WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

«ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

2) аномальная перестройка дисков коротких участков (11р13, 11р14, 11р15) и длинного плеча (11q14; 11q2; 11q23) 11 хромосомы, чаще всего происходящая в результате реципрокной транслокации, реже пара- и перицентрических инверсий (Андреева С.В. и др., 2007);

3) перестройка дисков 9q34 и 9q 22 длинного плеча 9 хромосомы в процессе аномальных делеций и транслокаций (Андреева С.В. и др., 2008;

Wan T.S. et al., 2003).

Природа возможных этиологических факторов, способных вызывать хромосомные нарушения, до настоящего времени точно не установлена. К ним относят ионизирующее излучение (Бурлакова Е.Б., Ерохин В.Н., 2001), вирусы и ряд химических соединений (Гурцева В.Э., 2006). Особое значение в развитии лейкозов придается также генетическим факторам, наследственной и приобретенной иммунной недостаточности, действию бластомогенных метаболитов.

Ряд ученых склоняется к кислородно-перекисной концепции лейкозогенеза, согласно которой причиной индукции и развития лейкоза являются гипероксические условия, возникающие, прежде всего, за счет нарушения нормального функционирования митохондрий и уменьшения их общего количества в клетке (Лю Б.Н., 2003).

Прогрессированию возникшего лейкоза способствуют дополнительные молекулярно-генетические события, к которым относят инактивацию опухолевых супрессоров (PP2A, pRb и р53) и дегрануляцию факторов транскрипции и трансляции (c-Myc, c-Myb). Кроме того, потеря хромосом, увеличение числа и амплификация центросом, нарушения в ЦОМ веретена деления инициирует прогрессирование заболевания. Также появление дефектов в системе КТВД (bub 1 и bubr 1) способствует активированию процессов, препятствующих индукции каспазонезависимой митотической гибели опухолевых клеток (Богданов К.В., 2009; Guo G. et al., 2000; Emambokus A. et al., 2003;

Topisirovic M. et al., 2003; Neviani P. et al., 2005).

1.3.2. Классификация лейкозов

В основе классификации лейкозов лежат два основных признака: гистогенетическая характеристика опухолевых клеток и степень их дифференцированности (Jaffe E.S. et al., 2001).

Согласно гистогенетической классификации, представленной в работе

Шиффман Дж. (2001), выделяют:

1) неопластические заболевания лимфоидных клеток, к которым относят лимфобластный, плазмоклеточный, пролимфоцитарный, волосатоклеточный и другие типы лейкозов;

2) злокачественные болезни из клеток миелоидной линии (миелоидный, промиелоцитарный, миелоцитарный и др.).

В зависимости от дифференцировки клеточных элементов различают острые и хронические лейкозы. Острые лейкозы гетерогенная группа опухолевых заболеваний системы крови с трансформированными молодыми незрелыми кроветворными элементами, вытесняющими нормальные клетки (Buonamici S. et al., 2003). Острые лейкозы происходят из мутировавшей стволовой кроветворной клетки, в которой, в результате повреждения генетического материала изменяются процессы транскрипции, нарушается способность контролировать клеточный цикл и продуцировать ряд ключевых белков (Дмитриев В.В., Дунаева И.А., 2009). В основе классификации острых лейкозов лежит цитологическая и иммунологическая характеристика бластной популяции (Мовчан Л.В., 2012).

Хронические лейкозы представляют собой пролиферативные злокачественные заболевания, субстратом которых являются созревающие и зрелые атипичные клетки. Более медленное течение хронических лейкозов по сравнению с острыми не является благоприятным. Хронические неоплазии более резистентны к терапии по сравнению с острыми формами (Fayad L., O’Brien S., 2005).

Острый лейкоз с течением времени не способен переходить в хронический, так как утраченную способность к дифференцировке опухолевый клон вновь приобрести не может, в то время как хронический лейкоз может трансформироваться в острый (Heim S., Mitelman F., 1995).

ОЛЛ (острый лимфобластный лейкоз) – опухоль, развивающаяся из клетки-предшественницы лимфопоэза. Выделяют три морфологических варианта ОЛЛ (L1, L2, L3), признаками которых являются различия в размере и форме ядер, структуре хроматина, вакуолизации цитоплазмы трансформированных клеток. По иммунологической классификации различают четыре вида Т-ОЛЛ и В-ОЛЛ (Clun W. et al., 2007). Наиболее встречающейся аномалией при ОЛЛ является наличие Филадельфийской хромосомы (Долинский Д.А., 2011).

ХЛЛ (хронический лимфоцитарный лейкоз) представляет собой опухоль иммунокомпетентной системы и ее периферических органов, подразделяется на Т- и В-формы. Развитие ХЛЛ обусловлено хромосомной абберацией клеток предшественниц, приводящей к трисомии 12-й хромосомы или нарушению структуры 6, 11, 13 или 14-й хромосом. В периферической крови возрастает содержание молодых форм лимфоцитов (пролимфоциты, иногда бласты), отличающихся дефектностью иммунологического ответа, снижением способности к бласттрансформации, появлением извращенных иммунологических реакций (Pulenzas N. et al., 2014).

ОМЛ (острый миелобластный лейкоз) – неопластическое заболевание, развивающееся из клетки предшественницы миелопоэза. Различные типы ОМЛ отличаются степенью утраты способности к дифференцировке (Testa U., Riccioni R., 2007). Для бластных элементов ОМЛ характерны делеции длинного плеча 5-й хромосомы и моносомия по 7-й хромосоме (Долинский Д.А., 2012; Ferrara F., Del Vecchio L., 2002).

ХМЛ (хронический миелоидный лейкоз) – неопластическое клоновое заболевание, возникающее в результате трансформации стволовой клетки и клетки-предшественницы миелопоэза, характеризуется наличием Рhхромосомы, добавочной Ph-хромосомой, трисомией 8-хромосомы (Druker B.J. et al., 2001; Melo J., Barnes D., 2007).

Независимо от принадлежности трансформированной популяции клеток крови в течение острых лейкозов выделяют следующие клинические стадии (O, Brien S., Keating M.J., 2005): начальная стадия (первые острые проявления заболевания); неполная ремиссия (положительная динамика заболевания с наличием 20% бластных клеток в костном мозге и полное их исчезновение из периферической крови); полная ремиссия (атипичные бласты в костном мозге не превышают 5%, показатели периферической крови близки к норме); излечение (полная ремиссия в течение 5 лет и более); повторное проявление заболевания (нарастание количества бластных клеток в костном мозге, появление внекостномозговых очагов кроветворения); терминальная стадия (увеличение опухолевых разрастаний на фоне неэффективности цитотаксической терапии).

Рядом ученых-клиницистов показано, что полная ремиссия не может считаться показателем выздоровления, так как неизбежно сменяется последующим обострением, протекающим отлично от начальной стадии заболевания. Установлено, что в период ремиссии возможно появление новой стволовой линии лейкемических клеток, приобретших устойчивость к применявшимся химиотерапевтическим агентам (Савва Н.Н., 2009).

В развитии хронических лейкозов различают хроническую фазу (умеренный лейкозоцитоз, количество атипичных бластов в костном мозге не превышает 7%) и терминальную фазу (блатсный криз, характеризующийся резким нарастанием числа бластных клеток в костном мозге и периферической крови) (O’Brien S., 1998).

1.3.3. Реологические свойства крови больных лейкозом Особым диагностическим критерием в течении и исходах гемобластозов является изменение реологических свойств крови, которые указывают на нарушения микроциркуляции у больных лейкозом. Тяжесть неопластического процесса определяется степенью нарушения транскапиллярного обмена, обеспечивающего гомеостаз (Evans P.A. et al., 2006).

При развитии острых лейкозов у подавляющего большинства больных, особенно в венулах, возникают сосудистые (извитость, неравномерность калибра и аневризмирование), внутрисосудистые (сладж-феномен) и переваскулярные (геморрагия, отек) нарушения (Молаева Н.Р., 2003). Такие изменения идентичны при разных типах лейкоза, но степень их выраженности различна (Бездетко П.А., 2009).

Характерным признаком микроангиопатий при развитии хронических миелолейкозов является снижение артериоло-венулярного коэффициента и увеличение венулярного калибра. Продолжительность болезни усугубляют нарушения микроциркуляции, а количество повторений заболевания увеличивает степень выраженности таких изменений (Молаева Н.Р., 2003).

Показано, что у больных различными формами лейкозов происходят нарушения в системе факторов протромбинового комплекса и протеинов С и S, в связи с чем легко возникают кровотечения, которые самостоятельно не останавливаются (Рощик А.С. и др., 2010).

1.4. Морфофункциональная организация лейкоцитов больных лейкозом

Морфология клеток. Общими признаками опухолевой трансформации форменных элементов крови, не зависимо от типа лейкоза, могут являться анизоцитоз лейкоцитов, увеличение числа и размеров нуклеол, повышение базофилии цитоплазмы, деформация контуров ядра, отшнуровка отдельных фрагментов, гипохроматоз, пикноз и рексис ядра (Шиффман Дж., 2001).

Специфическими особенностями лимфобластов больных лейкозов являются как правильная округлая форма, так и неровные контуры цитоплазмы, ядро занимает большую часть клетки и содержит одно ядрышко. В мазках крови больных ОЛЛ и ХЛЛ обнаружены клетки Риддера, представляющие собой лимфоциты с почкообразным и двухдольчатым ядром, и тельца Боткина-Гумпреха-Клейна в виде раздавленных при приготовлении препарата хрупких лимфоцитов и лимфобластов. На этапах прогрессирования лимфолейкозов морфологические изменения проявляются в исчезновении цитоплазмы и образовании голоядерных форм (Козинец Г.И., Макаров В.А.,1997;

Matutes E., Polliack A., 2000).

По данным электронной микроскопии клетки при ОЛЛ имеют умеренно ворсинчатую или пузырьковую поверхность с небольшими периферийными складками. В работе Tosh S.R. (1981) исследована структура плазмалеммы лимфобластов на разных этапах клеточного цикла. Показано, что в начале G1 периода интерфазы клеточная поверхность покрыта пузырьками, которые в середине G1 сменяются микроворсинками. К концу пресинтетического и в начале синтетического этапов лимфобласты имеют гладкую поверхность. В завершении S-фазы клеточная поверхность приобретает волнистую структуру с рафлами по краю цитоплазмы. Для лимфоцитов, находящихся в G2 периоде интерфазы, характерна густо покрытая филоподиями и микроворсинками клеточная поверхность, за счет которой осуществляется механический контакт между бластами. На этапе митоза лимфобласты имеют большое количество длинных филоподий, мелких и крупных пузырей. К концу телофазы клетки приобретают вытянутую форму с гладкой поверхностью.

Миелобласты при развитии лейкозов характеризуются правильной округлой или овальной формой. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) среднее или высокое, причем у бластных клеток мелких размеров ЯЦО наибольшее. Цитоплазма клеток серо-голубого цвета, в некоторых клетках присутствует азурофильная зернистость. Ядра чаще всего имеют округлую форму, неправильная форма ядер характерна для крупных бластов.

Структура ядерного хроматина нежная, в ядрах обнаруживаются 1-4 ядрышка различной величины (Краснова Л.С., 2009).

Иммунофенотипическая характеристика и биохимические особенности клеток. Ключевую роль в типировании лимфопролиферативных заболеваний играет иммунологическая характеристика клеток крови. Показано, что лейкимические бласты больных ОЛЛ характеризуются многочисленными иммунофенотипическими аберрациями (Байдун Л.В., 1997). В отличие от нормальных лимфоцитов опухолевые клетки интенсивно экспрессируют CD10, 19, 20, 34, 38, 45 и 58 (Шиффман Дж., 2001).

Цитохимические исследования показывают, что в лимфоцитах больных ОЛЛ, преобладают процессы деградации глицерофосфолипидов, значительно понижена активность АТФазы и нуклеаз, до 90% бластных клеток содержат полисахариды в виде гранул различных размеров (Казарян П.А. и др., 2011).

В лимфобластах не синтезируется пероксидаза, неспецифическая эстераза и хлорацетат по сравнению со здоровыми клетками. Т-клеточные бласты характеризуются повышенной активностью кислой фосфатазы, присутствием фермента терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (Шиффман Дж., 2001).

Для лимфоцитов больных ХЛЛ характерны иммунофенотипы CD5, CD19, CD20, CD23, CD24, CD31 и CD38, иногда СD10, основу бластов составляют СD5 В-лимфоциты. Показано, что СD38 и CD31, взаимодействуя между собой, приводят к избыточной экспрессии CD100, который способствует бесконтрольной пролиферации клеток и повышает агрессивность лейкоза (Chiorazzi N., Ferrarini M., 2003).

Лимфобласты характеризуются сниженным количеством антигенных сайтов L-цепи Ig по сравнению с нормальными лимфоцитами, высоким уровнем CCR7-рецептров, опосредующих хемокиновые эффекты, что способствует метастазированию в лимфоузлы (Harris N.L. et al., 2001).

Для лимфоцитов больных ХЛЛ показана повышенная активность АТФазы и преобладание процессов деградации глицерофосфолипидов, что приводит к значительному нарушению метаболизма фосфоинозитидов и подавлению функциональной активности мембран, оказывая негативное влияние на защитные механизмы иммунной системы (Казарян П.А. и др., 2011).

Установлены нарушения биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот лимфобластов, что ведет к изменению продолжительности фаз клеточного цикла и дестабилизации структуры ДНК (Когарко И.Н., 1991).

У больных ОМЛ лейкемические клетки характеризуются сложным иммунофенотипом. В крови больных ОМЛ определены незрелые клетки с высокой экспрессией антигенов CD34 и CD117, клоны клеток с признаками дифференцировки в направлении гранулоцитопоэза с антигенами CD13, CD15, CD33, CD65 (Глузман Д.Ф. и др., 2010). Миелобласты содержат большое количество миелопероксидазы (Вильчевская Е.В., Тютюнник В.В., 2008), катионов Ca2+ и Mg2+ (Jaffe E.S. et al., 2001).

Бластные клетки больных ХМЛ имеют иммунологический фенотип примитивной стволовой клетки (CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD19, CD33, CD34, CD38, CD45RA и HLA-DR), тогда как цитохимические маркеры свидетельствуют о миелоидной направленности дифференцировки, что расценивается как показатель их принадлежности к ранним предшественникам клеток миелоидного ряда. Миелобласты больных ХМЛ содержат большое количество фосфолипидов, пероксидазы и хлорацетат эстеразы, характеризуются моноклональным типом экспрессии изоэнзима глюкозо-6фосфатдегидрогеназы и сверхэкспрессией протеолитических ферментов (ММР-2 и ММР-9), что способствует проникновению миелобластов в ткани.

Обнаруженная, в большом количестве в бластах больных ХМЛ, Src-киназа, вызывает остановку апаптоза опухолевых клеток (Parsons S.J., Parsons J.T., 2004).

Организация элементов цитоскелета в клетках больных лейкозом.

Клетки больных лейкозом характеризуются рядом физиологических отклонений, обусловленных дефектами структур цитоскелета (Mullins R.D., Machesky L.M., 2000). Общим для разных типов бластов у больных лейкозом являются реорганизация и динамические изменения актина (Friedl P., Gunzer M., 2001), спектрина (Pfeffer L.M., Landsberger F.R., 1990).

На актиновые компоненты цитоскелета опухолевых клеток оказывает воздействие TPA. В неиндуцированных ТРА бластах больных лейкозом Fактин преимущественно связан с точкообразными структурами, представляющими собой неоднородные контакты, разбросанные по поверхности мембраны. После индукции TPA эти структуры локализуются в центре клетки около ядра (Mullins R.D., Machesky L.M., 2000). В некоторых клетках появляются удлиненные актин-содержащие выступы, которые никогда не встречаются в нормальных лимфоцитах (Barton G.M., Medzhitov R., 2003).

Большое влияние на распределение спектрина в цитоскелете клетки оказывает IFN-. Это вещество белковой природы регулирует рост, дифференцировку и миграцию здоровых, а также патологических лимфоцитов.

IFN- увеличивает общее содержание спектрина в клетках больных лейкозом примерно в 2-4 раза. Кроме того, IFN- изменяет клеточное распределение некоторых других белков цитоскелета, таких как актин и тубулин (Ghia P., 2008).

IFN-, обладая способностью регулировать текучесть и деформируемость плазматической мембраны, вызывает снижение числа мигрирующих лейкозных клеток, и тем самым играет важную роль в их передвижении. Под воздействием интерферона в лимфоцитах больных лейкозом происходит формирование дискретных скоплений спектрина. Лимфоциты, у которых спектрин равномерно распределен внутри клетки и связан с мембраной, характеризуются низкой вязкостью цитоплазмы.

Процесс образования агрегатов из спектрина включает в себя активацию синтеза этого белка, что необходимо для его перемещения внутри клетки. Влияние IFN- связано с изменениями в деятельности протеинкиназы C (PKC). IFN- активизирует конкретные изоферменты РКС в лимфобластных клеточных линиях. На поверхности лимфоцитов находятся рецепторные комплексы, которые влияют на активацию РКС и быстро изменяют внутриклеточную локализацию спектрина (Evans S.S. et al., 1990). На распределение спектрина оказывает значительное влияние применение химиотерапии. Белок цитоскелета в здоровых и клетках больных, выделенных до первого курса химиотерапии, равномерно распределен в цитоплазме. В клетках, полученных после первого курса химиотерапии, агрегация спектрина наблюдается в области ядра. Кроме того, в лимфоцитах после лечения цитостатиками присутствуют нерастворимые фракции спектрина. В нормальных и злокачественных клетках до начала химиотерапии спектрин полностью растворим (Annunziato F. et al., 1999).

В бластах миелоидного происхождения актин находится в полностью поляризованном состоянии, что ведет к дефектам передвижения и ускорению клеточной дегрануляции. По мере прогрессирования миелопролиферативного заболевания происходит частичное или полное разрушение нитей актина, обуславливающее значительные изменения клеточного метаболизма за счет активации ионных каналов (Negulyaev Y.A. et al., 1996).

Механические свойства клеток больных лейкозом. К настоящему времени показано, что наибольшей жесткостью обладают бласты миелоидного происхождения, которые в 18 раз жестче, чем лимфобласты, и в 6 раз, чем нормальные нейтрофилы (Rosenbluth M.J. et al., 2006). В результате снижения упруго-эластических свойств миелобласты обладают пониженной способностью к деформации и прохождению по капиллярам, что провоцирует кровоизлияния и дыхательную недостаточность у больных лейкозом (Porcu P. et al., 2002).

В работе Sharma K. (1993) показано, что индекс деформируемости бластов при острых лимфо- и миелолейкозах выше, чем у клеток при хронических гемобластозах. Установлено, что размер бласта и большая жесткость ядра, занимающего практически всю клетку, по сравнению с цитоплазмой, не обуславливает жесткость в целом, так как особое значение в изменении механических свойств клеток играют структуры цитоскелета (Rosenbluth M.J. et al., 2006).

На упруго-эластические свойства опухолевых клеток значительное влияние оказывает химиотерапия, так при контакте с цитостатиками их жесткость увеличивается в несколько раз, что уменьшает их способность проходить через капилляры (Фишер Т., Адельман Д., 2000). После воздействия химиотерапевтических веществ происходит сжатие клеток в связи с увеличением плотности цитоплазмы из-за снижения объема клетки (Friedl P., Gunzer M., 2001).

1.5. Митогены, механизмы действия

Митогены представляют собой разнообразные химические вещества, которые способны активировать клетки, стимулируя их деление. Большинство митогенов представлено лектинами, которые связываются с группой углеводов мультимерных гликопротеидов. Источником лектинов являются растительные и животные организмы. К лектинам, оказывающим стимулирующий эффект на лейкоциты, относят конканавалин А (Кон А) и фитогемагглютинин (ФГА) (Макурина О.Н., 2007).

Кон А выделяют из Канавалии мечевидной (Canavalia ensiformis). При pH7 Кон А представляет собой тетрамер, состоящий из двух -структурных слоев, ориентированных перпендикулярно друг другу. При pH 6 тетрамер диссоциирует на димеры. Молекулярная масса Кон А составляет 25,5 кДа (Toyabe S. et al., 1997).

Кон А обладает способностью связываться с различными клетками млекопитающих. В большей степени он агглютинирует суспензии многих видов опухолевых клеток, и клеток, трансформированных канцерогенами или вирусами, чем нормальных клеток. Способность к агглютинации Кон А объясняется формированием перекрестных связей между клетками в результате реакции лектина с углеводными группами на клеточной поверхности (Mannino R.

J., Burger M.M., 1975). В растворе тетрамерный Кон А имеет митотическую активность по отношению к Т-лимфоцитам, после сшивки двух молекул лектина, он начинает стимулировать и В-клетки. Димерный Кон А способен вызывать образование на поверхности клеток «колпачков» из молекул рецепторов (кэппинг) и активировать Т-клетки. Мономерная форма Кон А связывается с лимфоцитами, но не стимулирует ни кэппинга, ни приводит к активации (Xiang M., 1999). Показано, что после активации клеток синтез ДНК зависит от присутствия Кон А в среде в течении первых трех часов, а так же в течение периода между 16 и 24 часами от начала контакта. С 3 по 16 час стимуляции присутствие Кон А на синтез ДНК не влияет, основным стимулирующим фактором является поток Са2+ в клетку, индуцированный лектином (Tayoshima S.et al., 1976).

Лимфоциты, активированные Кон А, характеризуются высоким уровнем выработки ИЛ-2 и повышенной способностью к экспрессии рецепторов к ИЛ-1. Экспериментально установлено, что для пролиферативного ответа лимфоцитов на Кон А необходимо присутствие макрофагов, причем до 5% клеток в культуре. Увеличение содержания макрофагов приводит к снижению пролиферативного ответа лимфоцитов. Ингибирующее влияние избытка макрофагов на пролиферацию лимфоцитов объясняется действием перекиси водорода, которая образуется в результате дисмутации супероксидных радикалов, выделяющихся стимулированными макрофагами (Обернихин С.С., 2005).

ФГА выделяют из красной фасоли (Phaseolus vulgaris). Лектин состоит из двух фракций: R-ФГА с высокой гемагглютинирующей и низкой митогенной активностью, L-ФГА с низкой гемагглютинирующей и высокой митогенной активностью. L-ФГА состоит из четырех связанных нековалентными связями идентичных -субъединиц с молекулярной массой 34 кДа каждая.

Имеющий аналогичную структуру R-ФГА построен из четырех субъединиц. L- и R-ФГА не ассоциированы друг с другом. Анализ аминокислотной последовательности - и -субъединиц показал, что разница в связывающей способности двух фракций ФГА определяется различием в очень ограниченных участках (Zhang J. et al., 2009).

Лектин вступает в связывание с клеточной поверхность как В-, так и Тлимфоцитов за первые 30 мин воздействия, сенсибилизация возможна только в присутствие ионов Са2+ и Mg2+. Для активации клеток существенна сшивка молекул на плазмалемме и не обязательно проникновение митогена внутрь лимфоцита. Для получения пролиферативного эффекта необходимо, чтобы ФГА контактировал с клеткой в течение нескольких часов, при этом количество занятых митогеном участков на поверхности лимфоцитов должно составлять 3 – 10% от всех потенциально связывающих участков (Гуковская А.С., 1984).

Наиболее ранним признаком активации лимфоцитов ФГА является увеличение скорости синтеза белка к 8 часу взаимодействия клеток и митогена.

Увеличение размеров лимфоцитов начитается с 16 часа активации (Ferris et al., 1988). Узкое исходное распределение лимфоцитов по размерам после активации становится более широким: через 16 часов активации доля бластов составляет 25-30%, через 48 часов – 65% от общего числа клеток. Увеличение количества бластных форм сопровождается нарастанием удельного содержания калия в клетках. Синтез ДНК в активированных лимфоцитах начинается с 24 часа и достигает максимума в интервале 48-72 часов (Веренинов А.А. и др., 1991).

Клетки больных лейкозом не зависимо от типа гемобластоза, обладают сниженной восприимчивостью к действию митогенов, по сравнению с лимфоцитами здоровых людей, что объясняется меньшим количеством сайтов связывания для Кон А или ФГА на поверхности клеток. Установлено, что анеуплоидные клетки при острых лейкозах после митотического деления, стимулированного ФГА, переходят в диплоидные (Michaeli J., 1986).

По данным литературы, несмотря на различия в химической организации Кон А и ФГА, механизм активации лимфоцитов этими митогенами сходен. Основную роль в стимуляции клеток играет концентрация митогена и количество рецепторов связывания для него на клеточной поверхности (Hayashi S. et al., 1993). Показано, что механизмы действия митогенов и пути клеточного ответа состоят из двух этапов: 1) CD2- или CD5-зависимая активация экспрессии генов ИЛ-2; 2) пролиферативный ответ лимфоцитов на ИЛGringhuis S. et al., 1997).

В литературных источниках не удалось найти данных о различиях CD2и CD5-путей активации. Общие механизмы сигнальных каскадов от воздействия митогена на молекулы CD2 и CD5 до выработки лимфоцитом ИЛ-2 показаны на схеме 1.

Схема 1. Путь митогенной активации синтеза ИЛ-2.

Показано, что митогены вызывают активацию CD2 и CD5, при этом Cакальмодулинзависимая киназа IV типа выступает коактивационным фактором (Ginghuis S.J. et al., 1997). Далее происходит связывание молекул CD2 и CD5 с рецепторным комплексом TCR/CD3 на поверхности лимфоцитов, что обуславливает активацию Са2+ каналов и как следствие Са2+индуцированного фактора роста (Izquierdo J.H. et al., 2014). В свою очередь этот фактор служит пусковым сигналом экспрессии генов ИЛ-2, дополнительными стимулами и контролирующими элементами этого пути являются Rac 1 и транскрипционные факторы (Arrizabalaga O. et al., 2012). Результатом описанного сигнального пути является синтез ИЛ-2 лимфоцитами.

Второй этап митогенной стимуляции лимфоцитов начинается с воздействия ИЛ-2 на рецепторы плазмалеммы и заканчивается пролиферацией клетки (схема 2).

Схема 2. Активация пролиферации лимфоцита.

В результате связывания ИЛ-2 с его рецептором ИЛ-2R на поверхности лимфоцита происходит активация двух сигнальных путей. В первом случае Ras способствует фосфолирированию Raf с последующей активацией MEK (митогенактивированная протеинкиназа) и ERK (внеклеточная регуляторная киназа). Во втором случае происходит последовательная активация Jakкиназы и фактора STAT. Итогом, как первого, так и второго пути, является транслокация сигнала в ядро, где активируется G1-транскрипционный фактор, стимулирующий пролиферацию клетки (Fung M.M. et al., 2003).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация эксперимента Проведено 3 серии экспериментов, в каждой из которых исследовали кровь больных лейкозом (255 обследованных в возрасте от 18 до 45 лет) и здоровых людей (150 обследованных в возрасте от 25 до 45 лет). В работе использовали кровь больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в стадии обострения и ремиссии болезни, хроническим лимфобластным лейкозом (ХЛЛ) после лечения. Забор крови, общий клинический анализ крови здоровых и больных людей, а также цитохимический анализ клеток крови больных лейкозом и постановка диагноза выполнены на базе клинико-диагностической лаборатории областной клинической больницы им. Святителя Иосафа г. Белгорода с участием специализированного медицинского персонала.

Первая серия исследований включала изучение свойств и структуры поверхности, культивируемых в питательной среде, лимфоцитов больных лейкозом.

Формировали контрольную и опытную группы. В контроле изучали кровь 50 здоровых людей. В опытной группе исследовали кровь больных острым лимфобластным типом на стадии обострения (25 пациентов) и в стадии ремиссии болезни (15 пациентов), острым миелобластным типом (20 больных) и хроническим лимфобластным типом (25 больных).

Во второй и третьей серии исследований моделировали митогенстимулированную нагрузку на лимфоциты в культуре и изучали свойства и структуру поверхности субпопуляций клеток. Согласно данным литературы, митогены способны вызывать в здоровых клетках трансформации, сходные с преобразованиями, происходящими при опухолевом перерождении (Ломакин М.Е., 2009; Шутова М.С., 2010). Несомненный интерес к исследованию лимфоцитов, стимулированных митогенами, заключается в создании модели, которая позволит изучать изменения морфофункциональных параметров клеток крови в условиях, приближенных к неопластическому процессу. В виду чего, во второй серии экспериментов исследовали влияние митогена конканавалина А (Кон А) на структурную организацию и функциональные свойства лимфоцитов здоровых и больных лейкозом пациентов. В этой серии исследована кровь 50 здоровых людей. В группе больных изучена кровь 25 пациентов с диагнозом ОЛЛ на стадии обострения болезни и 15 в ремиссии, 25 больных ХЛЛ и 20 пациентов с ОМЛ.

В третьей серии изучали морфофункциональные параметры лимфоцитов, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА). Исследована кровь 50 здоровых людей, больных ОЛЛ в стадии обострения (25 пациентов) и в ремиссии (15 пациентов), ХЛЛ (25 пациентов), ОМЛ (20 пациентов).

В работе использовали следующие морфофункциональные методы:

1) общий и дифференциальный анализ крови;

2) цитохимическая диагностика лейкозов;

3) культивирование суспензии лимфоцитов;

4) атомно-силовое сканирование в режимах: полуконтактного сканирования, силовой спектроскопии, зонда Кельвина;

5) реакция торможения миграции лимфоцитов в прямом капиллярном тесте;

6) морфологические методы анализа цитологических фиксированных препаратов лимфоцитов: визуализации и измерение длины структур цитоскелета; оценка пролиферативного потенциала и учет числа ядрышек в лимфоцитах.

2.2. Общий клинический анализ крови и цитохимическая диагностика лейкозов

Забор периферической крови здоровых пациентов и больных лейкозом осуществляли из локтевой вены в вакуумные пробирки Vacuette K3E, содержащие сухую ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, предотвращающая свертывание крови путем блокирования ионов кальция) в концентрации 2,0 мг на 1 мл крови (0,006843 моль/литр).

Общий и дифференциальный анализ крови проводили при непосредственном участии врачей-лаборантов клинической лаборатории, которые осуществляли подсчет числа форменных элементов крови, лейкоформулы, определение концентрации гемоглобина, показателя гематокрита и расчет индексов красной крови на автоматическом гематологическом анализаторе Beckman Coulter LH500 (Франция, 2010).

Цитохимическая диагностика лейкозов. С целью диагностики острых типов лейкозов использовали алгоритм цитохимической диагностики, принятый в клинической онкогематологии (Почтарь М.Е. и др., 2003). Первоначально окраску мазков крови больных осуществляли по методу ГрехемаКнолля, используя набор реагентов для цитохимического определения пероксидазы в лейкоцитах Диахим-ЦитоСтейн-МПО (производитель НПФ «Абрис +», Санкт-Петербург, 2012). Положительно окрашенные бласты на мазках свидетельствуют о развитии миелобластного типа лейкоза, отсутствие окраски бластов указывает на развитие острого лимфобластного лейкоза.

Для дальнейшей диагностики типов лейкозов использовали окраску проб крови на выявление мукополисахаридов с помощью PAS-реакции, используя набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах Диахим-ЦитоСтейн-ПАС (производитель НПФ «Абрис+», СанктПетербург, 2012). В эксперимент отбирали пробы крови, в которых реакция на миелопероксидазу была отрицательной и PAS-реакция положительная в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, что указывает на развитие ОЛЛ (Глузман Д.Ф., 2000).

Мазки крови с положительной реакцией на миелопероксидазу и PAS реакцией с диффузным окрашиванием цитоплазмы окрашивали по методу Loffler, используя набор реагентов для цитохимического определения неспецифической эстеразы в лейкоцитах Диахим-ЦитоСтейн-НЭ (производитель НПФ «Абрис+», Санкт-Петербург, 2012). В эксперимент отбирали пробы с положительной окраской на неспецифическую эстеразу, которая не подавляется фторидом натрия, что соответствует ОМЛ в соответствии с Франкоамерикано-британской классификацией (FAB) острого миелоидного лейкоза:

М1 – острый миелобластный лейкоз без дифференцирования, М2 – острый миелобластный лейкоз с формированием некоторых гранул, М3 – острый промиелобластный лейкоз (промиелоцитарный).

Диагностику хронического лимфобластного лейкоза осуществляли методом селективного гейтирования на проточном цитометре FACS Cantu II (США, 2010), используя стандартные панели моноклональных антител для Ти В-лимфоцитов.

41

2.3. Морфофункциональные методы исследования лимфоцитов

2.3.1. Культивирование лимфоцитов

Разделение проб крови на лейкоциты и эритроциты осуществляли путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об./мин. Полученную надосадочную жидкость и лейкоцитарное кольцо отбирали, затем центрифугировали 10 мин при той же скорости. Получали суспензию лейкоцитов.

Культивирование лейкоцитов осуществляли по схеме, рекомендованной в патенте РФ № 2084523 Фроловой И.В. с соавт. (1993). Для приготовления 1 пробы 1 мл свежевыделенной суспензии лейкоцитов смешивали с 5 мл питательной смеси и инкубировали в течение 48 часов при 37°C в присутствии 5% CO2. Питательная смесь содержала 3 мл среды RPMI-1640 с HEPESбуфером («ПанЭко», Россия), 1 мл среды Хенкса 199 с глутамином и антибиотиками («ПанЭко», Россия), в одном литре которой были растворены 2,5 г канамицина сульфата, 5,0 г стрепномицина сульфата, 5·106 ед. бензилпенициллина натриевой соли, и 1 мл аутологичной плазмы. По окончании времени инкубации из каждой пробы отбирали 4,5 мл питательной среды, оставшуюся часть которой перемешивали с лейкоцитарной массой, находящейся на дне инкубационной пробирки.

При моделировании процессов митогеной стимуляции деления клеток в культуральную среду (состав описан выше) добавляли Кон А и ФГА, доза которых была выбрана согласно известным методикам и составила 0,02 мл на 5 мл культуральной среды (патент № 2084523; Эшмен Р.Ф., 1987). Лимфоциты в пробах с митогенами и без них культивировали в течение 48 часов при температуре 37°С, по истечении времени инкубации готовили суспензионные препараты для исследований структуры и функциональных параметров клеток.

Суспензии лимфоцитов, прошедшие митогенную стимуляцию Кон А и ФГА, состояли из гетерогенной популяции клеток, которые различались по геометрическим параметрам. На основе величин диаметров лимфоциты были разделены на 3 группы: микроциты – клетки в диаметре до 5 мкм, нормоциты

– 5,1-10 мкм, бласты – свыше 10 мкм. Причем микроциты представляли собой субпопуляцию молодых лимфоцитов, образовавшихся в результате деления бластных форм, трансформировавшихся из исходных клеток в результате активации митогенами (Эшмен Р.Ф., 1987). Нормоцитами могут быть исходные клетки, не прошедшие процесса бласттрансформации, либо лимфоциты новой субпопуляции, представляющие собой выросшие микроциты (Эшмен Р.Ф., 1987; Веренинов А.А. и др., 1991).

2.3.2. Методы исследования клеток крови на АСМ Режим полуконтактного сканирования. Геометрические параметры и микрорельеф поверхности лимфоцитов изучали в полуконтактном режиме на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71; производитель NTМDТ, Зеленоград, 2009). Для сканирования использовали кантилеверы серии NSG03 с радиусом закругления 10 нм. Сущность метода состоит в колебании кантилевера над поверхностью образца с частотой развертки сканирования порядка 0,6-0,8 Гц. Схема рабочей части микроскопа представлена на рисунке 1 (Руководство пользователя, 2006).

Рис. 1. Схема рабочей части АСМ.

Пробоподготовку для АСМ-исследования проводили следующим образом: суспензию лейкоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и помещали во влажную камеру (патент РФ № 98248). Из каждой пробы сканировали по 15 лимфоцитов согласно разработанному «Способу исследования нативных клеток крови» (патент РФ № 2398243).

На полученных сканах измеряли морфометрические параметры лимфоцитов и анализировали неоднородности их клеточной поверхности. Морфометрию клеток осуществляли, используя программные продукты:

- Nova (NT-MDT, Россия, 2009) – для расчета высоты (h, мкм) и диаметра (d, мкм) клеток;

- Gwyddion (Czech Metrology Institute, 2004) – для расчета площади поверхности (S, мкм2) и объема (V, мкм3) клеток. Алгоритм работы программы Gwyddion состоит в том, что полученный скан разбивается на множество отдельных участков и происходит обработка каждой части полученного изображения с учетом морфологических образований поверхности клеток. После этого полученные результаты суммируются, и программа выдает окончательный результат.

Данные полученные с помощью программных продуктов существенно различаются и являются более точными по сравнению со значениями, которые можно вычислить с использованием стандартных формул для расчета геометрических параметров клеток.

С целью оценки структурных неоднородностей клеточной поверхности проводили подсчет числа морфологических образований поверхности и измеряли их линейные размеры на участке плазмалеммы площадью 33 мкм.

Строили кривые профиля бокового сечения (рис. 2).

Рис. 2. АСМ-изображение и вид профиля поверхности.

А – глобулярный выступ на профиле поверхности (по оси абсцисс – длина профиля сечения, по оси ординат – высота профиля сечения).

Режим силовой спектроскопии. Упруго-эластические свойства лимфоцитов изучали в режиме силовой спектроскопии в соответствии с двумя подходами. В первом случае измеряли общую жесткость клетки с использованием модифицированного зонда, изготовленного на основе полимерных микросфер, прикрепленных к типлессу серии CSG 11, согласно разработанному автором в коллективе с соавторами «Способу определения упругости клеток крови» (патент РФ № 2466401). Регистрацию модуля Юнга, количественно характеризующего жесткость, осуществляли с помощью модифицированного сенсора, который воздействует на всю поверхность лимфоцита одновременно и с одинаковой силой, в результате чего можно получить «суммарную» силовую кривую с каждой клетки, как с гомогенного материала (Dimitriadis Е.К.

et al., 2002). Изготовление модифицированного кантилевера начинали с приготовления густого раствора желатина, в котором ополаскивали типлесс, давали ему немного остыть и подсохнуть на воздухе в течение 2-3 минут, не доводя до превращения желатина в гель. Суспензию лимфоцитов наносили на один край предметного стекла, на другой край которого наносили водную суспензию полых полимерных микросфер с диаметром 5 мкм (PS, производитель Micropartieles GmbH, Германия). Исследуемый препарат помещали во влажную камеру, насыщенную парами воды (патент РФ № 98248). Сначала проводили процедуру силовой спектроскопии на участке предметного стекла, где расположены микросферы, осуществляя подвод типлесса к отдельно лежащей полой микросфере, таким образом, чтобы она прикрепилась к типлессу. Получали модифицированный сенсор (рис. 3).

Рис. 3. Вид модифицированного кантилевера.

Изменяли область сканирования, перемещаясь на противоположный край препарата, где расположена суспензия клеток, и осуществляли процедуру силовой спектроскопии. Силовые кривые отвода и подвода кантилевера регистрировали с поверхности 15 микроцитов, 15 нормоцитов и 15 бластов из каждой пробы.

Во втором случае оценивали механические свойства поверхности в локальных участках 15 клеток каждой субпопуляции. Для этого использовали стандартный зондовый датчик серии NSG 03, при наложении нагрузки на клеточную поверхность в 25 точках (рис. 4).

В результате проведения АСМ-спектроскопии получали силовые кривые подвода и отвода (см. рис. 4, а). Для расчета модуля Юнга использовали кривые подвода, которые с помощью скрипта DFL_to_Force программного обеспечения Nova (NT-MDT, Россия, 2009) преобразовывали из системы координат «ток рассогласования – высота» в систему координат «сила – высота».

–  –  –

Рис. 4. Точки наноидентирования, силовые кривые и карта упругости лимфоцита.

а – экспериментальные кривые сближения зонда с поверхностью (синяя – кривая подвода, красная – кривая отвода зонда); б – изображение клетки; в – соответствующие локальные точки силового воздействия на поверхность клетки; г – результаты силовой спектроскопии (темные квадраты – точки максимальной жесткости).

Проводили расчет глубины погружения зонда в образец по формуле (Israelachvilli J., 1992):

(1) где Х – глубина погружения зонда, Z – значение преобразованной силовой кривой, равное DX (nm), SetPoint – величина входного сигнала цепи обратной связи при сканировании (nA), DFL0 –значение преобразованной силовой кривой, равное Y (nA), DFL – значение преобразованной силовой кривой, равное DY (nN).Значения DX (nm), DY (nN) и Y (nN) определяли по преобразованной силовой кривой подвода.

Определяли силу, с которой зонд действовал на образец, используя закон Гука:

(2) где k – жесткость зонда (Н/м), х – глубина погружения зонда (нм).

Модуль Юнга рассчитывали по формуле (Capella B., Dieter G., 1999):

(3) где F – сила, с которой зонд действует на образец, R – радиус закругления зонда, E – модуль Юнга, h – глубина погружения зонда в образец.

Режим зонда Кельвина. Применяемый в настоящее время метод зонда Кельвина основывается на двухпроходной методике. В первом проходе определяется рельеф поверхности образца с использованием полуконтактного метода сканирования (Руководство пользователя, 2006). На втором проходе этот рельеф отслеживается при прохождении зонда над образцом на некоторой высоте для определения поверхностного электрического потенциала (рис. 5, а).

Рис. 5. Распределение ПП по поверхности лимфоцитов.

А – скан лимфоцитов (первый проход), Б – распределение ПП по поверхности лимфоцитов (второй проход).

Измерение потенциала поверхности (ПП) осуществляли с помощью кантилевера с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, USA). Из каждой пробы сканировали по 15 клеток и проводили обработку полученных сканов в программе Nova (Зеленоград, 2009). На сканах, отражающих распределение потенциала по поверхности лимфоцитов, с помощью инструмента «Point Instruments» в программе Nova (NT-MDT) определяли значение ПП в 10 участках каждой клетки (см. рисунок 5б), рассчитывали среднее значение для всех клеток пробы.

Суспензию лейкоцитов для измерения потенциала поверхности (ПП) готовили согласно «Способу регистрации изменения поверхностного заряда»

(патент № 2027188). Белые клетки крови отмывали изотоничным раствором хлорида натрия в течение 5 мин. Фиксацию клеток осуществляли 0,25% раствором глутарового альдегида в течение 20 мин в соотношении суспензия клеток фиксатор 1:1. По истечении указанного времени суспензию лейкоцитов дважды отмывали изотоничным раствором хлорида натрия по 5 мин и готовили препараты на обезжиренной металлической подложке.

При измерении ПП лимфоцитов, стимулированных Кон А и ФГА не проводили разделение клеточных форм на микроциты, нормоциты и бласты, из-за сложности визуализации отдельных субпопуляций лимфоцитов, помещенных на металлическую подложку.

2.3.3. Изучение функциональной активности лимфоцитов

Реакция торможения миграции лимфоцитов в прямом капиллярном тесте. Миграционную активность лимфоцитов оценивали с помощью реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ). Преимуществами данного метода, помимо минимизации воздействия на клетки, являются простота в оценке полученных результатов, небольшой разброс значений и использование стандартного оборудования. В основе РТМЛ лежит феномен подавления миграции лимфоцитов веществом, синтезируемым клетками, взаимодействующими с митогенами (Хаитов Р.М., 2005).

Использовали методику РТМЛ в прямом капиллярном тесте с учетом жизнеспособности лимфоцитов не менее 95% (Новиков Д.К. и др., 2006).

Лимфоцитарную взвесь в количестве 0,02 мл ресуспендировали в 4 мл культуральной среды RPMI-1640. Жизнеспособность клеток проверяли в камере Горяева после окраски трипановым синим. В камере Горяева подсчитывали сто клеток, учитывая процент окрашенных (погибших).

Клеточной суспензией (0,1 мл) заполняли стеклянный капилляр. С одного конца капилляр запаивали; другой, содержащий клетки, погружали в агарозные лунки, заполненные 1 мл среды № 199. Для каждой суспензионной пробы в затвердевшем геле пробивали не менее 5 лунок (размером 2,5 мм).

Капилляры инкубировали при 37°С в течение 24 ч в строго вертикальном положении (рис. 6).

Рис. 6. Реакции торможения миграции лимфоцитов в прямом капиллярном тесте (Новиков Д.К. и др., 2006).

Капилляры извлекали из лунок пинцетом. Мигрировавшие из них клетки ресуспензировали, оценивали их жизнеспособность описанным выше способом. Количество лимфоцитов человека в 1 мкл крови определяли стандартными методиками (Золотницкая Р.П., 1987), согласно которым подсчет лимфоцитов вели в 25 больших квадратах сетки счетной камеры Горяева под большим увеличением (окуляр 20х, объектив 40х).

Число лимфоцитов рассчитывали согласно формуле:

(4) где Х – число лимфоцитов в 1 мкл крови; а – число лимфоцитов в 25 больших квадратах; б – разведение крови (20); в – число подсчитанных малых квадратов (400); 400 – объем одного малого квадрата 1/400.

Находили среднее число клеток в группе из пяти капилляров.

Вычисляли индекс подавления миграции лимфоцитов митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. Расчет проводили по следующим формулам (Новиков Д.К., 2005):

(5) (6) где ИТМЛ – индекс торможения миграции лимфоцитов; n (к) – количество мигрировавших лимфоцитов без воздействия митогенов (контроль); n (о) – количество лимфоцитов, мигрировавших под влиянием митогенов ФГА или Кон А (опыт).

Разделение культивированных с Кон А и ФГА лимфоцитов на субпопуляции не проводили. ИТМЛ дает информацию о способности лимфоцитов генерировать лимфокины при взаимодействии с митогеном, кроме того, позволяет сделать вывод о существующей сенсибилизации и клеточном ответе на определенные митогены (Новиков Д.К., 2005).

2.3.4. Морфологические методы анализа цитологических фиксированных препаратов лимфоцитов Исследование структур цитоскелета. С целью изучения пространственного расположения и измерения длины пучков филаментов цитоскелетных структур лимфоцитов здоровых людей и больных лейкозом готовили цитологические препараты. Методика приготовления включала следующие этапы: стабилизация элементов цитоскелета, лизис мембран, фиксация клеток и их окраска для световой микроскопии (Ченцов Ю.С. и др., 1982).

Предварительно готовили лизирующую смесь, содержащую 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2), 2 М сахарозы и 1% тритона Х -100. Для фиксации использовали 2,5%-ный раствор глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2). Окраску клеток проводили железным гематоксилином Гейденгайна по методике Реpа S.D. (1980).

Цитологические препараты из суспензии лейкоцитов готовили на обезжиренных предметных стеклах, которые затем помещали в чашки Петри, так, чтобы слой клеток на стеклах всегда был обращен вверх и полностью закрыт жидкостью. Препараты заливали лизирующей смесью на 20 мин при комнатной температуре. Затем стекла, клетками вверх, переносили на 5 мин в раствор глутарового альдегида. После фиксации препараты ополаскивали в дистиллированной воде и осуществляли процедуру окраски. Для этого стекла помещали на 10 мин в раствор 2,5% железных квасцов, приготовленных на фосфатном буфере (рН 7,2) при 75°С, затем ополаскивали дистиллированной водой и переносили на 10 мин при 55°С в раствор гематоксилина Гейденгайна. После окраски препараты промывали в большом объеме дистиллированной воды.

Анализ цитологических препаратов осуществляли с помощью комплекса аппаратно-программной (АПК) визуализации изображения «ВидеоТестМастерМорфология» (производитель НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург, рег.

удостоверение № 29/20010702/6102-04 от 16.02.2004). Для визуализации цитоскелетных структур использовали программное обеспечение «Видео-ТестРазмер 5.0» (НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург, 2005). На полученных препаратах наблюдали лимфоцитарные формы с темноокрашенным ядром и просветленной цитоплазмой, в области которой выявляли сеть фибрилл. На каждом препарате изучали по 15 клеток микроцитов, нормоцитов и бластов.

Определяли особенности расположения структур цитоскелета в клетках и измеряли длину пучков филаментов, отдельные нити фибрилл визуализировать не удалось.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Мамалова Хадижат Эдильсултановна БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ специальность: 06.01.08 – Плодоводство, виноградарство диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель, доктор сельскохозяйственных наук, доцент Заремук Римма...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«КУЖУГЕТ ЕЛЕНА КРАССОВНА «Хозяйственно-биологические особенности крупного рогатого скота, разводимого в разных природно-климатических зонах Республики Тыва» 06.02.10. Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.