WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 |

«КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ КОРИ, КРАСНУХИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА. ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ТОПТЫГИНА АННА ПАВЛОВНА

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ И

ПОДДЕРЖАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ НА ПРИМЕРЕ

ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ КОРИ, КРАСНУХИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО

ПАРОТИТА.

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА-2015

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Алешкин Владимир Андрианович

Официальные оппоненты:

Пинегин Борис Владимирович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России.

Тотолян Арег Артемович – член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор, зам. директора по научной работе ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Продеус Андрей Петрович – доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по научно-практической работе ГБУЗ «ДГКБ № 9 им.

Г.Н.Сперанского», заведующий кафедрой факультетской педиатрии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Защита диссертации состоится «___» _________2015 г. в 00.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова,10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 и на сайте: http/www.gabrich.ru.

Автореферат разослан «___» ________ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.И.Новикова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Инфекционные заболевания остаются актуальной проблемой XXI века, и для многих вирусных заболеваний вакцинация является основным средством борьбы, позволяющим не только контролировать эти инфекции, но и ставить вопрос об их глобальной эрадикации. Это решение, в полной мере, относится к таким серьезным вирусным инфекциям как корь, краснуха и эпидемический паротит.

Корь – тяжелое инфекционное заболевание: контагиозность кори 95и в допрививочную эру, по данным ВОЗ, в мире от ее последствий ежегодно умирало 2,6 млн. человек. Эпидемический паротит не отличается особой тяжестью течения или высокой смертностью, тем не менее, имея тропность к железистой ткани, вирус эпидемического паротита может поражать не только слюнные железы, но также вызывать панкреатит или орхит. Последний приводит к 100%-ному мужскому бесплодию и не поддается никакому лечению [Божедомова В.А. с соавт., 2013]. Краснуха является более лгкой и менее контагиозной вирусной инфекцией, чем корь, тем не менее, имеет большое значение для общественного здравоохранения из-за тератогенного эффекта врожднной краснушной инфекции, который может приводить к прерыванию беременности или гибели плода, а также к рождению детей с синдромом врожднной краснухи (СВК). По данным Л.Л. Нисевич, краснуха является причиной врожденной патологии в 27-35% случаев [Нисевич Л.Л. с соавт., 1997]. Для профилактики этих инфекций в России были зарегистрированы отечественные моновакцины против кори и эпидемического паротита, а также отечественная дивакцина. Кроме того, с 2000 года зарегистрированы импортные тривакцины MMR (Мерк Шарп и Доум, США) и Приорикс (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия) для профилактики кори, краснухи и эпидемического паротита.

ВОЗ поставила цель ликвидации кори в XXI веке к 2010 г. [Centers for Disease Control and Prevention., 2009]. В рамках общей стратегии, декларированной ВОЗ и направленной на полную ликвидацию кори в XXI веке, предполагается создать иммунную прослойку, достаточную для прерывания цепочек передачи инфекции. А в 2004 году было предложено также элиминировать краснуху к 2010 году. С учетом того, что краснуха является менее контагиозным заболеванием, чем корь, и большинство стран используют комбинированную вакцину против кори и краснухи, элиминация краснухи может быть достигнута в ходе работы по элиминации кори. Такой подход был одобрен на 55-ой сессии Регионального комитета ВОЗ как часть резолюции по укреплению национальных программ иммунизации, включающую ликвидацию кори, краснухи и профилактику врожденной краснушной инфекции. Западно-Тихоокеанский регион ВОЗ объявил о достижении уровня заболеваемости краснухой менее 10 на 1 млн. населения и СВК – менее 10 на 100 000 живых новорожденных к 2015 г. В остальных трх регионах ВОЗ идт речь только о снижении смертности от краснухи и СВК [Strebel P.M. et al., 2011].

Введение массовой вакцинации против кори дало первые обнадеживающие результаты. К 2000 г. смертность от кори снизилась до 733 тыс. человек, а к 2008 – до 164 тыс. человек. Предполагалось, что к 2015 г. цель будет достигнута [Van den Ent M. et al., 2011]. Однако в 2008 г из многих стран стали поступать сообщения о вспышках кори. Даже в странах с высоким охватом прививками, таких как США [Sugerman D. E. et al,. 2010], Австрия [Kasper S. et al,. 2009], Франция [Parent du Chtelet I. et al., 2009], Англия [Eaton L., 2009], Германия [Btzing-Feigenbaum J. et al., 2010], Израиль [Anis E. et al., 2009], Россия [Бичурина М.А. с соавт., 2013; Тихонова Н.Т. с соавт., 2013;

Каира А.Н. с соавт., 2014] и других, регистрировались вспышки кори. Анализ прививочного статуса заболевших лиц показал, что одну часть составляют не привитые по разным причинам (медицинские отводы, религиозные или иные соображения родителей). Вторую часть составляют привитые лица. В эту группу следует отнести прививки вакциной с нарушением правил транспортировки и хранения препарата, а также привитых только один раз (вместо положенного по графику в 1 год и в 6 лет) [Сергеева Н.В. с соавт., 2013]. Однако существует еще две группы восприимчивых лиц – группа первичных вакцинальных неудач, когда, несмотря на правильное и своевременное проведение прививки, у человека не формируется защитного титра антител, и группа вторичных вакцинальных неудач, когда сформированный после прививки иммунитет быстро утрачивается и такой привитый человек вновь оказывается восприимчивым к кори. Количество первичных и вторичных вакцинальных неудач составляет 5-10% от общего количества привитых для каждой группы [Цвиркун О.В. с соавт., 2012; Orenstein W.A. et al., 2000]. Более того, после перенесенной инфекции формируется пожизненный иммунитет, а поствакцинальный иммунитет постепенно истощается и даже правильно привитой, хорошо ответивший на прививку, без каких-либо генетических недостатков человек со временем может утерять защитные уровни антител [Голева О.В. с соавт., 2012]. Целью любой вакцинации является формирование и длительное поддержание иммунологической памяти против инфекционных антигенов. Оценка формирования иммунного ответа у инфекционных больных сильно затруднена: это люди разного возраста, имеют различный преморбидный фон, нет возможности оценить состояние иммунной системы у конкретного больного до инфекции, в большинстве случаев неизвестно точно, когда человек был инфицирован и никогда неизвестно, каким количеством вирусных частиц. Наблюдение за развитием адаптивного иммунного ответа и формированием иммунологической памяти у привитых и ревакцинированных лишено многих перечисленных недостатков. Благодаря этому мы можем расширить и детализировать фундаментальные представления о функциях иммунной системы, ее регуляции и поддержании иммунной защиты в течение продолжительного времени.

Таким образом, актуальной современной проблемой медицины является проведение научных исследований по комплексному изучению механизмов формирования и поддержания иммунологической памяти в ответ на живую вирусную прививку и разработка на основе полученных знаний методов оценки иммунологической памяти и прогнозирования вакцинальных неудач.

Степень разработанности темы исследования Хорошо известно, что коревая инфекция сопровождается иммуносупрессией, которая проявляется в виде лейко- и лимфопении, вызванной активацией механизмов клеточного апоптоза. При этом имеет место снижение численности основных субпопуляций лимфоцитов и нарушение их соотношений [Тихонова Н.Т., 1982; Okada H. et al., 2000; Ryon J.J. et al., 2002]. Кроме того, можно выявить такие функциональные дефекты иммунокомпетентных клеток как снижение индекса пролиферации, нарушение активности натуральных киллеров, дисбаланс синтеза основных цитокинов [Griffin D.E. et al., 1990]. Что касается воздействия на иммунную систему живых вирусных вакцин, то сформировать единое мнение по этому вопросу до сих пор не удалось. Некоторые авторы не обнаруживали ни лимфопении, ни существенных отклонений в иммунном статусе [Okada H. et al., 2001], тогда как, по данным других, имела место непродолжительная (2-4 недели) иммуносупрессия, выражавшаяся, в основном, в виде снижения количества лимфоцитов и торможения их пролиферативной активности [Буковская С.Н., 1989; Николаенко В.Н., 1990; Smedman L. et al., 1994].

Изучению механизмов формирования поствакцинального иммунитета против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита посвящено огромное количество работ, однако, целый ряд важных вопросов остается недостаточно исследованным. В частности, это касается проблемы распределения специфических IgG антител по субклассам. В литературе имеются лишь отдельные сообщения об исследовании спектра субклассов специфических противовирусных IgG (Isa M.B. et al., 2002; El Mubarak H.S et al., 2004). Другой серьезной проблемой является исследование специфического клеточного иммунитета. За рубежом этой теме уделяют огромное внимание практически все ведущие группы, занимающиеся проблемами вакцинации против кори и краснухи [Ovsyannikova I.G. et al.; 2003, Rager-Zisman B. et al., 2003]. Однако не существует общепринятого метода, способного однозначно оценить качество специфического клеточного иммунитета. Так, исследуют специфическую и митоген-индуцрованную пролиферацию лимфоцитов периферической крови [Bautista-Lopez N. et al., 2000], но этот метод связан, с одной стороны, с использованием радиоактивного Н3 тимидина, а, с другой стороны, очень зависит от выбранного антигена, так как известно, что, например, вирус кори способен размножаться в лимфоцитах человека и обладает выраженным цитопатическим действием. Используют также метод оценки секреторной активности клеток путем определения иммуноферментных пятен – ELISPOT [Scheibenbogen C. et al., 2000]. Крупные лаборатории и зарубежные фирмы, разрабатывающие вакцины, пользуются этим методом. В научных целях применяют определение антигенспецифических Т-лимфоцитов с использовнаием МНС-пептидных тетрамеров [Altman J.D. et al., 1996 ] – недостатком метода является HLA-рестрикция, то есть необходимость совпадения HLA тетрамера и пациента, ввиду высокой степени полиморфизма системы HLA это весьма затруднительно.

Большое внимание уделяется изменениям цитокинового профиля в ответ на вакцинацию [Ward B.J. et al., 1993; Ovsyannikova I.G. et al., 2003]. Тем не менее, из-за различий в методах оценки, спектре изучаемых цитокинов, а также дизайна самих исследований, до сих пор нет четкого мнения даже о том, какой именно тип иммунного ответа (Th1 или Th2) индуцирует вакцинация против кори или краснухи.

Одни считают, что это Th1-ответ, с преимуществом клеточного компонента иммунного ответа, другие полагают, что лидирует Th2-тип, преимущественно гуморальный [Ward B.J. et al., 1993; Ovsyannikova I.G. et al., 2003]. Имеются работы, доказывающие, что по мере формирования иммунного ответа происходит переключение с Th1 на Th2 [Dhiman N. et al., 2005]. Все больше исследователей не ограничиваются традиционными IFN- и IL-4 и включают в свои исследования некоторые другие цитокины, такие как IL-12 и IL-15 [Gans H.A. et al., 2008], ИЛ-10 [Yu X.L.et al., 2008], и даже используют мультипараметрические методы исследования [Munier C.M. et al., 2009]. Однако количество одновременно исследованных параметров было невелико, что позволяет оценить каждый раз лишь одну из сторон иммунного ответа. Кроме того, однократные исследования пациентов не позволяют увидеть систему цитокинов в динамике.

Особый интерес вызывает исследование клеточных рецепторов, используемых вирусами для взаимодействия с клеткой. В последнее десятилетие было показано, что существуют, по крайней мере, два клеточных белка, осуществляющих функцию рецептора для вируса кори – это CD46 и CD150 [Schneider U. et al., 2002]. Особенно интересны взаимодействия вируса кори с CD150, поскольку последний является необходимой молекулой для запуска иммунного ответа [Wang N. et al., 2004] и вполне возможно, что именно это взаимодействие опосредует нарушения иммунного ответа при кори.

Россия участвует в провозглашенной ВОЗ программе по элиминации кори и искоренению синдрома врожденной краснухи. Традиционно эффективность прививки оценивается по выработке специфических антител, однако известно, что при вирусных заболеваниях высока значимость специфического клеточного иммунитета. Кроме того, отмечено, что далеко не у всех вакцинированных удается обнаружить специфические антитела. При этом часть таких серонегативных привитых лиц заболевает при контакте с источником инфекции, тогда как другие, также серонегативные, не болеют. Очевидно, существует необходимость оценки специфического клеточного иммунитета, однако существующие методы либо недостаточно специфичны, либо слишком трудоемки. Также весьма важной проблемой является прогнозирование первичных и вторичных вакцинальных неудач, однако до сих пор эти случаи выявляются при скрининговых исследованиях уже после прививки, что не позволяет корректировать процесс формирования поствакцинального иммунного ответа.

Цель работы Совершенствование подходов к повышению эффективности вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита на основании изучения клеточных и молекулярных механизмов формирования и поддержания иммунологической памяти на вирусные антигены с использованием стандартных и оригинальных методических подходов.

Задачи исследования

1. Провести оценку состояния иммунитета детей до вакцинации по основным показателям клеточного и гуморального иммунитета, в том числе по продукции основных цитокинов, характеризующих эффективность работы иммунной системы.

2. Оценить общие гуморальные и клеточные реакции иммунной системы в ответ на введение живой вирусной вакцины Приорикс.

3. Изучить особенности саморегуляции иммунной системы при формировании и поддержании специфического иммунного ответа на вакцину Приорикс.

4. Провести оценку динамики формирования и созревания специфического гуморального иммунного ответа после прививки против кори, краснухи и эпидемического паротита.

5. Исследовать формирование и поддержание специфического клеточного иммунного ответа на вакцинацию Приорикс.

6. Оценить возможность использования иммунокорректора полиоксидония в качестве адъюванта при прививке Приорикс у часто болеющих детей.

7. Разработать математическую модель, позволяющую оценить формирование иммунологической памяти и прогнозировать ее дальнейшую эффективность.

Научная новизна Установлено, что снижение количества основных субпопуляций лимфоцитов после вакцинации Приорикс связано с перераспределением лимфоцитов из крови в лимфоидные органы, вызванным начальными процессами ответа иммунной системы на введенную вакцину. Показано, что после вакцинации повышается экспрессия молекулы CD150 (SLAM), являющейся рецептором для вируса кори, как на Т-лимфоцитах, так и, в большей степени, на Вклетках.

Используя для оценки направленности дифференцировки Т-хелперов вторую производную от функции изменения соотношения IFN-/IL-4 по времени, выявлено, что после прививки Приорикс половина детей реагировала преимущественно по типу Th1, тогда как другая половина – по типу Th2. У части детей, реагировавших по типу Th2, и у детей с атопическим дерматитом отмечалось транзиторное повышение общих IgE на 7-й день после прививки, самопроизвольно возвращавшееся к исходному уровню через 4 недели и не сопровождавшееся появлением или обострением клинических проявлений аллергии и повышением других важных для аллергии цитокинов, например IL-5. Обнаружено, что наблюдающееся после прививки Приорикс транзиторное повышение уровня провоспалительной субпопуляции Th17 и ее основного цитокина IL-17А в крови компенсируется последующим повышением количества T-регуляторных клеток и их противовоспалительными цитокинами IL-10 и TGF-, что приводит к нормализации провоспалительных параметров.

Впервые установлено, что спектр субклассов специфических IgG к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита зависит от вида антигена и срока, прошедшего с момента прививки. По мере формирования иммунологической памяти меняется спектр субклассов специфических IgG.

Ранние специфические антитела принадлежат преимущественно к субклассу IgG3, а клетки памяти продуцируют, в основном, антитела IgG1. При формировании специфического гуморального иммунного ответа на вирус кори выявлена задержка процесса переключения с IgG3- на IgG1-субкласс специфичных к нему антител.

Впервые доказано, что реакция специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических CD8hi лимфоцитов может быть использована для оценки активности эффекторных Т-клеток памяти на антигены вирусов кори и краснухи. На основе этой реакции разработан метод оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи, защищенный патентом «Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи» (Патент на изобретение № 2464571). Показано, что цитотоксические клетки памяти, специфичные к вирусам кори и краснухи, способны сохраняться и отвечать на антиген спустя многие годы после прививки или перенесенного заболевания.

Выявлены обратные (отрицательные) корреляции между показателями специфического гуморального и клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи у привитых вакциной Приорикс, что свидетельствует о разнонаправленных процессах формирования гуморального и клеточного звеньев иммунитета на соответствующие антигены.

Показана возрастная динамика нарастания количества центральных и эффекторных Т- и В-клеток памяти, а также их увеличение в ответ на прививку Приорикс. Обнаружено, что количество T-фолликулярных хелперов транзиторно повышается после прививки, но общее их количество практически не подвержено возрастным изменениям. Выявлено, что по мере взросления и иммунологического созревания организма ответ на первичную вакцинацию имеет некоторые особенности, например, в спектре субклассов IgG против кори у детей 6-7 лет появляются специфические IgG2-антитела, чего не наблюдается у детей в возрасте 1-2 лет. Первичный и вторичный иммунный ответ на прививку Приорикс различается по спектру субклассов специфических антител, активированных клеток и экспрессии поверхностных маркеров, вовлеченных в иммунный ответ, скорости и величине изменений различных параметров иммунного ответа Впервые с помощью методов математического моделирования определены информативные показатели иммунного статуса, оказывающие значимое влияние на высоту специфического гуморального ответа на антигены вакцины Приорикс и на продолжительность поддержания защитных уровней соответствующих антител, позволяющие предсказать исход вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита у детей через 4 недели и 1 год после прививки.

Впервые, на основании разработанных математических моделей, предложен конструктивный алгоритм, позволяющий, используя значения определенных показателей иммунного статуса до вакцинации, прогнозировать формирование первичных и вторичных вакцинальных неудач через 1 месяц и через 1 год после вакцинации у детей, привитых против кори, краснухи и эпидемического паротита.

Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость работы заключается в получении новых данных, вносящих вклад в понимание механизмов формирования и поддержания иммунологической памяти, в частности, на вирусные антигены. Результаты проведенного исследования позволяют оценить вклад как гуморального, так и клеточного иммунитета в специфический противовирусный иммунный ответ. Обнаруженные закономерности, в свою очередь, углубляют научные представления о формировании, созревании и функционировании иммунного ответа в целом. В результате проведенной работы были получены новые сведения, обеспечивающие возможность оценки специфического клеточного иммунитета на современном клеточно-молекулярном уровне, что позволяет осуществлять контроль за эффективностью прививок против кори, краснухи и эпидемического паротита, как у здоровых, так и у детей группы риска.

Практическая значимость работы состоит в следующем.

Предложен способ оценки субклассов специфических IgG к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита, рассчитаны значения порогового критерия cut off, позволяющие с вероятностью более 95% различить первичный и вторичный иммунный ответ на эти вирусы, при формировании поствакцинального и постинфекционного иммунитета.

Показано, что реакцию специфически индуцированного пролиферативного ответа мононуклеаров периферической крови на антигены вирусов кори и краснухи можно использовать для оценки Т-клеточной памяти. Рассчитаны значения порогового критерия cut off для оценки специфической пролиферации с помощью окрашивания CFSE, позволяющие с вероятностью более 99% выявить наличие специфически индуцированного пролиферативного ответа.

Разработан метод оценки специфического клеточного иммунного ответа цитотоксических лимфоцитов на антигены вирусов кори и краснухи на основе реакции специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических CD8hi лимфоцитов, защищенный патентом № 2464571. Рассчитаны значения порогового критерия cut off, позволяющие с вероятностью более 98% выявить наличие специфически индуцированной дегрануляции CD8hi лимфоцитов.

Показано, что индукция продукции цитокинов антигенами вирусов кори и краснухи может быть использована для оценки специфического Тклеточного ответа, в особенности Т-хелперов памяти. Выявлены наиболее информативные цитокины для оценки первичного (IL-4, TNF- и IFN-) и вторичного (IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, TNF- и IFN-) иммунного ответа.

Рекомендовано использовать метод расчета второй производной для оценки динамически изменяющихся показателей, например для оценки направления и интенсивности дифференцировки Т-хелперов после вакцинации.

На основании математического моделирования, выделены маркерыпредикторы и разработан алгоритм, позволяющий по результатам иммунологических анализов периферической крови предсказать эффективность прививки через месяц и вероятность сохранения (или утери) защитных уровней антител в крови через год после нее. Применение предложенного алгоритма позволяет еще до вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита выявить когорту лиц, с угрозой развития первичных и вторичных вакцинальных неудач.

Рекомендовано однократное введение полиоксидония в дозе 3 мг одновременно с вакциной Приорикс часто болеющим детям и детям с исходно сниженными показателями иммунного статуса, входящим, по результатам прогнозирования, в группу риска по формированию первичных или вторичных вакцинальных неудач, для усиления синтеза специфических антител.

Методология и методы исследования.

Предметом настоящего исследования являлась иммунологическая память, механизмы ее формирования и поддержания в ответ на антигены вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита. Объектами исследования были дети, подлежащие вакцинации или ревакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита и получавшие прививку Приорикс и пробы крови, полученные от этих детей. Научная работа была организована и проведена согласно с «Российскими и международными требованиями по надлежащей клинической практике» - ГОСТ Р 52379-2005, GOOD CLINICAL PRACTICE (GCP), одобренными Российской академией медицинских наук.

Дизайн исследования: клиническое открытое сравнительное проспективное контролируемое рандомизированное групповое исследование. Работа была одобрена Комитетом по биомедицинской этике при МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского Роспотребнадзора (протокол заседания от 05.07.2002), родители подписывали информированное согласие на участие детей в программе исследований.

Критериями включения в исследование были: возраст от 1 до 8 лет; отсутствие в анамнезе вакцинаций против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита для первично прививаемых и наличие такой вакцинации у ревакцинируемых; отсутствие в анамнезе указаний на перенесенные заболевания корью, краснухой или эпидемическим паротитом; информированное письменное согласие родителей пациента на участие в исследовании. Критерии исключения из исследования: наличие в анамнезе тяжелых гнойносептических и тяжелых инфекционных заболеваний; наличие тяжелых аллергических, аутоиммунных, эндокринных заболеваний, пороков развития и врожденных заболеваний; наличие поражений ЦНС, требующих лечения и не компенсированных к моменту вакцинации; участие в любом другом клиническом исследовании в последние 3 месяца.

В научном исследовании были использованы: формально-логические методы для анализа научной литературы, клинико-лабораторные, иммунологические, статистические методы, методы математического моделирования.

Клинико-лабораторные методы исследования выполнялись на базе КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и включали в себя: клинический осмотр детей с оценкой соматического статуса (при каждом визите);

клинический анализ крови на гематологическом анализаторе и подсчет формулы крови в мазке (при каждом визите); общий анализ мочи на мочевом анализаторе (при первом визите). Результаты обследования детей заносились в специальную карту индивидуально для каждого ребенка. Карты использовались для анализа результатов.

Иммунологические методы исследования. Мембранные CD- маркеры на выделенных с помощью градиентного центрифугирования из периферической крови лимфоидных клетках определяли методом проточной цитофлюорометрии в реакции прямой иммунофлюоресценции (реактивы и технологии BD Bioscienses: цитометр FacsCalibur, программа сбора и обработки информации CellQuest). Выделение лимфоидного региона проводилось с окрашиванием CD45 по графикам CD45/SSC и графикам светорассеяния FSC/SSC с контролем чистоты выделения лимфоцитов по экспрессии CD45 (95-98% CD45+ клеток в регионе). Использовали следующие композиции многоцветного окрашивания: FITC/ PE / PerCP / APC СD 45 / CD14 СD 5 / CD19 1. 8.

2. IgG1 FITC / IgG2 PE 9. CD45RA/CD45RO/CD8/CD62L

3. CD8 / CD38 / CD3 / DR 10. CD45RA/CD45RO/CD4/CD62L

4. CD8 / CD122 / CD3 11. CD3 / CD45RO / CD4 / CD161

5. CD3 / CD16/56 12. CD25 / CD127 / CD4

6. CD46 / CD150 / CD3 / CD19 13. CD57 / CD8 / CD4 / CXCR5

7. CD27 / CD20 / CD19 14. CD25 / CD152 / CD4 Для подсчета малых субпопуляций лимфоцитов использовали метод последовательного гейтирования. Количество общих иммуноглобулинов классов А, М и G определяли с помощью метода турбидиметрии на биохимическом анализаторе Chem-7 («Erba», Германия), наборы фирмы («Human», Германия).

С помощью различных вариантов иммуноферментного метода в сыворотке крови были исследованы: количество общего IgE (тест-системы фирмы «Хема», Россия); количество IgG четырех субклассов (тест-системы фирмы ООО «Полигност», Россия); количество специфических антител классов M, G и А, а также авидность и количество специфических IgG четырех субклассов к антигенам вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита («Human» или «Euroimmun» Германия); количество IL-17A и TGF- (тестсистемы фирмы «Bender Medsystems», Австрия); содержание общего IL-10 и TNF- (тест-системы фирмы «Cytimmune», США).

Содержание одиннадцати цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN- и TNF- оценивали в сыворотки крови или культуральной жидкости, методом проточной флуориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-plex Protein Assay System, «BioRad», США) с использованием коммерческих тест-систем 11-Plex (определяемый динамический диапазон 0,2-3200 пг/мл).

Оценка пролиферации мононуклеаров периферической крови осуществлялась методом прижизненной окраски лимфоцитов 5- и 6карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром с последующей оценкой на проточном цитофлюориметре (FacsCalibur) количества пиков пролиферации и расчетом процента пролиферировавших клеток в ответ на митоген или антигены вирусов кори или краснухи.

Определение специфически индуцированной дегрануляции цитотоксических CD8+ Т-клеток оценивали по экспрессии на них молекулы CD107a после индукции антигенами вирусов кори или краснухи с помощью проточного цитофлюориметра (FacsCalibur).

Статистическая обработка результатов проводилась методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±SE). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (t-критерий Фишера-Стьюдента) и непараметрических (U-критерий Вилкоксона) методов. Значимыми считали различия при р 0,05. Для оценки соответствия полученных результатов теоретической гипотезе использовали 2-критерий. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Расчеты проводились с использованием компьютерных программ «Statgraf», «Microsoft Office Excel 2003» и «Statistica 6.0».

Анализ диагностической и прогностической значимости исследуемых параметров, а также оценку уровня пороговых значений показателей осуществляли методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых). Для количественного сопоставления рассчитывали площади под ROC-кривыми (AUC). ROC-анализ проводили с использование программы SPSS 16.0 Для анализа динамически изменяющихся параметров был применен метод расчета второй производной.

Математическое моделирование процессов формирования и поддержания иммунологической памяти на антигены вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита осуществляли тремя методами.

Корреляционный анализ проводили методом многомерного корреляционного анализа с помощью пакета программ Statistics Toolbox MATLAB R2014a 8.3. Уровень значимости для выделения значимых корреляций составлял 0,05 (p 0,05).

Метод главных компонент является вариантом факторного и регрессионного анализа. Анализ данных также проводили с помощью пакета программ MATLAB R2014a 8.3, пакета Statistics Toolbox, был воспроизведен PCA алгоритм.

Байесовские сети традиционно применяют для моделирования процессов, характеризующихся неопределенностью из-за неполных знаний или случайных событий, что часто встречается в медицинской практике [Lucas P.J. et al., 2004; Gevaert O. et al., 2006]. Байесовская сеть представляет собой графическую вероятностную модель, которая представлена в виде ациклического графа, каждой вершине которого соответствует одна таблица условных вероятностей. Для анализа байесовской сети были использованы программы NetGen, ANN и SiLVIA.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунная система реагирует на введение чужеродного антигена не отдельными звеньями, а как единое целое. При иммунизации вакциной Приорикс выявляются: транзиторное снижение количества лимфоцитов в периферической крови и уровня основных их субпопуляций, тогда как уровни активационных маркеров на этих субпопуляциях повышаются; временное увеличение общего IgE у лиц, реагирующих по типу Th2; динамическое повышение Th17 и IL-17А. По завершении процесса реагирования на антиген повышается уровень Treg и их основных цитокинов, все отклонения различных параметров иммунитета возвращаются к исходному состоянию без каких-либо клинических проявлений.

2. Показано, что введение вакцины Приорикс дает эффективную иммунную защиту не у всех привитых, что может выражаться в отсутствии специфических IgG или быстром их истощении, а также проявляться в низкой авидности антител или отсутствии клеточных реакций специфического иммунного ответа, что не исключает наличия высокого уровня специфических IgA. Центральные и эффекторные субпопуляции клеток памяти выполняют различные функции и не могут полностью заместить недостаточность какой-либо из них.

3. Предложен способ прогнозирования результатов вакцинации и выделения групп риска по низкому или нестойкому иммунному ответу на прививку Приорикс на основании выявленных предикторов (параметров иммунного статуса до прививки). Использование иммунокоррегирующих препаратов одновременно с вакцинацией позволяет воздействовать на регуляторные функции иммунной системы и добиваться более высоких и продолжительных результатов специфической защиты.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности результатов исследования свидетельствует использование адекватных, современных методов, обладающих высокой чувствительностью и объективностью. Указанные методы были осуществлены с помощью современных автоматических диагностических приборов, обладающих системами автоматизированного сбора, учета и анализа данных. Были применены корректные методы статистической обработки материала и адекватные методы математического моделирования.

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» в 2012, 2013, 2014 гг; на 7-ми Международных конгрессах и конференциях по иммунологии: International conference “Immunopotentiators in Modern Vaccines” (Malaga, Spain, 2005); 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Paris, France, 2006); International congress “Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy” (Moscow, Russia, 2007); 2nd Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Berlin, Germany, 2009); 4th International Conference “Measurement of Antigen Specific Immune Responses” (Mykonos, Greece, 2010); 3d Joint Meeting of European National Societies of Immunology (Glasgow, GB, 2012); 5th International Conference “Measurement of Antigen Specific Immune Responses” (Dubrovnik, Croatia, 2013); и на 23-х Всероссийских конгрессах, форумах и конференциях, в том числе: 1-ом, 2-ом и 3-ем Объединенном Иммунологическом Форуме, (Екатеринбург, 2004; Санкт-Петербург, 2008 и г. Нижний Новгород, 2013); 5-ом, 10-ом и 14-ом конгрессах РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002, 2007, 2011); VIII, IX, X, XI, XIII, XIV Всероссийских форумах им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СанктПетербург, 2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2011); 2-ом и 3-ем Конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей» (Москва, 2003 и 2004); X, XI, XII Конгрессах педиатров России (Москва 2006, 2007, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Теоретические и практические аспекты элиминации кори в России», посвященной 145-летию со дня рождения Г.Н. Габричевского (Москва, 2005) и др.

Предложенный алгоритм прогнозирования первичных и вторичных вакцинальных неудач по результатам иммунологического обследования до введения вакцины против кори, краснухи и эпидемического паротита внедрен в работу Консультативно-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского Роспотребнадзора. Материалы диссертации включены в курс лекций по иммуноморфологии и клинической иммунологии кафедры иммунологии Биологического факультета ФГБО УВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; в курс лекций Всероссийской школы по клинической иммунологии «Иммунология для врачей» (Пушкинские Горы, Псковская область, 2011-2014); в курс лекций Всероссийской школы по проточной цитометрии «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Санкт-Петербург, 2012-2013; Челябинск, 2013Получен патент на изобретение «Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вируса кори и краснухи» № 2464571, 20.10.2012.

Публикации по теме диссертации По материалам исследования опубликовано 60 печатных работ, из них статей в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертационных исследований с высоким индексом цитирования – 23; статей в зарубежных журналах, цитируемых в PubMed, Medline, Index Medicus – 3; статей вне перечня ВАК – 3; патентов на изобретение – 1 и материалов научных конгрессов и конференций

<

Личный вклад соискателя

Автором самостоятельно проводился подбор, ведение и обследование детей, подлежащих вакцинации против кори, краснухи и эпидемического паротита, обработка клинических данных; сбор и обработка биологического материала; выделение лимфоцитов периферической крови; пробоподготовка для определения поверхностных CD маркеров; культивирование лимфоцитов с митогенами и антигенами вирусов кори и краснухи для получения супернатантов, оценки пролиферативной активности и процента дегрануляции CD8+ лимфоцитов (работа на проточном цитометре осуществлялась совместно с сотрудниками лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета (зав. – д.м.н., профессор М.С. Бляхер) ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского и централизованной клинико-диагностической лаборатории ФГБУ Научный центр здоровья детей РАМН (зав. – д.м.н. Е.Л.Семикина)).

Также самостоятельно автором были выполнены все тесты по определению количества цитокинов мультиплексным методом и тесты, основанные на методе ИФА (раздел по изучению количества специфических антител у больных корью выполнен совместно с сотрудником лаборатории иммунохимии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского к.м.н. Т.А. Мамаевой), и осуществлена статистическая обработка полученных данных. Раздел работы по математическому моделированию выполнен совместно с ФГБУН «Институт вычислительной математики им. Г.И. Марчука» РАН (руководитель проекта

– доктор физико-математических наук Г.А.Бочаров).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 343 страницах. Она состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 48 таблицами, 84 рисунками и 2 приложениями. Список литературы содержит 662 источника, из них работ отечественных авторов – 84, зарубежных авторов – 578.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика когорты обследованных лиц, вакцины и лекарственного препарата.

Под наблюдением находилось 110 детей (57 мальчиков и 53 девочки) в возрасте от 1 до 3 лет (средний возраст 1 г 7 мес.) и 10 детей (7 мальчиков и 3 девочки) в возрасте от 4 до 7 лет (средний возраст 5 л 7 мес.

), обращавшихся в кабинет вакцинопрофилактики КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для проведения прививки против вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита с 2002 по 2014 гг. Все дети были привиты, согласно инструкции, однократно подкожно 0,5 мл вакцины Приорикс (корь, краснуха, эпидемический паротит; «GlaxoSmithKline», Бельгия). Четырнадцать детей по разным причинам были исключены из дальнейшего исследования. Группу здоровых детей составили 48 человек, которые за свои 1-1,5 года жизни ни разу не болели и имели показатели иммунного статуса, соответствующие возрастной норме (группа 1). Все остальные (48 человек) были отнесены к группе с условным названием «иммунокомпрометированные дети» и были рандомизированно поделены на две группы. Группу 2 составили 26 «иммунокомпрометированных» детей. Двадцать два «иммунокомпрометированных» ребенка были отнесены в группу 3. Эти дети одновременно с вакцинацией Приорикс однократно получали 3 мг иммуномодулятора Полиоксидоний внутримышечно.

Согласно плану исследования дети находились под наблюдением в течение 5 лет. Обследования проводились до прививки, через 1 неделю после прививки, через 4 или 6 недель после прививки, через 1 год после прививки, через 5 лет после прививки (перед ревакцинацией), через неделю после ревакцинации и через 6 недель после ревакцинации. Группу ревакцинированных составили 24 ребенка. Ревакцинация проводилась также однократно подкожно 0,5 мл вакцины Приорикс, согласно инструкции. Также был обследован: в качестве контрольной группы для выяснения возрастной динамики изменения некоторых показателей иммунитета, 161 здоровый ребенок (84 мальчика и 77 девочек), из них 11 новорожденных в возрасте 4-7 дней, 33 ребенка в возрасте 4-8 месяцев, 32 ребенка в возрасте 1-2 лет, 17 детей в возрасте 4-5 лет, 25 детей в возрасте 6-8 лет, 15 детей 9-11 лет и 28 детей 14-16 лет. Кроме того, были обследованы 69 больных корью, различавшихся по возрасту и стадии заболевания. В их состав входили 14 детей больных корью в возрасте до одного года на 5-7 день после появления сыпи, 18 ранее не привитых больных корью взрослых в активной фазе заболевания (5-7 день со дня появления сыпи), средний возраст 28,3 года, 18 не привитых взрослых больных корью (средний возраст 27,5 лет) пациентов в стадии реконвалесценции (12-15 день со дня появления сыпи), 19 больных взрослых (средний возраст 30,7 лет) в активной фазе заболевания (4-7 день со дня появления сыпи), имевших достоверные сведения о прививках в детстве против кори. В качестве контрольных групп были обследованы 24 здоровых взрослых, дважды, согласно графику, привитых в детстве против кори (средний возраст 33,6 лет) и 27 здоровых взрослых, перенесших корь более 10 лет назад (средний возраст 45,4 года). Всего обследован 401 человек от одного до 7 раз.

В работе была использована вакцина Приорикс (вакцина против кори, эпидемического паротита и краснухи живая аттенуированная; «GlaxoSmithKline», Бельгия), содержащая вакцинные штаммы вирусов кори (Schwarz), краснухи (Wistar 27/3) и эпидемического паротита (RIT 4385, производный Jeryl Lynn). Регистрационное удостоверение № 0678049 от 28.10.2011 Вакцина рекомендована ВОЗ. Вакцинация проводилась в дозе 0,5 мл подкожно (согласно инструкции).

В качестве иммунопотенциатора был использован полиоксидоний, входящий в качестве неспецифического компонента в вакцину Гриппол и некоторые современные аллерговакцины. Полиоксидоний – синтетический иммуномодулятор и детоксикант, сополимер N-окиси 1,4- этиленпиперазина и (Nкарбоксиэтил)-1,4-этинилпиперазиния бромида. Полиоксидоний применяли однократно внутримышечно в дозе 3 мг, одновременно с вакцинацией.

Общие реакции иммунной системы в ответ на введение живой вирусной вакцины Приорикс В группе первично привитых здоровых детей через 1 неделю после прививки отмечалось значимое (р 0,05) снижение параметров клеточного иммунитета с последующим восстановлением количества клеток в субпопуляциях лимфоцитов периферической крови (Таблица 1).

Характерные для второй группы сниженные показатели клеточного иммунитета через 1 неделю после вакцинации демонстрировали тенденцию к повышению, а через 4 недели это повышение становилось статистически значимым. Более того, через 4 недели после вакцинации исследованные показатели достоверно не отличались от соответствующих показателей группы здоровых. В группе 3, несмотря на исходно сниженные показатели клеточного иммунитета, через 1 неделю после вакцинации, тем не менее, отмечалось, хотя и не достоверное, но снижение показателей (как в группе 1). Различия между второй и третей группами через 1 неделю были высоко значимыми (p 0,01). Через 4 недели в третьей группе отмечалось повышение исследованных показателей так же, как в группах 1 и 2.

При оценке распределения лимфоцитов по субпопуляциям не в абсолютном количестве клеток, а как процент лимфоцитов, экспрессирующих тот или иной маркер, ни в одной из исследованных групп не отмечалось значимых изменений в основных субпопуляциях лимфоцитов.

–  –  –

При оценке распределения лимфоцитов по субпопуляциям не в абсолютном количестве клеток, а как процент лимфоцитов, экспрессирующих тот или иной маркер, ни в одной из исследованных групп не отмечалось значимых изменений в основных субпопуляциях лимфоцитов. В когорте ревакцинированных детей (возраст 6-8 лет) никаких значимых изменений, как в абсолютном количестве клеток, так и в проценте различных субпопуляций лимфоцитов после вакцинации Приорикс не наблюдалось.

Уровень центральных Т-клеток памяти (Тm) (CD45R0+CD62L+) при первичной вакцинации практически не менялся в течение 6 недель после прививки, тогда как повышение эффекторных Тm (CD45R0+CD62L-) как CD4+, так и CD8+ отмечалось только через полтора месяца после вакцинации (p 0,05) (Рисунок 1). При ревакцинации детей через 5 лет после первичной вакцинации уже через неделю после введения вакцины отмечался подъем уровня Тm и центральных и эффекторных, как CD4+, так и CD8+ лимфоцитов и возвращение к исходному уровню через полтора месяца (p 0,01).

Аналогичные тенденции были выявлены при исследовании эффекторных Т-клеток, экспрессирующих CD45RA. У первично привитых повышение этих клеток отмечалось через 6 недель, а у ревакцинированных наблюдался быстрый подъем на 7-ой день и снижение до исходного уровня через 6 недель после прививки (p 0,01).

–  –  –

Рисунок 1 Изменение количества Т-клеток памяти после прививки Приорикс (% от количества Т-лимфоцитов М±SE).

Уровень пула В-клеток памяти (Bm) (CD20+CD27+) не менялся как у впервые привитых, так и у ревакцинированных. Через неделю после прививки и в группе впервые привитых, и у ревакцинированных отмечалось значимое повышение количества плазмобластов (фенотип CD3-HLA-DR+CD38hi+).

Через 6 недель после вакцинации у впервые привитых процент плазмобластов в крови продолжал увеличиваться, а у ревакцинированных – снизился, приближаясь к исходному уровню.

При исследовании экспрессии маркеров CD46 и CD150, являющихся рецепторами для вирусов кори, отмечено, что вакцинация существенно не повлияла на экспрессию CD46+ ни на Т-, ни на В-лимфоцитах. Выявлено значимое повышение CD150+ лимфоцитов как у впервые привитых, так и у ревакцинированных, как на Т-, так и на В-клетках: содержание CD3+CD150+ лимфоцитов значимо повысилось в 2 раза, а количество CD150+ В-клеток возросло в 4-5 раз (p 0,001).

Общее количество иммуноглобулинов классов А, М, G и Е во всех группах детей достоверно не менялось в течение месяца после прививки по сравнению с исходным уровнем, как у впервые привитых, так и после ревакцинации. Однако при анализе изменений количества общего IgE индивидуально для каждого ребенка оказалось, что практически у всех детей с атопическим дерматитом имеется повышение этого показателя в крови через 7 дней после вакцинации, тогда как у детей в контрольной группе отмечается как повышение, так и понижение IgE, которое в любом случае возвращается к исходному уровню через месяц после вакцинации. Следует отметить, что ни у одного ребенка как в контрольной группе, так и среди детей с атопическим дерматитом, не было отмечено никаких аллергических реакций на прививку против кори, краснухи и эпидемического паротита.

При анализе уровня цитокинов сыворотки крови (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN- и TNF-.) изменения средних концентраций исследованных цитокинов после вакцинации были незначимы, так как наблюдался значительный разброс индивидуальных показателей, и у разных детей встречались разнонаправленные изменения. Важно, что после вакцинации Приорикс не отмечалось значимого подъема цитокинов, отвечающих за аллергию, например IL-5, а также провоспалительных цитокинов IL-1, ILTNF-. В группе первично привитых наблюдалась отрицательная корреляция IL-7 и IL -10 практически со всеми другими изученными цитокинами.



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«РАГИМОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность – 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре почвоведения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Владимирский государственный университет имени Александра...»

«Жакова Светлана Николаевна РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ И КУЛЬТИВАРОВ РОДА СИРЕНЬ (SYRINGA L.) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2015 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» Научный руководитель:...»

«Абросимова Светлана Борисовна Совершенствование методов селекции картофеля на устойчивость к золотистой цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis (Woll.) Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Москва – 2014 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир-2015 Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ) Россельхознадзора и в ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный руководитель: Макаров Владимир...»

«УЛАНОВСКАЯ ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА Биоморфологические особенности Hemerocallis hybrida hort. коллекции Никитского ботанического сада Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ялта – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении Республики Крым «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад – Национальный научный центр» Научный руководитель доктор биологических наук, профессор...»

«ВОЛОДИНА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ОЦЕНКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ЛЮЦЕРНЫ ИЗМЕНЧИВОЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ СОРТОВ В УСЛОВИЯХ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Пенза 2015 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Поволжский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства имени...»

«Фомина Светлана Григорьевна ПЕЙЗАЖ ЭНТЕРОВИРУСОВ У ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ 03.02.02. – вирусология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора. Новикова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Надежда Алексеевна...»

«Шемякина Ирина Игоревна Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния Специальность03.01.03молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2015 год Работа выполнена в лаборатории геномики адаптивного иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии...»

«НЕСТЕРОВ Александр Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир – 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)....»

«Сусарев Сергей Викторович ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗНОУСЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (HETEROCERA, LEPIDOPTERA) МОРДОВИИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарва» на кафедре зоологии Научный руководитель: Аникин Василий...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»

«РАДУГИНА Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – Биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Исследования в области регенерации, начавшиеся еще в XVIII веке, вновь приобрели актуальность с появлением современных методов исследования....»

«Шуман Леонид Александрович ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ И РЕПРОДУКЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ У РЫБ В ВОДОЕМАХ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА С РАЗЛИЧНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2015 Работа выполнена в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем Института Биологии Тюменского государственного университета Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Селюков...»

«БЕРЕЗИНА Елена Сергеевна ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА, ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И ПОВЕДЕНИЯ И РОЛЬ ДОМАШНИХ СОБАК И КОШЕК В РАСПРОСТРАНЕНИИ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫХ ИНФЕКЦИЙ В РОССИИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Омск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный педагогический университет» и ФБУН «Омский НИИ...»

«Нгуен Тхи Тху Ха МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ ЛЕСНОГО ФОНДА ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ И ЦЕНТРАЛЬНОГО ВЬЕТНАМА 06.03.02 Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Использование недревесных ресурсов вносит существенный вклад в улучшение качества жизни населения многих стран, включая Россию и Вьетнам. До настоящего...»

«УДК 572 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в НИИ и Музее антропологии...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Балашовском институте (филиале) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г....»

«ЛЮТОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПЛАВЛЕНОГО СЫРА, ОБОГАЩЕННОГО ИКРОЙ И МОЛОКАМИ СЕЛЬДИ БАЛТИЙСКОЙ (CLUPEA HARENGUS MEMBRAS) 05.18.04 Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Калининград 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном...»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.