WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

федеральное государственное бюджетное учреждение

«НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ

И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА»

На правах рукописи

СЫРКАШЕВА

Анастасия Григорьевна

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ

ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ

14.01.01- акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Долгушина Н.В.

кандидат биологических наук Макарова Н.П.

Москва 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………5 ГЛАВА 1 Современные методы лечения бесплодия у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин (обзор литературы) ……………..…13

1.1 Влияние качества ооцитов на эффективность ВРТ………………..……..13

1.2 Генез и факторы риска анеуплоидии ооцитов………………….......……..17

1.3 Современные возможности преимплантационного генетического скрининга…………………………………………………………………….22

1.4 Митохондриальная ДНК ооцитов и фертильность женщины…….......….27

1.5 Влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на эффективность программ ВРТ………………………………………………………………..32 ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования…………………..…………41

2.1 Дизайн исследования для задачи 1……………………………………....…41

2.2. Дизайн исследования для задачи 2……………………..………………….42

2.3 Дизайн исследования для задачи 3…………………………………………44

2.4 Дизайн исследования для задачи 4…………………………………………45

2.5 Дизайн исследования для задачи 5…………………………………………46

2.6 Дизайн исследования для задачи 6…………………………………………47

2.7 Критерии включения и исключения………………………………………..48

2.8 Расчет объема выборки……………………………………………………...49

2.9 Методы исследования……………………………………………………….51 2.9.1 Общеклинические методы исследования………………………………...54 2.9.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза……………………55 2.9.3 Гормональное исследование……………………………………………...56 2.9.4 Исследование эякулята……………………………………………………56 2.9.5 Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция фолликулов………………………………………………………………………58 2.9.6 Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение…………………..60 2.9.7 Исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах...62 2.9.8 Морфологическая оценка эмбрионов…………………………………….63 2.9.9. Преимплантационный генетический скрининг…………………………63 2.9.10 Перенос эмбрионов в полость матки и ведение посттрансферного периода………………………………………………………………………...…65

2.10 Статистическая обработка данных………………………………………..66 ГЛАВА 3. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с различными дисморфизмами ооцитов………68

3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пар, включенных в исследование……………………………………………………………………..68

3.2 Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование…………………………………………………………………….75

3.3 Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изученных группах………………………………………………………………77

3.4 Многофакторный анализ шансов развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от изученных предикторов……………………………………….78

3.5 Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения………………………………………………82 ГЛАВА 4. Изучение генеза влияния дисморфизмов на исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий…………………………..92

4.1. Изучение числа копий митохондриальной ДНК в ооцитах человека с различными дисморфизмами…………………………………………………..92

4.2 Клинико-анамнестические характеристики супружеских пар, включенных в исследование…………………………………………………………………..95

4.3 Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование……………………………………………………………………101

4.4. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изучаемых группах……………………………………………………………..103

4.5 Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения…………………………………………….104

4.6 Преимплантационный генетический скрининг у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток: анализ затраты-эффективность……111

4.7 Клинико-экономический анализ эффективность ПГС для пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток………………………………………...115 ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов…………………………120 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….140 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………….....142 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ……………144 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………..….147

ВВЕДЕНИЕ

–  –  –

Качество половых клеток в циклах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является ключевым фактором успеха. Именно от зрелости ооцита и сперматозоида, как структурной, так и морфологической, зависит наступление беременности и рождение здорового ребенка.

В последнее время в литературе активно обсуждается взаимосвязь между качеством полученных при стимуляции суперовуляции ооцитов и неудачными исходами циклов ВРТ [1]. Аномалии яйцеклеток могут быть разделены на две группы: экстрацитоплазматические и цитоплазматические.

К цитоплазматическим аномалиям, наблюдаемым при световой микроскопии ооцита, относят центральную гранулярность цитоплазмы клетки, появление в цитоплазме аномальных агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР), вакуолей, рефрактерных телец, а также наличие темной цитоплазмы клетки. К экстрацитоплазматическим аномалиям относят изменение ширины перивителлинового пространства и появление в нем гранулярности, деформацию мембран оолеммы, а также аномалии строения первого полярного тельца [2]. Получены данные о том, что вышеперечисленные аномалии цитоплазмы, определяющие цитоплазматическую зрелость ооцита, оказывают особое влияние на оплодотворение и дальнейшее развитие эмбриона [3]. При этом окончательно не определена роль каждого из этих нарушений в дальнейшем развитии эмбриона, и не известны клинические предикторы их развития.

Нарушения цитоплазматической организации могут влиять на процесс оплодотворения и дальнейшее развитие эмбриона, которые не преодолеваются методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ, от англ. – ICSI - IntraCytoplasmic Sperm Injection). Появление вышеуказанных дисморфизмов ооцитов связывают с развитием генетических, эпигенетических или метаболических нарушений в клетках [4].

Частота генетических нарушений в ооцитах (анеуплоидии) достигает, по данным некоторых авторов, 47,5% [5]. При наличии анеуплоидии в ооцитах наблюдается высокий риск анеуплоидии у эмбрионов [6]. Выявление хромосомных аномалий ооцита возможно лишь при оценке полярного тела, биопсия которого может негативно влиять на последующее деление эмбриона [7]. Именно поэтому поиск ооцитарных морфологических предикторов анеуплоидии эмбрионов является весьма актуальной проблемой.

Метаболические явления в ооцитах являются важным фактором, способствующим правильному оплодотворению яйцеклетки и дальнейшему развитию эмбриона [8], [9]. Ооциту требуется большой объем энергии, чтобы осуществились такие важные биологические процессы, как формирование веретена деления, правильное расхождение хромосом, а также деление клетки после оплодотворения. До момента имплантации развивающаяся зигота зависит от существующего пула митохондрий, который уменьшается с каждым циклом деления клеток. Известно, что митохондрии ооцитов, полученных от женщин старшего репродуктивного возраста, содержат делеции ДНК, которые могут нарушать их функционирование. Сочетание уменьшенного числа митохондрий и повышенной частоты мутаций и делеций может привести к неадекватной активности митохондрий, и затем к отсутствию беременности. В последнее время активно изучалась роль митохондриального аппарата в развитии ооцитов и эмбрионов животных Лучшее понимание морфофункционального состояния [10], [11].

митохондриального аппарата ооцитов и эмбрионов ранней стадии развития, возможно, позволит выявить новые предикторы оценки их качества.

Использование преимплантационного генетического скрининга (ПГС) предотвращает перенос эмбрионов с аномальным числом хромосом (числовое нарушение кариотипа, анеуплоидии) и позволяет осуществить селекцию генетически полноценных эмбрионов, что в клинической практике ВРТ приводит к увеличению частоты наступления беременности, уменьшению репродуктивных потерь и снижению риска рождения детей с генетической патологией. Оценка клинико-экономической эффективности проведения ПГС необходима для выбора правильной тактики ведения для данной группы пациентов ВРТ.

Цель исследования

Целью исследования является повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с дисморфизмами ооцитов на основании морфологической оценки качества ооцитов, изучения числа копий митохондриальной ДНК и клинико-экономического анализа преимплантационного генетического скрининга.

Задачи исследования

Изучить клинико-анамнестические данные и выявить факторы 1.

риска развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ВРТ.

Оценить распространенность различных дисморфизмов ооцитов 2.

в программах вспомогательных репродуктивных технологий.

Провести сравнительный анализ результатов программ ВРТ у 3.

супружеских пар с дисморфизмами ооцитов (параметров фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре).

Исследовать число копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в 4.

неоплодотворившихся ооцитах с различными дисморфизмами у пациенток программ ВРТ.

Изучить риск развития анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y в 5.

ядрах бластомеров у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов.

Оценить клинико-экономическую эффективность 6.

преимплантационного генетического скрининга в исходах программ ВРТ у пациенток с дисморфизмами ооцитов.

–  –  –

В ходе проведения исследования были получены следующие новые знания:

Было оценено влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на параметры раннего эмбрионального развития и исходы программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием с расчетом скорректированного отношения шансов наступления беременности в зависимости от вида дисморфизмов ооцитов.

Было изучено влияние различных способов стимуляции суперовуляции и клинико-анамнестических факторов на риск развития различных дисморфизмов ооцитов в программах ВРТ с созданием моделей прогноза развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от выявленных факторов риска.

Было исследовано число митохондрий путем оценки числа копий мтДНК в ооцитах с различными видами морфологических изменений.

Была определена степень риска анеуплоидии в ядрах бластомеров в зависимости от наличия и вида дисморфизмов ооцитов.

Была изучена эффективность, в том числе клинико-экономическая эффективность, преимплантационного генетического скрининга в реализации программ ВРТ у пациентов с различными видами дисморфизмов ооцитов у женщин.

–  –  –

В результате проведенного исследования была обоснована значимость морфологической оценки качества ооцитов у пациенток программ ВРТ и выделены группы риска пациенток с наличием ооцитов с различными видами морфологических изменений.

Были созданы модели прогноза развития дисморфизмов ооцитов на основании выявленных клинико-анамнестических и ятрогенных факторов риска, которые могут быть использованы в качестве прогностических критериев эффективности программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием.

Был проведен анализ затраты - эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH у супружеских пар с различными видами дисморфизмами ооцитов, что послужило обоснованием его применения в изучаемой группе пациентов с учетом клинической и экономической составляющих.

Положения, выносимые на защиту

Морфологические изменения ооцитов, особенно 1.

цитоплазматические дисморфизмы, увеличивают риск неудачных исходов программ ВРТ. Значимыми клинико-лабораторными факторами риска развития дисморфизмов ооцитов являются возраст пациентки, уровень антимюллерового гормона и уровень свободного тироксина. Значимым ятрогенным фактором риска является применение агонистов гонадотропин рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции суперовуляции.

Возможными причинами неэффективности программ ВРТ у 2.

пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов могут быть хромосомные или метаболические нарушения в половых клетках. Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными ооцитами, а получение и перенос эмбрионов с различными видами анеуплоидий, полученных при их оплодотворении, осуществляется в 3,6 раз чаще.

Проведение преимплантационного генетического скрининга 3.

методом FISH неэффективно у пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, а в группе пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов увеличивает эффективность программ ВРТ в 1,4 раза, что объясняется переносом в полость матки эуплоидных по 13, 18, 21, X и Y хромосомам эмбрионов. Клинико-экономическая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH в лечении бесплодия у супружеских пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%.

Личный вклад автора

Автор участвовал в выборе темы научной работы, разработке цели и задач исследования, в проведении и интерпретации результатов морфологического исследования качества ооцитов, молекулярноцитогенетических исследований, в обобщении и статистической обработке полученных данных. Автором лично осуществлялось обследование и ведение супружеских пар на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО/ПЭ).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

–  –  –

Основные положения работы доложены на ХV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014), VII регионарном форуме «Мать и дитя»

(Геленджик, 2014), XXIV Международной конференции РАРЧ (Москва, Всероссийском конгрессе с международным участием 2014), XXI «Амбулаторно-поликлиническая помощь: от менархе до менопаузы»

(Москва, 2015).

Работа доложена на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 1 июня 2015 г.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (заведующий д.м.н. Калинина Е.А.) и лаборатории репродуктивной генетики (заведующий д.м.н. профессор Бахарев В.А.) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.

Кулакова» Минздрава России (директор академик РАН Сухих Г.Т.).

Материалы и результаты исследования включены в лекции и практические занятия для клинических ординаторов и аспирантов ФГБУ «НЦАГиП им.

В.И. Кулакова» Минздрава России. Результаты исследования изложены в 18 печатных работах, из которых 9 напечатаны в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК: в двух обзорных статьях, одном описании клинического случая и шести оригинальных статьях, опубликованных в журналах «Акушерство и гинекология» (импакт-фактор 0,617), «Гинекология» (импакт-фактор 0,465), «Проблемы репродукции» (импактфактор "Цитология" (импакт-фактор «Молекулярная 0,385), 0,507), медицина» (импакт-фактор 1,513).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена в традиционной форме. Состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа представлена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками 32 таблицами. Библиографический указатель включает 13 работ на русском языке и 155 работ на английском языке.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ У

СУПРУЖЕСКИХ ПАР С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ У

ЖЕНЩИН (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Влияние качества ооцитов на эффективность программ ВРТ 1.1.

Бесплодие – это нарушение функции репродуктивной системы, клинически проявляющееся неспособностью супружеской пары добиться беременности в течение как минимум одного года половой жизни без использования контрацепции [12], [13]. Бесплодие может быть обусловлено функциональными или анатомическими нарушениями женской репродуктивной системы (в 35-45% случаев), мужским фактором (в 20-40% случаев), сочетанным генезом (в 20-30% случаев). В некоторых случаях причина бесплодия остается неизвестной [14], [15]. Основными причинами женского бесплодия являются отсутствие или нарушение проходимости маточных труб, отсутствие овуляции, а также наружный гениальный или внутренний эндометриоз. Мужской фактор бесплодия обусловлен нарушениями сперматогенеза, приводящими к отсутствию или снижению концентрации сперматозоидов, повышению доли морфологически аномальных форм, снижению подвижности сперматозоидов, и соответственно, их оплодотворяющей способности. Также бесплодие у мужчин может быть обусловлено нарушением транспорта сперматозоидов по семявыносящим протокам.

Тактика ведения супружеских пар с бесплодием индивидуальна.

Основными методами лечения являются модификация образа жизни супругов, медикаментозное и/или хирургическое лечение заболеваний, лежащих в основе бесплодия, а при неэффективности данных мероприятий – применение методов вспомогательных репродуктивных технологий.

В настоящее время к методам ВРТ относятся:

внутриматочная инсеминация спермой мужа (партнера) или донорской спермой;

экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки;

криоконсервация и/или витрификация эмбрионов, ооцитов и спермы;

интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида, а также интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормальным сперматозоидом (ИМСИ);

программы суррогатного материнства, а также донорство спермы, ооцитов и эмбрионов;

преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) и преимплантационный генетический скрининг [16].

Основной целью программ ЭКО является наступление одноплодной беременности и рождение здорового ребенка при переносе минимального числа эмбрионов в полость матки. Программа ЭКО включает в себя несколько этапов:

стимуляция суперовуляции;

трансвагинальная пункция яичников и аспирация фолликулярной жидкости, содержащей ооцит-кумулюсные комплексы;

селекция и оплодотворение ооцитов;

культивирование эмбрионов с последующим переносом эмбриона/ов в полость матки реципиента;

Первостепенным фактором, определяющим вероятность наступления клинической беременности и рождения здорового ребенка в результате программы ЭКО, является качество полученных эмбрионов. Разработка схем культивирования эмбрионов до пятых суток развития (стадия бластоцисты) способствовала повышению результативности программ ВРТ при снижении числа переносимых эмбрионов. Культивирование до стации бластоцисты, вопервых, представляет больше возможностей для отбора «лучших»

эмбрионов, обладающих максимальным потенциалом к имплантации и дальнейшему развитию, а, во-вторых, делает перенос адекватным моменту физиологического попадания эмбрионов в «имплантационное окно». Тем не менее, несмотря на все достижения последних десятилетий в области клинической репродуктологии, эмбриологии и генетики, судьба эмбриона прежде всего зависит от исходного качества гамет, а именно их морфологической и структурной зрелости [17]. В опытах на ооцитах и эмбрионах млекопитающих было показано, что качество ооцита играет более важную роль, чем качество сперматозоида [18], [19].

Активация собственного генома эмбриона человека происходит на 3 сутки после оплодотворения на 8-клеточной стадии, когда начинают работать более 4000 генов, которые обеспечивают дальнейшее дробление, компактизацию, формирование бластоцисты, имплантацию и все последующее развитие эмбриона [20]. Однако до этого момента важны накопленные в течение оогенеза продукты — мРНК, протеины, субстраты, питательные вещества, которые аккумулируются в ооците. Именно поэтому для оплодотворения и развития эмбриона первостепенное значение имеет именно качество ооцита.

Клинические испытания подтверждают данные фундаментальных исследований. Использование донорских ооцитов является эффективным методом лечения бесплодия, позволяющим добиться наступления беременности и рождения здорового ребенка женщинам с низким овариальным резервом, независимо от того, вызвано ли снижение функции яичников возрастом, преждевременной недостаточностью яичников или ятрогенными факторами [21], [22]. В мета-анализе, опубликованном в 2013 году американскими авторами, оценивается эффективность программ ВРТ с использованием донорских ооцитов у пациенток с ожирением. По данным литературы, эффективность программ ЭКО у пациенток с нарушениями жирового обмена значительно ниже общепопуляционных значений, что может быть связано с явлениями окислительного стресса в различных тканях и клетках, в том числе ооцитах [23], [24]. Тем не менее, при использовании донорских ооцитов частота наступления беременности, частота ранних репродуктивных потерь и частота живорождений у пациенток с ожирением не отличаются от аналогичных показателей у пациенток с нормальным индексом массы тела (ИМТ) [25]. Испанские авторы в 2014 году опубликовали исследование, посвященное влиянию возраста отцов на исходы программ ЭКО/ИКСИ с использованием донорских ооцитов, проанализировав 4887 циклов ВРТ. Авторы наблюдали статистически значимую корреляцию между увеличивающимся возрастом мужчин и снижением качества спермы, а именно снижением объема, общей концентрации сперматозоидов, общей подвижности сперматозоидов, а также повышением морфологически аномальных форм. Ассоциация возраста мужчин с репродуктивными исходами (частота биохимических и клинических беременностей, частота репродуктивных потерь в I триместре беременности и частота живорождений) была проанализирована с помощью метода логистической регрессии, в качестве конфаундеров рассматривались возраст донора ооцитов, возраст реципиента, состояние спермы (свежая или криоконсервированная), а также число перенесенных в полость матки эмбрионов. Не было получено статистических значимых различий между исходами программ ВРТ и возрастом мужчины [26]. Авторы предполагают, что качественные ооциты молодых женщин совместно с использованием метода ИКСИ способны преодолевать низкий репродуктивный потенциал сперматозоидов возрастных мужчин.

Таким образом, качество ооцитов является одним из основных факторов, ограничивающих как фертильность женщины, так и эффективность лечения бесплодия в целом. Характеристики ооцитов, способные влиять на их качество, могут быть разделены на морфологические, генетические, метаболические и эпигенетические. В рутинной клинической практике лабораторий ЭКО применяется оценка клеток преимущественно по их морфологическим характеристикам и их свойствам во время и после оплодотворения. В данном обзоре литературы будут рассмотрены морфологические, генетические и метаболические характеристики ооцитов.

Эпигенетические характеристики ооцитов на данном этапе практически не изучены, хотя представляют определенный научный интерес.

–  –  –

Анеуплоидии (изменения числа хромосом) являются самыми распространенными вариантами хромосомных аномалий у человека, а также основной генетической причиной потерь беременности и рождения детей с врожденными дефектами, как при естественном зачатии, так и при применении ВРТ. Анеуплоидии являются результатом ошибок мейоза.

Известно, что большинство хромосомных нарушений в ооцитах возникают вследствие неправильного расхождения хромосом в анафазе I деления мейоза. Исследования гаметогенеза у человека показали, что оогенез значительно более подвержен ошибкам мейоза, чем сперматогенез [27], [28].

По данным литературы, распространенность анеуплоидии по 13, 18, 21, X, Y хромосомам в нормальной или субфертильной сперме не превышает 0,6% [29], а распространенность анеуплоидии по 24 хромосомам не превышает 5%, хотя при наличии патозооспермии, особенно тератозооспермии, распространенность анеуплоидии может возрастать в 4-5 раз [30], [31].

Появление процедуры ИКСИ сделало возможным получение эмбрионов даже при наличии тяжелой формы патозооспермии у мужчин, которая препятствует наступлению спонтанной беременности, что привело к более широкому распространению эмбрионов с отцовскими анеуплоидиями [32], [33], [34].

Оценка хромосомного набора ооцита возможно только при проведении оплодотворения in vitro и генетическом исследовании полярного тельца. По данным литературы, средний уровень анеуплоидии в ооцитах, полученных в естественных циклах, составляет около 20% [35]. Данные литературы о распространенности анеуплоидии в ооцитах в стимулированных циклах варьируют в широком диапазоне (20-70%), при этом наблюдается четкая прямая связь между возрастом пациентки и долей анеуплоидных ооцитов [6].

С помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) было показано, что у женщин старше 40 лет доля ооцитов с анеуплоидиями превышает 0,5 [36]–[38].

Возможной причиной большей предрасположенности к анеуплоидии именно ооцитов, а не сперматозоидов, являются различия между гаметогенезом у мужчин и женщин [27], [39]. Сперматогенез у мужчин является непрерывным процессом, в то время как женщины рождаются с законченным набором незрелых ооцитов, находящихся в пассивном состоянии, и процесс созревания завершается только в естественном или экзогенно стимулированном овуляторном менструальном цикле.

У обоих полов основой мейоза служит репликация ДНК в родительской клетке, за которой следуют два цикла деления ядра и клетки, известные как первое деление мейоза (мейоз I) и второе деление мейоза (мейоз II), которые приводят к образованию гаплоидных гамет. В профазе I гомологичные хромосомы выстраиваются в ряд, образуют хиазмы (точки перекреста), а затем происходит кроссинговер, необходимый для образования новых генных комбинаций. Также в течение профазы I происходит дезинтеграция ядрышек и ядерных оболочек клетки, и образуются нити веретена деления. В метафазе I пары хромосом выстраиваются у экватора веретена деления, прикрепляясь к нитям центромерами (центромеры – точки соединения хромосом). В анафазе I микротрубочки сокращаются, в результате чего нити веретена тянут гомологичные хромосомы к противоположным полюсам веретена деления. В анафазе I хромосомы разделяются на два гаплоидных набора, по одному на каждом полюсе веретена деления. В результате мейоза I деления гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам веретена деления. При этом число хромосом уменьшается вдвое, но они состоят из двух хроматид каждая. В результате кроссинговера возникают новые генные комбинации, и хроматиды неидентичны. Результатом мейоза II, которое по структуре сходно с митотическим делением, является образование гаплоидных дочерних клеток.

В процессе сперматогенеза мейотическое деление клеток происходит постоянно, начиная со времени полового созревания, и затем в течение всей жизни мужчины. В женском организме первое мейотическое деление начинается во время эмбрионального развития – в него вступают примордиальные зародышевые клетки, образовавшиеся в результате митоза (примерно с 20-й недели гестации), а затем мейоз останавливается на стадии профазы I [40].

В дальнейшем мейотическое деление продолжается только в результате овуляторного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) у девочки, достигшей полового созревания. Для большинства ооцитов финальная стадия мейоза никогда не наступает, а для остальных овуляторный пик ЛГ происходит спустя годы и десятилетия. Длительный временной интервал между началом и остановкой мейоза во время эмбрионального развития женского организма и окончанием мейоза во время овуляторных циклов является наиболее вероятной причиной высокой частоты хромосомных нарушений в ооцитах.

Расхождение хромосом в течение мейотического деления в целом является точно скоординированным биологическим процессом, и ошибки возникают достаточно редко. К примеру, у дрожжевых грибов только 1 из 100 000 делений ассоциировано с нарушением расхождения хромосом.

Анеуплоидии в гаметах млекопитающих, например грызунов, встречаются значительно чаще, их распространенность составляет от 0,5% до 1,0% [41].

Хромосомный статус человеческих ооцитов в процессе оогенеза и оплодотворения также достаточно хорошо изучен. Известно, что на различных этапах мейоза могут произойти ошибки, которые приведут к несбалансированному распределению хромосом, за счет нерасхождения хромосомы целиком или преждевременного разделения и случайного расхождения сестринских хроматид [42],[43].

Под воздействием овуляторного пика ЛГ возобновляется первое мейотическое деление в ооците, пары хромосом (биваленты) разделяются и мигрируют к противоположным полюсам веретена деления. Один из бивалентов переходит в первое полярное тельце (PB1), в то время как второй остается в цитоплазме ооцита. В норме каждый из бивалентов содержит 23 хромосомы и 46 хроматид, которые соединены между собой специфическими когезионными белками. Данная фаза соответствует второму мейотическому делению, которое завершается только после проникновения сперматозоида в клетку, индукции активации ооцита и выброса второго полярного тельца (PB2). На данном этапе сестринские хроматиды разделяются, и одна из них переходит во второе полярное тельце, а вторая остается в цитоплазме ооцита (рисунок 1).

По данным литературы, существует несколько гипотез, объясняющих механизм патологического расхождения хромосом в течение оогенеза.

Причинами данного состояния, по мнению американских ученых, могут быть неудачи кроссинговера в профазе I мейоза, неправильное расположение хиазм (слишком близко или, наоборот, слишком далеко от центромер), дефекты в формировании веретена деления, а также потери когезионных белков, осуществляющих связь между сестринскими хроматидами [6].

Вторым возможным механизмом является запаздывание хромосом в анафазе первого мейотического деления, которое представляет собой задержку движения одной из хромосом относительно других, обусловленную нарушением ее ориентации. Как правило, отстающие хромосомы не попадают в дочерние клетки и подвергаются разрушению в цитоплазме клетки [44].

Третьим возможным механизмом является гонадный мозаицизм – явление, при котором оогонии исходно являются анеуплоидными, а анеуплоидии возникают в процессе митотического деления на этапах формирования женского организма [45]. Как показали исследования, посвященные изучению хромосомного набора как ооцитов, так и соответствующих им первых полярных телец, гонадный мозаицизм встречается гораздо чаще, чем предполагалось ранее [46], [47]. Наличие в ооците и в соответствующем ему первом полярном тельце некомплементарных анеуплоидий является признаком наличия изменений числа хромосом в оогониях, которые имели анеуплоидии до начала первого мейотического деления. Результатом первого мейотического деления оогоний, имеющих анеуплоидии, становится появление первого полярного тельца и ооцита, один из которых повторяет анеуплоидии, а второй является эуплоидным – именно так возникают некомплементарные анеуплоидии.

–  –  –

Рисунок 1. Возможные причины анеуплоидии в человеческих ооцитах.

Предполагается, что около 30% человеческих эмбрионов имеют хромосомные аномалии в виде анеуплоидии, и этот показатель может значительно увеличиваться у женщин старше 38 лет [4], [48]. Аналогичные тенденции наблюдаются и при изучении эмбрионов, полученных in vitro в программах ЭКО: в 2010 году авторы из Великобритании опубликовали обзор литературы, по данным которого распространенность эмбрионов с анеуплоидиями в циклах ЭКО составляет от 50 до 70% и зависит, прежде всего, от возраста матери [49]. Суммарная частота анеуплоидии в эмбрионах на стадии бластоцисты, по-видимому, ниже, чем в эмбрионах на более ранних стадиях культивирования, но составляет около 50% у женщин старше 37 лет (по данным FISH-диагностики) [50]. Проспективные исследования демонстрируют, что даже в морфологически нормальных бластоцистах анеуплоидии являются широко встречающимся явлением [51]. Кроме возраста матери, факторами риска анеуплоидии ооцитов являются наличие привычного невынашивания беременности [52], [53] и неудачных программ ЭКО в анамнезе [37], [54]. Перенос анеуплоидных эмбрионов приводит к клиническим последствиям в виде повышения частоты прерываний беременности в I триместре гестации [55]. Хотя большинство беременностей анеуплоидным эмбрионом прерываются на очень ранних сроках беременности, некоторые трисомии, а именно трисомии 13, 18, 21 и половых хромосом, совместимы с жизнеспособностью эмбриона. Беременности анеуплоидными эмбрионами приводят к рождению детей с врожденными аномалиями, а также с умственной отсталостью, которые в большинстве случаев приводят к их ранней смерти.

–  –  –

Преимплантационная генетическая диагностика является методом селекции как ооцитов, так и эмбрионов in vitro с целью профилактики рождения детей с врожденными и наследственными заболеваниями. ПГД служит альтернативой пренатальной диагностике и селективному прерыванию беременности на ранних сроках у пар с высоким риском рождения детей с врожденными аномалиями.

Впервые генетическое исследование эмбрионов доимплантационной стадии было проведено в 1968 году с целью определения пола потомства кроликов [56]. В клиническую практику ПГД была внедрена только в 1990 году в качестве экспериментальной процедуры для диагностики моногенных заболеваний, таких как муковисцидоз, а также заболеваний, сцепленных с полом, таких как мышечная дистрофия Дюшена или гемофилия [57], [58].

Вначале технология генетической диагностики на этапе до переноса эмбрионов в полость матки не выглядела перспективной: за первые 3 года использования метода родилось всего несколько здоровых детей, к тому же были подтверждены случаи серьезных ошибок в диагнозе [59], [60]. Тем не менее, после внедрения методики флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и ее использования для диагностики хромосомных нарушений у эмбрионов, число циклов ПГД начало стремительно увеличиваться, и уже через два года использования данной технологии число родившихся здоровых детей превысило сотню [59].

В настоящее время показанием для проведения ПГД является высокий риск врожденных аномалий у потомства, не связанный с носительством известных мутаций. В клинической практике это пары, в которых возраст матери превышает 35 лет, имеющие привычное невынашивание беременности, выраженную патозооспермию у супруга, а также множественные неудачи ЭКО – отсутствие имплантации при переносе эмбрионов, либо неудовлетворительное качество эмбрионов в предыдущих программах. В данной ситуации методика носит название преимплантационного генетического скрининга. Термин преимплантационная генетическая диагностика более точно характеризует ситуации, когда необходимо исключить передачу известной хромосомной аномалии одного из родителей эмбриону.

В качестве материала для генетического исследования могут быть использованы первое или второе полярное тельце ооцитов, один или два бластомера эмбриона 3-х суток культивирования, или клетки трофоэктодермы эмбриона на стадии бластоцисты. В качестве метода исследования в настоящее время используют следующие технологии:

полимеразную цепную реакцию (ПЦР), флуоресцентную гибридизацию in situ, а также метод сравнительной геномной гибридизации (СГГ, от англ.

CGH – comparative genomic hybridization). Метод ПЦР применяется для диагностики мутаций в отдельных генах, что в клинической практике необходимо, во-первых, для диагностики моногенных заболеваний, а, вовторых, для определения антигенов системы тканевой совместимости человека (англ. HLA - Human Leucocyte Antigens) и резус-принадлежности эмбрионов. FISH применятся как для определения пола эмбриона, так и для диагностики хромосомной патологии. Для гибридизации используются индивидуальные ДНК-зонды, которые связываются с комплементарными мишенями в исследуемом образце. FISH-диагностика применяется также для диагностики сбалансированных транслокаций у эмбрионов, но для каждого вида хромосомной патологии требуется изготовление специфичных ДНКзондов. Основным ограничением метода FISH является небольшое число исследуемых хромосом (максимум 12). Для каждой хромосомы используется свой флуоресцирующий краситель – флюорохром, и чем больше их используется в одном препарате, тем больше вероятность наложения сигналов, а, значит, ошибки диагностики. Как правило, в клинической практике данный метод применяется для определений анеуплоидии не более чем 6 хромосом одновременно. Соответственно, при применении FISH не могут быть выявлены аномалии строения хромосом, которые не были подвергнуты исследованию. Метод CGH является альтернативой FISHдиагностике и позволяет проанализировать каждую из 24 хромосом одновременно. Технология CGH была успешно внедрена в клиническую практику для диагностики в онкологии [61], и только потом стала использоваться для ПГС [62]. С помощью CGH возможно диагностировать анеуплоидии, делеции и дупликации, а также несбалансированные транслокации. Однако сбалансированные транслокации или инверсии, а также полногеномные моно- или полиплоидии (например, 69, ХХХ или 23,

Х) не могут быть зафиксированы. Другим ограничением метода является его высокая стоимость.

Как обсуждалось ранее, первое и второе полярные тельца содержат хромосомы и хроматиды, которые были отбракованы в процессе мейотического деления с целью формирования гаплоидного статуса ооцита.

В норме полярные тельца являются точным зеркальным отражением ооцита.

FISH стала первой методикой, которая с успехом применялась для диагностики анеуплоидии 13, 16, 18, 21 и 22 и половой хромосом ооцитов [63], [64], [65]. Также исследование полярных телец ооцитов широко используется для профилактики передачи потомству аутосомно-рецессивных заболеваний и заболеваний, связанных с Х-хромосомой [66], [67], [68], [69].

Метод CGH также применяется для диагностики хромосомной патологии ооцитов путем изучения первого и второго полярных телец, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста, хотя имеются данные, что около 75-80 % выявленных анеуплоидий поражают 13, 16, 18, 21 и 22 хромосомы, а, значит, могут быть выявлены с помощью FISH [70], [5], [71].

Основными ограничениями изучения полярных телец ооцита является невозможность оценить вклад хромосомного набора сперматозоида [72], и выявить аномалии ранних митотических делений эмбриона [73].

Преимуществом данного метода является возможность избежать инвазивного вмешательства в клеточную массу развивающегося эмбриона, так как изучению подвергаются только побочные продукты мейотического деления.

Наиболее широко используемым материалом для проведения ПГС на сегодняшний день являются отдельные бластомеры эмбрионов. Биопсия одного или, редко, двух бластомеров, осуществляется на 3-и сутки культивирования эмбриона, когда эмбрион содержит от 6 до 10 клеток, являющихся тотипотентными, а процесс компактизации еще не начался.

На данной стадии биопсия бластомера не оказывает отрицательного влияния на дальнейшее развитие эмбриона. Эмбрионы продолжают культивирование in vitro до стадии бластоцисты, а селекция бластоцист для переноса в полость матки осуществляется на основании как морфологической оценки эмбриона, так и результатов генетической диагностики. Изучение хромосомного набора бластомеров проводится как методом FISH [74], [75], так и методом CGH Основным преимуществом генетического исследования [76], [77].

бластомеров является возможность проведения переноса эмбрионов в полость матки в исследуемом цикле. Тем не менее, в литературе имеются данные об отсутствии влияния генетической диагностики бластомеров методом FISH на результативность программ ЭКО [78], [79], или даже о снижении частоты наступления беременности после проведения данного вида диагностики [80], [7]. Несомненно, ограничениями исследования бластомеров эмбрионов являются, во-первых, невозможность исключить мозаицизм исследуемых эмбрионов [81], [82], а также их потенциальную способность к самокоррекции [83], [84]. Во-вторых, при проведении диагностики методом FISH изучаются анеуплоидии только тех хромосом, анеуплоидии которых ассоциированы с жизнеспособностью эмбрионов и возможностью рождения живых детей с хромосомной патологией.

Соответственно, использование данной технологии объективно снижает вероятность рождения детей с хромосомной патологией, но не исключает переноса в полость матки эмбрионов, имеющих анеуплоидии по оставшимся хромосомам, которые могут быть ассоциированы с отсутствием имплантации или прерывания имплантации на ранних сроках гестации. Также некоторые ученые не исключают прямого отрицательного влияния процедуры биопсии бластомеров на последующую имплантацию [7].

Одним из наиболее перспективных методов генетической диагностики эмбрионов представляется исследование клеток трофоэктодермы.

Исследование клеток трофоэктодермы проводится, как правило, методом CGH [85], [86] хотя в некоторых исследованиях представлены результаты Преимуществами биопсии бластоцисты FISH-диагностики [87], [88].

являются снижение травматичности для эмбриона, а также большая информативность вследствие исключения мозаичности клеток эмбриона. Тем не менее, биопсия бластоцисты требует сепарации цикла ЭКО и проведения криоконсервации или витрификации исследуемых эмбрионов с целью их криопереноса в последующих циклах после получения результатов диагностики. Для проведения витрификации бластоцист требуется высокий уровень материально-технического оснащения эмбриологической лаборатории, а также увеличиваются финансовые затраты на проведения программы ЭКО.

На настоящий момент имеющиеся в литературе данные о влиянии ПГС на эффективность программ ЭКО, в том числе частоту наступления беременности, частоту живорождений и частоту прерываний беременности на ранних сроках гестации, противоречивы. По данным Кохрановского систематического обзора, нет доказательств в пользу достоверного влияния ПГС на увеличение частоты живорождений [89]. Также четко не определены показания к проведению ПГС, и возможности применения различных методик генетической диагностики у различных групп пациентов.

1.4. Митохондриальная ДНК ооцитов и фертильность женщины Присутствующие во всех эукариотических клетках митохондрии – принципиально важные органеллы, играющие ключевую роль в различных биохимических процессах, включая аэробное дыхание и продуцирование энергии. Предполагается, что митохондрии являются эволюционными реликтами древних бактерий-симбионтов [90], а основным доказательством данной гипотезы служит наличие в митохондриях собственного генома, который носит название митохондриальной ДНК. МтДНК является единственным источником ДНК вне ядра клетки и имеет отличный от ядерной ДНК способ наследования.

Митохондрии представляет собой мембранные органеллы, состоящие из двух мембран – наружной и внутренней, между которыми располагается небольшое внутримембранное пространство.

Внутренняя мембрана образует многочисленные гребневидные складки (кристы), значительно увеличивающие площадь внутренней мембраны. Основной функцией митохондрий является дыхание и продукция аденозинтрифосфата (АТФ), универсального переносчика энергии в клетке путем окислительного фосфорилирования. Кроме того, биологическими функциями митохондрий являются регуляция апоптоза, цитозольной концентрации кальция, а также синтеза железносерных кластеров – белковых кофакторов, играющих важную роль в процессе окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Митохондрии являются первичным источников эндогенных активных форм кислорода и местом протекания важнейших биохимических процессов в клетке – цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса) и фрагмента орнитинового цикла. Окислительное фосфорилирование требует скоординированной работы пяти ферментных комплексов, расположенных на внутренней мембране митохондрий. Электроны, полученные при окислении жирных кислот или глюкозы, переходят от одного энзимного комплекса к другому, создавая, таким образом, электрохимический градиент для протонов на внутренней мембране, который запускает механизм синтеза АТФ из аденозиндифосфата (АДФ) с помощью АТФ-синтазы.

ДНК митохондрий представляет собой кольцевую молекулу ДНК, представленную множеством копий в каждой клетке, имеющей ядро. Геном митохондрий содержит 16 569 пар нуклеотидов, а полное его секвенирование было осуществлено в 1981 году [91], [92]. Митохондриальный геном кодирует в общей сложности 37 генов, которые расположены как на тяжелой (H-цепь, от англ. - heavy, так как содержит больше гуанина) цепи, так и на легкой (L-цепь, от англ. - light, так как содержит больше цитозина). Из всех генов 13 кодируют синтез субъединиц ферментных комплексов дыхательной цепи, еще 22 гена кодируют синтез транспортных РНК (тРНК), а оставшиеся 2 кодируют синтез рибосомальных РНК (рРНК). Другие белки, необходимые для синтеза митохондрий и поддержания их нормальной метаболической активности, закодированы в ядерном геноме. Они синтезируются клеткой и затем поступают в митохондрии из матрикса цитоплазмы [93].

Митохондрии в зрелых ооцитах обладают некоторыми отличиями от митохондрий в соматических клетках. Во-первых, они значительно меньше по размеру, имеют сферическую форму и состоят из нескольких частей. В отличие от своих полностью дифференцированных аналогов в соматически клетках, которые постоянно перемещаются по цитоплазме, динамически объединяются и разделяются, образуя объединенную сеть, они имеют меньше крист и электронно плотный матрикс [94]. В созревающих ооцитах процессы деления и слияния митохондрий происходят намного реже [95].

Во-вторых, митохондрии ооцитов, по-видимому, имеют только одну или две молекулы мтДНК в отличие от митохондрий соматических клеток, в которых число молекул мтДНК варьируется от двух до десяти [96], [97].

Именно это предположение о распределении мтДНК было использовано для оценки числа копий мтДНК в цитоплазме ооцитов. Изучение числа копий мтДНК в ооцитах млекопитающих, и особенно ооцитах человека, является актуальной проблемой. Тем не менее, на сегодняшний день данные различных исследований противоречивы, и не существует общепринятых нормативов количества копий мтДНК в ооцитах человека. В различных исследованиях число копий мтДНК в ооцитах человека широко варьирует не только между различными пациентками, но и между отдельными ооцитами в одной когорте [8], [9], [98]–[100], и оценивается в диапазоне между 104 и 107 числом копий в одной клетке. Следует отметить, что для оценки числа копий мтДНК в ооцитах используется гипотеза о том, что митохондрии содержат одну или две молекулы мтДНК, хотя напрямую количество молекул в одной митохондрии ооцита человека не изучалось. В связи с этим данные, отражающие число копий мтДНК в ооцитах человека, могут быть значительно преувеличены [101].

В-третьих, считается, что процессы репликации и транскрипции мтДНК приостановлены в зрелых ооцитах млекопитающих, и восстановление их происходит только после оплодотворения клетки [102].

Предполагается, что возобновление транскрипции митохондриального генома происходит одновременно с активацией собственного генома эмбриона [11]. Активация собственного генома эмбриона начинается на разных стадиях дробления у разных млекопитающих. У человека геном эмбриона начинает реплицироваться примерно через 72 часа после оплодотворения, когда эмбрион содержит от 4 до 8 бластомеров. Таким образом, на ранних этапах эмбриогенеза репликации мтДНК не происходит, соответственно, число молекул мтДНК в отдельных бластомерах прогрессивно уменьшается с каждым циклом деления эмбриона, также как уменьшается объем цитоплазмы. Только на стадии бластоцисты начинается полноценная экспрессия факторов репликации мтДНК и, соответственно, репликация мтДНК в клетках трофоэктодермы. Одновременно происходит изменение структуры митохондрий – органеллы вытягиваются в длину, кристы углубляются, увеличивается активность процесс окислительного фосфорилирования [103]. Что касается процесса оогенеза, число копий мтДНК в созревающих ооцитах непрерывно увеличивается параллельно с объемом цитоплазмы, и в течение развития от стадии первичной зародышевой клетки до стадии примордиального фолликулы их число увеличивается примерно в 50 раз [104]–[106].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 

Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Жукова Дарья Григорьевна ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ У БОЛЬНЫХ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В УСЛОВИЯХ МНОГОПРОФИЛЬНОГО СТАЦИОНАРА 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«Шестакова Вера Владимировна МОРФО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS MILL. К КОККОМИКОЗУ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В. Москва 20 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 1. Введение 2. Обзор литературы 2.1. Описание заболевания 2.2. Общая характеристика вируса гриппа 2.3. Эпидемиология вируса гриппа А...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Киселева Ирина Анатольевна СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 03.01.06 – биотехнология (в том числе...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.