WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Из пробы «молодой тепловодной секции» были получены ПЦР-продукты с Archaea – специфичными праймерами, при том, что было использовано только 5 мл пробы для ДНК-экстракции. Общее количество полученных клонов Архей 41 (Рисунок 19). Согласно филогенетическому анализу один клон был определн как неклассифицированный представитель Thaumarchaeota точнее к Candidatus Nitrosotalea devanaterra – облигатному аммоний-окислителю (Lehtovirta, 2011). Четыре клона были отнесены к Ignisphaera aggregans анаэробному гетеротрофу в Crenarchaeota (Niederberger et al.

, 2006). 36 клонов оказались метилотрофными метаногенами принадлежащими Euryarchaeota, которые сформировали три разных кластера: 28 клонов Candidatus Methanomethylophilus alvus, 4 клона Candidatus Methanomassiliicoccus и очень гомогенная филогенетическая группа клонов intestinalis Methanomicrococcus blatticola, метанол- и метиламин-восстанавливающий метаноген (Sprenger et al., 2000; Borell et al., 2012, 2013). В отношении архей мы наблюдали большее разнообразие среди клонов, чем это было показано в исследованиях сточных вод ранее (Neef et al., 1996; Schrenk et al., 1998; Chouari et al., 2005).

–  –  –

Рисунок 19. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена 16S рРНК и показывающее связи между штаммами домена Archaea и археальными клонами, выделенными из пробы «тепловодной секции».

Топология и эволюционные расстояния вычислены с использованием алгоритма Maximum Composite Likelihood. Число над точкой ветвления показывает значение «bootstrap» (%), выше 50 (от 550 повторностей).

Сиквенсы, полученные в этом исследовании выделены полужирным шрифтом. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100.

6.2.2. Анализ сиквенсов бактериальных генов 16S рРНК

Из библиотеки клонов случайным образом были отобраны клоны, далее было получено: 73 сивенса из пробы «молодой тепловодной секции» и 62 сиквенса из «старой холодноводной секции». (Рисунок 20, 21). Суммарно было определено 135 эубактериальных клонов: 103 клона (76,3%) были отнесены к Proteobacteria, 59 клонов (43,7%) к Gammaproteobacteria (46 клонов к группе Pseudomonas caeni), и 32 клона (23,7%) к Betaproteobacteria (23 клона к группе Advenella kashmirensis). Ps. caeni HY-14 (EU 620679), денитрифицирующий гетеротроф был впервые изолирован Xiao Y.-P. из активных илов аммонийокисляющего биореактора (Xiao et al., 2009). В пробе «тплой воды» был обнаружен гетерогенный кластер с клонами Pseudidiomarina taiwanensis PIT1 (DQ 118948), нитрат-редуцирующим гетеротрофом, который был изолирован из прибрежного мелководья и Pseudomonasmaricurvus alkylphenoliticus KU41G (AB 809181), аэробным гетеротрофом с оптимумом роста при pH 8,0, изолированным также из прибрежной воды островов Огасавара, Япония и Idiomarina insulisalsae CVS-6, выделенный из испарительного бассейна острова Сал (Кабо-Верде) (Jean et al., 2006; Taborda et al., 2009; Iwaki et al., 2014) (Рисунок 20). Также, в «тплой пробе» 15 клонов формировали гомогенный кластер, связанный с Advenella (Tetrathiobacter) kashmirensis WT001 (AJ

– факультативной хемолитотрофной нитрат-восстанавливающей 864470) бетапротеобактерией, (выделенной из насыпной садовой почвы, Индия) способна окислять различные восстановленные соединения серы, с Eoetvoesia caeni PB3-7B, изолированной из активного ила водоочистной системы коксохимического завода и Pusillimonas noertermannii BN9 (AY 695828), выделенной из р.Эльба, Германия – способна перерабатывать производные салициловой кислоты (Stolz et al., 2005; Ghosh et al., 2005; Felfldi et al., 2014).

Значительное число клонов (19–21% сиквенсов бактериальнаых клонов), представляют высоко-гомогенную филогенетическую группу и отнесены к Defluviitoga tunisiensis DSM 203805 (FR850164), связанную с Thermotogae – ограниченно термофильной бактерией, адаптированной к низкой температуре и микроаэрофильным условиям сточных вод (Hania et al., 2012). Ранее были сообщения о присутствии генов рРНК порядка Thermotogales в анаэробных биореакторах с температурой 30–34 C и в почвах холодных местообитаний (Dollhopf et al., 2001; Chouari et al., 2005; Nesb et al., 2006; Stiborova et al., 2015).

«Тплая» и «холодная» пробы содержали 2–4 клона и Deltaотнеснных к – Epsilonproteobacteria Desulforomonas thiophila NZ27 мезофильной, ацетат-окисляющей, серо-восстанавливающей дельтапротеобактерии, изолированной из аноксигенных грязей пресноводного серного источника, Новая Зеландия, и Acrobacter skirrowii DSM7302 (L14625) – аэротолерантной эпсилонпротеобактерии, выделенной из ветеринарных образцов (Vandamme et al., 1992; Finster et al., 1997). Группа клонов принадлежащая (2 клона), (2 клона), Bacterioidaceae Clostridia гаммапротеобактерия Thiomicrospira sp. NP20 (2 клона) и альфапротеобактерия Roseovarius sp. SS16.20 16S (1 клон) были обнаружены только в «холодном»

образце (Рисунок 21). Эти вариации могут быть вызваны как экологическими факторами, так и быть следствием методологических артефактов (Bouvier, del Giorgio, 2003).

–  –  –

Рисунок 20. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена 16S рРНК и показывающее связи между штаммами домена Bacteria и бактериальными клонами, выделенными из пробы «тепловодной секций».

Число над точкой ветвления показывает значение «bootstrap» (%), выше 50 (от 500 повторностей). Сиквенсы, полученные в этом исследовании выделены полужирным шрифтом. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100.

Рисунок 21. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена 16S рРНК и показывающее связи между штаммами домена Bacteria и бактериальными клонами, выделенными из пробы «холодноводной секций». Число над точкой ветвления показывает значение «bootstrap» (%), выше 50 (от 550 повторностей). Сиквенсы, полученные в этом исследовании выделены полужирным шрифтом. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100.

6.3. Анализ сиквенсов генов метанолдегидрогеназы mxaF Ген mxaF, кодирующий метанолдегидрогеназу был обнаружен во всех исследованных пробах из сточных вод полигона. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей клонов показал, что mxaF последовательности формировали три основных кластера (Рисунок 22, Приложение 2). Из образца «тплой воды» 29 сиквесов клонов mxaF определены принадлежащими к гаммапротеобактериальному метанотрофу Methylobacter luteus и 2 клона – альфапротеобактериальным метанотрофам Methylosinus trichosporium/Methylocystis parvus. Из пробы «холодной воды», 30 клонов демонстрировали принадлежность к бетапротеобактериальному метилотрофу Advenella kashmirensis W13003 (Wang et al., 2014).

Тем не менее, некоторые результаты филогенетического анализа mxaF гена оказались довольно неожиданными. Согласно предварительным анализам по данным детектирования методом FISH и секвенирования гена 16S рРНК представители Gammaproteobacteria явно доминировавшие в «тепловодной секции» (58,5% от Eub.). Однако в пробе «холодноводной секции» практически не было обнаружено репрезентативных клонов Gammaproteobacteria, несущих mxaF–ген. Напротив, и по гену mxaF и по результатам детектирования методом FISH здесь стали доминировать представители Betaproteobacteria. Таким образом, каждый из последующих анализов, использовавших молекулярные методы, предоставлял дополнительную информацию о составе анализируемых гетерогенных сообществ. Ранее было показано широкое распространение не культивируемых микроорганизмов, которые могут быть изолированы при помощи манипуляций со средой культивирования (Шаравин, 2013; McDonald, Murrell, 1977; Heylen et al., 2006; Lau et al., 2013).

0,05

–  –  –

Рисунок 22. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена mxaF и показывающее связи между штаммами филума Proteobacteria и бактериальными клонами метано- и метилотрофов, выделенными из «холодноводной» (CWM) и «тепловодной» (WWM) секций. Число над точкой ветвления показывает значение «bootstrap» (%), выше 50 (от 500 повторностей). Сиквенсы, полученные в этом исследовании выделены полужирным шрифтом. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100.

Глава 7 Ex situ исследования «культивируемых» бактерий

7.1. Разнообразие эколого-трофических групп бактерий По данным за 2010 – 2013 гг. в «старой холодноводной секции» общая численность бактериоподобных клеток по методу прямого счета (Nб) в придонных водах мелководного обводного канала ПТБО (700 – 1640 млн.

кл/мл) оказалась в среднем в 90 раз выше, чем в поверхностных слоях воды (6млн. кл/мл). Повышение численности Nб обычно происходило весной в пробах надиловой воды, содержащих много растворенного метана (1,6 – 2,2 мл СН4/л), черной взвеси и анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ). В то же время численность СВБ в воде у поверхности была в среднем в 5000 раз ниже (0,01% от Nб), чем у дна (15-22% от Nб). При этом массовое распространение СВБ было обусловлено преимущественным развитием анаэробных грамотрицательных Deltaproteobacteria, по морфотипу сходных с Desulfovibrio desulfuricans и Dv. vulgaris.

В сообществе микроорганизмов фильтрационных вод ПТБО были широко представлены условно патогенные Gammaproteobacteria, выявляемые на лактозо-пептонном агаре Макконки с солями желчи и кристалвиолета. При этом на данной селективной среде высевались преимущественно лактозаферментирующие «кишечные палочки» рода Enterobacter, в частности, Eb.

asburiae с Г+Ц в ДНК 56,0 мол.% и основными ЖК С16:1, С16, С18:1. Они быстро росли на глюкозо-пептонном агаре, в качестве единственного источника углерода и энергии использовали различные углеводы, цитрат и пируват, восстанавливали нитраты до нитритов.

7.2. Фенотипическая и генотипическая характеристика накопительных и чистых культур бактерий Практически все 20 чистых культур аэробных -, -, -протеобактерий, выделенных из образцов сточных вод ПТБО, существенно отличаясь по содержанию Г+Ц в ДНК (43,9 – 70,5 мол.%), обладали способностью к нитратредукции и 15 культур – к денитрификации на пирувате и метаноле (Таблица 6). При этом изоляты Alphaproteobacteria (включая типично гетеротрофные, метилотрофные и метанотрофные) относились к родам лишь одного порядка Rhizobiales: Rhizobium, Agrobacterium, Ochrobactrum, Methylobacterium и Methylosinus. В их жирнокислотных профилях явно преобладала октадеценовая С18:1 кислота (60-85% в сумме ЖК). В частности, штамм RS-V2 (KC577610) представлял собой розово-пигментированную факультативную метилобактерию, способную к денитрификации на метаноле и, особенно, на пирувате. Подвижные палочки размером 0,8–1,4 1,0–3,0 мкм со слабо выраженной каталазной и оксидазной активностью. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 70,5 мол.%. Согласно результатам филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК, изолят имел высокий уровень сходства (99,3%) с Methylobacterium radiotolerans и, следовательно, являлся штаммом указанного вида: Штамм Mb. radiotolerans RS-V2 (Рисунок 23).

альфапротеобактерии по последовательностям RS-MM6 (KF371658) нуклеотидов в гене 16S рРНК на 99,7% оказался схож с Methylobacterium hispanicum DSM 16372T (AJ635304), штамм RS-X6 на 97,7% сходен с гетеротрофом Ochrobactrum cytisi, а RS-Mo1 – с метанотрофом Methylosinus trichosporium.

В исследованных фильтрационных водах численность метанотрофов, учитываемых на элективных средах под газовой фазой с 15% CH4 при 25°С, была значительно ниже (в 10 – 100 раз) численности метилобактерий на плотных и жидких средах с 2–5 мл/л метанола: от 4 до 60% от Nб в поверхностных пробах и 0,3-0,7% от Nб в придонной воде. Среди культивируемых метанотрофов доминировали альфапротеобактерии рода Methylosinus (Ms. trichosporium) и гаммапротеобактерии рода Methylomonas (Mm. methanica). Среди метилобактерий доминировали бетапротеобактерии рода Methyloversatilis (Mv. universalis) порядка Rhodocyclales (сходство сиквенсов 16S рРНК изолятов RS-XM, RS-Х1, RS-X2 с типовым штаммом составило 99,4–99,7%), RS-MT7 с Castellaniella denitrificans – 99,1% и представителей двух таксономически неопределнных изолятов (RS-Х3, RSМ7) порядка Methylophilales. Изолят RS-XM филогенетически был наиболее близок к типовому штамму Methyloversatilis universalis (99,7%) и к метилобактерии Burkholderia phymatum и Bh. denitrificans (92,2%), но значительно удален от изолятов (90,8-91,0%) и от RS-Х3, RS-М7 альфапротеобактерии Methylobacterium radiotolerans RS-V2 (78,6%). Два филогенетически близких изолята RS-Х3, RS-М7 примыкали к группе родов семейства Methylophilaceae: Methylotenera, Methylovorus, Methylobacillus и (сходство лишь 93,0-95,5%). По совокупности гено- и Methylophilus фенотипических признаков изоляты RS-Х3, RS-М7 идентифицированы как представители нового вида нового рода семейства Methylophilaceae.

У всех метилотрофных изолятов из фильтрационных вод -протеобактерий (в отличие от - и -протеобактерий) в жирнокислотном профиле преобладали С16, С16:1 (70-75% в сумме ЖК), содержание Г+Ц в ДНК составляло 57-66 мол.%.

Все они являлись пресноводными нейтрофилами и мезофилами, росли на широком спектре органических субстратов, в анаэробных условиях в качестве терминальных акцепторов электронов использовали нитраты и нитриты.

Накопительные культуры изолятов RS-Х3 и RS-М7 представляли собой ассоциации метилотрофоных и сапротрофных Из

-протеобактерий.

ассоциаций и были выделены чистые культуры RS-Х3 RS-М7

Betaproteobacteria порядка Burkholderiales с высокой каталазной активностью:

из RS-М7 – сапротрофный Comamonas sp. RS-M7Pp2013 (на 96,5% сходен с из – сапротрофный и метилотрофный Comamonas terrigena), RS-Х3 денитрифицирущий Achromobacter xylosoxidans RS-X3Pp2013 (99,6% – с Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans и 99,1% – с Ab. xylosoxidans ssp.

denitrificans).

Изоляты по морфо-физиологическим, Gammaproteobacteria хемотаксономическим и генетическим признакам представляют довольно гетерогенную группу. У них в очень широком диапазоне варьирует и содержание Г+Ц в ДНК (44 – 68 мол. %). Большинство из них являются сапротрофными, хорошо растут на пептоне, обладают значительным сходством с известными видами. У изолятов RS-V, RS-H сходство последовательностей гена 16S рРНК достигает внутривидового уровня с Shevanella putrefaciens (98,1

– 98,8%), у RS-MT8 с Pseudoxanthomonas taiwanensis (98,5%), у RS-X5 со Stenotrophomonas maltophila (97,8%) и у RS-V3 с Enterobacter asburiae (97,7%).

Однако у умеренно галофильного метилотрофного денитрификатора RS-MM3 филогенетическое сходство с различными видами рода Methylophaga достигает лишь межвидового уровня (95,3 – 96,7%). Фенотипически сходный умеренно галофильный штамм M1K рода Methylophaga был выделен из техногеннозасоленной ризосферной почвы на территории г. Соликамска. Следует отметить, что представители данного рода ранее не выделялись из этого биотопа (Корсакова и др., 2011). Изолят обладал способностью продуцировать биологически активные соединения, способствующие росту растений. При обработке семян яровой пшеницы препаратами умеренно галофильного метилотрофного штамма Methylophaga sp. M1K отмечено стимулирование ростовых процессов, синтеза растительных пигментов и массы корней (Таблица 7).

–  –  –

0,02 Рисунок 23. Филогенетические отношения между чистыми культурами денитрифицирующих метилотрофов из фильтрационных вод ПТБО и представителями -, -, -протеобактерий. Дерево построено на основе секвенированных последовательностей генов 16S рРНК длиной 1250 п.н.

используя алгоритм Maximum-Likelihood. Число над ветвью обозначает Bootstarp значения выше 50%. Масштаб соответствует 2% дивергенции.

Последовательности, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом.

–  –  –

7.3. Детекция метанолдегидрогеназы mxaF культур метилотрофов Для подтверждения способности выделенных штаммов метилотрофных бактерий утилизировать метанол был проведн ПЦР-анализ по обнаружению функционального гена метанолдегидрогеназы, используя стандартные праймеры F1003 и R1561 для mxaF (McDonald, Murrell, 1997). На электрофореграмме продуктов ПЦР отчтливо видны полосы специфического продукта реакции длиной 550 пн (Рисунок 24). Ген метанолдегидрогеназы детектирован у новых видов метилотрофных денитрификаторов рода Methylophaga RS-MM3 и RS-M7 – представителя семейства Methylophilaceae.

Продукт реакции не зафиксирован у активного гетеротрофного денитрификатора Ochrobacterium cytisi RS-X6 не способного к росту на метаноле.

Далее, было проведено секвенирование полученных ПЦР-продуктов гена метанолдегидрогеназы. Полученные результаты отражены в таблице 8. BLASTанализ показал, что не у всех культур результаты секвенирования гена 16S рРНК соврадают с результатами сиквенса mxaF гена. В частности, изоляты RSMT7 (Castellaniella denitrificans) и RS- X3 Рp2013 (Achromobacter xylosoxidans) показали наибольшее сходство не с типовыми штаммами, а с некими невалидными видами Burkholderiales bacterium RZ18-153 и Pseudomonas sp.

CBMB18, соответвственно. В остальных случаях сиквенсы генов mxaF и 16S рРНК однозначно подтвердили систематическое положение изолированных культур.

Рисунок 24. Электрофореграмма продуктов ПЦР гена mxaF F1003.

Штаммы: 1–MT7 (Castellaniella denitrificans); 2–X2 (Methyloversatilis universalis); 3 – MM6 (Methylobacterium hispanicum); 4 – V2 (Methylobacterium radiotolerans); 5 – X3 Pp2013 (Achromobacter xylosoxidans); 6 – X6 (Ochrobactrum cytisi); 7 – M7 (gen. nov., sp. nov. Methylophilaceae); 8 – MM3 (Methylophaga sp.nov.); «+» – положительный контроль; М – маркер молекулярных весов.

–  –  –

На метаноле активность денитрификации оказалась в десятки раз слабее даже у метилобактерий и отсутствовала у штаммов Shewanella putrefaciens и На средах с метанолом или пируватом Ochrobactrum cytisi RS-X6.

диссимиляционная нитратредукция до N2O и N2 не была обнаружена только у Methylosinus trichosporium RS-Mo1 и Methylomonas methanica RS-Mo2, несмотря на их способность использовать нитраты в качестве источника азота, а метан и метанол – в качестве источника углерода и энергии.

Для определения активности денитрификации при благоприятных окислительно-восстановительных условиях в слабощелочной придонной воде из обводного канала ПТБО в пробы вносили органические вещества и минеральные соединения азота (Таблица 10). После введения метанола и

–  –  –

7.5. Предварительное описание новых метилотрофных денитрификаторов, изолированных из фильтрационных вод ПТБО Methylophaga RS-MM3 sp. nov. Колонии на среде с агаром и метанолом бледно-розовые, круглые, выпуклые до 1–2 мм в диаметре. Клетки грамотрицательные, аспорогенные, подвижные палочки (0,3–0,5 1,0–2,0 мкм), умеренно галофильные, нейтрофильные и мезофильные. Растт в среде с 0,02– 5% СН3ОН (оптимум 0,6–0,8%) и 0,2–10% NaCl (оптимум 3–5%), при 10–40C (оптимум 28–33C) и pH 6,0–9,5 (оптимум pH 7,5–8,2). Аэроб или факультативный анаэроб, оксидазо и каталазо-положителен. Активную денитрификацию осуществляет в среде с пируватом, но значительно слабее с метанолом, лактатом, малатом и ацетатом. Факультативный метилотроф, метанол, метиламин, фруктозу и сахарозу использует в качестве источников углерода и энергии. Содержит mxaF ген, кодирующий метанолдегидрогеназу.

Метан, глюкозу, дрожжевой экстракт не утилизирует. Продуцирует кислоты из метанола, но не из фруктозы и сахарозы. Гидролизует крахмал, но не казеин или желатин. В качестве источников азота использует аммоний, нитрат, триптон и метиламин. Добавка витамина B12, дрожжевого экстракта (0,005%) и микроэлементов ускоряет рост. Чувствителен к эритромицину (15 мкг /диск) и стрептомицину (10 мкг /диск), но устойчив к ампициллину (10 мкг /диск) и новобиоцину (30 мкг /диск).

При оптимальных условиях роста (30C, pH 7,8) в среде с метанолом (5 мл/л, 30 г/л NaCl, 20 мкг/л витамин B12), преобладают следующие жирные кислоты (% от общего количества ЖК): C16:17c (40,5), C16:0 (35,2), и C18:17c (18,7). Содержание Г+Ц в ДНК составляет 43,9 мол.%. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК (GenBank организм No KF371656) филогенетически близок к ограниченно-галоалкалофильным метилотрофам рода Methylophaga (95,3–96,7% сходства). Новый штамм идентифицирован как Methylophaga RS-MM3 sp. nov.

Methylotrophic bacterium RS-M7 gen. nov., sp. nov. Колонии на среде с агаром и метанолом оранжевые, выпуклые, круглые до 1–2 в диаметре. Клетки грамотрицательные, аспорогенные, подвижные палочки (0,6–0,7 0,8–1,5 мкм), пресноводные, нейтрофильные и мезофильные. Растт в среде с 0,01–1,5% СН3ОН (оптимум 0,3–0,5%) и 0 – 2% NaCl, при 15–40C (оптимум 30–35C) и pH 5,5–8,5 (оптимум pH 7,0–7,5). Аэроб или или факультативный анаэроб не способный к ферментации, каталазо-положителен. Нитрат восстанавливает до NO2–, N2O, и N2. Денитрификацию осуществляет на среде с пируватом, но слабее на метаноле. В качестве источников углерода и энергии использует метанол, метиламин, формальдегид, формиат, глюкозу и фруктозу. Содержит mxaF ген, кодирующий метанолдегидрогеназу. Ни из глюкозы, ни из фруктозы кислот не производит. В качестве источников азота использует аммоний, нитрат, пептон, глутамат и метиламин.

При оптимальных условиях роста (30C, pH 7,0) в среде с метанолом (5 мл/л,) преобладают следующие жирные кислоты (% от общего количества ЖК):

C16:0 (41,3), C16:17c (39,5), и C18:17c (6,8). Содержание Г+Ц в ДНК составляет 57,4 мол.%. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК (GenBank No KC577611) организм филогенетически близок к видам четырх родов внутри семейства сходства). Штамм Methylophilaceae (93,0–95,1% RS-M7 идентифицирован как новый вид нового рода семейства Methylophilaceae.

–  –  –

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В фильтрационных водах ПТБО г. Перми обнаружено «высокое загрязнение» соединениями азота (аммонием, нитратами, нитритами), фосфора и тяжелыми металлами. Инфильтрационные воды «молодой тепловодной секции» обладают значительно более высоким содержанием растворнного метана, соединений углерода, азота, фосфора и бикарбонатов натрия. В придонных водах реализуются интенсивные процессы денитрификации. Эти условия способствовали преимущественному распространению культивируемых протеобактерий. Ввиду возможности культивирования и поддержания чистых культур многие представители -, - и -Proteobacteria (в частности метилобактерий) исследованы как физиологически, так и таксономически. Они включали анаэробные СВБ Deltaproteobacteria, аэробные нитратвосстанавливающие порядка Alphaproteobacteria Rhizobiales, метанотрофные и типично гетеротрофные Gammaproteobacteria, метилотрофные Betaproteobacteria порядка Burkholderiales (Achromobacter xylosoxidans), порядка Rhodocyclales (Methyloversatilis universalis). Два штамма пресноводных метилотрофных денитрификаторов отнесены к неидентифицированным бетапротеобактериям семейства Methylophilaceae: по гену 16S рРНК они имеют уровень сходства с представителями четырх родов лишь 93,0–95,5%. Штамм умеренно галофильного Methylophilaceae метилотрофного денитрификатора идентифицирован как гаммапротеобактерия нового вида рода Methylophaga (уровень филогенетического сходства достигает Большинство изученных метилобактерий (Methylobacterium 95,3–96,7%).

radiotolerans RS-V2, Methyloversatilis universalis RS-XM, RS-X1 и RS-X2, Stenotrophomonas maltophila RS-X5, изоляты RS-Х3, RS-М7) в аэробных условиях росли на средах с метанолом, но в анаэробных условиях на средах с пируватом и нитратами росли как активные денитрификаторы. На метаноле активность денитрификации и анаэробный рост у них был значительно слабее.

Также в придонных водах обводного канала ПТБО интенсивность потенциальной денитрификации осенью была исключительно высока при введении добавок пирувата совместно с нитратами и особенно с нитритами.

Ранее неоднократно обращали внимание на прямую и опосредованную связь процессов денитрификации в определенных сточных водах и донных осадках с активностью сообществ метано- и метилотрофов.

В сообществе микроорганизмов явно преобладают представители филума Proteobacteria (83,8±8,5% от общего количества домена Bacteria детектируемых методом FISH). Представители домена Archaea распространены лишь в пробах «молодой тепловодной секции» (6,3% от общего количества клеток, выявляемых окрашеванием ДАФИ) при доминировании анаэробных метаногенов филума Euryarchaeota.

На протяжении сурового зимнего периода наблюдалось значительное отличие состава микробных сообществ между «молодой тплой секцией» и «старой холодной». После того как фильтрационные воды изливаются из тела полигона – они постепенно охлаждаются, деминерализуются и насыщаются кислородом. Таким образом, теряется часть микробного сообщества, а именно: члены домена Archaea, филум (метилотрофные метаногены Candidatus Euryarchaeota Methanomethylophilus alvus, Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis, (анаэробный гетеротроф Methanomicrococcus blatticola), Crenarchaeota и не классифицированный представитель Ignisphaera aggregans) Thaumarchaeota (облигатный аммоний-окислитель Candidatus Nitrosotalea devanaterra). Общее количество Delta- и Gammaproteobacteria, особенно метанотрофов как Methylobacter luteus было снижено, в то время как число Betaproteobacteria, особенно метилотрофов, таких как Advenella kashmirensis выросло. Было обнаружено широкое распространение клонов Advenella нитрат-редуцирующей, факультативной, хемолитотрофной kashmirensis бетапротеобактерии, способной окислять различные восстановленные соединения серы и содержащая ген метанол дегидрогеназы mxaF. Также, широко встречались клоны, относящиеся к филуму Thermotogae (19-21% от сиквенсов бактериальных клонов), которые формировали высоко-гомогенную филогенетическую группу, связанную с Defluviitoga tunisiensis, ограниченнотермофильную бактерию, адаптированную к низким температурам в микроаэрофильных условиях сточных вод. Следует отметить, что обнаружение филума Thermotogae в сточных водах различного происхождения – достаточно распространнное явление (Stiborova et al., 2014). В отличие от ранее проведнных исследований сточных вод, активных илов из муниципальных и промышленных очистных сооружений и процессов очистки сточных вод, микробное сообщество доменов Bacteria и Archaea в сточных водах ПТБО было более разнообразным, благодаря пространственно-временным особенностям изучаемой среды обитания (Layton et al., 2000; Crocetti et al., 2000, 2002;

Juretschko et al., 2002; Chouari et al., 2005; Heylen et al., 2006; Tang et al., 2011;

Lau et al., 2013).

Таким образом, современный полигон утилизации и захоронения ТБО является крупным промышленным предприятием, представляет собой тврдофазный анаэробный ферментр геологического масштаба (Горбанюк и др., 1989). Деструкция сложных полимерных органических веществ (ОВ) завершается образованием простых соединений и биогаза, состоящего на 60% из CH4 и на 40% из СО2 (Bogner, Spokas, 1993). В результате анаэробных микробиологических процессов температура внутри тела ПТБО варьирует от 30 до 60 С, и температура окружающей среды не оказывает существенного влияния на процессы метаногенеза (Вайсман и др., 2003). Биогаз из подстилающих, более плотных и увлажннных, слов диффундирует по профилю свалочного тела и разгружается в атмосферу. Эмиссию метана существенно снижают метанокисляющие почвенные микроорганизмы, но их активность сильно лимитируется короткой продолжительностью тплого периода года и погодными условиями (Ножевникова и др., 2006).

Полигон захоронения ТБО «Софроны» г. Перми функционирует в течение 36 лет. В составе отходов преобладают древесные и бумажные материалы, старые вещи и бытовые приборы, строительный и городской мусор. В осадочных отложениях скапливаются и захораниваются стекловидные, керамические, полимерные, синтетические материалы и с трудом разлагаемые микроорганизмами полимеризаты лигнино-гумусового комплекса (Рисунок 25).

На сформированные участки свалочного тела насыпается покрывающий слой почвы толщиной до 1 м, постепенно зарастающий травянистой и кустарниковой растительностью. Надземная высота свалочного холма полигона, заложенного на территории карьера по добыче песка и глины, достигает 30 м.

При пониженных температурах в период с ноября по март, характерных для климата Пермского края, покрывающий слой почвы замерзает, покрывается снегом и препятствует эмиссии биогаза в атмосферу. Поэтому зимой гидростатическое давление в теле полигона повышается и из увлажннных нижних слов через боковые разломы и трещины резко возрастает сток тплых тмноокрашенных щелоков в заглублнные водопримники обводного канала.

Здесь они смешиваются с аэрируемыми водами поверхностного стока и проходят стадию самоочищения вследствие интенсивно идущих бактериальных процессов и включения загрязняющих веществ, в состав осаждаемого органоминерального комплекса.

На полигоне «Софроны» анаэробная биодеградация биополимеров происходит в четыре последовательных этапа. Начальной стадией разрушения биополимеров является их гидролиз до мономеров с помощью экзоферментов разных видов грибов и бактерий. Сюда относятся представители филумов Firmicutes, Bacterioidetes, Fibrobacteres, Proteobacteria (Roseovarius), гидролизующих Actinobacteria, Thermotogae (Defluviitoga tunisiensis), целлюлозу, пектин, лигнин, белки, липиды, полисахариды, крахмал и другие глюконы до моно- и олигосахаридов, пептидов, мочевины, аминокислот, пуринов и пиримидинов, глицерина, фенольных соединений. К легко гидролизуемым природным высокомолекулярным соединениям относятся, в частности, белковые компоненты пищевых отходов, сравнительно быстро расщепляемых внеклеточными протеазами до поли- и олигопептидов, которые затем гидролизуются внутриклеточными протеазами до аминокислот. К очень стабильным в условиях анаэробиоза относятся несбраживаемые насыщенные и ароматические углеводороды, стероиды, полиизопреноиды, но поддающиеся расщиплению в присутствии кислорода бактериями филумов Actinobacteria, Bacterioidetes и Proteobacteria, особенно многочисленных в смывах свежих ТБО и фильтрационных водах обводного канала. Практически не поддатся микробному разложению полимерная основа пластмасс типа полиэтиленовых пакетов. Частичная трансформация плохо поддающихся микробному разложению ряда синтетических продуктов и ксенобиотиков происходит благодаря наличию утилизируемого ростового косубстрата.

На второй стадии анаэробного разложения ОВ продукты гидролиза биополимеров – мономеры, сбраживаются с образованием ряда более простых соединений – низших кислот (ацетат, лактат, пируват, сукцинат, формиат, пропионат, бутират) и спиртов (этанол, пропанол, бутанол). Эту стадию осуществляют термофильные археи филума Crenarchaeota (Ignisphaera aggregans), мезофильные бактерии филумов Firmicutes, Bacterioidetes и многочисленные представители Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilonproteobacteria.

–  –  –

Рисунок 25. Анаэробная биодеградация биополимеров с образованием метана в «теле» ПТБО г. Перми со стоком концентрированного «водного гумуса» в обводной канал.

На третей, ацетогеноой или водородогенной стадии, различные не полностью окисленные и восстановленные продукты брожения превращаются в ацетат, водород и CO2. На ПТБО этот процесс осуществляют преимущественно группа облигатно анаэробных сульфат-редуцирующих бактерий (СРБ) Deltaproteobacteria родов Desulfovibro и Desulfobulbbus, восстанавливающих сульфаты до сероводорода и окисляющих лактат и пропионат лишь до ацетата, а также термотога Defluviitoga tunisiensi, обладающая способностью и гидролизовать биополимеры, и сбраживать мономеры, и восстанавливать элементарную серу до сероводорода при использовании сахаров с образованием ацетата, и CO2. Вторая группа сероредуцирующих H2 и сульфат-редуцирующих (Desulfobacter) (Desulforomonas thiophila) Deltaproteobacteria осуществляет полное окисление лактата и ацетата до CO2.

СРБ обладают двойной способностью образовывать и потреблять водород, синтезировать ацетат из водорода и углекислоты.

Анаэробной деструкции мономеров завершается образование CH4, сероводорода и CO2. Небольшие концентрации сульфатов в ТБО лимитируют процесс сульфат-редукции, интенсивность накопления сульфидов невелика.

Здесь распад ОВ идт в основном с образованием СН4 и CO2. Облигатно анаэробные метанобразующие архебактерии для своего роста используют ограниченный набор субстратов, включающий Н2 + CO2, ацетат, формиат, метанол, метилированные амины. На ПТБО современными методами молекулярной in situ детекции архей выявлены описанные в последние годы представители трх различных кластеров метилотрофных метаногенов филума Candidatus Candidatus Euryarchaeota Methanomethylophilus alvus, Methanomassiliicoccus intestinalis, Methanomicrococcus blatticola, а также культивируемые ex situ морфотипы Methanosarcina, метаболизирующие H2, ацетат, метанол, метиламины. В итоге, образование метана из сложных полимерных веществ – комплексный процесс, осуществляемый при участии различных групп микроорганизмов, с которыми метаногены вступают в синтрофные взаимоотношения.

Также в донных отложениях обводного канала трудногидролизуемая часть осевшего детрита примерно на 50 – 60% подвергается анаэробному распаду с образованием метана, и лишь некоторая часть захоранивается и выпадает из круговорота углерода в водоме с зарегулированным стоком. Основная масса метана, образовавшегося в илах и поступающего из тела ПТБО в обводной канал со стоком концентрированного «водного гумуса», окисляется метанотрофными Alpha- и Gammaproteobacteria. Идентифицированные нами виды метанокисляющих бактерий Methylobacter luteus, Methylomonas methanica, Methylocystis parvus, Methylosinus trichosporium были обнаружены ранее в покрывающих почвах других ПТБО (Ножевникова и др., 2006). Причм в тплый весеннее-летний период численность почвенных метанотрофных Gammaproteobacteria родов Methylomonas и Methylobacter достигала 40 – 56% от общей численности бактерий.

В отличие от сообщества почвенных микроорганизмов, в инфильтрационных водах явно доминировали аэробные метилобактерии, не способные расти на метане. Причм в период с мая по октябрь плотность их популяции составляла 4 – 60% от численности домена Bacteria. Здесь кроме - и

-протеобактерий массовое распространение получили метанолокисляющие протеобактерии семейства Methylophilaceae, Methyloversatilis universalis, Advenella kashmirensis, Achromobacter xylosoxidans, Castellaniella denitrificans.

Метилобактерии семейства Methylophilaceae класса Betaproteobacteria и семейство класса Xanthobacteriaceae (Xanthobacter, Ancylobacter) Alphaproteobacteria широко распространены как фитосимбионты, в филлосфере и ризосфере растений, которые образуют и выделяют метанол, являясь глобальным источником этого атмосферного газа (Троценко и др., 2010;

Шаравин, 2012; Шаравин, Ковалевская, 2012). Аэробные метилобактерии фильтрационных вод принимают активное участие в процессах нитратредукции и денитрификации, а факультативно хемолитотрофная нитратвосстанавливающая метилотрофная бетапротеобактерия Advenella kashmirensis обладает способностью окислять различные восстановленные соединения серы.

В обводном канале ПТБО происходит микробиологическое окисление и других восстановленных соединений углерода, азота и железа автохтонного и аллохтонного происхождения. В частности обнаружен уникальный клон облигатного аммонийокисляющего нитрификатора Candidatus Nitrosotalea devanaterra, филогенетически связанного с новым не валидным пока филумом Thaumarchaeota в составе домена Archaea.

Таким образом, разнообразие метаногенных архей в анаэробной зоне ПТБО, а также метано- и метилотрофных протеобактерий в покрывающей почве, в ассоциации с растениями и в фильтрационных водах не имеют аналогов в природных экосистемах.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что фильтрационные воды обводного канала ПТБО («Софроны», г.Пермь) характеризуются высоким уровнем загрязнения по аммонию, нитратам, нитритам, фосфору и тяжлым металлам. В придонных водах реализуются интенсивные процессы денитрификации. Исключительно высокое содержание растворнного метана, соединений углерода, азота, фосфора и бикарбонатов натрия поступает с фильтратом из «тела» ПТБО (в составе тплого тмноокрашенного «водного гумуса»).

2. Установлено, что в сообществе микроорганизмов явно преобладают представители филума Proteobacteria (83,8±8,5% от общего количества домена Bacteria, детектируемых методом FISH). Представители домена Archaea сравнительно многочисленны лишь в тплых анаэробных водах (6,3% от общего количества жизнеспособных клеток, выявляемых окрашеванием ДАФИ) при доминировании метилотрофных метаногенов филума Euryarchaeota (36 клонов трх разных кластеров), Crenarchaeota (4 клона) и Taumarchaeota (1 клон).

3. Определено, что по мере охлаждения, деминерализации и насыщения кислородом фильтрационных вод после их смешения с водами поверхностного стока в микробных сообществах наблюдается эндодинамическая сукцессия:

выпадают представители домена снижается доля и Archaea, DeltaGammaproteobacteria, особенно метанотрофов подобных Methylobacter luteus, но увеличивается доля Betaproteobacteria, особенно метилотрофов подобных Advenella kashmirensis.

4. Из коллекции 103 накопительных культур было изолировано и идентифицировано 20 штаммов аэробных хемоорганотрофных нитратвосстанавливающих -, - и -Proteobacteria, включая 15 денитрификаторов и 13 метилотрофов. По совокупности гено- и фенотипических признаков 17 изолятов обладали значительным сходством с известными видами протеобактерий.

5. Два штамма пресноводных метилотрофных денитрификаторов с Г+Ц в

ДНК 57,4 – 58,2 мол.% отнесены к неидентифицированным Betaproteobacteria:

по гену 16S рРНК они имеют уровень сходства с представителями четырх родов семейства лишь 93–95%. Штамм умеренно Methylophilaceae галофильного метилотрофного денитрификатора с Г+Ц в ДНК 43,9 мол.% идентифицирован как Gammaproteobacteria нового вида рода Methylophaga (филогенетическое сходство соответствует межвидовому уровню 95,3–96,7%).

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ТБО – твердые бытовые отходы;

ПТБО – полигон захоронения тврдых бытовых отходов;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

ХПК – химическая потребность в кислороде;

БПК – биохимическая потребность в кислороде;

ФАО – фосфат-аккумулирующие организмы;

СВБ – сульфат-восстанавливающие бактерии;

Nб – численность бактерий;

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ;

ДАФИ – 4‘6‘–диамино–2–фенилиндол;

ОВ – органическое вещество.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анюшева, М.Г. Анаэробное окисление аммония: микробиологические, биохимические и биотехнологические аспекты / М.Г. Анюшева, С.В.

Калюжный. // Успехи современной биологии. – 2007. – Т. 127 – № 1. – С. 34 – 43.

2. Банкин, М.П.: Физико-химические методы в агрохимии и биологии почв :

учеб. пособие / М.П. Банкин, Т.А. Банкина, Л.П. Коробейникова. – СПб.: СПбУ, 2005. – 177 с.

3. Вайсман, Я.И. Управление метаногенезом на полигонах твердых бытовых отходов / Я.И. Вайсман, О.Я. Вайсман, С.В. Максимов. – Пермь: ПГТУ, 2003. – 232 с.

4. Гальченко, В.Ф. Метанотрофные бактерии / В.Ф. Гальченко. – М.: ГЕОС, 2001. – 500 с.

5. Галямина, В.В. Распространение пурпурных несерных бактерий в перифитоне водотоков разного генезиса, их роль в азотфиксации и денитрификации: дис…. канд. биол. наук: 03.02.03 / Галямина Валентина Владимировна – Пермь, 2011. – 131 с.

6. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии. В 3-хт. Т. 1-3: Пер. с англ. // под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир, 1983.

7. Горбатюк, О.В. Ферментры геологического масштаба / О.В. Горбатюк, О.И.

Минько, А.Б. Лифшиц // Природа. – 1989. – №9. – С. 71–79.

8. Громов, Б.В. Удивительный мир архей / Б.В. Громов // Соросовский Образовательный Журнал. – 1997. – № 4. – C. 23 – 26.

9. Громов, Б.В. Экология бактерий. / Б.В. Громов, Г.В. Павленко / Л.: Изд-во ЛГУ, 1989. – 248 c.

10. Демаков, В.А. Бактерии активного ила биологических очистных сооружений, трансформирующие цианопиридины и амиды пиридинкарбоновых кислот / В.А. Демаков [и др.] // Микробиология. – 2015. – Т. 84. – № 3. – С. 369– 378.

11. Доронина, Н.В. Methylophaga murata sp. nov. – галоалкалофильный аэробный метилотроф из разрушающегося мрамора / Н.В. Доронина [и др.] // Микробиология. – 2005. – Т. 74. – № 4. – С. 511 – 519.

12. Доронина, Н.В. Новые данные о способности метилобактерий и метанотрофов синтезировать ауксины / Н.В. Доронина, Е.Г. Иванова, Ю.А.

Троценко // Микробиология. – 2002. – Т. 71. – № 1. – С. 130 – 132.

13. Доронина, Н.В. Состав биомассы бактерий растущих на метаноле / Н.В.

Доронина, Ю.А. Троценко // Прикл. биохим. микробиол. – 1986. – Т. 22 – № 4. – С. 557 – 561.

14. Заварзин, Г.А. Бактерии и состав атмосферы / Г.А. Заварзин / М.: Наука, 1984.– 199 с.

15. Заварзин, Г.А. Будущее отбирается прошлым / Г.А. Заварзин // Вестн. РАН.

– 2004. – Т. 74. – № 9. – С. 813 – 822.

16. Загорский, В.А. Опыт промышленного внедрения технологий биологического удаления азота и фосфора / В.А. Загорский [и др.] // Водоснабжение и санитарная техника. – 2001. – № 12. – С. 21 – 27.

17. Иванов, Д.В. Биогеохимическое образование и окисление биогаза в техногенных грунтах по данным изотопно-химических исследований: дис....

канд. геол.-мин. наук: 04.00.13 / Иванов Дмитрий Владимирович – Раменское, 1998. – 97 с.

18. Иванова, Е.Г. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины / Е.Г.

Иванова [и др.] // Микробиология. – 2001. – Т. 70. – № 4. С. 452 – 458.

19. Иванова, Е.Г. Факультативные и облигатные метилобактерии синтезируют цитокинины/ Е.Г. Иванова [и др.] // Микробиология. – 2000. – Т. 69. – № 6. – С.

764 – 769.

20. Ившина, И.Б. Большой практикум Микробиология: учебное пособие / И.Б.

Ившина. – СПб.: Проспект Науки, 2014. – 112 с.

21. Каллистова, А.Ю. Изучение микробного состава активных илов московских очистных сооружений. / А.Ю. Каллистова [и др.] // Микробиология. – 2014. – Т.

83. – № 5. – С. 615 – 625.

22. Каллистова, А.Ю. Культивируемые психротолерантные метанотрофные бактерии в покрывающей почве полигона тврдых бытовых отходов / А.Ю.

Каллистова [и др.] // Микробиология. – 2014. – Т. 83. – № 1. – С. 109 – 118.

23. Каллистова, А.Ю. Окисление метана в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов. / А.Ю. Каллистова [и др.] // Микробиология. – 2005. – Т. 74. – № 5. – С. 699 – 706.

24. Кондратьева, Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. / Е.Н. Кондратьева / М.:

Изд-во МГУ, 1983. – 172 c.

25. Корсакова, Е.С. Филогенетическое разнообразие бактерий ризосферы растений, произрастающих на техногеннозасоленных почвах / Е.С. Корсакова [и др.] // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. – №4/1.

– С. 81-82.

26. Крылова, И.Н. Нитрификация и денитрификация в озрах разного типа:

Дис…. канд. биол. наук: 03.02.03 / Крылова Ирина Николаевна – Борок, 1984. – 183 с.

27. Кузнецов, С.И. Методы изучения водных микроорганизмов / С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина / М.: Наука, 1989. – 288 с.

28. Кузнецов, С.И. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озрах. / С.И. Кузнецов, А.И. Саралов, Т.Н. Назина / М.: Наука, 1985. – 213 с.

29. Литти, Ю.В. Обнаружение анаэробных процессов и микроорганизмов в иммобилизованном активном иле станции очистки сточных вод с интенсивной аэрацией / Ю.В. Литти [и др.] // Микробиология. – 2013. – Т. 82. – № 6. – С. 672

– 680.

30. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод / Ю.Ю.

Лурье / М.: МГУ, 1975. – 246 с.

31. Максимова, Н.П. Метаболизм ароматических соединений у метилотрофных бактерий // Автореф. дисс. … доктора биол. наук. Минск, 2005. 43 с.

32. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов [и др.] – М.:

Академия, 2005. – 608 с.

33. Ножевникова, А.Н. Анаэробное окисление аммония (анаммокс) в биоплнках иммобилизованного активного ила при очистке сточных вод с низкой концентрацией загрязнений / А.Н. Ножевникова др.] [и // Микробиология. – 2012. – Т. 81. – № 1. – С. 28 – 38.

34. Ножевникова, А.Н. Окисление метана в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов / А.Н. Ножевникова [и др.] // Микробиология. – 1989. – Т. 58. – № 5. – С. 859 – 863.

35. Ножевникова, А.Н. Эмиссия и окисление метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов: сезонные измерения. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского./ А.Н. Ножевникова, А.Ю. Каллистова, М.В. Кевбрина / М.: Наука, 2006. – Т. 13. – 172–191.

36. Плакунов, В.К. Микробные биоплнки: перспективы использования при очистке сточных вод / В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев // Вода: химия и экология.

– 2008. – № 2. – С. 11 – 13.

37. Речкин, А.И.: Геохимическая роль микроорганизмов: эл. учеб. пособие / А.И. Речкин, Г.Н. Ладыгина. – НГУ: 2010. – 72 с.

38. Саралов, А.И. Arhodomonas recens sp.nov.– галофильная алканотрофная водородная бактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов. / А.И. Саралов [и др.] // Микробиология. – 2012. – Т. 81. – № 5. – С.

630 – 637.

39. Светличный, В.А. Dictyoglomus turgidus sp. nov. – новая экстремально термофильная эубактерия, выделенная из горячих источников кальдеры вулкана Узон / В.А. Светличный, Т.П. Светличная // Микробиология. – 1988. – Т. 57. – № 3. – С. 435 – 441.

40. Старцева, Л.Б. Руководство по анализу шахтных вод. Изд.-е 2-е / Л.Б.

Старцева. – Пермь: Изд.-во ПВВКУ. 1980. – 278 с.

41. Трибис, В.П. Формирование почв на рекультивационном полигоне бытовых отходов / В.П. Трибис // Почвоведение. – 2000. – №7. – С. 898 – 904.

42. Троценко, Ю.А. Аэробные метилобактерии / Ю.А. Троценко, Н.В. Доронина, М.Л. Торгонская / Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. – 325 с.

43. Фдоров, Д.Н. Влияние экзогенной индолилуксусной кислоты на активность ферментов центрального метаболизма у Methylobacterium extorquens AM1 / Д.Н. Фдоров [и др.] // Микробиология. – 2009. – Т. 78. – № 6. – С. 844 – 846.

44. Фдоров, Д.Н. Клонирование и характеристика индолил-3пируватдекарбоксилазы из Methylobacterium extorquens AM1 / Д.Н. Фдоров, Н.В. Доронина, Ю.А. Троценко // Микробиология. – 2010. – Т. 75. – № 12. – С.

1651 – 1661.

45. Фдоров, Д.Н. Фитосимбиоз аэробных метилобактерий: новые факты и гипотезы / Д.Н. Фдоров, Н.В. Доронина, Ю.А. Троценко // Микробиология. – 2011. – Т. 80. – № 4. – С. 435 – 446.

46. Черноусова, Е.Ю. Филогенетический in situ/ex situ анализ микробного сообщества серного мата из термального сульфидного источника Северного Кавказа / Е.Ю. Черноусова [и др.] // Микробиология. – 2008. – Т. 77. – № 2. – С.

255 – 260.

47. Шаравин, Д.Ю. Выделение и идентификация денитрифицирующих метилотрофов из сточных вод полигона захоронения твердых бытовых отходов.

/ Шаравин Д.Ю. // 9-я Междун. Мол. Школа Конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии», ИНМИ, Москва. – 2013. – С. 117–120.

48. Alexandrov, A. Streamline method to analyse 16S rRNA Gene Clone Libraries. / A. Alexandrov, D. Kaushik, S.M. Pascal // BioTechniques. – 2001. – V. 30. – P. 938

– 944.

49. Amann, R.I. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. / R.I. Amann [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – V. 56. – P. 1919 – 1925.

50. Amann, R.I. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. / R.I. Amann, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Microbiol. Rev. – 1995. – V. 59. – P. 143 – 169.

51. Anaerobic Respiration [Электронный ресурс]: – Timothy Paustian, University

Режим доступа:

of Wisconsin-Madison.– http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869P/CHEM869PLinks/www.bact.wisc.edu/microt extbook/metabolism/RespAnaer.html (26.10.2014).

52. Anthony, C. The biochemistry of methylotrophs / C. Anthony / London: Acad.

Press, 1982. – 251p.

53. Antony, C.P. Methylophaga lonarensis sp. nov., a moderately haloalkaliphilic methylotroph isolated from the soda lake sediments of a meteorite impact crater / C.P.

Antony [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2012. – V. 62. – P. 1613 – 1618.

54. Arikan, O.A. Effect of temperature on methane production from field-scale anaerobic digesters treating dairy manure / O.A. Arikan, W. Mulbry, S. Lansing // Waste Management – 2015.– V. 43. – P. 108 – 113.

55. Basic Local Alignment Search Tool [Электронный ресурс]: – National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, USA. – Режим доступа: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (26.10.2014).



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |
 

Похожие работы:

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.