WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Для решения задачи глубокой очистки сточных вод в мировой практике существует ряд основополагающих технологических приемов. Среди них применение рецикла очищаемой воды для более полного удаления азота, а также применение иммобилизации микроорганизмов активного ила на различных носителях (Литти и др., 2013).

Иммобилизация активного ила на твердом носителе позволяет значительно увеличить плотность и биоразнообразие активных микроорганизмов в очистных сооружениях, благодаря чему увеличивается скорость и глубина очистки воды.

Более того, в образующихся на твердом носителе обрастаниях (биоплнке) происходит пространственная самоорганизация микробного сообщества, выстраивается сукцессия микроорганизмов по градиенту окислительно-восстановительного потенциала и концентрации субстрата (Плакунов, Николаев, 2008). Вследствие ограниченного доступа кислорода даже в условиях активной аэрации во внутренних слоях биоплнок возникают анаэробные микрозоны, где могут осуществляться анаэробные микробные процессы (Литти и др., 2013).

Анаэробное микробное разложение органических загрязнений сточных вод ведет к образованию летучих жирных кислот и спиртов и, при полной деградации, наиболее восстановленного из существующих в природе углеродных соединений – метана. Образование метана осуществляют крайне специализированные прокариоты – метанобразующие археи (Громов, 1997).

Образование метана возможно лишь при крайне низком окислительновосстановительном потенциале среды, от – 200 мВ до – 300 мВ и ниже. Все метаногены – облигатные анаэробы, рост некоторых из них в чистой культуре полностью подавляется при появлении в газовой фазе 0,004% кислорода (Zehnder, Stumm, 1988).

Однако развитие метанобразующих архей в смешанном микробном сообществе возможно и в присутствии кислорода во внешней среде. Так, из хлопьев аэробного ила выделена метаногенная культура Methanothrix в биопленках иммобилизованного активного (Methanosaeta) soehngenii, аэробного ила были обнаружены ацетокластические и водородиспользующие метаногены (Литти и др., 2013).

Эти результаты свидетельствуют о том, что в биопленках кислород активно потребляется аэробными бактериями, и создаются анаэробные микрозоны и условия для развития строго анаэробных микроорганизмов.

Обнаружение метаногенов в биопленках, развивающихся в анаэробных условиях, указывает на возможность развития в них также анаэробных азотогенных микроорганизмов – денитрификаторов и анаммокс бактерий.

Исследование анаэробных процессов образования молекулярного азота и метана в биопленках активного ила, а также последующего окисления образовавшегося метана представляет большой интерес для биотехнологии очистки сточных вод. Вклад анаэробной деградации органического вещества в системах аэробной очистки с иммобилизованной микрофлорой может быть довольно значителен (Литти и др., 2013).

Аэробные метанотрофные бактерии (метанотрофы), использующие метан в качестве единственного источника углерода и энергии, играют ключевую роль в глобальном цикле метана, окисляя этот парниковый газ и препятствуя его эмиссии в атмосферу. Полигоны захоронения твердых бытовых отходов (ТБО) являются экологически опасными объектами и важными антропогенными источниками метана. На полигонах ТБО развивается плотная популяция метанотрофных бактерий, спонтанно заселяющих верхний аэробный слой антропогенной почвы (Каллистова и др., 2014).

3.2. Метано- и метилотрофные бактерии

Аэробные метилотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) и его окисленные и замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, повсеместно распространены в природе (Beck et al., 2015). Метилотрофы часто ассоциированы с метанотрофами, особенно в почве, хотя часто и с высокой плотностью колонизируют листовую поверхность, присутствуют в семенах и ризосфере многих растений (Иванова, 2000;

Гальченко 2001; Sy et al., 2005; Knief et al., 2008; Dourado et al., 2015).

Аэробные метилобактерии – группа метилотрофных прокариот, использующих окисленные и замещнные производные метана в качестве источников углерода и энергии (Chistoserdova et al., 2003). Поскольку спектр этих соединений, не имеющих С-С связи, достаточно широк (~50), логично существование значительного числа таксонов метилобактерий, метаболизирующих данные соединения. Однако открытые в конце XIX века аэробные метилобактерии долгое время оставались энигматическими объектами, о чм свидетельствовали редкие публикации.

Лишь во второй половине XX века основополагающие исследования Дж.Р. Квейла, Л. Затмана, К. Энтони, М. Лидстром и К. Маррелла, открывших новые ферменты и гены путей С1-метаболизма, придали мощный импульс развитию метилотрофии как научного направления. В немалой степени этому способствовало активное внедрение молекулярно-биологических и генетических методов, которые революционизировали наши представления об особенностях биологии и планетарной роли метилотрофов (Троценко и др., 2010; Anthony, 1982; Ochsner et al., 2015).

Тем не менее их основная роль заключается в участии в глобальном круговороте С1– соединений, таких как метан, метанол, метилированные амины, галометаны и метилированные соединения серы. Таким образом, исчерпывающие знания о распротранении, структуре сообществ метилотрофных популяций в различных местообитаниях очень важны для раскрытия их метаболического потенциала (Anthony, 1982; Kalyuzhnaya et al., 2004).

3.3. Метилотрофия как научное направление Метилотрофия – это специализированный тип питания микроорганизмов, растущих на восстановленных одноуглеродных (C1) соединениях или соединениях с несколькими С-атомами, но не имеющих С-С связи. Спектр С1соединений биогенного и абиогенного происхождения достаточно широк и включает около 50 наименований: от предельно восстановленного СН4 до предельно окисленного СО2, среди которых моноокись углерода, муравьиная кислота, диметиловый эфир, метилированные амины, галометаны, метилсульфид, метилсульфоксиды, тиоцианаты и др. Многие из этих летучих соединений обладают цитотоксическим и даже канцерогенным действием, а также ответственны за так называемый парниковый эффект (Троценко и др., 2010; Anthony, 1982).

Аэробные метилотрофные бактерии, использующие в качестве источников углерода и энергии окисленные или замещнные производные метана, но неспособные расти на метане, предлагается называть метилобактериями.

Ростовыми субстратами для метилобактерий служат метанол, метиламин, диметиламин, триметиламин, галометаны (хлорметан и дихлорметан), серосодержащие соединения - метансульфоновая кислота, диметилсульфид и многие другие. Некоторые из этих соединений, например триметиламин СН3)N, содержат более одного атома углерода, но не имеют С-С связи.

Метилобактерии, в отличие от метанотрофов, не имеют сложной системы внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) (Гальченко, 2001; Максимова, 2005; Dourado et al., 2015).

По типу питания различают три группы метилобактерий:

Облигатные - растут только на С1-соединениях;

Ограниченно-факультативные - используют наряду с С1-субстратами одно или несколько полиуглеродных (Сn) соединений;

Факультативные - используют, кроме С1-соединений, широкий спектр Сn-соединений.

В последние годы установлено, что аэробные метилобактерии повсеместно распространены в природе и вносят жизненно важный вклад в биосферные циклы углерода, азота, фосфора и других биогенных макро- и микроэлементов.

Наряду с метанотрофами, метилобактерии являются важнейшим звеном в цепи метаболических превращений летучих С1-соединений, также своеобразным биофильтром на их пути в тропосферу, уменьшающим опасную вероятность истощения озонового слоя Земли (Nemecek-Marshall et al., 1995; Warneke et al., 1999; Keppler et al., 2008; Knief et al., 2008).

Известно более 40 родов аэробных метилобактерий, относящихся к -, - и

-классам Proteobacteria, Необходимо также упомянуть о метазотрофах. Это микроорганизмы, способные только окислять, либо ассимилировать, но не расти на С1-соединениях, т.е. не могут использовать их одновременно как источник углерода и энергии. Например, есть бактерии, которые могут только окислять метанол до СО2 и даже получать энергию, но не способны его ассимилировать из- за отсутствия соответствующих генов/ферментов. Другие бактерии ассимилируют, но не окисляют формальдегид, поскольку у них нет генов/ферментов, окисляющих формальдегид (Троценко и др., 2010).

Доступность метанола как возобновляемого субстрата и успехи в расшифровке биохимической и генетической структуры уникальных путей С1метаболизма у метилобактерий создали научную основу для промышленной реализации их биотехнологического потенциала (Максимова, 2005; Фдоров и др., 2011).

Метилсодержащие соединения (серин, глицин, биотин, холин, бетаин, метионин, триптофан, гистидин, лигнин, тимин, никотин и др.) являются центраболитами при синтезе многих полиуглеродных соединений. В центре их превращений метильные, метиленовые, оксиметильные, и формильные группировки, которые участвуют в метаболизме Сn-соединений. Таким образом, видно, что С1-фрагменты очень важны метаболически для существования всего живого, поэтому использующие их метилотрофные микроорганизмы представляют значительный интерес как в плане изучения особенностей биологии, так и в целях практического применения (Иванова и др., 2000;

Троценко и др., 2010; Anthony, 1982).

3.4. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий

Метанотрофные и метилотрофные бактерии представляют значительный интерес как потенциальные объекты биотехнологии: для производства белка, ферментов, липидов, стеринов, антиоксидантов, пигментов, полисахаридов, факторов транспорта железа, первичных и вторичных метаболитов (аминокислоты, органические кислоты, растворители, витамины, алкалоиды, антибиотики), биотрансформации органических соединений, снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов (Гальченко и др., 2001).

Спектр соединений и продуктов, синтезируемых с помощью аэробных метилобактерий, постоянно расширяется и пополняется новыми наименованиями. Таким образом, аэробные метилобактерии можно с полным основанием считать идеальными и перспективными объектами современной биотехнологии для целей биокатализа, биосинтеза и биоремедиации.

(Максимова, 2005; Троценко и др., 2010; Sy et al., 2005). В промышленных процессах одним из факторов, определяющих стоимость конечного продукта, является цена источника углерода. В связи с этим весьма заманчиво получать целевые продукты на основе сравнительно дешвого непищевого сырья – метанола, который может быть синтезирован из природного газа (метана) или получен из нефти, угля и древесины. В настоящее время мировое производство метанола достигло 50 млн. т/г, причем большая часть используется на химический синтез. Метанол также используется в качестве частичного заменителя бензина. Производство метанола не зависит от сезонных изменений и погодных условий, что выгодно отличает его от сырья сельскохозяйственного происхождения (Троценко и др., 2010).

Биосинтез микробного белка. Проблема дефицита кормового белка остатся нерешенной во многих странах, являясь одной из причин низкой эффективности работы птицефабрик и животноводческих комплексов. В принципе, она может быть решена за счт производства белка одноклеточных (SCP). Специфика производства SCP выдвигает ряд требований к продуценту:

высокие скорости роста и выходы по отношению к субстрату, способность расти при большой плотности популяции для обеспечения экономической эффективности процесса, высокое сродство продуцента к метанолу, повышенный температурный оптимум для снижения затрат на охлаждение ферментера, стабильность процесса при длительном непрерывном культивировании, устойчивость к заражению посторонней микрофлорой, отсутствие потребности в дополнительных факторах роста, отсутствие патогенности и токсичности, а также питательная ценность источника белка (Доронина, Троценко, 1986).

В качестве белковой добавки в корма можно использовать биомассу метилобактерий, которая по составу и количеству незаменимых аминокислот сопоставима с рыбной и соевой мукой и даже имеет определенные преимущества относительно таких продуктов растительного происхождения, как хлеб из пшеничной муки (Троценко и др., 2010).

Известно, что метилобактерии с РМФ-путм отличаются от метилобактерий с РБФ- и сериновым путями высокими показателями удельной скорости роста и экономического коэффициента, благоприятным элементным составом клеток, содержанием белка и лизина, жирнокислотным составом, лучшей перевариваемостью биомассы протеолитическими ферментами in vitro и, вследствие этого, предпочтительны для крупномасштабного культивирования и получения кормового белка (Иванова и др., 2000; Dourado et al., 2015).

Биосинтез аминокислот.

Серин. Метилобактерии с сериновым путем C1-метаболизма привлекают внимание как эффективные продуценты L-серина, поскольку их серинтрансоксиметилазы индуцируется при росте на метаноле (Keune et al., 1976).

Метионин обеспечивает серой и метальными группами различные метаболические процессы. Рацемическую форму DL-метионина синтезируют в промышленности из акролеина и метилмеркаптана. Микроорганизмы синтезируют эту аминокислоту в сложных и разветвлнных метаболических путях. Необходимыми интермедиатами путей синтеза L-метионина являются Lгомосерин, сульфид, S-метил-ТГФ и, возможно, серин. Конечным этапом биосинтеза L-метионина является трансметилирование L-гомоцистеина.

Этионин-резистентный мутант FM518, реализующий ицл– сериновый путь, накапливал в среде с метанолом 0,8 г/л L-метионина. Очевидно, что метилобактерии с сериновым путм перспективны для получения L-метионина.

Также, метилобактерии с РМФ-путем образуют из метанола сахарофосфаты, которые являются интермедиатами биосинтеза ароматических аминокислот - L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана. В связи с этим они рассматриваются как перспективные продуценты этих аминокислот (Максимова, 2005; Троценко и др., 2010; Sy et al., 2005; Mosin, Ignatov, 2014).

Экзополисахариды (ЭПС). Метилобактерии-продуценты ЭПС реализуют, в основном, РМФ- и РБФ-пути С1-метаболизма. Биоконверсия C1-соединений в полисахариды лимитирована кислородом. Так, выходы полисахарида из метанола и глюкозы идентичны при пересчете на углерод, а расход кислорода на образование ЭПС из метанола почти в 10 раз больше. Некоторые факультативные метилотрофы, использующие различные источники углерода, способны синтезировать ЭПС только на средах с метанолом (Dourado et al., 2015).

Высокая вязкость растворов, способность к гелеобразоваию псевдопластичность, тиксотропность ЭПС метилобактерий позволяет обсуждать возможность их использования в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве, для производства картона и повышения нефтедобычи. Однако остается актуальным выделение и селекция новых штаммов-продуцентов ЭПС на основе метанола (Троценко и др., 2010).

Поли--гидроксибутират/валерат (ПГБ/В). Производство полимеров и пластмасс развивается высокими темпами, что обусловлено стремительным ростом их потребления. Однако упаковка из синтетических полимеров, составляющая 40% бытового мусора, практически не разлагается почве, так как не найдены микроорганизмы и ферменты, способные е деградировать. При сжигании синтетических полимеров образуются крайне токсичные диоксины.

Кроме того, в посуде, упаковочных материалах, детских игрушках и других изделиях из синтетических пластиков обнаружены высокотоксичные соединения: бисфенол А, вызывающий рак груди, и эфиры фталевой кислоты, наносящие вред развитию новорожденных и поражающие головной мозг.

Кроме того, на производство синтетических пластиков расходуется более 8% добываемой нефти, запасы которой ограничены, а цены на нее постоянно растут. В связи с этим вс большее внимание уделяется исследованиям по получению и использованию различных биоразлагаемых пластиков, в том числе ПГБ и ПГБ/В.

Многие прокариоты синтезируют и запасают ПГБ и подобные ему полимеры при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфора, кислорода или магния) в виде цитоплазматических гранул. ПГБ обладает рядом полезных свойств – биоразлагаемостью, биосовместимостью и термопластичностью. Введение -гидроксивалерата в ПГБ существенно улучшает физико-химические и реологические свойства полимера.

Образующийся сополимер (ПГБ/В) прочнее и эластичнее, чем ПГБ, поэтому перспективен как биоразлагаемый заменитель персистентных химических полимеров (Dourado et al., 2015).

Отобраны метилотрофные продуценты, накапливающие ПГБ/В при росте на метаноле в присутствии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, причем добавление C5-субстратов приводит к более высокому содержанию гидроксивалерата в составе сополимера, нежели внесение С3-соединений.

Paracoccus methylutens синтезирует ПГБ/В из метанола также в присутствии глицерина и гептана (Троценко и др., 2010; Dourado et al., 2015).

В условиях периодического культивирования различные сериновые метилобактерии способны накапливать как низкомолекулярный (50-60 кДа), так и высокомолекулярный ПГБ (1300-2000 кДа). В оптимизированных условиях содержание ПГБ может составить 50-55%. При непрерывном культивировании максимальная продуктивность 0,64 г/л ч получена для Hyphomicrobium zavarzinii, а содержание ПГБ варьировало от 40 до 59%. При периодическом культивировании с контролируемым с ношением C/N М.

extorquens К накапливал до 60% ПГБ с выходом 0,2 г/г метанола.

Фитогормоны (цитокинины, ауксины), B12. В последнее десятилетие установлена новая жизненно важная роль аэробных метилотрофов в качестве фитосимбионтов, поскольку показано, что метанол и другие C 1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений (Nemecek-Marshall et al., 1995). Проведнный скрининг 140 видов одно- и двудольных растений показал, что филлосфера и ризосфера, а также семена растений колонизованы метилотрофными бактериями. Высокая плотность метилобактерий на единицу листовой поверхности (до 600 КОЕ/см2) свидетельствует об образовании ими своеобразного катаболического экрана, препятствующего поступлению в атмосферу летучих С1 продуктов метаболизма растений, прежде всего метанола и формальдегида (Фдоров и др., 2011). Особо следует отметить широкое распространение среди метилотрофов – фитосимбионтов представителей рода Methylobacterium, которые чаще других метилобактерий обнаруживаются в ассоциации с растениями (Dourado et al., 2015). В частности, многие метилобактерии (Methylobacterium cerastii, Mtb. marchantiae, Mtb. gnaphalii, Mtb.

trifolii, Mtb. thuringiense, Mtb. gossipiicola и др.) впервые были выделены с различных органов растений (Schauer et al., 2011; Madhaiyan et al., 2012; Tani et al., 2012; Wellner et al., 2012, 2013; Zou et al., 2013). Показано, что колонизация метилотрофами растений повышает скорость роста, фотосинтетическую активность, регенерационный потенциал и способность к корнеобразованию.

Кроме того, у колонизованных метилобактериями растений повышалась устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам (Иванова и др., 2000; Knief et al., 2008; Gogleva et al., 2011). Также, среди метилобактерий есть симбионты растений способные индуцировать образование клубеньков (Sy et al., 2001).

Биоактивные соединения, выделяемые метилобактериями прижизненно или в результате лизиса клеток, оказывают благоприятное воздействие на рост и развитие растений. При росте на одно- и полиуглеродных субстратах некоторые факультативные метилотрофы конститутивно синтезируют цитокинины (Koenig et al., 2002). Представители всех известных родов метилобактерий, выращенные на средах с метанолом или метиламином в присутствии 5 мМ L-триптофана, синтезируют индольные соединения, в частности, индолилуксусную кислоту (ИУК), что зачастую используется как таксономический признак (Герхардт, 1983; Иванова и др., 2001; Доронина и др., 2002; Фдоров и др., 2009; Gogleva et al., 2011). Выделены ключевые ферменты, участвующие в синтезе ИУК у некоторых метилотрофов (Фдоров и др., 2010).

Целый ряд сообщений свидетельствует об образовании факультативными метилобактериями витамина В12 (кобаламина), выход которого был существенно выше при использовании С1, чем Сn-субстратов. Так, при росте на средах с метанолом или дихлорметаном Methylobacterium dichloromethanicum DM4 образует 10 мкг В12/г сухой биомассы, а на средах с этанолом и сукцинатом – на 30% меньше. Наряду с тем, что метионинсинтетаза метилотрофов является В12-зависимым ферментом, более высокий уровень кобаламина при метилотрофном росте связан с участием в ключевых реакциях путей С1-метаболизма (Троценко, 2010; Фдоров и др., 2011).

Эктоин. Эта циклическая иминокислота является одним из наиболее распространенных в микробном мире осмопротекторов (Reshetnikov et al., 2010). В последние годы эктоин вс более активно используется в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективного стабилизатора ферментов, нуклеиновых кислот и ДНК-белковых комплексов, а также в косметической промышленности как УФ-протектор и увлажнитель (Троценко и др., 2010; Reshetnikov et al., 2010). Показано, что у галофильных/толерантных метилобактерий одним из механизмов осмоадаптации является синтез de novo и преимущественное накопление в клетках эктоина. Обычно гало(алкало)фильные метилобактерии синтезируют эктоин только при высоком содержании соли (3% NaCl), когда возрастают энергетические затраты на поддержание ионных градиентов и уменьшается энергетический статус клеток (Dourado et al., 2015).

Интерес к биопротекторам (эктоины, бетаины) во многом обусловлен возможностью использования их в качестве «химических шаперонов», оказывающих стабилизирующее и защитное действие на ферментативные системы, ДНК- и РНК-белковые комплексы (Троценко и др., 2010).

Биодеградация токсичных соединений. Перспективность использования аэробных метилобактерий в биотехнологии обусловлена не только их способностью синтезировать различные полезные продукты, довольствуясь минимальными, в сравнении с гетеротрофами питательными потребностями, но и разлагать широкий спектр высокотоксичных соединений (Dourado et al., 2015).

Известны метилобактерии, использующие в качестве источников углерода и энергии метанол, формальдегид, метилированные амины, метилсернистые соединения, галометаны, метил- и этилацетат, ацетон и толуол (Максимова, 2005; Троценко и др., 2010; Krausova et al., 2003; Van Aken et al., 2004; Roselli et al., 2013; Pasternak, Kowzan, 2013; Ventorino et al.,2014).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследований В период с мая по октябрь 2010 по 2013 гг. изучали микробиоценоз водных масс обводного канала (средняя глубина 1,5 м) ПТБО «Софроны» г. Перми, используемого для утилизации основной массы городского мусора с 1978 г.

Полигон расположен в 12 км от черты города и занимает 52 гектара, и представляет из себя холм от 20 до 30 метров в высоту. Температура внутри полигона варьируется от 30 до 60 C вследствие разогрева его процессами анаэробного разложения органических веществ.

Объем складированных отходов превышает 5,5 млн. т, средняя плотность ТБО – 0,8–1,2 т/м3. Рекультивация полигона «Софроны» проводится с 1999 года.

В зоне свалки отмечено превышение предельно допустимых концентраций в атмосферном воздухе по этилбензолу (1,5–6 НДК) и сумме углеводородов (метану) (до 4,5 ПДК). Выделение биогаза на уровне 6 – 10 мг/м3 зафиксировано в рекультивированной части свалки (Вайсман и др., 2003).

Территория полигона не имеет надежного естественного водоупорного основания под рабочим телом и расположена в верхней части водораздельной возвышенности с усиленной нисходящей вертикальной фильтрацией подземных вод, что приводит к избыточному увлажнению территории и способствует формированию больших объемов загрязненных грунтовых и фильтрационных вод.

На территории прилегающей к полигону, отмечено загрязнение почвенного покрова, угнетение лесной растительности, снижение видового разнообразия наземных позвоночных животных при резком увеличении численности серых крыс (Вайсман и др., 2003).

В Мае-Октябре 2010–2013 исследовалась «старая холодноводная секция»

ирригационного канала в южной части полигона (57°57'26.62"СШ, 56°31'38.34"ВД). На протяжении зимы, вода на этом участке промерзала от поверхности до дна. В середине Марта 2013 была исследована более молодая область свободная ото льда, находящаяся в северной части ПТБО («молодая тепловодная секция») (57°57'47.90"СШ, 56°31'19.86"ВД) (Рисунок 4). Было обнаружено, что из тела полигона истекает тплый, тмно-коричневый водный раствор с придонной температурой +23,1C, в то время как уличная температура была –13C (Рисунок 5).

Пробы поверхностной и придонной воды из обводного канала ПТБО для микробиологических исследований отбирались в стерильные пластиковые бутылки объмом 1,5 л. Для физико-химических исследований использовали пластиковые вдра объмом 5 литров. Часть измерений (глубина резервуара, температура, pH) проводили на месте с использованием переносного оборудования.

4.1. Методы лабораторных исследований 4.1.1. Гидрохимические анализы фильтрационных вод Гидрохимические анализы выполняли согласно практическому руководству по изучению состава промышленных сточных вод (Лурье, 1975).

Содержание растворенного метана в пробах оценивали по результатам анализа газовых смесей на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия), металлы – в гексановых и хлороформных экстрактах на атомно-абсорционном спектрометре Shimadzu AA-6300 (Япония) после подкисления проб азотной кислотой до pH2. Состав органических веществ (ОВ) фильтрационных вод определяли на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N (США). ОВ экстрагировали метилхлоридом, разделяли на хроматографической капиллярной колонке с неполярной фазой HP-5MS в режиме программирования температуры и далее анализировали на масс-спектрометре.

Рисунок 4. Тепловодная секция полигона ТБО «Софроны», март 2013 года.

–  –  –

Численность аэробных и анаэробных бактерий в фильтрационных водах ПТБО определяли методом предельных разведений на жидких и агаризованных средах, используемых при изучении отдельных групп пресноводных микроорганизмов, участвующих в превращениях соединений углерода и азота.

Посевы инкубировали при 25-30°С в течение 2-14 сут до появления отдельных колоний на плотных средах или клеточных суспензий на жидких средах (Нетрусов, 2005; Ившина, 2014).

Рисунок 5. Расположение точек отбора проб на теле полигона ТБО «Софроны», Пермский край.

–  –  –

Для культивирования метилобактерий использовали модифицированную нами среду «К» при 28С и pH 7,2 (г/л): NaCl – 2; KН2РО4 – 1; MgSO4 · 7Н2О – 0,5; NaНСО3 – 0,4; FeSO4 · 7Н2О – 0,002; (NН4)2SO4 – 0,3; KNO3 – 0,6;

дрожжевой экстракт – 0.05; витамин B12 – 20 мкг/л; метанол – 5 мл/л;

микроэлементы по Пфеннигу – 1 мл/л. Для получения плотных сред того же состава добавляли 20 г/л агара Difco. Культуры хранили на скошенном агаре при 2-3С в пробирках под резиновыми пробками. При анаэробном культивировании протеобактерий в качестве акцепторов электронов использовали нитрат калия (2 г/л), тестируя в качестве донора электронов метанол, ацетат, цитрат, глюкозу, пептон и пируват. Для выявления сапротрофных компонентов из накопительных культур метилотрофных протеобактерий использовали метод последовательных пересевов отдельных колоний на плотной среде (г/л): агар Difco – 20; NaCl – 2; KН2РО4 – 1; MgSO4 · 7Н2О – 0,5; пептон – 5 (Герхардт, 1983; Нетрусов, 2005).

Сульфатвосстанавливающих бактерий выращивали на среде «Постгейта В» (г/л): KН2РО4 – 0,5; NH4Cl – 1,0; CaSO4 – 1,0; MgSO4 · 7Н2О – 2,0; лактат Ca – 3,0; NaCl – 50,0; KCl – 0,4; дрожжевой экстракт – 0,1. Отдельно готовится 1 г/100 мл Na2S·9H2O в 1% NaHCO3; 3% FeSO4 в 1% HCl; 5% NaOH (Романенко, Кузнецов, 1974). Таксономическую принадлежность выделенных бактерий устанавливали по совокупности фенотипических и генотипических признаков (Bergey‘s Manual.., 2005).

4.1.4. Газохроматографический анализ активности денитрификации

Способность к денитрификации микрофлоры сточных вод и культур протеобактерий оценивали по накоплению N2O в газовой фазе с N2 и ацетиленом. Анализ газовых смесей производили на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия) с применением катарометра, колонки длиной 2,4 м и диаметром 6 мм с абсорбентом Porapak N (США) (Галямина, 2011; Stewart et al., 1967;

Yoshinari, Knowles, 1976).

При вычислении активности денитрификации по скорости накопления закиси азота (N2O) учитывали, что определение фактической денитрификации ограничено недостаточной чувствительностью катарометра к N2O, а также неполным ингибированием ацетиленом при низкой N2O-редуктазы концентрации нитратов в среде (Кузнецов, Дубинина, 1989; Oremland, Capone, 1988). Поэтому мы определяли потенциальную скорость денитрификации после внесения в испытуемые образцы 1 мг N–NO3 /л и увеличения инкубационного периода до 24 часов. Расчт скорости денитрификации вели по формуле:

где h – высота пика соответствующего выходу N2O, мм;

K – чувствительность детектора к N2O, мкг/мм (нмоль/мм) высоты пика;

Vгф – объм газовой фазы в опытной склянке с пробой;

Vжф – объм самой жидкой пробы в опытной склянке;

24 – перевод на сутки, ч;

1000 – перевод на литр пробы, мл;

Vан – объм газа вводимого в примник хроматографа, мл;

t – время инкубации, ч.

При этом стандартный коэффициент растворимости N2O в жидкости – равен 0,55 на литр (Галямина, 2011; Orcutt, Seevers, 1937).

Химический анализ накопления нитритов в культуральной среде проводили фотометрически с реактивом Грисса (Старцева, 1980).

4.1.5. Определение состава жирных кислот

Жирнокислотный состав (ЖК) анализировали на хромато-массспектрометрической системе (США). ЖК Agilent 6890/5973N концентрированной центрифугированием бактериальной биомассы переводили в метилированные эфиры в смеси метанол–HCl, эфиры экстрагировали гексаном, затем разделяли на хроматографической капиллярной колонке с неполярной фазой HP-5MS в режиме программирования температуры и далее анализировали в динамическом режиме на масс-спектрометре (Imhoff, Thiemann, 1991). Идентификацию метиловых эфиров ЖК осуществляли с использованием автоматизированной системы обработки масс-спектральных данных AMDIS с поиском целевых компонентов по библиотеке NISTEPA, MSL (США) с фактором сходства не менее 80%.

4.1.6. Выделение ДНК из исследуемых проб in situ / ex situ

Полученные образцы фильтрационных вод хранились на холоду при 2C в течение 1 дня, после чего осаждались центрифугированием при 4000 g в течение 20 минут, при температуре 10C и в дальнейшем использовались для ДНК-экстракции. ДНК выделяли, используя набор для экстракции ДНК из почвенных образцов (MolBio, Laboratories, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Очищенную ДНК получали используя Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) и хранили при –80C. Из выделенных культур микроорганизмов ДНК выделяли по стандартной методике (Булыгина и др., 2002). Концентрация полученного препарата ДНК при использовании этого метода составляла 30 – 50 мкг/мл. РНК в полученном препарате присутствует в следовых количествах (менее 1%, согласно данным электрофоретического анализа). Содержание Г+Ц-пар оснований оценивали по температуре плавления ДНК по общепринятому методу Мармура (Marmur, Doty, 1962).

4.1.7. ПЦР-амплификация гена 16S рРНК, клонирование, секвенирование и анализ На первом этапе выделения микроорганизмов, доминирующих в фильтрационных водах ПТБО, в суспензиях и колониях которых визуально загрязнений не обнаруживали, секвенировали нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК.

Фрагменты тотальной ДНК из образцов окружающей среды, кодирующие бактериальные гены 16S рРНК, были амплифицированы с использованием ПЦР с универсальными эубактериальными праймерами: 27f и 1492r (Lane, 1991), для архей использовали системы праймеров: A8F, A800R, и A1041R (Kolganova et al., 2002). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1x буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 2 мМ MgCl2); по 12,5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНКматрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР был следующим:

Первый цикл:

94°С 9 мин;

55°С 1 мин;

72°С 2 мин.

Последующие 30 циклов:

94°С 1 мин;

55°С 1 мин;

72°С 2 мин.

Завершающий цикл - 72°С 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% агарозном геле при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера с соавт. (Sanger et al.,1977) с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры (Lane, 1991) и чтение проводили в двух направлениях.

Затем проводили первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с помощью прогрограммного пакета BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). На заключительном этапе выделения чистых культур протеобактерий, в частности, у метилотрофных штаммов определяли практически полные последовательности гена 16S рРНК (1475-1505) нуклеотидов. Затем эти последовательности анализировали с помощью пакета программ Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp).

Филогенетический анализ проводили по методу maximum-likelihood и алгоритмов, реализованных в пакете программ TREECON и MEGA 4.

Очищенные ПЦР фрагменты гена 16S рРНК (выделенные в марте 2013 года из образцов «холодной» и «горячей» секции для in situ-анализа) длиной 1500 пн были клонированы в вектора pGEM-3Zf (+) или pGEM-T (Promega, США). Клоны несущие схожие ПЦР-фрагменты были сгруппированы на основании рестрикционного анализа. После этого, было отобрано по 3–4 клона от каждой группы и отсеквенировано на автоматическом секвенаторе DNA США). Дендрограммы Analyzer ABi3730 (Applied Biosystems, филогенетического родства архейных и бактериальных генов 16S рРНК были построены, используя алгоритм Maximum Likelihood (Tamura et al., 2011).

4.1.8. ПЦР-амплификация гена mxaF, клонирование, секвенирование и анализ Ген метанолдегидрогеназы был амплифицирован в полимеразной цепной реакции, используя пару праймеров (mxaF): F1003 и R1561, для метилотрофов и метанотрофов (McDonald, Murrell, 1997; Lau et al., 2013). ПЦР амплификация без ДНК-матрицы был использован как контроль на загрязнения. Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1x буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 2 мМ MgCl2); по 12,5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл:

94°С 5 мин;

последующие 35 циклов:

94°С 1 мин;

55°С 1 мин;

72°С 1 мин;

завершающий цикл - 72°С х 5 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов проводили по методу Сэнгера с соват. с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали те же праймеры, что и для end-point ПЦР и чтение проводили в двух направлениях. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов изучаемых образцов проводили с помощью программного пакета BLAST.

Очищенные ПЦР фрагменты гена mxaF из образцов окружающей среды (выделенные в марте 2013 года из образцов «холодной» и «горячей» секции для in situ-анализа) длиной 550 пн были получены используя набор Wizard PCR Preps (Promega, США) в соответствии с прилагающимися инструкциями.

Фрагменты были клонированы в векторную систему pGEM-T (Promega, США) в компетентные клетки Escherichia coli DH5. Рекомбинантные клоны, несущие схожие ПЦР-фрагменты (mxaF) были сгруппированы на основе рестрикционного анализа, где были использованы эндонуклеазы HAE III Hha I (Alexandrov et al., 2001). Далее, были выбраны от 2 до 5 клонов из каждой группы и секвенированы на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer ABi3730 (Applied Biosystems, США) с применением набора реагентов BigDye v.3.1. Предварительный анализ результатов секвенирования нуклеотидных последовательностей гена mxaF проводился с использованием пакета программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Дендрограммы были построены на основании нуклеотидных сиквенсов гена mxaF с применением алгоритма Maximum Likelihood с использованием программы MEGA 5 (Tamura et al., 2011). «Bootstrap» анализ 500 альтернативных деревьев выполнялся для подтверждения достоверности порядка ветвления (Felsenstein, 1985).

4.1.9. Подсчт клеток и флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)

Общее количество жизнеспособных клеток бактериопланктона определяли, используя эпифлуоресцентную микроскопию и окрашивание 4‘6‘–диамино–2– фенилиндолом (ДАФИ) (Amann et al., 1990, 1995). Определение структуры микробного сообщества инфильтрационных вод ПТБО проводили посредством флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) согласно протоколу детекции и идентификации планктонных бактерий (Manz et al., 1992; Glckner et al., 1996).

Фиксацию клеток проводили 3%-ым параформальдегидом. После дегидратации с 50, 80 и 96% этанолом, клетки были перенесены на тефлоновые плашки и иммобилизованы высушиванием на воздухе. Затем гибридизованы с группспецифичными олигонуклеотидными зондами ARC 344 (Raskin et al., 1994), EUB 338, HGC69a (Amann et al., 1990, 1995), SRB385Db (Rabus et al., 1999), ALF1b, BET42a, Gam42a (Manz et al., 1992), CFB560 (O‘Sullivan et al., 2001) и NON338 (Wallner et al., 1993). Cy3–меченые зонды были синтезированы компанией «Синтол» (Москва, Россия). После гибридизации зонды были окрашены по ДАФИ (концентрация 1 мг/мл) и определены на микроскопе Zeiss Axiolmager D1 (Carl Zeiss, Йена, Германия), оснащнном ртутной лампой HBO 100-W Hg, необходимым набором фильтров для Cy3 и ДАФИ флуоресценции.

Обсчитывали от 300 до 500 объектов на пробу, окрашенных по ДАФИ.

Полученные результаты корректировали по зонду NON338, который не обладает сходством ни с одним из участков гена 16S rRNA (Wallner et al., 1993).

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ MS Excel 2007.

Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК 9 штаммов бактерий, выделенных из фильтрационных вод полигона ТБО «Софроны», депонированы в базе данных GenBank под номерами: KF371656 – KF371658, KC577607 – KC577612 (Приложение 1). Клоновые последовательности генов 16S рРНК и mxaF полученные в этом исследовании депонированы в базе данных GenBank под номерами: KM870428 – KM870474 (архейные 16S рРНК); KM870230 – KM870309, KM870310 – KM870395 (бактериальные 16S рРНК); KM870396 – KM870427, KM870475 – KM870503 (ген mxaF).

4.1.10. Эксперименты с проростками

Полученные бактериальные препараты концентрировали центрифугированием, отмывали физиологическим раствором от метаболитов и доводили до оптической плотности 0,2 на спектрофотометре Cary 100 (Agilent Technologies, США) при 590 нм. Семена пшеницы стерилизовали в 1% растворе KMnO4 в течение 5 минут и помещали в стерильные стеклянные стаканы с крышкой из фольги (по 10 шт./стакан) с 1,0 мл бактериальной суспензии в солевом растворе (0,5 или 1,0% NaCl). Контрольные образцы семян в солевом растворе не содержали микробных препаратов. После 6-ти дневной инкубации образцов при 25С оценивали морфометрические параметры проростков.

Суммарное содержание хлорофиллов и каротиноидов в 6-ти дневных проростках измеряли спектрофотометрическим методом в 80%-ных ацетоновых экстрактах по стандартной методике на спектрофотометре (Sohrabi et al., 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Общая характеристика фильтрационных вод ПТБО Согласно нормативам загрязннности поверхностных вод, принятым в системе Росгидромета, в частности, по нормативам предельно допустимых концентраций вод хозяйственно-бытового использования, исследованные фильтрационные воды из «холодной» Станции 2 (отобранные в 2010–2012 годах) обводного канала ПТБО характеризовались «высоким загрязнением» по химическому потреблению кислорода (ХПК), общей численности бактерий и одноклеточных водорослей (преимущественно зелных и эвгленовых), «кишечных палочек», аммонию, нитратам, нитритам, фосфору, железу и никелю (Таблица 3,4). Из донных отложений в придонные слои воды сравнительно легко переходили метан, аммоний, фосфор и железо. Также «старая холодноводная секция» характеризовалась резким снижением цветности раствора (в 40–60 раз), концентрации метана (32–260 раз), общего фосфора (35–56 раз), хрома (19–56), железа (7–20 раз) и натрия (6–14 раз) по сравнению с «тепловодной секцией».

Станция 1 расположена в северной части полигона в водоеме на изливе теплых инфильтрационных вод («тепловодная секция»), а станция 2 - на южном участке в обводном канале, промерзающем до дна в зимний период («холодноводная секция») (Рисунок 5). Пробы, отобранные в марте 2013 года, по интегральным показателям (ХПК, БПК) относятся к чрезвычайно грязным водам (Таблица 4, Рисунок 6,7). Химическая потребность в кислороде (ХПК) – количество кислорода, необходимое для окисления углерода органических соединений водорода, азота и серы. Биохимическая потребность в кислороде (БПК) – характеризует содержание органики, которая может быть удалена методом биологической очистки, например, с помощью активного ила в аэротенках. Известно, что соотношение БПК к ХПК характеризует способность воды к самоочищению. Если оно более единицы, то биологическим путем разрушается весь спектр загрязняющих веществ. В исследованных образцах соотношение БПК5/ХПК составляет около 0,02-0,07, что свидетельствует о высоком содержании биорезистентных компонентов и низкой самоочищаемости.

По данным исследований на стации 1 в поверхностном слое фильтрата зафиксировано 1140, а в придонном 1329 органических поллютанта. С фактором сходства более 80% идентифицировано, соответственно 33 и 41 экотоксиканта. На станции 2 в верхнем слое выявлено 1002, а в придонном слое 1326 органических веществ. С фактором сходства более 80% идентифицировано, соответственно 28 и 30 экотоксикантов. Среди идентифицированных экотоксикантов наиболее распространены фенольные соединения, фталаты, фосфаты, терпеноиды, терпены, кетоны, карбоновые и бензойные кислоты, нитрозосоединения, продукты биодеградации. Из химических показателей качества вод, существенно повышены содержания сульфатов, хлоридов, магния, кальция, натрия, общей жсткости, щлочности, свинца, никеля, железа, кадмия, хрома и марганца.

–  –  –

Общее количество клеток, определнное при использовании окрашивания по ДАФИ в двух секциях сточных вод («тплой» и «холодной») было приблизительно одинаковым (98,9±2,7 10 6 /мл), где доминировали представители домена Bacteria (65,0±1,2% по ДАФИ), филума Proteobacteria (53,9±5,5 106 /мл; 54,5±5,6% по ДАФИ или 83,8±8,5% от Bacteria) (Таблица 5, Рисунок 8).

Наиболее распространнными были представители Gammaproteobacteria: 58,5% от Eubacteria в «молодой тепловодной секции» и 32,2% от Eubacteria в «старой холодноводной секции». В то время как пропорция Alphaproteobacteria увеличилась с 6,8% до 21,4%, количество Betaproteobacteria также выросло с 10,0% до 27,3%, тогда как содержание Deltaproteobacteria снизилось с 8,2 до 3,3%, а домена Archaea с 6,3 до 0,6% по ДАФИ (Рисунок 9-17). Филум Actinobacteria и Bacterioidetes (Cytophaga составили 2–4% от Flavobacterium Bacteroides) Eubacteria идентифицированных в сточных водах. Наблюдаемая эндодинамическая сукцессия состава микробного сообщества может быть вызвана охлаждением, деминерализацией и насыщением кислородом постоянного потока фильтрационных вод из тела полигона. Эффективность похожих рРНК систем олигонуклеотидных зондов для детекции методом FISH показала ранее свою состоятельность при определении доли протеобактерий среди эубактерий в активном иле сточных вод из промышленных очистных сооружений (до 60– 93%) (Wagner et al., 1993; Crocetti et al., 2000, 2002; Juretschko et al., 2002).

Полученные данные частично согласуются с результатами ряда исследований, в частности Guo с соавторами (Guo et al., 2015) проведя метагеномное секвенирование анаэробного сообщества ила муниципальных очистных сооружений Пекина обнаружили, что в пробах преобладают представители домена Bacteria ( 93%), тогда как Archaea только 6%, что несколько превышает значения, полученные в предыдущих исследованиях (Li et al., 2013;

Yang et al., 2014). Среди бактерий преобладали филумы Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria (41,2%, 12,5%, 9,6% и 5,2% соответственно). Самым распространнным классом среди протеобактерий был Alphaproteobacteria 36,4% (Рисунок 18) (Guo et al., 2015).

–  –  –

Рисунок 8. Соотношение численности прокариотических клеток в фильтрационных водах ПТБО определнное по ДАФИ окрашиванию и детектированное методом FISH (А).

Распределение детектированных Эубактерий по некоторым филогенетическим группам (Б); Н.О. – принадлежность не определена.

А.

Б.

85% 83% Рисунок 9. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «тепловодной» секции с архейными праймерами. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 10. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «тепловодной» секции с праймерами для альфапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 11. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «тепловодной» секции с праймерами для бетапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 12. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «тепловодной» секции с праймерами для гаммапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 13. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «тепловодной» секции с праймерами для дельтапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 14. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «холодноводной» секции с праймерами для альфапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 15. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «холодноводной» секции с праймерами для бетапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 16. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «холодноводной» секции с праймерами для гаммапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 17. Флуоресцентная гибридизация in situ пробы «холодноводной» секции с праймерами для дельтапротеобактерий. (А) – Исходная микрофотография; (Б) – Окраска клеток красителем ДАФИ; (В) – Гибридизационные сигналы с соответствующими праймерами.

Рисунок 18. Таксономический состав илов очистых сооружений на уровне филумов и процентное соотношение классов протеобактерий внутри Proteobacteria (Guo et al., 2015).

–  –  –

Из «старой холодноводной секции» получить ПЦР-продукты используя систему праймеров A8F, A800R, и A1041R не удалось, учитывая, что на выделение ДНК бралось до 100 мл пробы.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
 

Похожие работы:

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«Киселева Ирина Анатольевна СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 03.01.06 – биотехнология (в том числе...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Мамалова Хадижат Эдильсултановна БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ специальность: 06.01.08 – Плодоводство, виноградарство диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель, доктор сельскохозяйственных наук, доцент Заремук Римма...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.