рис. 8) и локализация (субфовеолярно или вне центра) ОПЭ в динамике;

наличие и тип КО (умеренный – множественные мелкие кисты в 5) толще сетчатки; гигантские кисты экстрафовеолярно, субфовеолярные кисты, рис.

9) в динамике.

До начала основного анализа была произведена оценка исходной выборки в целом по вышеперечисленным признакам.

А Б В Рис. 4. Примеры офтальмоскопической и ангиографической картины глазного дна пациентов с различной площадью поражения: А – менее 1,5 площади ДЗН, Б – от 1,5 ДЗН до аркад, В – за аркадами.

А А Б Рис. 5. Примеры офтальмоскопической и ангиографической картины глазного дна и результатов ОКТ сетчатки пациентов с различной степенью рубцевания: А – легкий рубец, Б – выраженный рубец, В – гиперрубец.

В В Рис. 6. Пример результата ОКТ сетчатки пациента с отслойкой нейроэпителия.

А Б В Рис. 7. Примеры результатов ОКТ сетчатки на глазах без эпиретинального физброза (А), с умеренным (Б) и выраженным (В) эпиретинальным фиброзом.

А Б В Г Рис. 8. Примеры результатов ОКТ сетчатки на глазах с плоской (А), средней куполовидной (Б), высокой куполовидной (В) и множественными (Г) ОПЭ.

А Б В Г Рис. 9. Примеры результатов ОКТ сетчатки на глазах с умеренным КО (А), экстрафовеолярными гигантскими кистами (Б) и субфовеолярными (В и Г) кистами.

Методика проведения антиангиогенной терапии В рамках исследования пациентам эндовитреально вводили препарат «Луцентис» (ранибизумаб) 3 раза с перерывом в 1 мес. Международное непатентованное название: Ранибизумаб [165]. Регистрационный номер: JICPРаствор для внутриглазного введения 10 мг/мл: фл. 0,3 мл 1 шт.

Раствор для внутриглазного введения прозрачный или слегка опалесцирующий, бесцветный. Вспомогательные вещества: а,а-трегалозы дигидрат, L-гистидин, L-гистидина гидрохлорида моногидрат, полисорбат 20, вода д/и 0,3 мл - флаконы из бесцветного стекла в комплекте с иглой, снабженной фильтром, иглой и шприцем.

Препарат относится к клинико-фармакологической группе моноклональных антител к эндотелиальному фактору роста-A (VEGF-A).

Препарат «Луцентис» (ранибизумаб) применяели эндовитреально в дозе 0,5 мг (0,05 мл). До введения препарата Ранибизумаб проверяли качество растворения и цвет раствора. Препарат невозможно использовать при изменении цвета раствора и появлении нерастворимых видимых частиц.

Методика проведения эндовитреального введения Луцентиса. Перед началом операции необходимо набрать Луцентис из флакона, четко следуя нижеописанным рекомендациям (все манипуляции проводятся в асептических условиях):

1) до вскрытия флакона с препаратом поверхность резиновой пробки следует продизенфицировать;

2) в асептических условиях соединяют прилагаемые шприц (вместимостью 1 мл) с иглой, снабжённой фильтром (размер пор которого 5 мкм). Иглу, снабженную фильтром, вводят во флакон через центральную часть резиновой пробки (конец иглы должен достигнуть дна флакона);

3) все содержимое флакона набирают в шприц, удерживая флакон в вертикальном положении, слегка наклоняя его (для полного извлечения раствора);

4) после извлечения препарата из флакона поршень шприца следует отодвинуть назад (до отметки 0,8-0,9 мл) для полного перехода раствора из иглы, снабженной фильтром, в шприц;

5) затем иглу, снабженную фильтром, отсоединяют от шприца и оставляют во флаконе. После извлечения раствора из флакона в шприц иглу, снабженную фильтром, утилизируют;

6) шприц плотно соединяют с иглой для инъекции, аккуратно удаляют воздух из шприца и устанавливают поршень на отметке 0,05 мл. После того как шприц с необходимым количеством препарата готов к применению приступают к выполнению непосредственно всех этапов операции.

Кожу века и область вокруг глаза обрабатывают 10% раствором йодопирона. Далее накладывают векорасширитель (блефаростат). Эпибульбарную капельную анестезию осуществляют раствором Алкаина. Конъюнктивальную полость промывают раствором Бетадина (2,0 мл), разведенным физиологическим раствором в соотношении 1:2, а затем только физиологическим раствором (3,0 мл).

С помощью циркуля в меридиане 2 часов (можно и в любом другом, главное, избегать горизонтального меридиана) отмеряют 3,5 мм кзади от лимба и устанавливают метку.

С использованием операционного микроскопа, ориентируясь на метку, при помощи тонкой иглы 30g, через плоскую часть цилиарного тела, в полость стекловидного тела вводится 0,05 мл (0,5 мг) препарата «Луцентис». При введении препарата иглу следует направлять к центру глазного яблока. После этого с помощью непрямой офтальмоскопии оценивают перфузию ДЗН и сосудов сетчатки. Оценивают светоощущение, внутриглазное давление. В случае резкого и значительного повышения внутриглазного давления выполняется парацентез [5].

После инъекции препарата пациенты закапывали противомикробные капли в конъюнктивальный мешок 3 раза в сутки в течение 7 дней. Последующая инъекция Ранибизумаба проводилась в другую половину склеры.

В один день, препарат «Луцентис» вводили только в один глаз.

Методы генетических исследований Генетические исследования проводили на базе Научно- исследовательского института физико-химической медицины под руководством к.б.н. Т.В. Погоды и д.б.н. Э.В. Генерозова. Изучали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) генов CFH (фактора комплемента Н), HTRA1 (сериновой пептидазы) и IL-8 (интерлейкина-8, или ген CXCL8).

Определяли генотип каждого пациента по трем исследуемым полиморфизмам трех генов, исследовали частоту полиморфизмов в анализируемых группах. Большой размер этой выборки позволяет получить несмещенную оценку частоты полиморфизмов.

Выделение ДНК производили из 5 мл венозной крови с помощью набора «Wizard® Genomic DNA Purification Kit» (фирма «Промега», США) согласно инструкции, генотипирование полиморфизмов - с помощью MALDI-TOF минисеквенирования. Анализ этим методом включает 5 этапов:

1) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – амплификация участка генома, содержащего исследуемый полиморфизм.

2) Дефосфорелирование дезоксинуклеотидтрифосфатов, неиспользованных в ходе 1-го этапа.

3) Реакция минисеквенирования – достройка олигонуклеотидного зонда на 1-2 нуклеотида в зависимости от аллельного состояния исследуемого полиморфизма.

4) Очистка продуктов реакции с помощью полимерной катионо-обменной смолы.

5) Детекция продуктов реакции с помощью MALDI TOF масс-спектрометра.

Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих искомые полиморфизмы, с помощью программных пакетов Vector NTI 9 и Primer Express

2.0 были подобраны и синтезированы пары праймеров. Их специфичность проверялась при помощи онлайн-ресурса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Реакционная смесь включала реакционный буфер (67 mmol/l Tris-HCl (pH 8.8); 16,6 mmol/l (NH4)2SO4; 0,1% Triton X-100; 2,5 mmol/l MgCl2), 100 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата; 1,5 пкмоль каждого праймера; 1ед. Taqполимеразы и 0,01 мкг анализируемой ДНК. Реакцию амплификации проводили по программе: 94°С 5 мин., затем 35 циклов 94°С 30 сек., 60°С 12 сек., 72°С 20 сек., в конце 72°С 2 мин. для окончательной достройки фрагментов.

Для удаления из смеси всех незадействованных дезоксинуклеотидтрифосфатов проводили реакцию дефосфорилирования. Для этого к смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего реакционный буфер того же состава, что и для амплификации, и 1 ед. щелочной фосфатазы (фирма «Ферментас», Литва). Реакцию проводили по программе: 37°С 30 мин., 85°С 10 мин.

Затем ставили реакцию минисеквенирования, для чего к смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего амплификационный буфер, 1ед. термоустойчивой ДНК-полимеразы (TermiPol, фирма «Солис Биодин», Эстония), по 1 пкмоль необходимых дидезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пкмоль олигонуклеотидного зонда. Реакцию проводили согласно программе: 94°С 5 мин, затем 40 циклов 94°С 5 сек., 55°С 5 сек., 72°С 5 сек.

Для проведения анализа продуктов реакции с помощью MALDI-TOF массспектрометра (REFLEX- IV™, «Брукер Дальтоникс», Германия) к образцам добавляли по 8 мг полимерной катионообменной смолы. На специальный чип (AnchorChip 400/384, «Брукер Дальтоникс») наносили матрицу по 0,2 мкл, приготовленную из насыщенного раствора 3’-гидроксипиколиновой кислоты («Флука», Германия) в 50% ацетонитриле («Мерк», Германия) с добавлением 10 г/л двухосновного цитрата аммония («Флука», Германия). Очищенные ионообменной смолой образцы в объёме 0,2 мкл наносили на кристаллы матрицы.

Масс-спектрометрический анализ проводили в линейном режиме, напряжение на мишени 20 kV, на конвертирующем электроде – 17,1 kV.

Для анализа генов CFH, HTRA1 и IL-8 использовали геномную ДНК, выделенную из 5 мл крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Определение аллелей полиморфизмов проводили в ходе реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов реакции на времяпролетном масс-спектрометре (MALDI-TOF массспектрометрия). Для этого первоначально амплифицировали участки генов, несущие анализируемые полиморфизмы, в ходе ПЦР.

Амплификацию осуществляли в реакционной смеси, содержащей 66 мМ ТрисHCl, рН 9,0, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дНТФ, 1 Ед Taq-полимеразы (Promega, США) и по 2 пмоля каждого праймера в объёме 10 мкл. Реакцию амплификации (35 циклов) проводили в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США) в следующем температурном режиме: 940°С, 15 сек., 580°С, 15 сек., 720°С, 16 сек. Продукты амплификации анализировали в 2% агарозном геле. Для последующего проведения реакции минисеквенирования проводили дефосфорилирование концевых фосфатных групп дНТФ в постамлификационной смеси. Для этого инкубировали образцы с 1 ед. активности фосфатазы из антарктической креветки (New England BioLabs, Великобритания) при 370°С в течение 30 минут с последующей инактивацией фермента прогреванием при 850°С в течение 10 мин. Реакцию минисеквенирования осуществляли в 20 мкл реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ необходимых ддНТФ и/или дНТФ; по 3 пмоля каждого праймера и 2 Ед TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты ДНК.

Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по универсальному профилю: 940° С – 5 сек., 580° С – 20 сек., 720° С – 5 сек., 40 циклов. Очистку продуктов реакции минисеквенирования проводили с помощью набора SpectroCLEAN Kit (Sequenom, США) согласно инструкции фирмы-производителя.

Входящий в состав набора сорбент в количестве 8 мг растворяли в 16 мкл ультрачистой воды (Merck, Германия), после чего полученную суспензию в объеме 24 мкл вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования.

Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. Затем осаждали сорбент центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант использовали для масс-спектрометрического анализа.

Аликвоту образца (0,3 мкл) наносили на предварительно высушенную на планшете AnchorChip (600 мкм, Bruker Daltonics, Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, Германия) в 50% ацетонитриле (Merck, Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного (Fluka, Германия) и высушивали на воздухе. Все использованные растворители, включая воду (Merck, Германия), были только аналитической чистоты или специальные для масс-спектрометрии. Спектры получали с использованием MALDI-времяпролетного масс-спектрометра Reflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером (=337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц. Все измерения проводили в линейном режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением – 20 кВ, накапливающем электроде – 18,65 кВ, фокусирующей линзе – 9,2 кВ и временем задержки анализатора 400 нсек.

Для получения каждого масс-спектра использовали 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбцииионизации образца. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы «Bruker Daltonics» (Германия): flexControl 2,4 (Build 38) и flexAnalysis 2,4 (Build 11). По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении.

Математическая и статистическая обработка полученных в ходе исследований данных проводилась c использованием стандартных пакетов программ (Excel; SPSS 19.0). Статистическая обработка исследуемого материала включала обработку всей базы данных с частотным анализом полей с дискретными непрерывными значениями (N, M m,, минимальные и максимальные значения, асимметрия и эксцесс, где N - число наблюдений, М м - ошибка средней арифметической, - среднее среднее арифметическое, квадратическое отклонение).

Для оценки статистической значимости различий количественных признаков был применен критерий t Стьюдента и критерий F Фишера. При использовании критерия t Стьюдента предварительно производилась проверка соответствия распределения выборочных значений закону нормального распределения с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. По критерию Стьюдента производили сравнение средних значений для параметрических показателей, а по критерию U Манна-Уитни для непараметрических данных.

Анализ статистической значимости различий качественных признаков, а также количественных признаков, не соответствующих закону нормального распределения, проведен с помощью критерия 2 Пирсона с поправкой Йетса.

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался меньше 0,05 (p0,05). Для оценки взаимосвязи между показателями определялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Для исследования зависимости остроты зрения, ЦТС, ОМО от генотипов по исследуемым генам использовался дисперсионый анализ. Общая методика проведения дисперсионного анализа была следующая:

анализировались распределения рассматриваемых показателей на нормальность или наличие симметричного распределения в исследуемых группах (критерий нормальности Колмогорова-Смирнова и Шапира-Уилка, анализ гистограммы распределения, анализ описательных статистик по группам);

анализировались дисперсии зависимой переменной внутри групп, образуемых факторами на основе статистики Ливиня, основанной на среднем и на медиане;

устанавливалась значимость влияния рассматриваемых факторов (проверялась гипотеза, что среднее значение количественных зависимых переменных, а именно – острота зрения до лечения, ЦТС и ОМО, одинаково по категориям факторов);

В дополнение к однофакторному параметрическому дисперсионному анализу для выявления зависимости между остротой зрения, ЦТС, ОМО и полиморфизмами генов применялся непараметрический дисперсионный анализ на основе критерия Краскала-Уоллиса.

В работе с пациентами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki).

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОФИЗМА Y402H ГЕНА CFH НА

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАНИБИЗУМАБОМ

В данной главе рассматривается зависимость остроты зрения, ЦТС, ОМО и других клинических признаков от наличия полиморфизма rs1061170 (или Y402H), расположенного в 9-м экзоне Y402H гена фактора комплемента Н (CFH), определяющего замену тирозина на гистидин в белке. Гомозигот по полиморфизму rs1061170 обозначали как генотип НН, гетерозигот, имеющих только один аллель rs1061170, - как генотип YH, а гомозигот по аллелю дикого типа, без данного полиморфизма, - как генотип YY. Анализ проводили сначала в выборке в общем, затем в каждой группе по исходной остроте зрения. Для исследования зависимости остроты зрения, ЦТС, ОМО от наличия полиморфизма 402H гена CFH (YY, YH, HH) использовался дисперсионный анализ (см.

Материалы и методы).

3.1 Исходные характеристики выборки в зависимости от наличия полиморфизма 402H гена CFH Острота зрения. В результате анализа гистограмм распределения остроты зрения в зависимости от наличия полиморфизма CFH Y402H было сделано предположение о том, что данное распределение приближено к нормальному.

Однофакторный дисперсионный анализ не показал зависимости между величиной остроты зрения и генотипом по CFH, что подтверждают данные табл. 3. Также отсутствие взаимосвязи было подтверждено с помощью непараметрического критерия Краскала-Уоллиса (см. рис. 10).

Таблица 3. Результаты проведения однофакторного дисперсионного анализа

–  –  –

Рис. 10. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Общий макулярный объем. По статистике Ливиня, гипотеза о равенстве дисперсий в группах по генотипу CFH не отвергается (p=0,425). Критерий нормальности Колмогорова-Смирнова и Шапира-Уилка (p0,001) показал, что гипотеза о нормальности распределения ОМО в зависимости от гена отвергается.

В результате однофакторный дисперсионный анализ не выявлял зависимости между ОМО и наличием полиморфизма CFH Y402H, что подтверждают данные табл. 4 и рис. 11.

Таблица 4. Результаты проведения однофакторного дисперсионного анализа

–  –  –

Рис. 11. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Центральная толщина сетчатки. ЦТС в зависимости от генотипа по CFH распределена нормально. Равенство дисперсий в группах по генотипу CFH подтверждено статистикой Ливеня (p=0,729).

В результате однофакторного дисперсионного анализа не выявлено зависимости между ЦТС и генотипом по CFH, что подтверждают данные табл. 5, а также расчет критерия Краскала-Уоллиса для независимых выборок на рис. 12.

Таблица 5. Результаты проведения однофакторного дисперсионного анализа

–  –  –

Рис. 12. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Другие клинические признаки. Зависимость изучаемых клинических признаков от наличия полиморфизма гена CFH выявлена только для КО.

Расчет критерия независимости хи-квадрат на уровне значимости p меньше 0,10 показал наличие взаимосвязи между КО до лечения и генотипом по CFH (табл. 6). Распределение по типу КО в зависимости от наличия полиморфизма CFH Y402H представлено в табл. 7.

Таблица 6. Результат применения теста хи-квадрат

–  –  –

На основе сравнения пропорций по столбцам с помощью z-критерия установлена связь между количеством пациентов с КО и полиморфизмом CFH Y402H, а также значимо различающимся «умеренным» КО и полиморфизмом CFH Y402H. У пациентов с КО преобладают генотипы YY и YH (40,2 и 36,9% соответственно), что в процентном соотношении значимо больше по сравнению с генотипом HH (25%) (табл. 8 и 9). При этом более благоприятный «умеренный»

КО у пациентов с генотипом YY встречается значительно чаще, чем у пациентов с HH (58,6 и 22% соответственно). Таким образом, у пациентов с генотипом HH КО развивается реже, но при его наличии вероятнее его более тяжелое течение с развитием гигантских и субфовеолярно расположенных кист (рис. 13).

Таблица 8. Результаты применения z-критерия сравнения пропорций столбцов1

–  –  –

Примечание. - С помощью поправки Бонферрони тесты корректируются на множественность для всех парных сравнений в пределах одной и той же строки каждой подтаблицы с наиболее глубоким уровнем вложенности.

Таблица 9. Распределение пациентов (в %) с различным типом КО по генотипам CFH

–  –  –

Рис. 13. Ангиографическая картина глазного дна и результат ОКТ сетчатки пациентки Х. 87 лет до лечения, с КО и гигантской субфовеолярной кистой и с генотипом HH по гену CFH.

На основе критерия независимости хи-квадрат зависимости поражения одного или двух глаз, степени рубцевания, наличия эпиретинального фиброза, ОНЭ и ОПЭ от наличия полиморфизма CFH Y402H не выявлено. Результаты расчета теста хи-квадрат представлены в таблице 10.

Таблица 10. Результаты применения теста хи-квадрат и z-критерия

–  –  –

В общей выборке. В результате дисперсионного анализа с повторными измерениями можно утверждать, что на остроту зрения влияет не только количество инъекций, но и полиморфизм Y402H гена CFH (p0,05). Результаты расчета критерия внутригрупповых эффектов для выявления влияния фактора времени (инъекции) и взаимодействия фактора времени и генотипа по CFH (инъекции и CFH) представлены в табл. 11.

Таблица 11. Результаты расчета критерия внутригрупповых эффектов при дисперсионном анализе с повторными измерениями для остроты зрения

–  –  –

На рис. 14 графически представлено выявленное взаимодействие фактора количества инъекций и генотипа по CFH при влиянии их на остроту зрения. На графике линии идут практически параллельно, кроме третьей инъекции. У пациентов с генотипом YH средняя острота зрения статистически значимо (p0,015) различается со средней остротой зрения пациентов с остальными генотипами. Пациенты с генотипом YH достигают наилучшего результата лечения по остроте зрения после третьей инъекции.

Рис. 14. График средних значений остроты зрения до, после первой и третьейинъекций.

В группах по исходной остроте зрения. Результаты расчета критерия внутригрупповых эффектов представлены в табл. 12. Можно сказать, что количество инъекций значимо влияют на остроту зрения в 1-й и 2-й группах. А во 2-й группе, помимо количества инъекций, сделанных пациенту, на результат остроты зрения влияет еще и полиморфизм Y402H гена CFH.

Таблица 12. Результаты расчета критерия внутригрупповых эффектов при дисперсионном анализе с повторными измерениями для остроты зрения по группам

–  –  –

Влияние полиморфизма CFH Y402H проявляется при проведении лечения во 2-й группе. До лечения средняя острота зрения у пациентов с разными генотипами по CFH примерно одинаковая и статистически значимо не различается (рис. 15). После первой инъекции у пациентов с генотипами YY и YH наблюдается одинаковый результат по остроте зрения - существенно выше, чем у больных с генотипом HH. После третьей инъекции все группы больных по генотипу значимо отличаются друг от друга по средней остроте зрения.

Наилучшая острота зрения наблюдается у пациентов с генотипом YH, затем - с YY, и в последнюю очередь - с HH. Таким образом, при исходной остроте зрения от 0,10 до 0,51 наличие неблагоприятного для развития экссудативной ВМД генотипа НН по гену CFH также ассоциируется с худшим результатом лечения (по остроте зрения) ранибизумабом как после одной, так и после трех инъекций.

Рис. 15. График средних значений остроты зрения до, после первой и третьей инъекций во 2-й группе.

Центральная толщина сетчатки В общей выборке. ЦТС после первой и третьей инъекций не зависит от совместного влияния и количества инъекций, проведение CFH Y402H дисперсионного анализа с повторными измерениями не дало значимых результатов (p=0,911), что подтверждают данные табл. 13.

На рис. 16 приведен график средних значений ЦТС в зависимости от генотипа по CFH, на котором видно, что линии, соединяющие средние значения по генотипам, не пересекаются.

–  –  –

После третьей инъекции средняя ЦТС примерно одинаковая вне зависимости от наличия полиморфизма CFH Y402H (рис. 17). Однако при генотипе YY до лечения и после первой инъекции средняя ЦТС существенно больше, но после трех инъекций различий этого показателя при других генотипах уже нет, что говорит о хорошем ответе на лечение.

Рис. 17. График средних значений ЦТС до, после первой и третьей инъекций во 2й группе.

На клиническом примере пациента З. 90 лет с генотипом YY по гену CFH видно, что ЦТС после первой инъекции уменьшилась незначительно - с 452 (рис.

18, А) до 438 µм (рис. 18, Б), а после третьей инъекции составила 246 µм (рис. 18, В).

А Б Рис. 18. Ангиографическая картина глазного дна и результат ОКТ сетчатки пациента З. 90 лет с генотипом YY по гену CFH. А - до лечения. Умеренный КО сетчатки, невысокая ОПЭ; Б - после первой инъекции. Незначительная резорбция отека сетчатки, исчезновение кист, ОПЭ сохраняется. В - после трех инъекций.

Отек сетчатки резорбировался, высота ОПЭ уменьшилась.

В Общий макулярный объем В общей выборке. Зависимость ОМО от взаимодействия количества инъекций и генотипа по CFH не установлена (p=0,839). Результаты расчета критерия внутригрупповых эффектов представлены в табл. 15.

Отсутствие совместного влияния числа инъекций и полиморфизма CFH Y402H на ОМО подтверждается данными на рис. 11, средние значения макулярного объема у пациентов с различными генотипами по гену CFH статистически не значимо различаются между собой (рис. 19).

–  –  –

Рис. 19. График средних значений ОМО до, после первой и третьей инъекций в зависимости от генотипа по CFH.

В группах по исходной остроте зрения. Достоверных изменений ОМО при совместном воздействии числа инъекций и генотипов CFH по группам также не установлено. Основные результаты дисперсионного анализа с повторными измерениями для проверки данной гипотезы представлены в табл. 16.

–  –  –

Другие клинические признаки Среди изучаемых клинических признаков влияние полиморфизма Y402H гена CFH выявлено только для степени рубцевания и КО.

Степень рубцевания. В сводной табл. 17 представлены результаты применения непараметрического теста хи-квадрат, которые свидетельствуют, что значимых изменений в степени рубцевания после первой и третьей инъекций в зависимости от наличия полиморфизма Y402H гена CFH не выявлено.

–  –  –

В группах при применении z-критерия единственным значимым различием было следующее: после первой инъекции во второй группе пациентам с генотипом НН гена CFH менее свойственна легкая степень рубцевания по сравнению с аналогичным признаком при генотипе YH (65,9 и 81,6% соответственно, табл. 18 и 19, рис. 20). Ячейки табл. 18, отмеченные звездочкой, не использовались в сравнениях, поскольку их доля в столбце равна нулю или единице.

–  –  –

Рис. 20. Результат ОКТ сетчатки пациентки М. 68 лет с генотипом НН по гену CFH после первой инъекции. Выраженное хориоретинальное рубцевание.

Влияния полиморфизма Y402H гена CFH на степень рубцевания в группах после трех инъекций не обнаружено (p=0,723 для категории до 0,10;

p=0,195 для категории 0,11-0,50 и р=0,347 для категории от 0,51 и выше).

Применение z-критерия также подтвердило отсутствие зависимости.

Кистовидный отек. Значимые различия в динамике КО в выборке в зависимости от полиморфизма Y402H гена CFH были выявлены как после первой, так и после третьей инъекций (р0,05). При этом более 20% ячеек в таблице сопряженности имеют ожидаемые частоты менее 5, следовательно, результат применения данного теста может быть некорректным (табл. 20).

Поэтому было проведено исследование для определения различий в динамике КО по столбцам между типами гена CFH на основе z-критерия (табл. 21).

Таблица 20. Результаты применения теста хи-квадрат Кистовидный отек Значение р-значение 11,943 0,063 После первой инъекции 15,451 0,017 После третьей инъекции

–  –  –

Исследование КО после первой инъекции в зависимости от полиморфизма Y402H гена CFH с помощью z-критерия не показало его значимого отличия при разных генотипах.

После трех инъекций процент больных с полной резорбцией КО при генотипе YH по гену CFH больше, чем при генотипе HH (80,0 и 48,6% соответственно, табл. 22, рис. 21, А и Б, 22, А и Б). Пациентов c частично ушедшим КО при генотипе HH значимо больше, чем при генотипе YH (28,6 и 6,7% соответственно). Достоверных различий этого признака при генотипах НН и YY выявлено не было, но при анализе данных табл. 25 видно, что процентное распределение исходов КО у пациентов с генотипом YY сравнимо с таковым у пациентов с YH и значительно лучше, чем у больных с генотипом НН по гену CFH. Таким образом, наличие полиморфизма Y402H в двух копиях гена CFH (генотип НН) ассоциируется с худшей резорбцией, а иногда и с увеличением КО после трех инъекций по сравнению с результатами при генотипах YH (статистически значимое различие) и YY (рис. 23, 24, А и Б).

В результате использования теста хи-квадрат и z-критерия значимых различий КО по группам в зависимости от наличия полиморфизма Y402H гена CFH как после первой, так и после третьей инъекций не выявлено.

–  –  –

А Р Рис. 21. Офтальмоскопическая и ангиографическая картина глазного дна, результат ОКТ сетчатки пациентки Г. 72 года с генотипом YН по гену CFH. А - до лечения. КО сетчатки, ОПЭ; Б - после трех инъекций. КО сетчатки полностью резорбировался, ОПЭ прилегла.

Б А Рис. 22. Офтальмоскопическая и ангиографическая картина глазного дна, результат ОКТ сетчатки пациентки П. 72 года с генотипом НН по гену CFH. А до лечения. КО сетчатки; Б - после трех инъекций. КО сетчатки сохраняется.

Б А Б Рис. 23. Результаты ОКТ сетчатки левого глаза пациентки А. 75 лет с генотипом НН по гену CFH. А - до лечения. ОПЭ, КО нет, однако его наблюдали на парном глазу; Б – после трех инъекций. ОПЭ сохраняется, в толще сетчатки появилась киста.

А Б Р Рис. 24. Офтальмоскопическая и ангиографическая картина глазного дна и результат ОКТ сетчатки пациентки Е. 76 лет с генотипом YY по гену CFH до лечения. КО сетчатки, ОПЭ; Б – после трех инъекций. КО сетчатки полностью резорбировался, сохраняются небольшие ОПЭ, на месте ОПЭ, которая прилегла полностью, - участок атрофии пигментного эпителия.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОФИЗМА 625А ГЕНА HTRA1 НА

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАНИБИЗУМАБОМ

В данной главе рассматривается зависимость остроты зрения, ЦТС, ОМО и других клинических признаков от наличия полиморфизма rs11200638 (или 625А), расположенного в промоторном участке гена сериновой пептидазы HRTA1.

Гомозигот по полиморфизму rs11200638 обозначали как генотип AA, гетерозигот, имеющих только один аллель rs11200638, - как генотип GA, а гомозигот без данного полиморфизма - как генотип GG. Анализ проводили сначала в выборке в общем, затем в каждой группе по исходной остроте зрения. Для исследования зависимости остроты зрения, ЦТС, ОМО от наличия полиморфизма 625А гена HRTA1 (GG, GA, AA) использовали дисперсионный анализ (см. Материалы и методы).

5.1 Исходные характеристики выборки в зависимости от наличия полиморфизма 625А гена HRTA1 Острота зрения. При анализе гистограмм распределения остроты зрения в зависимости от наличия полиморфизма 625А гена HRTA1 было предположено, что данное распределение приближено к нормальному.

Однофакторный дисперсионный анализ не выявлял зависимости между остротой зрения и полиморфизмом 625А гена HTRA1, о чем свидетельствуют данные табл. 23. Также отсутствие взаимосвязи было подтверждено с помощью непараметрического критерия Краскала-Уоллиса (рис. 25).

Таблица 23. Результаты однофакторного дисперсионного анализа

–  –  –

Рис. 25. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Статистика Ливиня не показала различия дисперсии в группах (p=0,117 для 1-й группы; p=0,538 для 2-й группы; p=0,154 для 3-й группы). Критерий нормальности Колмогорова-Смирнова и Шапира-Уилка (p0,001) показал ненормальность распределения, поэтому в дополнение к однофакторному дисперсионному анализу был использован непараметрический критерий Краскала-Уоллиса.

Связь величины остроты зрения и наличия полиморфизма 625А гена HTRA1 значима (p0,05) для 1-й группы и не значима для 2-й и 3-й групп (р=0,984 и р=0,220 соответственно). Результаты однофакторного дисперсионного анализа приведены в табл. 24.

–  –  –

Поскольку различие средней в 1-й группе доказано, то с помощью апостериорного критерия Шеффе, который применяется при равенстве дисперсий, устанавливалось, какие именно групповые средние генотипов по HTRA1 различаются (табл. 25). Результаты расчета апостериорного критерия Шеффе представлены в табл. 25, в которой звездочкой указаны значимые разности при уровне достоверности меньше 0,05 (p0,05).

В 1-й группе у пациентов с полиморфизмом 625А в двух копиях гена HTRA1 (генотип АА) острота зрения до лечения больше в среднем на 0,021 по сравнению с таковой у больных с генотипом без полиморфизма 625А (генотип GG) (рис. 26).

–  –  –

Рис. 26. График средней исходной остроты зрения в зависимости от наличия полиморфизма 625А гена HTRA1 в 1-й группе Общий макулярный объем. По статистике Ливиня, гипотеза о равенстве дисперсий по генотипам GG, GA и AA гена HTRA1 не отвергается (p=0,214).

Критерий нормальности Колмогорова-Смирнова и Шапира-Уилка (p=0,008) показал, что гипотеза о нормальности распределения ОМО в зависимости от гена также не отвергается. Анализ гистограмм также дает основание предполагать, что распределения носят нормальный характер.

В результате применения однофакторного дисперсионного анализа не выявлена зависимость между ОМО и наличием полиморфизма 625А гена HTRA1, что подтверждают данные табл. 26 и рис. 27.

–  –  –

Рис. 27. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Центральная толщина сетчатки. По гистограммам можно сделать предположение, что распределение пациентов по ЦТС в зависимости от наличия полиморфизма 625А гена HTRA1 имеет правостороннюю асимметрию, поэтому применялся дополнительно и непараметрический дисперсионный анализ.

Равенство дисперсий в группах по генотипам GG, GA и AA гена HTRA1 подтверждено статистикой Ливеня (p=0,510).

В результате однофакторного дисперсионного анализа не выявлено зависимости между ЦТС и наличием полиморфизма 625А гена HTRA1, что подтверждают данные табл. 27, а также расчет критерия Краскала-Уоллиса для независимых выборок на рис. 28.

Таблица 27. Результаты проведения однофакторного дисперсионного анализа Сумма квадратов Средний квадрат р-значение F Между группами 25750,068 12875,034 0,788 0,456 Внутри групп 5800964,703 16340,746 Итого 5826714,771 Рис. 28. Применение непараметрического критерия Краскала-Уоллиса.

Другие клинические признаки. Зависимость изучаемых клинических признаков от наличия полиморфизма 625А гена HTRA1 выявлена только для признаков «ОПЭ» и «площадь поражения».

Но основе критерия независимости хи-квадрат на уровне значимости меньше 0,1 (p0,1) выявлена взаимосвязь между ОПЭ и полиморфизмом 625А гена HTRA1. Значимые различия между данными клиническими признаками при генотипах GG, GA и AA подтверждаются и z-критерием для сравнения двух долей между собой на уровне значимости менее 0,05 (р0,05) (табл. 28 и 29, рис.

29). У гомозигот по полиморфизму 625А гена HTRA1 (генотип АА) ОПЭ развивалась чаще, чем у гомозигот без полиморфизма с генотипом GG (54,8 и соответственно). То есть больше чем у половины пациентов с двумя 39,2% копиями полиморфизма 625А в гене HTRA1 развилась ОПЭ, причем часто у таких больных с относительно высокой остротой зрения ОПЭ была первым и единственным признаком экссудативной ВМД. Примеры различных вариантов ОПЭ сетчатки у пациентов, гомозиготных по данному полиморфизму, приведены на рис. 30-32.

Таблица 28. Результаты применения z-критерия сравнения пропорций столбцов1

–  –  –

ОПЭ 60% 54,8% 50% 45,7% 39,2% 40% 30% 20% 10%

–  –  –

Рис. 29. Процент пациентов с ОПЭ до лечения при генотипах GG, GA и AA по HTRA1 Рис. 30. Офтальмоскопическая и ангиографическая картина глазного дна и результат ОКТ сетчатки пациента К. 76 лет с генотипом АА по гену HTRA1 до лечения. Высокая куполообразная экстрафовеолярная ОПЭ, геморрагии, КО сетчатки и гиперрубцевание. Острота зрения равна 0,2.

Рис. 31. Офтальмоскопическая и ангиографическая картина глазного дна и результат ОКТ пациентки Т. 76 лет с генотипом АА по гену HTRA1 до лечения.

Субфовеолярная ОПЭ, ОНЭ. Острота зрения составляет 0,6, именно жалобы на искривление линий вследствие ОПЭ послужили поводом для обращения в врачу.

Рис. 32. Результат ОКТ сетчатки пациентки К. 64 года с генотипом АА по гену HTRA1 до лечения. Высокая куполообразная субфовеолярная ОПЭ сетчатки.

Острота зрения равна 0,4.

Зависимость поражения одного или двух глаз, КО, наличия эпиретинального фиброза и ОНЭ от полиморфизма гена HTRA1 не выявлена на основе критерия независимости хи-квадрат. Результаты расчета теста хи-квадрат представлены в табл. 30.

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В. Москва 20 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 1. Введение 2. Обзор литературы 2.1. Описание заболевания 2.2. Общая характеристика вируса гриппа 2.3. Эпидемиология вируса гриппа А...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Мамалова Хадижат Эдильсултановна БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ специальность: 06.01.08 – Плодоводство, виноградарство диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель, доктор сельскохозяйственных наук, доцент Заремук Римма...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.