WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ ...»

-- [ Страница 4 ] --

Вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 0,8% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пациенток с дисморфизмами ооцитов составила 116 446 руб. по сравнению со 192 480 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для рождения одного здорового ребенка составила 573 625 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС – 1 173 658 руб. (Таблица 31). В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 51%.

Мы провели аналогичный анализ для пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов. Вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 15% по сравнению с 21% для пар при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 1,4% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС (Рисунок 20).

– точка принятия решения; - точка вероятности; - конечная точка Рисунок 20. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин.

Учитывался один цикл ЭКО со свежими эмбрионами по сравнению с одним циклом ЭКО/ПГС методом FISH.

Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов составила 116 065 руб. по сравнению со 190 278 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. При этом средняя стоимость лечения методом ЭКО для рождения одного здорового ребенка составила 733 766 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС – 889 149 руб. В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 13% (Таблица 31).

Для пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 28% по сравнению с 15% для пар при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 0% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС (Рисунок 21).

– точка принятия решения; - точка вероятности; - конечная точка Рисунок 21. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами у женщин. Учитывался один цикл ЭКО со свежими эмбрионами по сравнению с одним циклом ЭКО/ПГС методом FISH.

Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов составила при этом 116 983 руб. по сравнению со 193 451 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС.

–  –  –

Односторонний анализ чувствительности лечения бесплодия методом ЭКО и ЭКО/ПГС методом FISH у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин с указанием вероятностей величин, при которых обе стратегии были одинаково эффективны Переменная в модели Исходная вероятность Гипотетическая вероятность Беременность при ЭКО/ПГС 0,214 0,261 Стоимость ЭКО/ПГС 188’909 руб. 126’238 руб.

ЭКО/ПГС стала бы доминирующей стратегией, если бы вероятность наступления беременности возросла до 26,1% по сравнению с исходной вероятностью 21,4%, а стоимость ее снизилась до 126 238 руб. по сравнению с исходными 188 909 руб. (Рисунок 22).

Порогом отсечки является частота наступления беременности в циклах ЭКО/ПГС 26,1% и стоимость ЭКО/ПГС 126’238 руб.

а Рисунок 22. Односторонний анализ чувствительности лечения бесплодия в циклах ЭКО и ЭКО/ПГС методом FISH у пациентов с наличием цитоплазматических дисморфизмов ооцитов у женщин в зависимости от частоты наступления беременности в циклах ЭКО/ПГС (а) и стоимости ЭКО/ПГС (б).

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Бесплодие в браке является важной медико-социальной проблемой во всем мире, а распространенность бесплодия неуклонно увеличивается.

Изменения в репродуктивном поведении как мужчин, так и женщин, отнесение деторождения на старший репродуктивный возраст, приводит к увеличению потребности в применении методов ВРТ.

В свою очередь результативность программ ЭКО, а именно вероятность рождения живого здорового ребенка, определяется, в первую очередь, качеством эмбриона. На протяжении последнего десятилетия в клиническую практику были внедрены методики, позволяющие проводить культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты с возможностью последующей витрификации. Также стало возможным применение различных методов генетического исследования эмбрионов на преимплантационной стадии. Следует отметить появление высокотехнологичных операций с использованием микрохирургической техники в андрологии, позволяющие получить потомство у ранее бесперспективных пациентов с азооспермией. Тем не менее, все вышеперечисленные достижения в области репродуктивной медицины не способны влиять на исходное качество как сперматозоидов, так и ооцитов.

При этом, несмотря на то, что ооцит определяет не только половину генома будущего эмбриона, а, значит, вероятность рождения ребенка без генетической патологии, но и потенциал развития эмбриона на ранних этапах дробления, проблема оценки качества ооцитов изучена недостаточно.

Наиболее достоверным критерием качества ооцита является его способность к оплодотворению и формированию эмбриона, способного к имплантации, наступлению беременности и рождению здорового ребенка.

Оценка молекулярных, клеточных и генетических характеристик ооцитов человека затруднена, и морфологическая оценка является наиболее простым и доступным методом. Тем не менее, в клинической практике морфологии ооцита уделяется значительно меньше внимания, чем выбору сперматозоида для проведения процедуры ИКСИ или селекции эмбриона для переноса в полость матки. В основном морфологическая оценка ооцита сводится к определению степени зрелости путем визуализации первого полярного тельца клетки.

В ряде научных исследований, проведенных в начале 2000-х годов, было отмечено, что аномалии морфологии ооцитов человека встречаются более чем в половине циклов ВРТ, и при их наличии вероятность наступления беременности значительно снижается [122], [127], [140]. В качестве вероятных причин развития данных осложнений рассматриваются генетические или метаболические нарушения в ооцитах с дисморфизмами.

При этом данных, доказывающих патогенез подобных нарушений, а также исследований по выявлению факторов риска и выработке мер по их коррекции недостаточно.

В связи с этим, нами было проведено трехэтапное исследование, основной целью которого было повышение эффективность программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин на основании морфологической оценка ооцитов, определения числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах, а также проведения клинико-экономического анализа применения ПГС у данной категории пациенток.

Цель исследования основывалась на гипотезе о том, что у пар с дисморфизмами ооцитов у женщин повышена частота метаболических и генетических нарушений в ооцитах, что влияет как на хромосомный набор эмбриона, так и его метаболическую компетентность. Так как дробление эмбриона является энергозависимым процессом, а энергетический потенциал эмбриона определяется исключительно возможностями митохондрий ооцита, второй гипотезой исследования было то, что ооциты с дисморфизмами имеют снижение числа митохондрий. Пары с повышенным риском рождения детей с хромосомной патологией нуждаются в проведении генетического скрининга, поэтому третьей гипотезой исследования было то, что проведение ПГС у пар с дисморфизмами ооцитов у женщин повышает эффективность циклов ЭКО и снижает риск генетических заболеваний у потомства.

На первом этапе нашего исследования у супружеских пар с различными дисморфизмами ооцитов у женщин мы провели проспективное исследование случай-контроль для выявления возможных факторов риска развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ЭКО. Также нами была проведена оценка эмбриологических и клинических исходов ЭКО у данной категории пациенток в зависимости от различных дисморфизмов ооцитов. Так как цитоплазматические и экстрацитоплазматические дисморфизмы определенно имеют различные механизмы формирования, было решено рассматривать их как отдельные формы патологии. Поэтому в зависимости от морфологической оценки ооцитов были выделены группы с цитоплазматическими и экстрацитоплазматическими дисморфизмами.

Группу сравнения составили пары с морфологически нормальными ооцитами.

Для выявления возможных факторов риска дисморфизмов ооцитов нами был проведен однофакторный, а затем многофакторный анализ для оценки валидности созданной модели.

На развитие цитоплазматических дисморфизмов ооцитов по данным однофакторного анализа оказывали влияние возраст пациенток, ИМТ, уровень АМГ и Т4. При проведении многофакторного анализа значимое влияние имели лишь возраст пациенток и уровень Т4. Согласно полученным данным, у женщин 38 лет и старше с уровнем Т4 менее 13 пмоль/л в 5,6 раз чаще получают ооциты с дисморфизмами цитоплазмы. Следует отметить высокую точность созданной модели, так как площадь под ROC-кривой составила 71,5%.

На развитие экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов по данным однофакторного анализа влияли возраст пациентки, уровень АМГ и применение а-ГнРГ для десенситизации гипоталамо-гипофизарнояичниковой системы или в качестве триггера овуляции. При проведении многофакторного анализа существенную роль играли только уровень АМГ и применение а-ГнРГ. Согласно полученным данным, у женщин с уровнем АМГ менее 2,2 нг/мл и при применении а-ГнРГ в циклах ВРТ в 2,2 чаще получают ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами. Площадь под ROC-кривой составила 61,8%. Полученные результаты не согласуются с некоторыми исследованиями, в которых не было выявлено корреляции между возрастом пациенток, их гормональным профилем, и появлением дисморфизмов [1], [152], [153]. При этом в большинстве исследований, приведенных ниже, были получены данные, подтверждающие наши наблюдения.

Возраст является известным фактором риска неудач ЭКО, что связано, прежде всего, с анеуплоидиями гамет и полученных эмбрионов [154].

Существуют данные о том, что ооциты с хромосомными аномалиями часто имеют те или иные цитоплазматические дисморфизмы [155]. Наши данные согласуются с данными, полученными в исследовании Fancsovits et al. (2012), в котором более старший возраст пациенток коррелировал с появлением в цитоплазме ооцитов различных аномалий [124].

Избыточная масса тела является одной из причин нарушений менструальной функции и снижения фертильности, что может быть связано с явлением окислительного стресса в различных клетках, в том числе ооцитах [24]. ИМТ пациенток влияет на эффективность программ ВРТ, а также коррелирует с вариабельностью ответа на гормональную стимуляцию и качеством эмбрионов. Были получены данные о снижении уровня АМГ у женщин с ожирением [156]. Наши данные согласуются с исследованием Setti A. et al. (2012), в котором ИМТ коррелировал с количеством полученных ооцитов, но не с наличием дисморфизмов [118]. Хотя в нашем исследовании женщин с избыточной массой тела (ИМТ25) было больше всего в группе с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, данный фактор не показал статистической значимости при проведении многофакторного анализа.

АМГ продуцируется гранулезными клетками яичников и является доказанным количественным маркёром овариального резерва. Снижение уровня АМГ у женщин репродуктивного возраста менее 1,0 нг/мл сопряжено с истощением фолликулярного пула и имеет плохое прогностическое значение для стимуляции овуляции и исходов ВРТ. В нашем исследовании уровень АМГ был значимо ниже у пациенток с дисморфизмами, особенно с экстрацитоплазматическими нарушениями в ооцитах. В исследовании Ebner et al. (2006) проводилось изучение влияния лабораторных характеристик на морфологию ооцитов, а также на последующее развитие эмбрионов [152].

Была выявлена сильная связь между уровнем АМГ и наличием цитоплазматических дисморфизмов в клетке, при этом уровни других половых гормонов существенно не различались между группами. В нашем исследовании уровень АМГ оказывал более сильное влияние на риск экстрацитоплазматических дисморфизмов, чем возраст женщины. Возможно, это связано с дисфункцией клеток гранулезы, которое на ранних стадиях не приводит к клинически значимому снижению овариального резерва, но нарушает формирование экстрацитоплазматических структур ооцитов.

Гипотиреоз является распространенным заболеванием у женщин репродуктивного возраста, и проявляется повышением уровня ТТГ и последующим снижением функций щитовидной железы.

Данное заболевание негативно влияет на репродуктивную функцию женщины и сопряжено с высокой частотой различных осложнений гестационного периода. При анализе научных публикаций нами не было выявлено данных о влиянии гипотиреоза на морфологию ооцитов в циклах ВРТ. В нашем исследовании уровень ТТГ не различался значимо в группах пациенток, однако была выявлена значимая разница в уровне Т4, который был выше у пациенток контрольной группы. При этом порог уровня Т4, ниже которого вероятность получения ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами была максимально высокой, составил 13 пмоль/л. Возможно, незначительное повышение гормонов щитовидной железы является в нашей выборке более чувствительным признаком формирования цитопплазматических дисморфизмов.

Влияние различных протоколов стимуляции на морфологию ооцитов было проанализировано в исследовании Cota et al. (2012) [119]. Авторы не обнаружили сколь-нибудь значимого влияния данного фактора на оогенез.

При этом следует отметить, что в исследовании доля протоколов с а-ГнРГ была значительно больше, чем в нашем исследовании, а объем выборки в целом был меньше. Также нами не было найдено данных, свидетельствующих о негативном влиянии дозы вводимых гонадотропинов или длительности стимуляции на морфологию ооцитов. По данным литературы, замена триггера с препаратом ХГ на а-ГнРГ при риске развития синдрома гиперстимуляции яичников также не влияет на качество полученных ооцитов [157], [158]. Тем не менее, в нашем исследовании применение а-ГнРГ играло значительную роль в развитии экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов. Длительность стимуляции суперовуляции существенно не различалась в группах сравнения, также, как и частота использования различных препаратов гонадотропинов, что согласуется с данными литературы. Но при этом пациентки с дисморфизмами ооцитов получили более высокую суммарную доза назначаемых препаратов гонадотропинов по сравнению с группой контроля.

В протоколах стимуляции а-ГнРГ используются для десенситизации гипоталамо-гипофизарной системы и предотвращения промежуточных пиков ЛГ. Тем не менее, применение данной группы препаратов сопровождается начальным периодом стимуляции и повышением синтеза эндогенных гонадотропинов и стероидных гормонов. Вероятно, изменения концентрации эстрогенов в периферической крови, происходящие в периоде селекции примордиальных фолликулов (то есть в периоде формирования экстрацитоплазматических структур ооцита), вызывают нарушения пролиферации и секреции клеток гранулезы, что приводит к появлению морфологических аномалий ооцитов. Возможно, подобный механизм реализуется при назначении а-ГнРГ в качестве триггера овуляции для созревания ооцитов, так как изменение пика ЛГ способствует появлению аномалий строения первого полярного тельца.

После морфологической оценки полученных в ходе проведения исследования ооцитов мы сравнили эмбриологические характеристики (частоту нормального оплодотворения, морфологию полученных эмбрионов) и клинические исходы в группах сравнения. По полученным данным, ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имели значительно более низкую частоту оплодотворения и худшее качество полученных эмбрионов. Также в данной группе было больше всего эмбрионов, прекративших дробление на ранних этапах культивирования. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, согласно которым наличие различных цитоплазматических дисморфизмов отрицательно коррелирует с частотой оплодотворения и качеством полученных эмбрионов [1], [3], [129].

Цитоплазматические дисморфизмы ооцитов являются косвенными признаками цитоплазматической незрелости клетки, то есть асинхронизации созревания ядра и подготовки органелл клетки к оплодотворению. Низкая частота оплодотворения ооцитов с цитоплазматическими аномалиями может быть связана как с механическим смещением веретена деления и нарушением архитектоники цитоскелета, так и со структурными нарушениями органелл, приводящими к метаболическим нарушениям в клетке.

На ранних этапах эмбриогенеза, когда собственный геном эмбриона не подвергается репликации, дробление происходит за счет накопленных в процессе оогенеза протеинов и питательных веществ, которые аккумулируются в ооците [159]. Мы предполагаем, что ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют нарушенный потенциал к формированию полноценного эмбриона за счет метаболических нарушений на молекулярном уровне, которые невозможно диагностировать с помощью световой микроскопии.

Ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами имели несколько меньшую частоту оплодотворения (87,4%) по сравнению с морфологически нормальными ооцитами (88,4%). Тем не менее, в данной группе по сравнению с контрольной был ниже процент эмбрионов класса А (52,6% и 65,7%, соответственно) и выше процент эмбрионов класса С (11,5% и 5,2%, соответственно). Относительно влияния экстрацитоплазматических дисморфизмов на частоту оплодотворения и качество эмбрионов в литературе нет единого мнения. Наши данные не согласуются с исследованиями Lasiene et al. (2009) и Ubaldi et al. (2008), в которых частота оплодотворения ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами была значительно ниже, чем в группе контроля [139], [161]. В исследовании (2006) при оплодотворении ооцитов с Chamayou et al.

экстрацитоплазматическими дисморфизмами были получены эмбрионы более низкого качества, чем в контрольной группе. При этом частота наступления беременности в обеих группа существенно не различалась [138].

Большинство исследователей придерживаются мнения, что экстрацитоплазматические аномалии строения являются только фенотипическими особенностями клеток, не нарушая их потенциал к оплодотворению и дальнейшему развитию [159].

Частота наступления как биохимической, так и клинической беременности в нашем исследовании была существенно ниже у пациенток с дисморфизмами ооцитов. С помощью метода логистической регрессии с учетом выявленных конфаундеров нами было рассчитано скорректированное отношение шансов наступления беременности, которое составило 3,69 (95% ДИ: 2,12; 6,14) для цитоплазматических дисморфизмов и 1,42 (95% ДИ: 1,07;

1,89) для экстрацитоплазматических дисморфизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов шансы наступления беременности в 3,7 раза ниже, чем у пациенток с морфологически нормальными ооцитами, что является статистически значимым. Обращала на себя внимание более высокая, хотя статистически не значимая, распространенность потерь беременности в I триместре у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Также одна беременность в этой группе была прервана по причине наличия анеуплоидии у плода.

В результате выше описанных данных частота живорождений была существенно ниже у женщин с дисморфизмами ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, и составила 15,8% в группе 1а, 27,8% в группе 1б и 43,9% в группе 2. Несмотря на проведение пренатального скрининга, в группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов был рожден один ребенок с анеуплоидией.

Таким образом, в ходе проведенного анализа было выявлено, что ооциты с дисморфизмами могут быть причиной формирования эмбрионов низкого качества. Причиной низкой частоты оплодотворения и нарушений ранних этапов дробления эмбриона могут быть нарушения функции органелл ооцитов. Одной из наиболее вероятных причин негативных исходов циклов ЭКО у пациенток с дисморфизмами ооцитов является наличие хромосомных аномалий в клетках с дисморфизмами.

На втором этапе нашего исследования мы проанализировали число копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах человека, имеющих различные морфологические особенности. В нашем исследовании распределение числа копий мтДНК было несколько выше, чем в проведенных ранее, тем не менее во всех подобных работах отмечается крайне широкий диапазон между минимальными и максимальными значениями [101], [115], [161].

По результатам нашего исследования, число копий мтДНК существенно различалось не только между ооцитами различных пациенток, имеющих особенности анамнеза и протокола стимуляции суперовуляции, но и между ооцитами одной когорты, что согласуется с данными проведенных ранее работ [9]. Тем не менее, в нашем исследовании были получены данные о том, что в некоторых ооцитах число копий мтДНК превышает 5х106 степени, хотя в большинстве исследований содержание мтДНК в клетке не превышает 3х106-4х106. Мы можем предложить несколько объяснений широкому диапазону полученных значений. Во-первых, это может быть связано с генетической гетерогенностью исследуемой популяции. Нельзя не отметить, что мы исследовали ооциты декретированной группы пациенток, а именно пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ВРТ. С этической точки зрения исследовать ооциты здоровых фертильных женщин является неприемлемым. Кроме того, исследованию подвергались ооциты, которые не смогли завершить нормальное оплодотворение. Мы можем подозревать что оплодотворение не произошло вследствие низкой фертильности спермы, однако достоверная причина отсутствия оплодотворения в клетке остается неизвестной.

Мы не можем достоверно утверждать, является ли увеличение мтДНК в ооцитах приспособительной реакцией клетки, вариантом нормы или проявлением патологических процессов в клетке. Возможно, различное число мтДНК в ооцитах одной когорты является следствием неравномерного расхождения митохондрий между клетками в процессе митотического деления на стадии образования оогоний. Созревание ооцита in vivo является результатом длительной и тщательной селекции. Стимуляция функции яичников подавляет натуральную селекцию и приводит к созреванию большой группы ооцитов, которые потенциально содержат различное число митохондрий, а часть из них в естественных условиях должна была подвергнуться апоптозу.

Необходимо также учесть, что число копий мтДНК в клетке достаточно достоверно отражает количество органелл в клетке, но не их функциональные возможности. Мы предполагаем, что активная репликация мтДНК в созревающем ооците могла быть реакцией на снижение функции имеющихся митохондрий. Изучались ооциты, полученные в результате стимуляции функции яичников, при этом в литературе имеются данные, что явления окислительного стресса могут быть следствием экзогенной стимуляции яичников гонадотропинами [162].

Наконец, по этическим соображениям для исследования отбирались исключительно клетки, не имеющие перспектив для дальнейшего культивирования, а именно не имеющие пронуклеусов, и не начавшие дробление через 40 часов после ИКСИ. Поэтому мы не можем быть уверены, что в процессе культивирования не происходит репликации мтДНК.

По нашим данным нарушение морфологии ооцитов связано со снижением числа митохондрий в клетке. При этом наименьшее число копий мтДНК наблюдалось у ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с морфологически нормальными ооцитами или ооцитами с экстрацитоплазматическими дисморфизмами. Снижение числа копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными клетками наблюдалось в ооцитах с агрегатами ГЭР, центральной гранулярностью и вакуолями.

Минимальное число копий мтДНК определялось в ооцитах с аномальными агрегатами ГЭР. По данным Nottola et al. (2007), в ооцитах с аномальными агрегатами ГЭР могут визуализироваться морфологически аномальные митохондрии подковообразной или кольцевидной формы [163].

Точный механизм образования аномальных агрегатов ГЭР неизвестен.

Наиболее вероятной гипотезой является нарушение структуры цитоскелета, который играет важную роль в реорганизации ГЭР в процессе созревания ооцита. Снижение числа, и, как следствие, функции митохондрий может быть одной из причин негативных исходов ЭКО у пациенток с агрегатами ГЭР [3], [131].

Наличие центральной гранулярности цитоплазмы ооцита негативно влияет на исходы программ ВРТ, что связано с высоким уровнем анеуплоидии в клетках с данным дисморфизмом [122], [114]. Тем не менее, не исключено наличие метаболических изменений в ооцитах с центральной гранулярностью цитоплазмы, которые могут оказывать как прямое негативное влияние на развитие эмбриона, так и вызывать нарушения формирования веретена деления, что может быть одной из причин формирования анеуплоидии во время второго мейотического деления.

Потенциал развития ооцитов с вакуолями в цитоплазме зависит от количества и размеров вакуолей. Ооциты с крупными вакуолями имеют значительно более низкую частоту оплодотворения [127]. Одним из возможных механизмов негативного влияния вакуолей в ооцитах на ранние этапы эмбриогенеза, помимо механического смещения веретена деления и нарушения архитектоники цитоскелета, может быть нарушение функции митохондрий. По полученным нами данным, ооциты с центральной гранулярностью цитоплазмы и ооциты с вакуолями характеризовались примерно сходным числом копий мтДНК, более высоким, чем у ооцитов с агрегатами ГЭР, но значительно более низким, чем у морфологически нормальных ооцитов.

Число копий мтДНК в ооцитах с экстрацитоплазматическими дисморфизмами было значительно выше, чем в ооцитах с цитоплазматическими аномалиями, и не отличалось от морфологически нормальных клеток. Между различными типами экстрацитоплазматических дисморфизмов также не было выявлено существенных различий в распределении числа копий мтДНК. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии снижения количества митохондрий в ооцитах с экстрацитоплазматическими аномалиями.

Мы также провели анализ факторов, способных влиять на число копий мтДНК в исследуемых клетках. мтДНК сперматозоида не оказывает существенного влияния на содержание мтДНК в ооцитах, потому что подвергается деградации после оплодотворения. Кроме того, число мтДНК в одном сперматозоиде является незначительным и составляет около 100 копий [108], [113]. Для предотвращения попадания клеток кумулюса в исследуемый препарат мы отбирали неоплодотворившиеся ооциты после механического и энзимного очищения, а также осуществляли визуальный контроль в процессе отмывания ооцита перед переносом в стерильную пробирку.

Клинические характеристики пациенток, такие как возраст и масса тела, могут оказывать потенциальное влияние на число копий мтДНК в ооцитах вследствие явлений окислительного стресса у пациенток с избыточной массой тела и ожирением [162], а также накоплением мутаций мтДНК или снижением способности к репликации мтДНК в ооцитах женщин старшего репродуктивного возраста [99]. Однако в нашем исследовании число копий мтДНК ооцитов не коррелировало с возрастом и ИМТ донировавших их пациенток. Ятрогенные факторы также не оказывали влияние на число митохондрий в неоплодотворившихся ооцитах. При этом нами не было найдено публикаций, анализирующих корреляцию между особенностями протоколов стимуляции и числом копий мтДНК в ооцитах человека, а влияние стимуляции функции яичников на явления окислительного стресса в ооцитах является спорным [164].

Таким образом, в ходе проведенного анализа было выявлено, что ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными ооцитами и ооцитами в экстрацитоплазматическими аномалиями. Снижение числа копий мтДНК в ооцитах уменьшает функциональные возможности не только самой клетки, но и эмбриона на ранних этапах развития. Эмбрионы, полученные при оплодотворении ооцитов с низким числом копий мтДНК, могут иметь низкий потенциал для продукции энергии на том этапе, когда происходит активное дробление, а собственные митохондрии эмбриона еще не синтезируется. Также нарушение функции митохондрий может приводить к дефектам формирования веретена деления, что повышает вероятность возникновения анеуплоидии в процессе мейотического деления. Таким образом, снижение количества, и, как следствие, нарушение функции митохондрий в ооцитах с цитоплазматическими дисморфизмами может быть одной из причин негативных исходов ЭКО у данной категории пациенток.

На третьем этапе нашего исследования у супружеских пар с различными дисморфизмами ооцитов у женщин был оценен риск выявления различных типов анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X и Y в ядрах бластомеров и проведен анализ результатов программ ВРТ в зависимости от наличия и вида дисморфизмов.

Для оценки влияния дисморфизмов ооцитов на риск получения анеуплоидных эмбрионов мы провели сравнение групп пациенток с различными дисморфизмами, а также группы пациенток с морфологически нормальными ооцитами, прошедших ПГС. В группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов был выявлен статистически значимый более высокий уровень анеуплоидии в эмбрионах (68,4%) по сравнению с группой экстрацитоплазматических дисморфизмов (38,9%) и группой морфологически нормальных ооцитов (31,3%) (р0,0001). Затем с помощью метода логистической регрессии с учетом выявленных конфаундеров было рассчитано скорректированное ОШ получения анеуплоидных эмбрионов в зависимости от наличия и вида дисморфизма ооцитов, которое составило 3,6 (95% ДИ=1,8; 7,2) для цитоплазматических дисморфизмов и 1,3 (95% ДИ=0,7; 2,1) для экстрацитоплазматических дисморфизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что шансы развития анеуплоидии эмбрионов у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов в 3,6 раза выше по сравнению с пациентками, имеющими морфологически нормальные ооциты.

Помимо морфологии ооцита, на риск возникновения анеуплоидного эмбриона при проведении однофакторного анализа влияли возраст пациентки, ИМТ, уровень АМГ, курение в анамнезе, наличие хламидийной инфекции и ИППП в анамнезе, а также суммарная доза гонадотропинов в изучаемом цикле ЭКО. При применении многофакторного анализа влияние имели только возраст, ИМТ, уровень АМГ, хламидийная инфекция в анамнезе и суммарная доза гонадотропинов. Поскольку в нашей выборке уровень АМГ и суммарная доза гонадотропинов находились в сильной корреляции с возрастом пациентки, мы не включали данные факторы в регрессионную модель.

Высокая доля анеуплоидии в ооцитах женщин старшего репродуктивного возраста является общепризнанным фактом и обусловлен, вероятнее всего, длительным временным промежутком между блоком первого мейотического деления и овуляторным циклом [165], [37], [38].

Избыточная масса тела и ожирение являются причинами снижения фертильности пациенток, однако в литературе нет единого мнения о возможном влиянии ожирения на частоту анеуплоидии в ооцитах.

Существует гипотеза, что нарушение функции митохондрий в ооцитах пациенток с ожирением может приводить к нарушению формирования веретена деления, повышая частоту возникновения ошибок мейоза [24].

Пациентки с ожирением имеют не только более низкую частоту наступления беременности, но и более высокий процент ранних репродуктивных потерь [166], тем не менее роль анеуплоидии в возникновении данных осложнений не доказана [167].

При анализе научных публикацией нами не было найдено данных о влиянии хламидийной инфекции и ИППП на возникновение анеуплоидии в ооцитах. Возможно, развитие функциональных и органических изменений в ткани яичника на фоне иммунопатологических реакций, развивающихся на фоне хронического воспаления, способствует возникновению ошибок мейоза.

Качество спермы в нашем исследовании не влияло на риск возникновения анеуплоидного эмбриона, что может свидетельствовать об отсутствии влияния отцовских анеуплоидий на хромосомный набор эмбриона.

Следует отметить, что наиболее распространенным типом анеуплоидии в нашем исследовании были полисомии хромосом, а распространенность всех видов полисомий была значительно выше у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов. При этом максимальное число анеуплоидных эмбрионов было получено из ооцитов с агрегатами ГЭР и центральной гранулярностью, а также с темной цитоплазмой. Данный феномен возможно объяснить двумя гипотезами. Во-первых, формирование веретена деления в течение созревания ооцита является энергозависимым процессом и требует нормальной функции митохондрий и запаса энергетических субстратов [168].

Как обсуждалось ранее, ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют дефицит митохондрий, что может приводить к недостаточной концентрации АТФ в клетке, дефектам формирования веретена деления, и, как следствие, возникновению ошибок мейотического деления. Нарушение формирование веретена деления может сопровождаться феноменом анафазной задержки, который приводит к появлению ооцитов с диплоидным хромосомным набором. Во-вторых, в ооцитах с патологией цитоплазмы может быть нарушена белковосинтетическая функция при вовлечении в патологический процесс гладкого эндоплазматического ретикулума. В свою очередь, повреждения когезионного комплекса могут приводить к потере связи между сестринскими хроматидами и преждевременного расхождению хроматид [169].

Таким образом, пациентки с морфологическими аномалиями ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, представляют группу риска по выявлению различных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ. Поэтому данной категории пациенток необходимо рекомендовать дополнительное медико-генетическое консультирование с целью решения вопроса о целесообразности проведения молекулярноцитогенетического анализа эмбрионов.

Несмотря на проведение ПГС и селекцию эуплоидных эмбрионов, частота наступления беременности различалась в группах сравнения. Частота наступления клинической беременности составила 10,7% в группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами, 32,1% в группе пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами и 28,6% в группе пациенток с морфологически нормальными ооцитами.

Обращала на себя внимание более низкая частота наступления беременности при применении ЭКО и ПГС, по сравнению с ЭКО, у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов и у пациенток с морфологически нормальными ооцитами, что может быть обусловлено несколькими факторами. Во-первых, изучение дробящихся эмбрионов не позволяет исключить мозаичность бластомеров эмбрионов, а также потенциальную способность дробящегося эмбриона к самокоррекции При этом существует риск как переноса в полость матки [82], [84].

анеуплоидного эмбриона, так и прекращения культивирования и не переноса эмбриона с нормальным хромосомным набором. Во-вторых, при применении ПГС методом FISH нельзя исключить наличие анеуплоидии хромосом, не подвергнутых анализу, и переноса в полость матки анеуплоидного эмбриона.

Что касается низкой частоты наступления беременности у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами, прошедших ПГС, наиболее вероятным механизмом является наличие метаболических нарушений в ооцитах, что обсуждалось ранее.

Несмотря на достаточную клиническую обоснованность проведения ПГС в группах пациенток высокого риска возникновения анеуплоидии у потомства, данная процедура является дорогостоящей, что затрудняет ее внедрение в качества рутинного метода. Для оценки клинико-экономической обоснованности внедрения ПГС методом FISH в клиническую практику нами был проведен клинико-экономический анализ эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов. Наше исследование является первым исследованием, в котором была применена аналитическая модель принятия решений по выбору более клиникоэкономически выгодной стратегии - ЭКО или ЭКО/ПГС - для диагностики анеуплоидии и рождения здорового потомства у бесплодных пар с дисморфизмами ооцитов у женщин.

Анализ показал, что эффективность лечения бесплодия методом ЭКО/ПГС методом FISH не была выше по сравнению с ЭКО в плане рождения здорового потомства у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами: 27,8% при применении ЭКО и лишь 15,4% при применении ЭКО с ПГС. И, наоборот, у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами удалось добиться рождения живого здорового потомства в 21,4% наблюдений при применении ЭКО с ПГС и лишь в 15% случаев при применении ЭКО. Важно, что в отсутствии применения ПГС в этой группе пациентов 1,4% рожденных детей имели те или иные анеуплоидии.

Несмотря на высокую эффективность ПГС у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, высокая стоимость данной процедуры не позволила назвать метод ЭКО/ПГС более клиникоэкономически эффективной стратегией лечения бесплодия в этой группе больных. При этом следует отметить, что стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка у этих пациентов отличалась всего на 13% в отличие от пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, у которых дельта в цене составляла 66,5%. Анализ чувствительности показал, что, для того чтобы добиться увеличения клинико-экономической эффективности ЭКО с ПГС по сравнению с ЭКО у пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин, надо снизить ее стоимость до 126 238 руб. по сравнению с исходными 188 909 руб. При этом следует повысить эффективность ЭКО/ПГС до 26,1% по сравнению с исходными 21,4%.

Существует несколько возможных способов повышения эффективности ЭКО/ПГС. Во-первых, как обсуждалось ранее, исследование эмбриона на стадии дробления не позволяет исключить мозаичность бластомеров эмбриона или потенциальную способность эмбриона к самокоррекции, что приводит к риску получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. ПГС путем анализа клеток трофоэктодермы позволит повысить частоту наступления беременности за счет устранения мозаичности клеток эмбриона. Во-вторых, использование метода FISH не позволяет исключить анеуплоидии хромосом, которые не были подвергнуты диагностике. Следует также учитывать, что анализу подвергаются те хромосомы, аномалии которых ассоциированы с рождением жизнеспособных детей с генетической патологией, в то время аномалии других хромосом сопряжены с гибелью эмбрионов на доимплантационной стадии или прерыванием беременности на ранних сроках. Таким образом, методика FISH позволяет осуществить профилактику рождения детей с хромосомными аномалиями, а применение сравнительной геномной гибридизации, возможно, позволит более существенно повысить частоту наступления беременности после ПГС.

Мы рассчитали и провели сравнение показателей приращения затрат (ICER) на проведение ЭКО и ЭКО/ПГС в данной группе пациентов, который составил 18 028,60 руб. Анализ ICER показал, что для достижения дополнительного 1% эффективности (т.е. 1% рождения здоровых детей) при применении ЭКО/ПГС в группе пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин требуется всего лишь 18 028,60 рублей дополнительных вложений.

Наиболее интересной находкой нашего исследования с клинической точки зрения является высокая вероятность рождения ребенка с анеуплоидией при наличии цитоплазматических дисморфизмов ооцитов, составляющая 1,4%, что превышает общепопуляционные значения. Несмотря на то, метод ЭКО/ПГС не является экономически выгодной стратегией для пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, применение ПГС может способствовать профилактике рождения детей с врожденными аномалиями. Следует учитывать, что для упрощения созданной модели мы не включали в анализ расходы на лечение детей с врожденными аномалиями.

ЭКО является более клинико-экономически эффективным методом лечения бесплодия у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин.

У пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин ЭКО с применением ПГС методом FISH может быть более выгодной методикой в случае снижения стоимости ПГС.

–  –  –

ВЫВОДЫ

Эффективность программ ВРТ у пар с дисморфизмами ооцитов у 1.

женщин, особенно с цитоплазматическими дисморфизмами, ниже по сравнению с парами с морфологически нормальными ооцитами. У пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 1,4 раза реже, а живорождение - в 2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов. У пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 3,7 раз реже, а живорождение - в 4,2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов.

Факторами риска развития дисморфизмов ооцитов у пациентов 2.

ВРТ являются старший возраст пациенток, низкий уровень антимюллерова гормона и свободного тироксина, а также применение агонистов гонадотропин рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции суперовуляции. Различные гинекологические заболевания (эндометриоз, синдром поликистозных яичников, воспалительные заболевания органов малого таза) не оказывают значимого влияния на развитие дисморфизмов ооцитов.

Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более 3.

низкое число копий мтДНК по сравнению с ооцитами с экстрацитоплазматическими дисморфизмами или морфологически нормальными ооцитами. Снижение числа и, как следствие, функции митохондрий является одной из возможных причин низкой эффективности программ ВРТ у данной категории пациенток.

Дисморфизмы ооцитов, в первую очередь цитоплазматические 4.

дисморфизмы, оказывает существенное влияние на развитие хромосомной патологии эмбрионов в программах ВРТ: анеуплоидии 13, 18, 21, X и Y хромосом выявляются у 38,9% эмбрионов, полученных из ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами, и у 68,4% эмбрионов, полученных из ооцитов с патологией цитоплазмы. Оплодотворение ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами увеличивает риск получения анеуплоидных эмбрионов в 3,6 раза. Наиболее частыми видами хромосомной патологии эмбрионов при этом являются различные полисомии хромосом.

При применении программ ВРТ у пациенток с 5.

экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов проведение преимплантационного генетического скрининга методом не FISH увеличивает эффективность программ ВРТ (наступление беременности, живорождения). При применении программ ВРТ у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH увеличивает эффективность программ ВРТ (живорождения - в 1,4 раза) за счет переноса в полость матки эуплоидных по 5-хромосомам эмбрионов, что свидетельствует о клинической обоснованности применения ПГС для лечения бесплодия и профилактики хромосомной патологии плода в данной группе пациентов.

Клиническая эффективность преимплантационного 6.

генетического скрининга методом FISH у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин не сочетается с его клинико-экономической эффективностью, которая может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Всем пациенткам программ ВРТ следует проводить тщательную 1.

морфологическую оценку ооцитов на предмет выявления различных дисморфизмов. Выявление патологии цитоплазмы ооцита является плохим прогностическим фактором в плане его оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона.

При получении ооцитов с агрегатами гладкого 2.

эндоплазматического ретикулума в циклах ВРТ следует отказаться от их оплодотворения вследствие низкой вероятности дальнейшего развития эмбрионов (минимальное число копий мтДНК) и высокого риска получения анеуплоидных эмбрионов (65,2%).

Пациенткам с риском развития дисморфизмов ооцитов требуется 3.

комплексный подход в коррекции соматических заболеваний и метаболических нарушений, а также дифференцированный подход в выборе подходящего протокола стимуляции суперовуляции. Для расчета индивидуального риска получения ооцитов с различными дисморфизмами в программах ВРТ могут быть использованы разработанные математические модели, включающие оценку клинико-лабораторных и ятрогенных факторов.

Пациентки с морфологическими аномалиями ооцитов, в первую 4.

очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, представляют группу риска по выявлению различных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ.

Данной категории пациенток необходимо рекомендовать дополнительное медико-генетическое консультирование с целью решения вопроса о целесообразности проведения молекулярно-цитогенетического анализа эмбрионов.

Клинико-экономическая эффективность преимплантационного 5.

генетического скрининга методом FISH в группе пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин может быть достигнута снижением его стоимости. Полученная вследствие снижения стоимости экономическая выгода назначения данного метода позволит внедрить его в группах пациенток высокого риска по рождению детей с генетической патологией.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

17-ОП - 17-оксипрогестерон А-ГнРГ - агонисты гонадотропин – рилизинг гормона Ант-ГнРГ - антагонисты гонадотропин – рилизинг гормона АДФ - аденозиндифосфат АЗС - астенозооспермия АМГ - антимюллеров гормон АСАТ - антиспермальные антитела АТ - астенотератозооспермия АТФ - аденозинтрифосфат ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ГнРГ - гонадотропин рилизинг-гормон ГЭР - гладкий эндоплазматический ретикулум ДГЭА-С - дегидроэпиандростерона сульфат ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита ИМСИ - интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормального сперматозоида ИМТ - индекс массы тела ИППП - инфекции, передаваемые половым путем КОК - комбинированные оральные контрацептивы ЛГ - лютеинизирующий гормон мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота МКБ-10 - Международная классификация болезней десятого пересмотра НЗС - нормозооспермия НЦАГиП - Научный центр акушерства гинекологии и перинатологии им.

В.И. Кулакова ОА - олигоастенозооспермия ОАТ - олигоастенотератозооспермия ОЗС - олигозооспермия ОКК - ооцит-кумулюсный комплекс ОМС - обязательное медицинское страхование ОТ - олиготератозооспермия ОШ - отношение шансов ОШгр - грубое отношение шансов ОШкор - скорректированное отношение шансов ПГД - преимплантационная генетическая диагностика ПГС - преимплантационный генетический скрининг ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭ - перенос эмбрионов рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота рФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон С/в - самопроизвольный выкидыш СГГ - сравнительная геномная гибридизация СТГ - соматотропный гормон СПКЯ - синдром поликистозных яичников тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота Т - тестостерон ТВП - трансвагинальная пункция ТЗС - тератозооспермия ТТГ - тиреотропный гормон Т4св - тироксин свободный ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГ - хорионический гонадотропин ЧМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин ЭКГ - электрокардиограмма ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

-ХГ - -субъеденица хорионического гонадотропина ANOVA - analysis of variance (дисперсионный анализ) AUC - area under curve (площадь под кривой) CGH - comparative genomic hybridization (сравнительная геномная гибридизация) GV - germinal vesicle (Зародышевый пузырек) FISH - fluorescence in situ hybridization (флюоресцентная гибридизация in situ) HBs-Ag - cпецифический антиген вируса гепатита В HCV - вирус гепатита С HLA - human leucocyte antigens (человеческие лейкоцитарные антигены) ICSI - Intracytoplasmic sperm injection (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита) LSIL - Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (низкая степень внутриэпителиального поражения) M I - metaphase I (метафаза первого мейотического деления) M II - metaphase II (метафаза второго мейотического деления) PB1 - first polar body (первое полярное тельце) PB2 - second polar body (второе полярное тельце) ROC - receiver operating characteristic (операционная характеристика надежности) RW - реакция Вассермана OR - оdds ratio (отношение шансов)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome /L. Rienzi [et al.] // Fertil. Steril. - 2008. - Vol. 90, № 5. - P.

1692–1700.

2. Balaban, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation / B. Balaban, B. Urman // Reprod Biomed Online.- 2006.- Vol. 12. - P. 608–615.

3. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes / J. Otsuki [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.- Vol. 19.- P. 1591–1597.

4. Frequency and distribution of chromosome abnormalities in human oocytes / A. Kuliev [et al.] // Cytogenet. Genome Res.- 2005.- Vol.

111.- P. 193–198.

5. Comparative genomic hybridization of oocytes and first polar bodies from young donors/ E. Fragouli [et al.] //Reprod. Biomed. Online.Vol. 19, № 2.- P. 228–237.

6. The origin of human aneuploidy: Where we have been, where we are going / T. Hassold [et al.] // Hum. Mol. Genet.- 2007.- Vol. 16, № 2.- P. 203–208.

7. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening /T.

Mastenbroek [et al.] // N Engl J Med.- 2007.- Vol. 357, № 1, P. 9–17.

8. Mitochondrial content reflects oocyte variability and fertilization outcome / T. Santos [et al.] // Fertil. Steril.- 2006.- Vol. 85, № 3.- P. 584-591.

9. Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes /C. Morgan [et al.] // Mol. Hum. Reprod.- 2001.- Vol. 7, № 5.- P.

425–429.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |
 

Похожие работы:

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ФЕДИН Андрей Викторович КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09 – аллергология и иммунология 14.01.03 – болезни уха, горла и носа ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» НА ПРАВАХ РУКОПИСИ НИКУЛИНА НЕЛЯ ШАМИЛЕВНА ПРОДУКТИВНЫЕ КАЧЕСТВА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОРОВ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ «БИОГУМИТЕЛЬ-Г» 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.