WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ ...»

-- [ Страница 2 ] --

В отличие от ядерной ДНК, мтДНК передается по наследству только по материнской линии [107]. В сперматозоидах млекопитающих обычно содержится не более десяти митохондрий, а в сперматозоиде человека – одна спирально закрученная митохондрия [108]. Более того, после оплодотворения начинается активная деградация митохондрий сперматозоидов. В нормальной сперме человека содержится мтДНК [109], и хотя в литературе обсуждался отдельный клинический случай передачи мтДНК от отца к ребенку [110], в последующих популяционных исследованиях не было найдено убедительных доказательств в пользу наследования мтДНК по отцовской линии [111], [112]. Несмотря на опасения ученых, что при проведении процедуры ИКСИ может быть нарушен механизм, посредством которого осуществляется деградация отцовской мтДНК после оплодотворения, даже при проведении ЭКО/ИКСИ механизм передачи мтДНК не нарушался [113].

В литературе активно обсуждается связь между числом копий мтДНК, продукцией АТФ митохондриями и качеством ооцитов, а также потенциалом развития эмбрионов в программах ВРТ. Несмотря на то, что созревание ооцита может происходить при большой вариабельности содержания АТФ в клетке, ооциты с более высокой концентрацией АТФ обладают большим потенциалом к успешному эмбриогенезу и имплантации [114]. Хотя число копий мтДНК в ооцитах широко варьирует, как обсуждалось ранее, ооциты с более низким числом копий мтДНК, по данным н, имеют более низкую частоту оплодотворения Отмечается четкая корреляция между [9].

увеличением возраста пациентки и снижением числа копий мтДНК в ооцитах [115]. Кроме того, ооциты пациенток с преждевременной недостаточностью яичников содержат значительно меньшее число копий мтДНК, чем пациентки с нормальным овариальным резервом [116]. Тем не менее, полученные данные сложно интерпретировать с практической точки зрения, так как изучение митохондрий в отдельных ооцитах сопряжено с гибелью клетки, и доподлинно не известно, насколько возможно экстраполировать полученные данные на общую популяцию гамет.

Большой интерес представляет исследование Murakoshi et al. (2013), в котором ученые из Японии анализировали число копий мтДНК в отдельных бластомерах эмбрионов 3-суток культивирования. Эмбрионы продолжали культивировать после биопсии, а затем переносили в полость матки на стадии бластоцисты. В данном исследовании была выявлена статистически значимая положительная связь между числом копий мтДНК в отдельных бластомерах эмбрионов и частотой наступления клинической беременности [115].

Биология и генетика митохондрий представляет собой большой научный интерес, особенно в области патологии репродукции и методов ВРТ.

Изучение митохондриального аппарата ооцитов человека, особенно числа копий мтДНК, необходимо для более полного понимания процессов метаболических нарушений в ооцитах, а значит, для разработки методов их коррекции.

1.5. Влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на эффективность программ ВРТ В повседневной клинической практике лаборатории ЭКО оценка качества полученных при трансвагинальной пункции ооцитов производится достаточно поверхностно. При проведении инсеминации ооцитов in vitro (процедура классического ЭКО) тщательная оценка морфологии ооцитов не проводится, учитывая наличие в препарате клеток кумулюса. И хотя при проведении процедуры ИКСИ оплодотворение ооцитов производится после энзимного удаления клеток кумулюса, оценка качества клеток сводится в основном к определению степени зрелости ооцита (стадия зародышевого пузырька – GV, метафазы I или метафазы II). Даже при наличии грубых морфологических аномалий, все зрелые ооциты на стадии MII подвергаются процедуре ИКСИ. При этом потенциал развития эмбрионов оценивается исключительно по морфологии самого эмбриона без связи с качеством ооцита, из которого данный эмбрион был получен. Нельзя не отметить, что морфологической оценке ооцитов уделяется меньше внимания, чем выбору сперматозоидов для проведения ИКСИ или анализу эмбрионов в процессе культивирования.

Применение контролируемой стимуляции функции яичников дополнительно усложняет ситуацию. Созревание ооцита in vivo является результатом длительной и тщательной селекции. Стимуляция функции яичников подавляет естественную селекцию и приводит к созреванию заведомо аномальных ооцитов, которые физиологически должны были подвергнуться апоптозу.

Распространенность морфологических аномалий ооцитов, по данным разных авторов, достигает 50% [117]. Аномалии строения ооцитов (дисморфизмы) классифицируются на две группы: цитоплазматические и экстрацитоплазматические.

К цитоплазматическим относят повышение гранулярности цитоплазмы, повышение вакуолизации, аномальные агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума, а также наличие разнообразных цитоплазматических включений. Принято считать, что данная группа аномалий является признаком цитоплазматической незрелости клетки, а, значит, наличие цитоплазматических дисморфизмов влияет на оплодотворение ооцита и дальнейшее развитие эмбриона. К экстрацитоплазматическим аномалиям относят изменение ширины перивителлинового пространства, наличие гранулярности в перивителлиновом пространстве, изменение толщины и/или формы зоны пеллюцида, а также особенности строения первого полярного тельца.

Остается спорным вопрос, влияют ли данные аномалии на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и способность его к имплантации.

В качестве возможных факторов риска появления дисморфизмов ооцитов рассматриваются возраст женщины, генетические нарушения, причина бесплодия, а также наличие метаболических нарушений (избыточная масса тела и ожирение) и гинекологических заболеваний (наружный генитальный эндометриоз, синдром поликистозных яичников, ановуляция) [118], [119], [120]. При этом нет данных за четкую связь между данными факторами и появлением у пациенток дисморфизмов ооцитов.

Особое внимание уделяется влиянию различных протоколов стимуляции функции яичников в программах ЭКО на морфологию ооцитов. В крупном ретроспективном когортном исследовании были получены данные о том, что длительность стимуляции функции яичников четко коррелирует с качеством ооцитов и эмбрионов 3-х суток культивирования. При длительности стимуляции функции яичников меньше девяти дней отмечается значительно более частая фрагментация бластомеров эмбрионов [121].Учитывая, что длительность стимуляции функции яичников связана с длительностью собственного менструального цикла пациентки, которая в свою очередь уменьшается с возрастом или при снижении овариального резерва, можно провести параллель между данными состояниями и качеством эмбрионов. В другом проспективном рандомизированном исследовании связи между различными протоколами стимуляции функции яичников и морфологией полученных ооцитов отмечено не было [119].

К наиболее часто встречающимся цитоплазматическим дисморфизмам ооцитов относят центральную гранулярность цитоплазмы, наличие в цитоплазме вакуолей, рефрактерных телец, а также аномальных агрегатов ГЭР.

Центральная гранулярность цитоплазмы является особенностью строения ооцита и представляет собой крупную темную губчатую зернистую область в цитоплазме. Распространенность данного варианта дисморфизма составляет около 30-35 % [1], [122]. Основным фактором риска появления данной аномалии ооцитов считался возраст женщины [123], однако эти данные не получили подтверждения в последующих исследованиях [124].

Связи между данным дисморфизмом и различными протоколами стимуляции функции яичников также не было отмечено [1], [124]. Зрелые ооциты с гранулярностью цитоплазмы имеют более кислую внутриклеточную среду, а также низкое содержание АТФ в клетке [123], что, по мнению авторов, связано с гипоксией фолликулов в процессе фолликулогенеза. Отрицательное влияние центральной гранулярности на частоту оплодотворения и качество полученных эмбрионов является спорным [122], [124]–[126]. При этом во всех исследованиях отмечалась существенно более низкая частота наступления развивающихся беременностей, не превышающая 10%. По данным генетического исследования частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов, полученных путем оплодотворения ооцитов с центральной гранулярностью, достигает 52%, что может быть объяснением причины низкой эффективности программ ЭКО у данной группы пациенток [114], [122].

Вакуоли представляют собой цитоплазматические включения, окруженные мембраной и заполненные жидкостью, иногда содержащие дегенерирующие органеллы клетки (лизосомы или митохондрии). Вакуоли могут появляться в ооците или бластомерах на любой стадии развития, быть единичными или многочисленными. Размер вакуолей широко варьирует.

Появление вакуолей может быть, как спонтанным во время созревания ооцита, когда происходит выделение первого полярного тельца, так и искусственным после проведения ИКСИ. Жидкость, заполняющая вакуоли, по составу близка содержимому перивителлинового пространства.

Распространенность вакуолизации в зрелых ооцитах на стадии профазы второго мейотического деления (МII) невысока и составляет около 3-4% [1], [127]. Факторы риска появления данного дисморфизма ооцитов не определены. Потенциал дальнейшего развития ооцитов и эмбрионов с вакуолями значительно снижен. Частота оплодотворения ооцитов с данным дисморфизмом ниже, чем в морфологически нормальных ооцитах, и зависит от количества и размера вакуолей [127], [128]. Оплодотворение ооцита отсутствует, если размер вакуолей превышает 14 мкм. Существует гипотеза, что крупные вакуоли смещают веретено деления, а также нарушают архитектонику цитоплазмы (приводят к смещению микротрубочек), что препятствует нормальному движению пронуклеусов. Наличие вакуолей в ооцитах также оказывает неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона. Такие эмбрионы реже достигают стадии бластоцисты, либо формируется бластоциста низкого качества [127].

Рефрактерные тельца состоят из смеси липидов и плотного материала гранул. Они могут обнаруживаться на различных стадиях созревания ооцитов. Основную роль играет размер гранул. Доказано, что наличие рефрактерных телец размеров более 5 мкм сопровождается снижением частоты оплодотворения и развития эмбрионов до стадии бластоцисты [129].

Скопление аномальных агрегатов ГЭР представляет собой круглые гладкие прозрачные диски, находящиеся, как правило, в центре ооцита.

Данный дисморфизм наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII, распространенность его составляет 0,5-2% [1], [130]. Появление агрегатов ГЭР снижает вероятность оплодотворение клетки и потенциал развития эмбриона В процессе оплодотворения проникновение [130]–[132].

сперматозоида в ооцит запускает цепь реакций, тесно связанных с кинетикой внутриклеточного кальция. Выброс кальция необходим для протекания кортикальной реакции, завершения мейоза и формирования пронуклеусов.

Кроме того, нормальная кинетика внутриклеточного кальция необходимо для развития эмбриона до стадии бластоцисты. В клетке основной органеллой, накапливающей кальций, служит ГЭР, поэтому изменения внутриклеточного распределения данной органеллы могут влиять на выброс кальция, оплодотворение, а также на ранние этапы эмбриогенеза. Ооциты с данным дисморфизмом чаще встречаются в протоколах с антагонистами гонадотропин рилизинг-гормона (ГнРГ). При этом не зарегистрировано появления таких ооцитов в циклах без стимуляции функции яичников [130], [132]. Наличие агрегатов ГЭР в ооцитах коррелирует с низкой частотой оплодотворения, низким качеством полученных эмбрионов, при этом эмбрионы редко достигают стадии бластоцисты, реже наступает имплантация и развивающаяся беременность Помимо [130]–[132].

эмбриологических аспектов, наличие агрегатов ГЭР в ооцитах ассоциировано с частыми акушерскими осложнениями. Наблюдается более высокая частота преждевременных родов и рождения детей с серьезными пороками развития, а также более низкий вес новорожденных [130]–[132]. По данным генетического исследования, частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов, полученных при оплодотворении ооцитов с данным дисморфизмом, достигает 37% [114]. Большинство авторов рекомендует отказаться от оплодотворения ооцитов с агрегатами ГЭР, учитывая все вышеописанные факторы [130], [132].

Наличие темной цитоплазмы ооцита увеличивает риск получения эмбрионов низкого качества, что может быть связано с цитоплазматической незрелостью клетки [133], [134].

К экстрацитоплазматическим дисморфизмам ооцитов относят увеличение перивителлинового пространства, наличие гранулярности (дебриса) в перивителлиновом пространстве, изменение формы и/или толщины зоны пеллюцида, а также аномалии строения первого полярного тельца.

Перивителлиновое пространство ооцитов человека может варьировать по размеру, а также по наличию или отсутствию гранулярности. Наличие дебриса часто сочетается с увеличенным перивителлиновым пространством.

Распространенность увеличенного перивителлинового пространства ооцитов составляет около 30% [1]. Факторы риска появления данного дисморфизма неизвестны, хотя предполагается, что широкое перивителлиновое пространство ооцитов является специфической ответной реакцией на стимуляцию функции яичников. Гранулярность перивителлинового пространства наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII. Вероятнее всего, появление дебриса в перивителлиновом пространстве связано с преждевременным закрытием пор зоны пеллюцида. Существует гипотеза о том, что наличие гранулярности в перивителлиновом пространстве связано с преждевременным экзоцитозом секреторных гранул при больших дозах гонадотропинов в циклах ЭКО [135]. Большинство исследователей считают, что наличие увеличенного перивителлинового пространства и дебриса в нем не влияет на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и его способность к имплантации [2], [135]–[137]. Существует мнение, что увеличенное перивителлиновое пространство и наличие в нем дебриса коррелируют с образованием эмбрионов низкого качества, но при этом данные дисморфизмы не влияют на частоту имплантации и процент клинических беременностей [138]. В ряде исследований было показано, что ооциты с широким перивителлиновым пространством и дебрисом имеют более низкую частоту оплодотворения имплантации и клинических [125], [139], беременностей [140]. Частота генетических нарушений в клетках с дебрисом в перивителлиновом пространстве не отличается от таковой в морфологически нормальных ооцитах. При генетической диагностике первого и второго полярных телец ооцитов было выявлено, что в ооцитах с увеличенным перивителлиновым пространством несколько повышена частота анеуплоидий 18 хромосомы [141].

По наличию первого полярного тельца в циклах ИКСИ можно судить о готовности ооцита к оплодотворению. Только ооциты на стадии метафазы второго мейотического деления пригодны для оплодотворения методом

ИКСИ. Существуют различные аномалии первого полярного тельца:

фрагментация, увеличение размера, нарушение формы.

Распространенность фрагментации первого полярного тельца достигает 50%, а других аномалий около 4% [1].Фрагментация первого полярного тельца, по данным исследований, не влияет на частоту оплодотворения и качество полученных эмбрионов [125], [142] хотя есть данные, что скорость дробления таких эмбрионов достаточно низкая [123]. При наличии других аномалий строения (гигантское или дегенеративное первое полярное тельце) снижается частота оплодотворения, но сохраняется нормальная морфология пронуклеусов [1]. Предполагается, что наличие дегенеративного первого полярного тельца является признаком асинхронности процессов созревания в ядре и цитоплазме, что объясняет низкий процент оплодотворения таких клеток. Гигантское первое полярное тельце отображает дислокацию мейотического веретена деления в клетке. Таким образом, ооциты с наличием данных аномалий строения имеют сниженный потенциал к оплодотворению, но если оплодотворение произошло, дальнейшее развитие таких эмбрионов не нарушено.

Зона пеллюцида, или прозрачная оболочка, - внешняя оболочка ооцита, конгломерат из гликопротеинов, синтезируемых и секретируемых растущим ооцитом и клетками гранулезы, который утолщается по мере роста ооцита. В норме толщина прозрачной оболочки варьирует от 10 до 31 мкм и не зависит от диаметра цитоплазмы. Распространенность аномалий строения зоны пеллюцида составляет около 4-5% [1]. При утолщении прозрачной оболочки может нарушаться проникновение сперматозоида в клетку. Известно, что лучше всего оплодотворяются ооциты, имеющие толщину прозрачной оболочки не более 18,6 мкм. На развитие эмбриона после проведения оплодотворения методом ИКСИ толщина прозрачной оболочки влияния не оказывает [143]. Не получено данных о том, что изменение формы зоны пеллюцида негативно влияет на частоту оплодотворения, качество эмбрионов и частоту имплантации [133].

Снижение тургора ооцита не является само по себе морфологической характеристикой ооцитов, тем не менее, наличие данной особенности клетки было включено в морфологические классификации клеток [128]. Ооциты со сниженным тургором характеризуются более низкой частотой формирования бластоцист.

Несмотря на высокую распространенность аномалий строения ооцитов в программах ВРТ, достоверных данных о корреляции отдельных дисморфизмов с генетическими и/или метаболическими нарушениями в клетках нет. Особый интерес представляет изучение частоты анеуплоидии в ооцитах с различными дисморфизмами, так как изменение хромосомного набора в ооцитах является наиболее вероятной причиной низкой эффективности программ ВРТ, а имеющихся в литературе данных недостаточно для замены ПГС морфометрией гамет у данной группы пациентов [141]. При анализе научных публикаций нами не было найдено данных о корреляции между дисморфизмами ооцитов и изменениями строения и функции митохондрий в клетках, в том числе изменениями числа копий мтДНК. Тем не менее, подобные исследования представляют большой научный интерес, вследствие потенциального нарушения метаболизма в ооцитах с дисморфизмами, прежде всего с цитоплазматическими, что также может негативно влиять на результативность программ ВРТ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на базе ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова»

Минздрава России (директор - академик РАН Г.Т. Сухих). Набор пациентов осуществлялся в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия (заведующий - д.м.н. Е.А. Калинина). Лабораторные исследования проводились в лаборатории репродуктивной генетики (заведующий профессор В.А. Бахарев) и в лаборатории цитологии (заведующий - к.б.н.

А.М. Красный). Было обследовано 420 супружеских пар с бесплодием различного генеза. В результате проведенного обследования из 420 пар выбыло 77 пар в связи с несоответствием критериям включения, либо отказа от дальнейшего участия в исследовании. Для финального анализа было отобрано 343 супружеские пары, подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Супружеские пары были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению". На первом этапе у супружеских пар оценивались клинико-анамнестические данные, а также лабораторные характеристики. В процессе проведения программы ЭКО проводилась морфометрия полученных ооцитов. На втором этапе у части пациентов проводилось исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. На третьем этапе у части пациентов проводилось молекулярно-цитогенетическое исследование эмбрионов (FISH-методом).

–  –  –

Для оценки распространенности различных цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов в программах ВРТ было проведено одномоментное исследование (Рисунок 2). Оценка морфологии ооцитов производилась эмбриологом с помощью световой микроскопии, после механического и энзимного удаления клеток кумулюса, непосредственно перед проведением процедуры ИКСИ. На основании морфологической оценки выявляли наличие или отсутствие, а также тип дисморфизма. К цитоплазматическим дисморфизмам относили наличие в цитоплазме ооцита центральной гранулярности, вакуолей различного размера, аномальных агрегатов ГЭР, рефрактерных телец, а также темной цитоплазмы. К экстрацитоплазматическим дисморфизмам относили изменение толщины перивителлинового пространство, наличие в нем дебриса, аномалии строение первого полярного тельца, наличие деформации или утолщение зоны пеллюцида ооцита.

Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилась распространенность различных дисморфизмов ооцитов у пациенток в программах ЭКО/ИКСИ.

–  –  –

Для оценки влияния клинико-анамнестических данных, включая ятрогенные факторы, как возможные предикторы появления дисморфизмов ооцитов в циклах ВРТ, было проведено проспективное исследование случайконтроль (Рисунок 3). Группы формировались путем метода подбора пар (англ. – matching) по числу полученных ооцитов (2-5 ооцитов, 6-10 ооцитов и более 10 ооцитов) и эмбриологу, выполнявшему морфометрию клеток (морфологическое исследование ооцитов осуществлялось 3-мя эмбриологами). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или с экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов.

–  –  –

В качестве предполагаемых факторов риска рассматривались возраст пациенток, ИМТ, протокол стимуляции функции яичников (длинный или короткий с агонистами гонадотропин рилизинг-гормона (а-ГнРГ), с антагонистами гонадотропин рилизинг-гормона (ант-ГнРГ), а также ЭКО в естественном цикле), длительность стимуляции функции яичников, суммарная доза экзогенных гонадотропинов, триггер овуляции в коротком протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона, гормональные характеристики (уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), антимюллерового гормона (АМГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), тестостерона, эстрадиола, тиреотропного гормона (ТТГ) и свободного тироксина), наличие эндометриоза и синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), невынашивание беременности в анамнезе.

Группу 1а составили пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами.

Первичной конечной точкой исследования данного этапа исследования явилось скорректированное отношение шансов (ОШкор) развития различных дисморфизмов ооцитов в зависимости от наличия выявленных факторов риска, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии.

2.3. Дизайн исследования для задачи 3

Для анализа исходов программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов (параметры раннего эмбрионального развития, частота биохимических и клинических беременностей, частота потерь беременности до 12 недель гестации, а также частота живорождений) было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 4). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов.

Частота наступления биохимической и клинической беременности, частота потерь беременности до 12 недель гестации, частота живорождений, а также процент циклов с отменой переноса по причине отсутствия эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки рассчитывались на один проведенный цикл ЭКО/ИКСИ. Частота оплодотворения ооцитов, доля эмбрионов различных классов и доля эмбрионов, остановившихся в развитии на ранних этапах, рассчитывались на один полученный при трансвагинальной пункции зрелый ооцит. Группу 1 составили пациентки с дисморфизмами ооцитов: группу 1а с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами.

Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось ОШкор наступления клинической беременности в изучаемых группах, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии.

–  –  –

Для оценки числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах пациенток программ ВРТ было проведено одномоментное исследование в параллельных группах.

Критериями отбора ооцитов для включения в исследование было отсутствие двух пронуклеусов в цитоплазме ооцита через 18-20 часов после проведения ИКСИ, отсутствие дробления ооцита через 40 часов после проведения ИКСИ, а также подписанное информированное согласие пациентки. В зависимости от наличия или отсутствия, а также типа дисморфизма, пациентки были разделены на 3 группы: группу 1 составили ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами, группу 2 – ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами, группу 3 – морфологически нормальные ооциты.

Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось распределение копий мтДНК в различных группах дисморфизмов ооцитов.

2.5. Дизайн исследования для задачи 5

Для изучения риска развития анеуплоидии 13, 18, 21, X, Y хромосом в ядрах бластомеров у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов и морфологически нормальными ооцитами, а также оценки исходов программ ВРТ после переноса эуплоидных по указанным хромосомам эмбрионов было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 5). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов.

Группу 1 составили пациентки с дисморфизмами ооцитов: группу 1а - с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами.

Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось скорректированное отношение шансов развития анеуплоидии и различных видов анеуплоидии бластомеров у пациенток различных групп, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии.

–  –  –

Для оценки клинико-экономической эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 6).

–  –  –

Группу 1а(1) составили пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС, группу 1а(2) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС, группу 1б(1) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитами, прошедшие ПГС, группу 1б(2) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитами, не прошедшие ПГС.

Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилась клинико-экономическая эффективности ПГС у пар с дисморфизмами ооцитов.

2.7. Критерии включения в исследование

Критериями включения в исследование были:

нормальный кариотип супругов;

отсутствие противопоказаний к ВРТ у женщин, в том числе отсутствие наружного генитального эндометриоза III-IV степени, хронического эндометрита, образований яичников, пороков развития внутренних половых органов, миомы матки крупных размеров;

базальный уровень ФСГ менее 12 мМЕ/мл;

подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерием невключения в исследование было:

наличие тяжелой формы патозооспермии у мужчины (концентрация сперматозоидов менее 6 х 000 000/мл, наличие менее 4% морфологически нормальных сперматозоидов по строгим критериям Крюгера, а также наличие азооспермии).

Критериями исключения из исследования были:

развитие синдрома гиперстимуляции яичников средней или тяжелой степени в изучаемом цикле ЭКО;

другие причины и осложнения, требующие отмены переноса эмбрионов в изучаемом цикле.

–  –  –

Расчет объема выборки был произведен с помощью программы STATISTICA 10 (США).

Для решения задачи 2 (выявление факторов риска появления дисморфизмов ооцитов) объем выборки определялся количеством изучаемых факторов риска (предполагалось изучение 17 предикторов). Принимая во внимание, что максимальное число предикторов, включенных в модель, не должно быть больше, чем число исходов, деленное на значение от 5 до 20, для изучения 17 факторов риска необходимо включить минимум 85 человек в каждую группу – всего 255 человек.

Для решения задачи 3 (оценка исходов ВРТ в зависимости от наличия и вида дисморфизмов ооцитов) расчет объема выборки был основан на данных литературы о частоте наступления беременности у супружеских пар с наличием или отсутствием дисморфизмов ооцитов [144]. Для получения валидных данных при принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 90%, с учетом возможного 15% выбывания пациенток из исследования, необходимо включить по 62 пациентки в каждую группу, всего – 186 пациенток.

Для решения задачи 4 (определение числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах) расчет объема выборки не производился.

Исследование носило пилотный характер, и в него были включены все неоплодотворившиеся зрелые ооциты пациенток, подписавших информированное согласие на участие в исследовании.

Для решения задачи 5 (оценка риска анеуплоидии эмбрионов в зависимости от наличия и вида дисморфизма ооцитов) расчет объема выборки был основан на данных литературы о частоте анеуплоидии в эмбрионах в зависимости от наличия или отсутствия дисморфизмов ооцитов [145]. При принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 90% необходимо было включить по 22 пациентки в каждую группу, всего 66 пациенток.

Для решения задачи 6 количество ПГС-циклов определялось этическими аспектами исследования, а именно наличием дополнительных показаний для проведения ПГС, информированным согласием пациентки на проведение ПГС. Исходя из данных литературы об эффективности ПГС в выявлении эмбрионов с анеуплоидиями [146], у пациенток с отсутствием имплантации в анамнезе, частота наступления беременности после циклов ПГС составляет 34%, без проведения ПГС – 3%. При принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 80% достаточно включения 24 пациенток в каждую группу – всего 72 женщины.

Таким образом, в зависимости от результатов морфологической оценки ооцитов, а также проведения ПГС были сформированы следующие группы пациентов. Для решения задач 1, 2 и 3 были включены 343 супружеские пары:

группа 1а (n=139) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов;

группа 1б (n=97) пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов;

группа 2 (n=107) - пациентки с морфологически нормальными ооцитами.

Для решения задачи 4 у 198 женщин с их информированного согласия для исследования числа копий мтДНК было отобрано 343 ооцита, не оплодотворившихся в программах ВРТ:

группа 1а (n=126) - ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами;

группа 1б (n=108) ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами;

группа 2 (n=109) - морфологически нормальные ооциты.

Для решения задачи 5 были включены 84 супружеские пары:

группа 1а (n=28) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС;

группа 1б (n=28) пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС;

группа 2 (n=28) - пациентки с морфологически нормальными ооцитами, прошедшие ПГС.

Для решения задачи 6 были включен 112 супружеских пар:

группа 1а(1) (n=28) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС;

группа 1а(2) (n=139) пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС;

группа 1б(1) (n=28) – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС;

группа 1б(2) (n=97) – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС.

2.9. Методы исследования

Перед вступлением в программу ЭКО все пациентки были обследованы в амбулаторных условиях. Обследование включало обязательные методы исследования, специальные методы исследования, а также исследования по медицинским показаниям. Все обследования в рамках проводимого исследования, за исключением ультразвукового исследования (УЗИ) органов малого таза, проводились однократно (Таблица 1).

Обязательные исследования для обоих супругов включали:

определение антител к бледной трепонеме в крови (RW), антител класса M, G к вирусу иммунодефицита человека 1, 2 (ВИЧ 1,2), к антигену вирусного гепатита В и С (HBs-Ag, HCV);

микроскопическое исследование отделяемого половых органов на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, на грибы рода кандида, паразитологическое исследование на атрофозоиты трихомонад;

исследование соскоба из цервикального канала на хламидии, микоплазму и уреаплазму методом полимеразной цепной реакции (ПЦР);

исследование соскоба из цервикального канала на вирус простого герпеса 1, 2, цитомегаловирус методом ПЦР;

Определение кариотипа супругов, медико-генетическое консультирование.

Обязательные исследования для женщин включали:

Общеклинический анализ крови;

биохимический анализ крови;

гемостазиограмму;

определение групповой и резус-принадлежности крови;

общий анализ мочи;

количественный анализ антител класса M, G к вирусу краснухи в сыворотке крови;

цитологическое исследование соскоба эндоцервикса и экзоцервикса;

ультразвуковое исследование органов малого таза на 5-8 день менструального цикла;

флюорографию;

электрокардиографию (ЭКГ);

заключение терапевта о наличии или отсутствии противопоказаний для проведения программы ЭКО/ПЭ;

УЗИ молочных желез (до 35 лет) или маммографию (после 35 лет);

УЗИ щитовидной железы;

гормоны крови (на 2-3 день менструального цикла): ЛГ, ФСГ, эстрадиол, тиреотропный гормон (ТТГ), свободный тироксин (Т4св), дегидроэпиандростерон-сульфат, пролактин, соматоторопный гормон, кортизол, тестостерон, АМГ;

–  –  –

При первичной консультации производили сбор анамнестических данных у пациенток, который включал возраст, этническую принадлежность, место проживания, образование, наличие или отсутствие работы, наличие профессиональных вредностей, курения и других «вредных привычек», семейное положение. Полученные данные вносили в индивидуальную карту пациента.

При первичном осмотре измеряли рост, вес пациентки, артериальное давление (АД) и пульс, оценивали состояние и распределение подкожной жировой клетчатки (наличие ожирения, стрий), проводили осмотр и пальпацию молочных желез, щитовидной железы и органов брюшной полости. Большое внимание уделяли оценке акушерско-гинекологического анамнеза: оценивали менструальную функцию, наличие или отсутствие нарушений менструального цикла в анамнезе, паритет, число своевременных и преждевременных родов в анамнезе, число самопроизвольных прерываний беременности на ранних сроках гестации, наличие осложнений во время беременности и родов. Также выясняли перенесенные гинекологические заболевания, объем перенесенных оперативных вмешательств на органах малого таза. Оценивали наличие перенесенных инфекционных и соматических заболеваний, оперативных вмешательств. У каждой женщины был собран семейный анамнез.

У каждой женщины уточняли данные о продолжительности бесплодия, а также о проведенных диагностических и лечебных мероприятиях. Отмечали наличие или отсутствие программ ВРТ в анамнезе, а также их особенности (дата и время проведения ВРТ, протокол стимуляции суперовуляции, количество полученных ооцитов, количество полученных эмбрионов и их качество, качество эмбрионов при переносе в полость матки, исход программы).

Во время гинекологического исследования проводили осмотр наружных половых органов, оценку их развития и анатомических особенностей, а затем осмотр шейки матки в зеркалах. При бимануальном исследовании органов малого таза оценивали размеры, форму и консистенцию тела матки, подвижность и наличие болезненности при пальпации, наличие опухолевидных образований в области придатков матки, а также наличие спаечного процесс в малом тазу.

Сбор анамнеза у мужчины проводили в рамках медико-генетического консультирования с заполнением индивидуальной карты пациента. Уточняли возраст пациента, наличие или отсутствие профессиональных вредностей, наличие соматических и инфекционных заболеваний в анамнезе. Также оценивали анамнез бесплодия у пациента, количество браков и наличие детей в предыдущих браках, длительность бесплодия и произведенные методы лечения.

2.9.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза

УЗИ органов малого таза выполняли в отделении функциональной диагностики ФГБУ «НЦАГиП им. В. И. Кулакова» Минздрава России (заведующий - профессор А.И. Гус). Впервые УЗИ проводили в первую фазу (5-8 день) менструального цикла, предшествующего циклу стимуляции функции яичников. Оценивали размер и структуру тела матки, толщину и структуру эндометрия, размеры и объем яичников, количество антральных фолликулов в обоих яичников, наличие или отсутствие объемных образований в полости малого таза.

Впоследствии УЗ-мониторинг проводили на 2-3 день менструального цикла, в день начала стимуляции функции яичников, на 6-й день стимуляции функции яичников, и затем ежедневно до введения триггера овуляции. Во время УЗ-мониторинга проводили оценку динамики фолликулогенеза и ответа эндометрия на стимуляцию функции яичников, для своевременной возможности коррекции дозы вводимых экзогенно гонадотропинов, а также с целью определения даты введения антагониста гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРГ) и даты введения триггера овуляции, а значит и даты трансвагинальной пункции яичников. В дальнейшем УЗИ органов малого таза выполняли на 21 день после ПЭ в полость матки при наличии положительного результата -хорионического гонадотропина (-ХГ), с целью визуализации плодного яйца в полости матки. Повторное УЗИ органов малого таза проводили через 5-6 недель после ПЭ в полость матки с целью определения сердцебиения эмбриона.

2.9.3. Гормональное исследование

Целью гормонального исследование перед программой ЭКО явилась оценка овариального резерва и функционального состояния эндокринной системы. Для этого проводили анализ крови пациенток в научнодиагностической лаборатории ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова»

Минздрава России (заведующий - к.м.н. Т.Ю. Иванец). Для этого использовался радиоиммунологический метод определения концентрации гормонов в крови (тест-системы «Hoffmann – La Roche, Ltd.» Швейцария).

Гормональное исследование осуществлялось в период ранней фолликулярной фазы (2-3 день менструального цикла) в цикле, предшествующем стимуляции функции яичников.

2.9.4. Исследование эякулята

Пациентам перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ проводили анализ эякулята. Эякулят собирался путем мастурбации после 3-4 дней полового воздержания в стерильный пластмассовый контейнер для сбора эякулята.При анализе эякулята определяли характеристики клеточных элементов: концентрацию сперматозоидов, их подвижность, наличие

–  –  –

Для оценки патологии эякулята руководствовались следующими критериями:

аспермия – отсутствие эякулята;

азооспермия – отсутствие сперматозоидов в эякуляте;

олигозооспермия – снижение концентрации сперматозоидов ниже 15 млн/мл;

астенозооспермия – снижение подвижности сперматозоидов ниже нормальных значений (общая подвижность 40%, сперматозоиды с прогрессивным движением 32%);

тератозооспермия – повышение количества сперматозоидов с аномальной морфологией (96%);

олигоастенотератозооспермия — сочетание олигозооспермии, астенозооспермии и тератозооспермии;

астенотератозооспермия (АТ) – сочетание астенозооспермии и тератозооспермии;

олиготератозооспермия (ОТ) – сочетание олигозооспермии и тератозооспермии;

олигоастенозооспермия (ОА) – сочетание олигозооспермии и астенозооспермии.

2.9.5. Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция фолликулов Стимуляцию функции яичников проводили по протоколу с ант-ГнРГ, модифицированному протоколу с ант-ГнРГ, «короткому» протоколу с агонистами гонадотропин рилизинг-гормона (а-ГнРГ), «длинному»

протоколу с а-ГнРГ. У части пациенток ооциты были получены в результате проведения программы ЭКО в естественном цикле, без стимуляции функции яичников. Стимуляция функции яичников проводилась во всех типах протоколов препаратами рекомбинантного ФСГ или комбинированного препарата рекомбинантного ФСГ и ЛГ. Доза препарата подбиралась индивидуально в зависимости от возраста пациентки, наличия в анамнезе оперативных вмешательств на яичниках, данных гормонального исследования и количества антральных фолликулов по данным УЗисследования. После проведения УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препаратов гонадотропинов.

При проведении протокола с ант-ГнРГ введение экзогенных гонадотропинов начинали со 2-3 дня менструального цикла. При достижении лидирующим фолликулом диаметра 14 мм начинали введение ант-ГнРГ с целью предупреждения эндогенных паразитарных пиков ЛГ. Затем препарат ант-ГнРГ вводили ежедневно, включая день назначения триггера овуляции.

При проведении модифицированного протокола перед началом введения гонадотропинов вводили препарат ант-ГнРГ с целью синхронизации фолликулярного пула. В протоколах с ант-ГнРГ триггер овуляции вводили при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17 мм. В качестве триггера овуляции использовали человеческий хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе 8 000 – 10 000 МЕ, а при риске развития синдрома гиперстимуляции яичников (при наличии более 15 доминантных фолликулов в обоих яичниках в день назначения триггера овуляции) – а-ГнРГ в дозе 0,2 мг или сочетание а-ГнРГ с низкими дозами ХГ (1500 МЕ).

При проведении «длинного» протокола с а-ГнРГ введение а-ГнРГ в виде дейли-форм ежедневно начинали с 21-го дня менструального цикла, предшествующего началу стимуляции функции яичников, а введение гонадотропинов начинали со 2-3 дня менструального цикла.

При проведении «короткого» протокола с а-ГнРГ введение а-ГнРГ в виде дейли-форм ежедневно начинали одновременно с введением гонадотропинов со 2-3 дня менструального цикла. В протоколах с а-ГнРГ триггер овуляции вводили при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17 мм, в качестве триггера овуляции использовали ХГ в дозе 8 000

– 10 000 МЕ.

При проведении программы ЭКО в естественном цикле УЗ-мониторинг осуществляли на 4-5 и 7-8 дни менструального цикла с целью визуализации доминантного фолликула, а затем ежедневно для определения времени назначения триггера овуляции. Триггер овуляции, в качестве которого применяли ХГ в дозе 3 000 МЕ, назначали при диаметре доминантного фолликула 17 мм.

Трансвагинальную пункцию (ТВП) яичников осуществляли в малой операционной с применением кратковременного внутривенного обезболивания. ТВП и аспирацию фолликулярной жидкости производили под ультразвуковым контролем, с использованием одноразовых пункционных игл. Полученную фолликулярную жидкость помещали в стерильные подогретые пробирки, содержащие 0,5 мл гепарина (2500 ЕД/мл).

2.9.6. Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение Просмотр аспирированной фолликулярной жидкости осуществлялся эмбриологом под контролем стереомикроскопа. Определяли количество полученных ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), после чего ооциты отмывали от фолликулярной жидкости и крови, а затем помещали в стерильные планшеты с культуральной средой для периода предварительной инкубации в течение 2-3 часов.

После окончания предварительной инкубации производили денудирование ооцитов, то есть механическое и энзимное удаление клеток кумулюса из препарата. Вначале ОКК помещали на 20 секунд в раствор гиалуронидазы, затем отмывали от фермента в буферной среде и оставляли на 30 минут в исходной культуральной среде. Оставшиеся клетки кумулюса удаляли механическим путем. После энзимной и механической обработки ооцитов оценивали степень зрелости клеток:

если в цитоплазме клетки визуализируется ядро и отсутствует полярное тельце - ооцит находится на стадии зародышевого пузырька (GV-germinal vesicle), что соответствует профазе первого мейотического деления;

если в цитоплазме клетки отсутствует ядро и отсутствует полярное тельце

- ооцит находится на стадии метафазы первого мейотического деления (MI);

наличие полярного тельца в перивителлиновом пространстве свидетельствует о завершении процессов созревания ооцита и достижения второго мейотического деления (MII).

На данном этапе эмбриолог проводил морфологическую оценку ооцитов и выявление цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов. К цитоплазматическим дисморфизмам относили наличие в цитоплазме ооцита центральной гранулярности, вакуолей различного диаметра, аномальных агрегатов ГЭР, рефрактерных телец, а также цитоплазмы темного цвета. Центральная гранулярность представляет собой темную губчатую зернистую область в цитоплазме ооцита. Вакуоли - это цитоплазматические включения, окруженные мембраной и содержащие жидкость. Аномальные агрегаты ГЭР располагаются в центральной части ооцита и представляют собой круглые полупрозрачные образования.

Рефрактерные тельца – это мелкие светлые включения в цитоплазме ооцита, как правило, множественные. Темный цвет цитоплазмы - значительное изменение цвета всей цитоплазмы ооцита.

К экстрацитоплазматическим дисморфизмам относили изменение ширины перивителлинового пространства и наличие в нем гранулярности, аномалии первого полярного тельца, а также деформацию или утолщение зоны пеллюцида ооцита.

Параллельно с очисткой ооцитов производили центрифугирование, флотирование и обработку спермы супруга. Все зрелые ооциты подвергали оплодотворению методом ИКСИ.

После проведения оплодотворения методом ИКСИ ооциты переносили в культуральную среду для дальнейшего культивирования. Нормальное оплодотворение регистрировали при наличии двух симметричных по размеру пронуклеусов в цитоплазме через 16-18 часов после проведения ИКСИ. В случае наличия одного или трех и более пронуклеусов в цитоплазме оплодотворение расценивали как аномальное. При отсутствии пронуклеусов в цитоплазме ооцита ооцит считали неоплодотворившимся. Этап культивирования был произведен с использованием сред культивирования COOK (Австралия).

2.9.7. Исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах Ооциты, неоплодотворившиеся после проведения ИКСИ, в которых не наблюдались признаки дробления через 40 часов после оплодотворения, отбирали для исследования числа копий мтДНК. В асептических условиях с использованием инвертированного микроскопа ооциты отмывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (phosphatebufferedsaline, PBS), а затем помещали в индивидуальные пробирки, содержащие PBS. Определение абсолютного числа копий мтДНК осуществляли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Для этого из каждого отдельного ооцита выделяли ДНК.

Клетки лизировали буфером с додецил сульфатом натрия (sodium dodecylsulfate, SDS) (10мМ EDTA, 1% SDS, 50мМ Tris-HCl, pH 7,5) в течение 5 минут. После этого осуществляли осаждение ДНК изопропанолом в присутствии дрожжевой тРНК (YeasttRNA, Ambion) в качестве соосадителя при -20С в течение 30 минут. Далее осадок промывали 70 этанолом, высушивали, и ресуспендировали в воде. Весь объём (10 микролитров) полученного раствора ДНК сразу использовали для проведения ПЦР.

Для подсчёта копий мтДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зонда к митохондриальному гену субъединицы 1 NADHдегидрогеназы (NADHdehydrogenase, subunit 1) (прямой праймер:

CCACATCTACCATCACCCTC; обратный праймер:

TAGAATAAATAGGAGGCCTAGGTT; зонд: R6G ATC ACC GCC CCG ACC

TTA GCT CTC A BHQ1). Для получения результата ПЦР в виде абсолютного числа копий гена субъединицы 1 NADHдегидрогеназы во время каждого запуска использовали калибровочные растворы плазмид (107 копий/10 мкл, 105 копий/10 мкл, 103 копий/10 мкл) с заклонированным соответствующим ампликоном. Реакцию проводили в амплификаторе RealTimePCRDetectionSystemCFX96 (BioRad, США) с набором для ПЦР (М-428, Синтол, Россия) по следующей программе: 95С - 3 мин, (60С-30 сек/95С-10 сек) 45 циклов. Детекцию флуоресценции осуществляли в канале, соответствующем флуорохрому зонда (R6G). Полученные данные флуоресценции были пересчитаны в абсолютное количество копий при помощи программного обеспечения амплификатора CFX96 BioRad.

–  –  –

Морфологическую оценку эмбрионов проводили через 72 часа после аспирации ооцитов. Оценивали количество имеющихся бластомеров, симметричность дробления, а также процент суммарной фрагментации цитоплазмы [149]. Учитывая морфологические характеристики эмбрионов, эмбрионы были классифицированы на 4 группы:

класс А - размер бластомеров примерно одинаков, фрагментации цитоплазмы нет или фрагментация не превышает 5%;

класс В - размер бластомеров примерно одинаков, фрагментация не более 10%;



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
 

Похожие работы:

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«Платонова Ирина Александровна ПОСТПИРОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ НАДЗЕМНОЙ ФИТОМАССЫ В СОСНЯКАХ СЕЛЕНГИНСКОГО СРЕДНЕГОРЬЯ Специальность 06.03.02 – Лесоведение и лесоводство, лесоустройство и лесная таксация ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., с.н.с. Г.А. Иванова Красноярск – 2015...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.