WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«ОПТИМИЗАЦИЯ ИСХОДОВ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С ПОВЫШЕННЫМ УРОВНЕМ АНЕУПЛОИДИИ В СПЕРМАТОЗОИДАХ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Наряду с известными и хорошо отработанными цитогенетическими и молекулярными методами пренатальной диагностики при уже существующей беременности, прерывание которой является эмоциональным испытанием для женщины и ее семьи, в последние десятилетия в связи с развитием ВРТ стало возможным проведение диагностики генетических нарушений у будущего ребенка до переноса эмбриона в полость матки в программе ЭКО. ПГД стала применятся в 90-х годах, когда был достигнут достаточный технологический уровень проведения ЭКО, а также разработан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей проводить анализ ДНК в единичных клетках.

Как уже было отмечено выше, ПГД изначально была разработана для диагностики нарушений у потомства пар с моногенными заболеваниями, такими как муковисцидоз, или заболеваниями, сцепленными с полом, такими, как мышечная дистрофия. В дальнейшем, эта методика стала применяться для диагностики различных видов анеуплоидии у эмбрионов. В клинической практике ПГД часто рекомендуется парам с повышенным риском врождённых аномалий у детей, который не связан с носительством известных мутаций. К таким парам относятся те, у которых возраст матери превышает 35 лет, имеются указания на множественные неудачные попытки ЭКО, или привычное невынашивание беременности в анамнезе. В этом случае эта диагностическая методика носит название преимплантационного генетического скрининга. К другим показаниям для применения ПГС относится плохое качество эмбрионов в предыдущих попытках ЭКО и мужской фактор бесплодия [93]. Китайские коллеги проводили ПГД в циклах ВРТ у 80 супружеских пар, страдающих бесплодием или привычным невынашиванием беременности. Все 80 мужчин были носителями робертсоновских транслокаций. После проведения ПГД у 79 пар имелись пригодные для переноса эмбрионы. Частота наступления беременности составила 31,6% (25 из 79) [94]. На сегодняшний день, молекулярно-цитогенетическая диагностика - это, пожалуй, единственная методика, которая позволяет диагностировать хромосомные нарушения на преимплантационном этапе.

Европейские коллеги сообщают об успешном применении ПГС у женщин с привычным невынашиванием беременности и антифосфолипидным синдромом (АФС). При совместном применении ЭКО/ПГС на фоне лечения АФС у беременных удалось добиться рождения доношенных здоровых детей [95].

Коллеги из США также сообщают о положительном влиянии ПГС методом сравнительной геномной гибридизации (СГГ от англ. CGH - сomparative genomic hybridization) на частоту пролонгированной беременности и живорождений в группе пациентов с идиопатическим привычным невынашиванием. В данной группе удалось снизить частоту выкидышей до 6,9% по сравнению с контрольной группой пациенток, в которой частота выкидышей составила 33,5% [96]. По некоторым данным, возможной причиной множественных неудачных попыток ЭКО является высокий процент хромосомных нарушений в эмбрионах.

Доказательством этого являются результаты исследований, в которых применялся ПГС в циклах ВРТ. В результате, удалось увеличить частоту наступления беременности и снизить риск самопроизвольных выкидышей у данной категории пациентов [97] [98].

Следует отметить, что в мире нет единого мнения по поводу положительного влияния ПГС на результаты ВРТ. В ряде рандомизированных исследований приведены данные об отсутствии или даже отрицательном влиянии ПГС на исходы циклов ЭКО [99] [100] [101]. Некоторые авторы приводят ряд возможных биологических причин такого различия в результатах: возникновение мозаицизма и возможность самокоррекции анеуплоидных эмбрионов. Что касается мозаицизма, во многих исследованиях показана высокая частота мозаицизма у эмбрионов в стадии дробления и, следовательно, любой анализ, основанный на исследовании одной клетки, не может быть надежным [102] [103] [104] [105]. В двух крупных исследованиях процент возможной ошибки, связанный с хромосомным мозаицизмом, при использовании FISH метода составил 5-7% [106][107]. Вероятность ошибки можно снизить до 2%, исследуя бластоцисту методом CGH [108].

Для проведения ПГС могут быть использованы первое или второе полярные тельца оплодотворенных ооцитов, один или два бластомера, полученные путем биопсии трехдневного эмбриона, или клетки трофэктодермы эмбриона на стадии бластоцисты [109] [110] [111]. Более предпочтительным является анализ ядер бластомеров эмбрионов, либо трофэктодермы. При исследовании полярных телец возможно выявить генетические нарушения, которые присутствовали в яйцеклетке. Однако при оплодотворении нормальной яйцеклетки генетически неполноценным сперматозоидом нарушения не будут выявлены [112].

Кроме того, примерно одна треть аномалий у эмбриона возникает при постзиготических делениях, что также не может быть выявлено при исследовании полярных телец [113]. В настоящее время предпочтение отдается диагностике трофэктодермы, так как этот метод является менее травматичным для эмбриона и более информативным. Но для осуществления данной диагностики необходимо дорогостоящее оснащение эмбриологической и генетической лабораторий с возможностью проведения витрификации эмбрионов [114][115].

Впервые ПГД применили Handyside AH., с соавторами в 1989 году [109]. Они определяли специфические последовательности Y хромосомы методом ПЦР с целью определения пола эмбрионов. В настоящее время технику ПЦР применяют для выявления мутаций в уникальных генах, т.е. генах, представленных единственной копией в гаплоидном наборе хромосом, а также определение антигенов системы HLA, и резус принадлежности эмбрионов. В дальнейшем для определения пола эмбриона и диагностики хромосомной патологии стали применять метод FISH, который имеет ряд преимуществ перед другими способами молекулярной гибридизации (Рисунок 3).

Рисунок 3. Ядро бластомера с нормальным хромосомным набором (применение зондов к 5-ти хромосомам).

Для генетического исследования этим методом не требуется получение большого количества биологического материала и выделения ДНК из клеток, что позволяет анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе в интерфазе, что в ряде случаев позволяет обходиться без исследования метафазных пластинок. С помощью метода FISH с успехом можно диагностировать сбалансированные транслокации у эмбрионов, полученных от родителей, которые являются носителями транслокации. Для диагностики каждого вида хромосомных транслокаций методом требуется FISH предварительное приготовление индивидуальных зондов. Ограничением FISH метода является то, что только небольшое число хромосом (до 12-ти) может быть проанализировано в каждом эмбрионе. Чем больше используется флюорохромов, тем больше вероятность наложения сигналов и, соответственно, ошибочной оценки. Поэтому преимплантационный скрининг методом FISH имеет некоторые ограничения. При применении этого метода могут быть пропущены аномалии других, не подвергнутых исследованию, хромосом. Также при FISH диагностике наблюдается достаточно много ложно-отрицательных результатов, так как данный вид исследования обладает низкой чувствительностью за счет возможного мозаицизма исследуемых эмбрионов [116]. В этом случае существует вероятность переноса в полость матки анеуплоидных эмбрионов. Кроме того, за счет недостаточно высокой специфичности и, соответственно, относительно высокого уровня ложно-положительных результатов возможна выбраковка нормальных эуплоидных эмбрионов, что снижает число эмбрионов, годных для переноса. Точные данные по чувствительности и специфичности ПГС методом FISH не известны, так как проведение исследований высокого качества с использованием человеческих эмбрионов невозможно в виду возникающих этических проблем. Вследствие низкой точности этого метода в ряде стран женщинам группы риска по анеуплоидии у потомства рекомендуется пренатальная диагностика путем амниоцентеза или биопсии хориона несмотря на проведение преимплантационного скрининга.

На сегодняшний день стало возможным проведение полного кариотипирования отдельных клеток при помощи метода сравнительной геномной гибридизации. В отличие от предыдущих методов преимплантационной диагностики (ПЦР и FISH), СGH позволяет проанализировать каждую из 24 хромосом. Метод CGH был первоначально разработан для анализа анеуплоидии в клетках, полученных из солидных опухолей [117]. Сейчас метод CGH применяется для ПГС человеческих эмбрионов. Хромосомные дисбалансы, такие как анеуплоидия, несбалансированные транслокации, делеции и дупликации, легко обнаруживаются с помощью CGH (Рисунок 4).

Рисунок 4. Исследование трофэктодермы эмбриона методом CGH. 47,XXY.

Ограничением метода является то, что полиплоидия и сбалансированные транслокации или инверсии не могут быть обнаружены. Однако, по мнению многих авторов, это является небольшим ограничением, так как большинство полиплоидных эмбрионов имеют грубые и сочетанные нарушения развития и выбраковываются еще до 5 дня развития, и лишь 0,2% однородно поли- или гаплоидных (без других аномалий) продолжают развиваться [118][119]. Также ограничением метода является его высокая стоимость. Процедура CGH является достаточно трудоемкой. После биопсии 5-ти дневные эмбрионы обычно подвергаются криоконсервации. Далее эти эмбрионы могут быть перенесены женщине только в следующем цикле. Как было показано в ряде исследований, криоконсервация эмбрионов после биопсии приводит к значительному снижению их жизнеспособности [120] [121].

Однако в последнее время появляются сообщения об ускоренном анализе геномного секвенирования благодаря новой технологии генетического тестирования. При применении этой методики результат ПГС может быть получен в течение первых суток исследования материала, поэтому стало возможным переносить в полость матки «свежие» эмбрионы [122]. Сообщение о первом успешном применении сравнительной геномной гибридизации в программе ЭКО было опубликовано Wilton L., с соавторами (2001). 38-летняя женщина, страдавшая бесплодием много лет, родила здоровую девочку. При генетическом анализе 5 полученных эмбрионов только 1 эмбрион женского пола был без патологии [123]. В настоящее время в клиниках ВРТ во всем мире наблюдается увеличение количества селективных переносов одного здорового эмбриона в полость матки. В ряде европейских стран перенос в полость матки более одного эмбриона запрещен. По данным некоторых авторов, перенос двух и трех эмбрионов после ПГС более чем в 50% случаев приводит к возникновению многоплодной беременности [124]. Многоплодная беременность, в свою очередь, может сопровождаться различными осложнениями и преждевременными родами.

По мнению многих авторов, селективный перенос эмбриона в полость матки после может способствовать увеличению частоты наступления CGH беременности [125].

В настоящее время данные по эффективности ПГС противоречивы. Согласно данным Кохрановского систематического обзора, нет убедительных доказательств в пользу эффективности ПГС для увеличения уровня живорождения [126]. Данные по применению ПГС у мужчин с нарушениями сперматогенеза также являются неопределенными [127] [128]. Однако ПГС все чаще применяется в клиниках ЭКО, опираясь на противоположные точки зрения о том, что каким бы способом ни проводился ПГС, его применение увеличивает частоту имплантации эмбрионов и снижает риск возникновения спонтанных абортов, тем самым повышая эффективность программ ВРТ [129] [130] [131].

1.6. Риск анеуплоидии эмбрионов в программах ВРТ у супружеских пар с патозооспермией (мета-анализ) Нами был проведен мета-анализ для обобщения данных первичных исследований о риске анеуплоидии эмбрионов, полученных от бесплодных пар с патозооспермией в программах ВРТ. Основанием для проведения мета-анализа были данные о том, что у мужчин с различными видами патозооспермии значительно возрастает риск анеуплоидии в сперматозоидах по сравнению со средними популяционными данными [132][133][134] [135]. При изучении исходов ЭКО у пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах была обнаружена более низкая частота имплантации и наступления беременности и более высокая частота потерь беременности по сравнению с парами, в которых у мужчин были нормальные параметры спермограммы [136][137]. Кроме того, было выявлено, что у мужчин с повышенной частотой хромосомных аномалий в половых клетках чаще, чем в популяции, наблюдается возникновение хромосомных аномалий у потомства [136][137].

В анализ были включены исследования следующего дизайна: когортные исследования, исследования случай-контроль и одномоментные исследования с параллельным контролем на английском языке, в которых изучался риск развития анеуплоидии эмбрионов при проведении ПГС в зависимости от наличия или отсутствия патозооспермии (кроме азооспермии) у мужчин в программах ВРТ.

Описание отдельных случаев/серии случаев, исследования без параллельного контроля, исследования, изучающие влияние обструктивной азооспермии на риск анеуплоидии эмбрионов, а также исследования не на английском языке исключались из анализа. Участниками исследований были супружеские пары с различными видами патозоспермии (кроме азооспермии) или нормозооспермией у мужчин, проходившие лечение бесплодия в клиниках ЭКО.

Изучаемым воздействием были различные виды патозооспермии. Изучались следующие виды исходов:

- Первичные исходы – суммарная частота анеуплоидии эмбрионов, частота различных типов анеуплоидии эмбрионов.

- Вторичные исходы – частота имплантации, частота наступления беременности, частота самопроизвольных выкидышей, частота живорождений.

Поиск исследований проводился в базах данных Pubmed и EMBASE. Для поиска использовались следующие ключевые слова и медицинские термины:

Oligozoospermia, Asthenozoospermia, Teratozoospermia, Aneuploidy, Embryo aneuploidy, Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)/ Preimplantation Genetic Screening (PGS), Fluorescence in situ hybridization (FISH). Три автора, независимо друг от друга, проводили поиск исследований, соответствующих критериям включения. Несоответствия в поиске устранялись в ходе совместной дискуссии и разбора найденных источников или привлечения к дискуссии четвертого автора.

Для извлечения данных из найденных исследований авторами была разработана специальная форма, позволяющая оценивать полученные данные. Любые возникающие противоречия устранялись в ходе совместной дискуссии.

Исследования, не подходящие критериям включения, исключались из анализа.

Авторы проводили оценку качества включенных в анализ исследований по следующим критериям:

1) Ошибка отбора (selection bias):

ошибка выборки (sampling bias): расчет объема выборки (обеспечивающий 90% мощности исследования), равномерность наблюдений в группах исследования;

ошибка вследствие выбывания из исследования (attrition bias): доля утерянных в исследовании данных (не более 20%), наличие неполных данных исходов исследования (вследствие нарушений в протоколе исследования, утерянных данных).

2) Ошибка измерения (measurement bias):

ошибка представления данных (data степень

presentation bias):

однородности и полноты представления данных;

информационная ошибка (information bias): качество и параллельность представления результатов в сравниваемых группах.

3) Ошибка дизайна исследования (design bias):

учет вмешивающихся факторов;

адекватность применения статистических показателей.

4) Суммарный риск ошибки (overall risk of bias): вывод о суммарном риске ошибки в исследовании был сделан согласно Cochrane Handbook for Systematic Reviews of InterventionsVersion 5.1.0 part 8.6 (Higgins J, Green S, updated 2011, http://www.cochrane-handbook.org). Каждому виду ошибки был предан балл согласно Кохрановским рекомендациям: А – критерий соблюден, В – критерий частично соблюден или не ясен, С – критерий не соблюден.

Согласие между авторами достигалось путем применения Каппа-статистики.

Согласно проведенному анализу включенные исследования суммарно были среднего методологического качества с максимально высокой степенью доказательности данных в исследовании Magli MC., с соавторами (2009) [75] и минимальной доказательностью данных в исследовании Sanchez-Castro M., с соавторами (2009) [79]. Ни одно из включенных исследований не было исключено из анализа на основании проводимой оценки качества (рисунки 5 и 6).

5) Для оценки ошибки публикации был построен график типа funnel plot, и ошибка была оценена визуально. Согласно графику распределение публикаций было симметричным относительно отношения шансов (ОR) и находилось в пределах доверительных интервалов, что свидетельствует об отсутствии ошибки публикации (рисунок 5).

.

–  –  –

*Примечание:

OR – отношение шансов (ОШ) SE (log[OR]) – стандартная ошибка log[ОШ] Из каждого исследования извлекались данные об имени первого исследователя, годе публикации, стране проведения исследования, названии исследования, объеме выборки в группах сравнения, виде патозооспермии, числе эуплоидных эмбрионов, числе анеуплоидных эмбрионов, типах анеуплоидии эмбрионов, числе переносов, частоте имплантации, частоте наступления беременности, частоте самопроизвольных выкидышей и живорождений в каждой из групп сравнения. Дополнительно извлекались данные о вмешивающихся (в том числе материнских) факторах, влияющих на риск анеуплоидии эмбрионов, методе определения анеуплоидии.

Статистический анализ проводился в программе Review Manager 5.1.

(Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions Version 5.1.0). Модель с фиксированным эффектом (the fixed-effect model) использовалась для получения отношения шансов Мантеля-Ханцеля с 95% доверительным интервалом.

Гетерогенность данных оценивалась с помощью I2 статистики.

Результаты поиска. По комбинации ключевых слов «oligozoospermia» OR «asthenozoospermia» OR «teratozoospermia» (OR – булевский оператор «ИЛИ») было найдено 6273 статей. Поиск по медицинскому термину «embryo aneuploidy»

дал 2830 статей. В результате комбинации двух предыдущих результатов булевским оператором «И» («AND») число статей сократилось до 27. Поиск по медицинскому термину «preimplantation genetic diagnosis» дал 2792 статей. Число статей было сокращено до 35 статей после комбинации булевским оператором «И» («AND») данных результатов с результатами поиска по ключевым словам «oligozoospermia» OR «asthenozoospermia» OR «teratozoospermia».

Далее поиск по названиям и абстрактам производился вручную и дал 4 потенциально подходящих когортных исследования (Kahraman S., с соавторами (2006), Турция; Dubey A., с соавторами (2008), США; Magli MC., с соавторами (2009), Бельгия; Sanchez-Castro M., с соавторами (2009), Испания) [76][75][79] [138]. Дополнительно был произведен поиск в библиографических ссылках указанных статьей, который не дал ни одной статьи, соответствующей критериям включения. Во всех четырех исследованиях биопсия эмбрионов проводилась на 3й день после пункции яичников, и FISH метод использовался для выявления анеуплоидии эмбрионов. Одно исследование Kahraman S., с соавторами (2006), Турция «Preliminary FISH studies on spermatozoa and embryos in patients with variable degrees of teratozoospermia and a history of poor prognosis» было исключено из исследования, т.к. не были представлены данные об исходах в группе контроля [138]. Характеристика исследований, включенных в анализ, представлена в таблице 2. В анализ были включены 3 исследования (Dubey A., с соавторами (2008), США; Magli MC., с соавторами (2009), Бельгия; Sanchez-Castro M., с соавторами (2009), Испания). Общий объем выборки составил 257 пациентов, которым было проведено 313 ПГС циклов. Общее количество пациентов в группе с патозооспермией составило 159 человек, количество ПГС циклов - 190.

Количество участников в группе с нормозооспермией составило 98 человек, количество ПГС циклов - 123. У всех пациентов был нормальный кариотип.

–  –  –

В исследовании Dubey A., с соавторами (2008) объем выборки составил 52 пациента, которым было проведено 52 цикла ЭКО с ПГC [76]. Для оценки морфологии сперматозоидов применялся строгий критерий Тайгерберга.

Пациенты были разделены на группы по количеству проведенных циклов: группа с нормальной морфологией сперматозоидов (5% морфологически нормальных сперматозоидов) - 9 циклов, и группа с ТЗС (0-4% морфологически нормальных сперматозоидов) - 43 цикла.

В работе Magli МС., с соавторами (2009) участники исследования (230 участников, 295 циклов ЭКО с ПГС) были разделены на группы в зависимости от параметров спермограммы согласно критериям ВОЗ (2000) [75]. Пациенты с нормозооспермией составили группу 1 (105 циклов), пациенты с ОАТ составили группу 2 (134 цикла). Пациенты с азооспермией (группа 3 и 4) были исключены из анализа ввиду несоответствия критериям включения в исследование. Таким образом, объем выборки для анализа составил 185 пациентов (239 циклов ПГС).

В исследовании Sanchez-Castro M., c соавторами (2009) объем выборки составил 20 пациентов, которым было проведено 22 цикла ЭКО с ПГС. Участники были разделены на группы в зависимости от морфологии сперматозоидов.

Параметры спермограммы оценивались по критериям ВОЗ (1999), для оценки морфологии сперматозоидов применялись строгие критерии Крюгера.

Во всех трех исследованиях биопсия эмбрионов проводилась на 3-й день после оплодотворения: у Dubey А., с соавторами (2008) – на стадии 6-8 бластомеров, у Magli MC., c соавторами (2009) – на стадии 4-х бластомеров, у Sanchez-Castro М., с соавторами (2009) - стадия не указана. Анеуплоидия определялась при наличии набора хромосом, отличного от нормального. ПГС проводился по хромосомам X, Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 в исследовании Dubey А., с соавторами (2008); хромосомам X, Y, 13, 15, 16, 18, 21, 22 в исследовании Magli MC., с соавторами (2009); хромосомам X, Y, 13, 18, 21 в исследовании Sanchez-Castro М., с соавторами (2009). Однако данные о частоте анеуплоидии по отдельным хромосомам были представлены только в исследованиях Dubey А., с соавторами (2008) и Magli MC., с соавторами (2009).

Оценка результатов диагностики проводилась по следующим FISH критериям. Эуплоидия определялась как полный набор, гаплоидия - как одинарный набор и полиплоидия - как тройной и более набор исследуемых хромосом. В исследовании Dubey А., с соавторами (208) анеуплоидия определялась как наличие менее или более 2-х копий исследуемых аутосом, или отсутствие одной половой хромосомы, или наличие лишней половой хромосомы.

Комплексной патологией считалось наличие более 2-х из выше указанных нарушений. В исследовании Magli MC., с соавторами (2009) моносомии и трисомии определялись как ненормальное количество копий для одной или двух исследуемых хромосом. Сочетанная патология определялась при выявлении двух и более хромосом с ненормальным числом копий. Анеуплоидными считались эмбрионы, в которых число хромосом в клетках было не кратно гаплоидному набору. В исследовании Sanchez-Castro М., с соавторами (2009) анеуплоидными считались эмбрионы с любым не кратным основному числу исследуемых хромосом.

На 4 или 5 день проводился перенос только нормальных (эуплоидных по исследуемым хромосомам) эмбрионов, причем у Dubey А., с соавторами (2008) в количестве не более двух. Беременность определялась по данным УЗИ при выявлении плодного яйца и сердцебиения эмбриона. Число беременностей рассчитывалось на число проведенных циклов и завершенных переносов. Частота имплантации определялась как число выявленных по данным УЗИ плодных яиц, деленное на общее количество перенесенных эмбрионов.

Полученные данные представлены в рисунке 8. Первичным исходом была оценка влияния патозооспермии на развитие анеуплоидии эмбрионов. Во всех трех исследованиях (Dubey А., с соавторами (2008), США; Magli MC., c соавторами (2009), Бельгия; Sanchez-Castro M., с соавторами (2009), Испания) были опубликованы данные о частоте анеуплоидии эмбрионов. Общее количество проанализированных эмбрионов составило 1749, по 1033 и 716 в группах мужчин с патозооспермией и нормозооспермией, соответственно. Частота анеуплоидии эмбрионов была выше в группе с патозооспермией (65,6%, 678 из 1033), чем в группе с НЗС (53,2%, 381 из 716). В результате чего ОШ составило 1,41 (95% ДИ 1,15-1,73).

Вторым первичным исходом было влияние патозооспермии на развитие отдельных типов анеуплоидии эмбрионов.

В двух исследования (Dubey А., с соавторами (2008), США; Magli МС., с соавторами (2009), Бельгия) были представлены данные о типах анеуплоидии (моносомии и трисомии, сочетанная патология). Общее количество проанализированных эмбрионов составило 980, по 631 и 439 соответственно в группах с патозооспермией и НЗС. Частота моносомии и трисомии эмбрионов была выше в группе НЗТ (44,4%, 155 из 349), чем в группе с патозооспермией (37,1%, 234 из 631). В результате чего ОШ составило 0,75 (95% ДИ 0,56-0,98). Частота сочетанной патологии эмбрионов была выше в группе с патозооспермией (52,5%, 331 из 631), чем в группе НЗС (45,5%, 159 из 349), ОШ составило 1,24 (95% ДИ 0,94-1,63). Визуальная оценка всех графиков типа forest plot показывает, что ДИ отдельных исследований перекрываются и I2 равно 0%, что свидетельствует об однородности данных включенных исследований.

Вторичными изучаемыми исходами была частота наступления беременностей, самопроизвольных выкидышей и живорождений. В двух исследованиях (Dubey А., с соавторами (2008), США; Magli МС., с соавторами (2009), Бельгия) были представлены данные о частоте имплантаций и частоте наступления беременности. Частота наступления беременности (из расчета на перенос эмбрионов) была выше в группе НЗС (38,5%, 35 из 91), чем в группе с патозооспермией (30,9%, 43 из 139). ОШ составило 0.75 (95% ДИ 0.43 – 1.30), I2 = 60%. Частота наступления беременностей (из расчета на цикл стимуляции) была выше в группе НЗС (30,7%, 35 из 114), чем в группе с патозооспермией (24,3%, 43 из 177). ОШ составило 0,78 (95% ДИ 0,46 – 1,32), I2 = 68%. Частота имплантаций была выше в группе НЗС (27,8%, 49 из 176), чем в группе с патозооспермией (22,8%, 58 из 254). ОШ составило 0,76 (95% ДИ 0,49 – 1,19), I2=61%. В одном исследовании (Magli МС., с соавторами (2009), Бельгия) были представлены данные о частоте самопроизвольных выкидышей (от общего количества пациентов) и частоте живорождений. Не было выявлено существенных различий в частоте самопроизвольных выкидышей (от общего количества переносов) в группе НЗС (2,5%, 2 из 81) и в группе с патозооспермией (2,9%, 3 из 104). ОШ составило 1,17 (95% ДИ 0,19 – 7,19). Частота живорождений была выше в группе НЗС (35,8%, 29 из 81), чем в группе с патозооспермией (32,7%, 34 из 104). ОШ составило 0,87 (95% ДИ 0,47-1.61).

Рисунок 8. Данные, получены при проведении мета-анализа.

Таким образом, в систематическом обзоре мы обобщили имеющиеся данные о частоте и типах анеуплоидии эмбрионов, полученных от пар с наличием патозооспермии у мужчин в программах ВРТ, и провели анализ эффективности циклов ВРТ в группах с нормальными показателями спермограммы и патозооспермией у мужчин. На основании обобщения полученных данных была выявлена статистически значимая зависимость между патозооспермией и риском развития анеуплоидии эмбрионов в программах ВРТ.

Интересным результатом исследования явилось то, что частота имплантации и частота наступления беременности не была ниже у пациентов с патозооспермией по сравнению с парами без патологии сперматогенеза. Однако данные по этому вопросу были суммированы на основании 2-х представленных исследований, что свидетельствует об их недостаточной доказательности. Данные о частоте самопроизвольных выкидышей и живорождений были получены только из одного из 3-х включенных в анализ исследований и свидетельствовали об отсутствии значимой разницы в изучаемых группах пациентов. Это может быть связано с тем, что в исследованиях, включенных в анализ, эмбрионы переносились в полость матки после проведения ПГС, а, значит, были генетически полноценными. Данные многочисленных исследований свидетельствуют об отрицательных исходах ЭКО у пар с патозооспермией у мужчин.

Мы не смогли проанализировать риск развития анеуплоидии эмбрионов при наличии различных видов патозооспермии у мужчин (олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия, сочетанная патология), так как во включенных исследованиях отсутствовали или имелись необобщенные данные по этому вопросу. Также нами не было найдено данных по взаимосвязи различных видов патозооспермии и различных типов анеуплоидии у полученных эмбрионов.

Таким образом, нами был сделан вывод о том, что данные литературы о риске анеуплоидии эмбрионов в парах с патозооспермией у мужчин противоречивы, а исследований, касающихся этой проблемы, недостаточно.

Необходимо проведение дальнейших исследований высокого методологического качества для решения этой актуальной проблемы современной репродуктологии.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Исследование проводилось на базе ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова»

Минздрава России (директор академик РАН Сухих Г.Т.). Набор пациентов осуществлялся в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель д.м.н. Калинина Е.А.). Лабораторные исследования и медикогенетическое консультирование проводилось в лаборатории репродуктивной генетики (руководитель д.м.н. профессор Бахарев В.А.).

Были обследованы 344 супружеские пары с бесплодием, обусловленным мужским или мужским и трубно-перитонеальным фактором. В результате проведенного обследования из 344 пар выбыло 244 пары в связи с несоответствием критериям включения, либо отказа от дальнейшего участия в исследовании. В итоге было отобрано 100 супружеских пар, подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Супружеские пары, участвующие в исследовании до августа 2012 г., были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России №67 от 26.02.2003 г.

«О применении вспомогательных репродуктивных технологий в терапии женского и мужского бесплодия». Супружеские пары, включенные в исследование после августа 2012 г., были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению". На первом этапе у мужчин изучались параметры спермограммы и проводилось исследование сперматозоидов с помощью молекулярно-цитогенетического исследования (FISH-методом). На втором этапе у части пациентов проводилось молекулярно-цитогенетическое исследование эмбрионов (FISH-методом).

2.1. Дизайн исследования

Для решения задач №1-3, а именно, оценки частоты, уровня, типов анеуплоидии в сперматозоидах, и исходов программ ВРТ у супружеских пар с различными видами патозооспермии и уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, было проведено проспективное когортное исследование. На основании данных спермограммы супружеские пары были поделены на следующие группы в зависимости от наличия и вида патозооспермии: группа 1.1 - пациенты с тератозооспермией; группа 1.2 – пациенты с астенозооспермией и/или олигозооспермией; группа 2 - пациенты с нормозооспермией. Всем включенным в исследование пациентам было проведено молекулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов (FISH – метод) (Рисунок 9).

Рисунок 9. Дизайн исследования для задач 1-3.

Конечными точками данной части исследования были:

средний уровень суммарной анеуплоидии в сперматозоидах и средний уровень отдельных видов анеуплоидии в сперматозоидах в сравниваемых группах;

корреляционная зависимость между различными параметрами спермограммы и уровнем анеуплоидии хромосом в сперматозоидах;

ОШкор наступления беременности у пар с патозооспермией по сравнению с парами с нормозооспермией;

ОШкор наступления беременности у пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах по сравнению с парами с нормальным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин;

пороговый уровень анеуплоидии в сперматозоидах в зависимости от наступления беременности.

Для решения задач №4-5, а именно, изучения риска развития анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y в ядрах бластомеров у супружеских пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах и оценки эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у супружеских пар с различными видами патозооспермии и повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, было проведено проспективное когортное исследование.

На основании данных молекулярноцитогенетического исследования сперматозоидов супружеские пары с патозооспермией у мужчин были поделены на группы в зависимости от уровня анеуплоидии в сперматозоидах. Пороговый уровень анеуплоидии, на основании которого было проведено разделение на группы, был выявлен в результате статистического моделирования с построением Пары с ROC-кривой.

повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах также были поделены на группы в зависимости от проведения или не проведения молекулярноцитогенетического исследования ядер бластомеров: группа 1а - пациенты с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, которым проводился ПГС;

группа 1б – пациенты с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, которым не проводился ПГС; группа 1в – пациенты с нормальным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, которым проводился ПГС. При этом молекулярно-цитогенетическое исследование ядер бластомеров проводилось по медицинским показаниям (старший репродуктивный возраст, повторные неудачи ЭКО или привычное невынашивание беременности, наличие детей или плодов с анеуплоидией) (Рисунок 10).

Рисунок 10. Дизайн исследования для задач 4-5.

Конечными точками данной части исследования были:

- скорректированное отношение шансов (ОШкор) развития анеуплоидии и различных типов анеуплоидии в бластомерах у пар с различным уровнем анеуплоидии по сравнению с парами без анеуплоидии в сперматозоидах;

- средний уровень анеуплоидии в сперматозоидах в группах эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов;

- корреляционная зависимость между уровнем анеуплоидии в сперматозоидах и числом анеуплоидных эмбрионов;

- ОШкор наступления беременности в зависимости от проведения ПГС в парах с высоким и нормальным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах.

Критериями включения супружеских пар в исследование были:

- нормальный кариотип супругов;

- мужской или мужской и трубно-перитонеальный фактор, или трубноперитонеальный фактор бесплодия в зависимости от группы сравнения;

- возраст женщин до 38 лет;

- наличие нормального овариального резерва и базальной концентрации фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) 12 мМЕ/мл;

- отсутствие противопоказаний к ВРТ у женщин, в том числе отсутствие генитального эндометриоза III-IV степени, миомы матки больших размеров, хронического эндометрита, опухолевых и опухолевидных образований яичников;

- отсутствие пороков развития внутренних половых органов у женщин, включая состояния после хирургической коррекции пороков развития внутренних половых органов;

- отсутствие острых воспалительных и инфекционных заболеваний и обструкции семявыносящих путей у мужчин;

- отсутствие приема лекарственных средств со сперматоксичным действием у мужчин;

- отсутствие указания на воздействие радиации и химиотерапии у мужчин;

- наличие не более 2 безуспешных попыток ЭКО/ПЭ в анамнезе;

- информированное согласие на участие в исследовании.

Критериями исключения были развитие синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) средней или тяжелой степени в данном цикле ЭКО, а также другие состояния и осложнения, требующие отмены переноса эмбрионов в изучаемом цикле.

2.2. Расчет объема выборки

Расчет объема выборки был произведен с помощью программы STATISTICA 10 (США). Расчет объема выборки был основан на данных литературы о частоте наступления беременности в программах ВРТ у пар с различными параметрами спермограммы [139]. Для получения валидных данных при принятии уровня альфа 0,05, уровня достоверности исследования 90%, средней 1 = 2,6%, средней 2 =1,2%, стандартного отклонения =1,4% с учетом возможного 10% выбывания пациентов из исследования достаточно включения 25 пациентов в каждую группу.

Таким образом, в зависимости от результатов спермограммы и молекулярноцитогенетического исследования сперматозоидов, а также проведения ПГС были сформированы следующие группы пациентов:

–  –  –

Обследование перед вступлением в программу ЭКО/ПЭ проводилось в амбулаторных условиях и включало обязательные исследования, исследования по медицинским показаниям и специальные методы исследования. Все обследования в рамках проводимого исследования, за исключением УЗИ и анализа эякулята, проводились однократно.

Обязательные исследования для обоих супругов включали:

- определение антител к бледной трепонеме в крови (RW), антител класса M, G к вирусу иммунодефицита человека 1, 2 (ВИЧ 1,2), к антигену вирусного гепатита В и С (HBs-Ag, HCV), определение антигенов вируса простого герпеса в крови;

- микроскопическое исследование отделяемого половых органов на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, на грибы рода кандида, паразитологическое исследование на атрофозоиты трихомонад;

- микробиологическое исследование на хламидии, микоплазмы и уреаплазмы;

молекулярно-биологическое исследование на вирус простого герпеса 1, 2, на цитомегаловирус;

медико-генетическое консультирование и кариотипирование.

Обязательные исследования для женщин включали:

- клинический анализ крови;

- биохимический анализ крови;

- коагулограмму;

- определение группы крови и резус-фактора;

- общий анализ мочи;

- определение антител класса M, G к вирусу краснухи в крови;

- цитологическое исследование шейки матки;

- ультразвуковое исследование органов малого таза на 5-8 день цикла;

- флюорографию или рентген грудной клетки;

- регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ);

- заключение терапевта о состоянии здоровья;

- УЗИ (до 35 лет) молочных желез или маммографию (после 35 лет).

Обязательные исследования для мужчин включали:

- спермограмму.

Исследования по показаниям включали:

- исследование состояния матки и маточных труб (гистеросальпингография или гистероскопия и лапароскопия);

- гормоны крови (на 2-3 день менструального цикла): лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), эстрадиол (Е2), тиреотропный гормон (ТТГ), трийодтиронин (Т3), свободный тироксин (Т4св), дегидроэпиандростерон-сульфат (ДГА-С), пролактин (ПРЛ), соматотропный гормон (СТГ), кортизол, тестостерон (Т), прогестерон (П);

- консультацию других специалистов (эндокринолога, андролога).

Специальные методы исследования включали:

- молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH диагностика) сперматозоидов;

- ПГС молекулярно-цитогенетическим методом - FISH (Таблица 4).

–  –  –

Для уточнения диагноза и выбора дальнейшей тактики лечения производился сбор анамнестических данных у женщин, который включал возраст, национальность, образование, наличие профессиональных вредностей, наличие вредных привычек, семейное положение. Данные вносились в индивидуальную карту пациента.

Измерялись рост, вес, артериальное давление (АД), пульс, исследовалось состояние подкожной жировой клетчатки (наличие ожирения, стрий), молочных желез, щитовидной железы и внутренних органов. Особое внимание уделялось оценке менструальной и репродуктивной функции (паритет, число родов в анамнезе, наличие осложнений во время беременности и родов).

Также выяснились перенесенные гинекологические и соматические заболевания, перенесенные операции. Для выявления наследственных заболеваний подробно собирался семейный анамнез. У каждой пациентки уточнялись данные о продолжительности бесплодия и методах его лечения на предыдущих этапах, о ранее проведенных программах ВРТ (дата и место проведения процедуры, использованная схема стимуляции суперовуляции, количество полученных ооцитов и эмбрионов, качество эмбрионов, перенесенных в матку, исход программы и др.).

Во время гинекологического исследования проводился осмотр наружных половых органов с оценкой их развития и анатомических особенностей, осмотр шейки матки в зеркалах. При бимануальном исследовании органов малого таза оценивались размер, форма и консистенция матки, ее подвижность, болезненность при пальпации, наличие образований в области придатков матки, наличие спаечного процесса в малом тазу.

Сбор анамнеза у мужчин производился в рамках медико-генетического консультирования с заполнением индивидуальной карты пациента. Уточнялась национальность пациента, собирались данные о ранее перенесенных соматических и инфекционных заболеваниях (инфекционный паротит), оперативных вмешательствах в паховой области, оценивалось наличие возможных профессиональных вредностей. Также проводилось детальное изучение наследственности (случаи бесплодия или рождения детей с генетической патологией у ближайших родственников), анамнеза бесплодия, репродуктивной функции мужчин (количество браков, наличие детей в предыдущих браках).

2.3.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза

УЗИ органов малого таза выполнялось в отделе функциональной диагностики ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (руководитель д.м.н. профессор Гус А.И.) на аппарате «Brulle Kierre» с использованием трансвагинального датчика. Первое УЗИ выполнялось в первую фазу менструального цикла, предшествующего циклу стимуляции суперовуляции.

Оценивались размеры и структура тела матки, эндометрия и яичников, определялось количество антральных фолликулов, диагностировалось отсутствие объемных образований в малом тазу. Далее УЗ-мониторинг стимуляции суперовуляции осуществляли на 2-3 день менструального цикла, на 6-й день стимуляции суперовуляции, далее ежедневно до введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина. Проводилась оценка динамики роста фолликулов и эндометрия для своевременной возможности коррекции дозы вводимого индуктора, а также с целью определения даты начального введения ант-ГнРГ и даты трансвагинальной пункции фолликулов. При условии положительного анализа -ХГ последнее УЗИ органов малого таза выполнялось на 21 день после переноса эмбрионов в полость матки, для диагностики развивающейся маточной беременности.

2.3.3. Гормональное исследование

Для оценки состояния эндокринной системы и овариального резерва проводилось гормональное исследование пациенток в научно-диагностической лаборатории ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Для этого использовался радиоиммунологический метод определения концентрации гормонов в крови. Исследование эндогенного гормонального фона проводилось в период ранней фолликулярной фазы одного из циклов, предшествовавших стимуляции функции яичников. Проводилось измерение концентраций в плазме крови следующих гормонов: ФСГ, ЛГ, Е2, Т, кортизола, 17-оксипрогестерона (17ОП), ДГЭА-С, ТТГ, Т4св, пролактина. Концентрацию прогестерона оценивали на 20-21 день менструального цикла в период лютеиновой фазы цикла.

2.3.4. Исследование эякулята

Мужчинам проводился анализ эякулята согласно рекомендациям ВОЗ 2010 года дважды с интервалом в 3 месяца [37]. Эякулят собирался в стерильный пластмассовый контейнер путем мастурбации после 3 дней полового воздержания. При анализе эякулята определяли характеристики клеточных элементов спермы: количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов, морфологические характеристики сперматозоидов, количество и типы лейкоцитов, количество и типы незрелых клеток сперматогенеза. Кроме того, оценивался объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, pH (Таблица 5). НЗС диагностировалась при условии соответствия параметров образца спермы принятым нормативным значениям.

Для оценки патологии эякулята руководствовались следующими критериями:

- аспермия – отсутствие эякулята;

- азооспермия – отсутствие сперматозоидов в эякуляте;

–  –  –

2.3.5.Молекулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов Помимо обязательного обследования пациентам проводилось молекулярноцитогенетическое исследование сперматозоидов в лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Количество хромосом сперматозоидов оценивалась с помощью FISH-метода. Классический метод FISH анализа основан на гибридизации известной по нуклеотидному составу ДНК пробы с учетом тестируемой хромосомы и последующим выявлением результата гибридизации по метке – флуоресцентному сигналу.

Проводилось исследование хромосом X,Y и 18. Препараты клеток эякулята готовили по методу Guttenbach [140]. Флюоресцентную in situ гибридизацию проводили в соответствии с «Протоколом подготовки образцов для гибридизации и проведения гибридизации». FISH анализ осуществлялся в несколько этапов [141]:

- получение препаратов и их предварительная подготовка;

- гибридизация с ДНК-пробой, то есть собственно технология FISH:

денатурация препарата с ДНК- пробой;

процедура гибридизации;

постгибридизационная отмывка препаратов;

- детекция ДНК-зонда при микроскопическом анализе.

Предподготовка эякулята осуществлялась путем инкубации в течение 30 минут при температуре +37С с добавлением фосфатного буфера PBS и центрифугировании в течение 8 минут при 2000 об/мин. Осадок ресуспендировали в фиксаторе метанол/уксусная кислота (3:1) и помещали в камеру при -20С не менее 1 часа. После смены фиксатора суспензию раскапывали на предметные стекла и высушивали на воздухе. Препараты хранили при комнатной температуре. Для гибридизации in situ использовали препараты, хранившиеся не более 3-х месяцев. Подготовка ядер сперматозоидов к гибридизации заключалась в:

- дегидратации препарата в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 5 минут в каждом;

- обработка стекла со сперматозоидами в 2 - 2,5% растворе NaOH и 2xSSC при комнатной температуре в течение 2-5 минут;

- повторная дегидратации препарата в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 5 минут в каждом.

Для флуоресцентной гибридизации in situ использовали зонды фирмы Abbott. Данный набор включает в себя: ДНК зонды для хромосом X, Y и 18;

противовыцветающий реагент и набор реагентов для Dapi II постгибридизационного отмывания препаратов. Гибридизация in situ состояла из следующих этапов:

- препарат высушивали на воздухе, к исследуемому образцу добавляли ДНК зонд, помещали на термоплату при 75С на 5 мин;

- препарат инкубировали во влажной камере в течение 2 – 4 часов при температуре 42С;

- постгибридизационное отмывание препарата проводили в 0.4Х SSC (рН 7.0при 73С 1 минуту, последующую отмывку проводили в растворе 2Х SSC/0.1% NP-40 при комнатной температуре от 5 до 50 секунд с последующим нанесением на препарат противовыцветающего реагента Dapi II.

Микроскопический анализ проводили при увеличении 100Х10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss. По количеству выявленных сигналов судили о количестве исследуемых хромосом.

Для каждого пациента были оценены не менее 500 сперматозоидов. У пациентов с выраженной ОЗС анализировали все доступные для анализа сперматозоиды.

2.3.6. Преимплантационный генетический скрининг

Молекулярно-цитогенетический скрининг состоял из двух этапов: биопсии бластомера и непосредственно молекулярно-цитогенетического исследования ядер. Биопсия эмбриона проводилась эмбриологом на 3 день развития эмбриона in vitro. Для биопсии одного бластомера использовали микроманипулятор Narishiga. Для прохождения zona pellucida использовали лазерную пушку фирмы Fertilase. Аспирацию бластомера производили с помощью микропипетки фирмы Сook. ПГС подвергались только эмбрионы хорошего качества, то есть имеющие от 6 до 10 бластомеров и фрагментацию не более 50% (классы А, В, С).

Подготовка ядра и гибридизации in situ проводилась согласно протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем. Выделение ядра из бластомера проходило с использованием 10 мкл гипотонического раствора, помещенного на предметное стекло. Гипотонический раствор, состоящий из 1% Твина 20 (1мл), 0.01 % раствора HCl (0,1 мл), дистиллированной воды (8,9 мл). Фиксацию ядер бластомеров проводили метанол-уксусным раствором (3:1) при комнатной температуре. Далее процесс гибридизации in situ состоял из следующих этапов:

1. Дегидратация препаратов с ядрами в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 2 минуты в каждом.

2. Экспозиция препарата в раствор пепсина при 37оС в течение 3 минут.

3. Помещение препарата в раствор 2xSSC при 37оС на 4 минуты.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
 

Похожие работы:

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.