WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

«СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕН ...»

-- [ Страница 4 ] --

Для высева E. coli из разведений фекалий использовали среду Эндо. Через 24 часа инкубации при 37 С выделяли с чашек характерные колонии и идентифицировали их. Из типичных колоний делали микробную взвесь, соответствующую по плотности 10 единиц по отраслевому стандарту мутности (ОСО) – 0,93х109 клеток/мл. Из приготовленной взвеси на чашки Петри с разлитой и подсушенной питательной средой наносили 0,05 -0,1мл микробной взвеси, тщательно растирали шпателем и давали подсохнуть 15-20 минут. Затем на засеянную поверхность наносили каплями в первый сектор испытуемый коктейль бактериофагов, во второй – «Интести-бактериофаг», а третий сектор оставляли интактным. Термостатировали при 37 0С в течение суток. Результат оценивали по наличию или отсутствию пятна лизиса на бактериальном газоне каждого из секторов (таблица 21).

Таблица 21. Литическая активность коктейля бактериофагов и «Интестибактериофага» (ФГУП «НПО Микроген») по отношению к изолятам E.coli с нормальными ферментативными свойствами (методом spot-теста).

Микроорганизмы, Частота выявления фагорезистентных штаммов, % (количество иссле- Коктейль бактериофагов «Интести-бактериофаг»

дованных проб) E.coli (hem-), (34) 100 В результате проведенной работы оказалось, что коктейль бактериофагов не лизирует E. coli с нормальными ферментативными свойствами, в то время как коммерческий «Интести-бактериофаг» лизирует E. coli с нормальными ферментативными свойствами в 30 % случаев. На наш взгляд, это может свидетельствовать о том, что данный бактериофаг проявляет неспецифическую литическую активность. Но вопрос остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Стабильность биологических свойств фагов-кандидатов при воздействии на них различных физических и химических агентов является существенной характеристикой вирусных частиц с точки зрения дальнейшего их использования в готовой форме специализированного продукта. Мы исследовали влияние на фаги высоких температур (табица 22), кислых и щелочных сред (таблица 23), хлороформа (таблица 24).

Таблица 22. Изменение титра бактериофагов под воздействием высоких температур (по Грациа).

–  –  –

температуры и колифаги. Повышение температуры до 85 °С является губительным для вирусных частиц.

Таблица 23. Изменения титра бактериофагов под воздействием хлороформа (по Грациа).

–  –  –

Все бактериофаги-кандидаты устойчивы к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут исследуемые фаги не теряли своей активности, а обработка фаголизата в течение 45 минут приводила лишь к незначительному снижению их активности. Полученные данные подтверждают возможность использования хлороформа, как средства освобождения фаголизатов от не лизированных бактерий.

Таблица 24. Изменение титра бактериофагов при различных значениях рН среды.

–  –  –

Данные таблицы свидетельствуют о том, что в слабощелочных буферных смесях бактериофаги проявляют большую стабильность, чем при кислых значениях рН, за исключением сальмонеллезных бактериофагов, которые выдерживают слабокислую реакцию среды длительное время.

2.1.4. Молекулярно-генетическая характеристика производственноперспективных штаммов бактериофагов В ходе подбора производственных штаммов бактериофагов важную роль играет их молекулярно-генетическая характеристика, которая включает в себя размер фагового генома, процент идентичности с таксономически наиболее близкими бактериофагами, отсутствие в составе ДНК генов, кодирующих токсины, интегразы, репрессоры транскрипции и других нежелательных генов.

Изучение этих характеристик позволило говорить об оригинальности и вирулентной природе отобранных бактериофагов.

Методом ПЦР со специфическими праймерами нам удалось показать, что все отобранные нами бактериофаги не несут в своем составе генов, кодирующих известные локусы патогенности некоторых штаммов-хозяинов (rfb, stx1, stx2, eae fliC, -toxin, Stx А, LLO- toxin).

Получение бактериофагов в высокой концентрации позволило соответствующим образом подготовить фаговую ДНК для проведения ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) анализа и полногеномного секвенирования.

Метод ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) позволил получить ориентировочный размер фагового генома каждого штамма бактериофага. При помощи этого метода были охарактеризованы ДНК всех бактериофагов, предварительно включенных в продукт на основании их фенотипических свойств (рисунок 11).

108

–  –  –

Рисунок 11 ПДРФ - анализ ДНК бактериофагов Для получения полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов бактериофагов использовали секвенирование второго поколения (в частности Ion Torrent) и секвенирование по методу Сэнгера (при необходимости закрытия нуклеотидных брешей). Каждый штамм бактериофага был секвенирован трижды.

Данные каждого раунда секвенирования были проанализированы методами биоинформатики. Фильтрация качества прочтений (ридов) позволила собрать геномы бактериофагов с высокой достоверностью. Собранные геномы сравнивали с известными геномами известных бактериофагов. На рисунках 12-18 визуализированы эти данные.

Рисунок 12 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома колифага EсD7 Рисунок 13 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома колифага V18 Рисунок 14 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома бактериофага Salmonella Enteritidis SE40 Рисунок 15 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома бактериофага Salmonella Typhimurium ST11 Рисунок 16 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома бактериофага Salmonella Infantis Si3 Рисунок 17 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома листериозного бактериофага Lm1 Рисунок 18 Визуализация глубины покрытия и идентичности генома стафилококкового бактериофага СН1.

–  –  –

Проведенные в работе исследования по изучению молекулярно - генетической характеристики бактериофагов позволили нам:

- подтвердить отсутствие в геномах бактериофагов генов, кодирующих токсины или какие-либо известные факторы вирулентности, а также гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага;

- доказать оригинальность фаговых ДНК, подлежащих дальнейшему патентованию.

–  –  –

Для того чтобы успешно решить главную задачу работы – получение специализированного продукта диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов, необходимо было разработать методику получения фаговой биомассы в высоком титре, с высокой литической активностью, не содержащей экзотоксинов и с минимальным содержанием эндотоксинов. До сегодняшнего времени в РФ бактериофаги, которые применяются в терапевтических целях, получают методом выращивания в ферментерах с жидкой питательной средой, так называемым методом глубинного культивирования. Этот способ получения бактериофагов имеет свои плюсы и недостатки, главным из которых является большое содержание токсинов в конечном продукте. Размножаясь в питательной среде, бактериальные штаммы выделяют туда свои продукты жизнедеятельности, экзотоксины, а в процессе бактериолиза туда же попадают эндотоксины грамотрицательных микроорганизмов. Традиционная очистка фаголизатов не позволяет полностью избавить продукт от присутствия в нем токсинов. Увеличенное содержание экзои эндотоксинов в конечном продукте приводит к нежелательным эффектам, например, они могут вызывать усиление интоксикационного синдрома, что особенно опасно у детей на фоне ОКИ бактериальной этиологии. Также присутствие остатков питательной среды влияет на органолептические свойства препаратов, чужеродные компоненты которой тоже могут вызывать аллергические реакции. Опираясь на работы коллег, проводя свои многочисленные эксперименты, мы подобрали и отработали собственные оптимальные условия для культивирования различных видов бактериофагов на плотной питательной среде, используя стеклянные колбы-матрасы (толщина питательной среды в матрасе от 10 до 25 мм, толщина слоя воздуха над поверхностью среды от 25 мм до 40 мм). Для избавления от экзотоксинов в фаголизате заменили патогенный штамм-хозяина на непатогенный без изменения спектра литической активности бактериофага. Немаловажной составляющей метода является отработанный в процессе диссертационной работы параметр множественности инфицирования (соотношения количества вирусных частиц и бактерий в посевном материала) при котором достигается максимальная урожайность бактериофага. В результате проведенной работы разработан метод выращивания различных видов бактериофагов на плотных питательных средах с высоким титром вирусных частиц и предельно низкими значениями эндотоксина (патент на изобретение №2525141). Он включает следующие этапы:

1 этап – это получение ночной (18-ти часовой) культуры штамма-хозяина. Для этого ампулу (флакон) с лиофилизированной культурой вскрывают асептически, содержимое растворяют в 2 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Полученную взвесь микробных клеток наносят на чашку Петри с плотной питательной средой для получения одиночных колоний. Культивируют при 37 °С сутки. На следующий день одиночные колонии секторами пересевают на чашку Петри с питательной средой. Культивируют сутки при 37 0 С. Бактериальные культуры 2го пассажа, выросшие на плотной питательной среде, микробиологической петлей засевают в МПБ, разлитый по 4,5 мл из расчета одна пробирка на одну матрасную колбу. Посеянные таким образом индикаторные штаммы культивируют в термостате 18 часов при 37 0С, через 18 часов экспозиции достигая 108- 109 КОЕ/мл.

2 этап – нанесение штамма-хозяина на поверхность плотной питательной среды.

В матрасные колбы с плотным питательным агаром толщиной слоя от 10 мм до 25 мм вносят 18-ти часовую культуру штамма-хозяина с соблюдением всех правил асептики. Раскатывают культуру по всей поверхности питательной среды, создавая монослой. Стерильной микробиологической пипеткой удаляют лишнюю жидкость. Культивируют в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина.

3 этап – нанесение маточного штамма бактериофага.

В образовавшийся таким образом газон культуры вносят шприцем или стерильной микробиологической пипеткой 2 мл одноименного (маточного) бактериофага в титре 106 – 107 БОЕ/мл. Для этого флакон с лиофильно высушенным штаммом бактериофага асептически вскрывают и растворяют в 2 мл стерильного 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Дав содержимому хорошо раствориться, собирают шприцем или стерильной пипеткой и над огнем горелки вносят в матрас. Соотношение посевной культуры и бактериофага составляет 100 к 1, т.е. на 100 бактериальных клеток 1 частица бактериофага. Покачивающим движением распределяют бактериофаг так, чтобы он тонким слоем покрыл всю поверхность газона бактериальной культуры. И опять отбирают стерильной пипеткой лишнюю жидкость. Инкубируют в термостате 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина и одноименного бактериофага.

4 этап – сбор бактериофага.

В матрас в асептических условиях вносят физиологический раствор с рН 7,0в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 (9 мл на один матрас). Плавным покачивающим движением производят смыв фага с поверхности питательного агара. Стерильной микробиологической пипеткой собирают жидкую фракцию и переносят в стерильные центрифужные пробирки. Эта фракция состоит из бактериофага, обломков бактериальных клеток, живых нелизированных клеток штамма-хозяина. Для освобождения фаголизата от нелизированных бактерий в пробирки добавляют хлороформ из расчета 1/10. Экспонируют полученную суспензию 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют 30 мин при 5000 – 6000 об/мин. Собирают полученный супернатант в стерильную емкость. После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги.

5 этап – очистка и контроль фаголизата.

Полученный таким образом фаголизат или коктейль бактериофагов стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и затем очищают от эндотоксинов на хроматографической колонке типа Endo Trap Blue или Endo Trap HD (Hyglos GmbH, Германия) согласно инструкции производителя с использованием буфера, разработанного этой фирмой.

Титр полученного бактериофага, микробиологическую чистоту, концентрацию экзо- и эндотоксинов определяют способами, описанными выше.

В таблице 28 представлены данные по содержанию токсинов в коммерческом бактериофаге и коктейле фаголизатов, который получали описанным выше способом.

–  –  –

Из представленной таблицы следует, что продукт, полученный из коктейля фаголизатов, выращенных на плотной питательной среде и очищенных методом афинной хроматографии содержит менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл фаголизата (ЕЭ/мл). В то же время образец коммерческого бактериофага превышает международно-допустимые нормы по содержанию эндотоксинов в 2362 раза.

Контроль шигаподобных токсинов в коктейле осуществляли иммунохроматографическим экспресс-тестом для качественного in vitro определения токсинов. По итогам проводимых тестов можно утверждать, что шигаподобных токсинов в коктейле не обнаружено. Замена патогенного штаммахозяина на непатогенный для колифагов и листериозного бактериофага позволяет избавиться от экзотоксинов, не изменяя высокие литические свойства батериофагов. Это достигается разработанной и обоснованной в ходе выполнения работы оригинальной схемой культивирования бактериофагов, дающей возможность сохранять высокие литические свойства штаммов бактериофагов:

первое поколение фагов культивируется на патогенном штамме - второе поколение фага на непатогенном - третье на непатогенном. Далее опять используем второе поколение фага, как стартерную культуру, потому что 4 поколение уже не лизирует весь спектр бактерий (таблица 16).

К отличительными чертам полученной, таким способом фаговой биомассы, можно отнести: отсутствие экзотоксинов (в частности шигатоксина и стафилококковых энтеротоксинов); низкие значения эндотоксина; высокую 1010 - 1012 концентрацию фаговых частиц БОЕ/мл (при глубинном культивировании в производственном ферментере максимальный титр равняется 108 БОЕ/мл).

121

2.3. Конструирование рецептуры и технология получения готовой формы специализированного продукта профилактического питания.

2.3.1. Отработка рецептуры Действующим началом созданного специализированного продукта диетического профилактического питания является смесь стерильных фильтратов фаголизатов активных в отношении S.enterica сероваров Enteritidis, Typhimurium, Infantis, Escherichia coli О157:Н7, Escherichia coli O104:H4, Shigella sonnei, Shigella flexneri, S.аureus и L.monocytogenes, получаемых путем раздельного наращивания семи бактериальных культур с последующим внесением стартерных штаммов соответствующих бактериофагов (схема получения описана в главе 3.2).

Содержание видоспецифических активных бактериофагов в готовой форме продукта соответствует 106 - 107 БОЕ/мл (по Грациа). Концентрация действующего вещества подобрана с учетом известных из данных литературы [7, 125] и проведенных собственными силами доклинических (2.4) и ограниченных клинических (2.5) испытаний терапевтически эффективного титра фаговых частиц.

В состав разработанного специализированного продукта также были включены:

- стерильный сироп корня солодки (ФС 42-1187-96), дополняющий бактерицидное действие бактериофагов спазмолитическим, противовоспалительным, иммуностимулирующим и регенерирующим эффектами, а так же определяющий органолептику готовой формы [118];

пребиотический компонент пектин яблочный

- (СЭЗ №77.99.13.008Д.004689.04.09), стабилизирующий окислительновосстановительные процессы, улучшающий периферическое кровообращение и перистальтику кишечника, стимулирующий рост эндогенной нормофлоры ЖКТ, а также защищающий фаговые частицы от инактивирующего действия желудочного сока [69, 78];

- аминокислота глицин (ФСП 42-0002-4867-03), улучшающая метаболические процессы, обладающая антиоксидантными свойствами, стабилизирующая титр фага в процессе длительного хранения готовой формы [119].

В качестве вспомогательных компонентов были использованы буферный раствор (HEPES-0,4г, NaCl-0,8г, CaCl2-0,001г) и дистиллированная вода, обеспечивающие стабильность при хранении действующих веществ и необходимый объем готовой формы специализированного продукта – 100 мл (таблица 29).

Таблица 29. Рецептура специализированного продукта диетического профилактического питания

–  –  –

Примечание: **– количество концентрата фаголизата и дистиллированной воды расчетное и зависит от активности исходных бактериофаговых субстанций.

Подобранные компоненты в рецептуре не превышают норм пищевой и энергетической ценности продукта, установленных в МР «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» (МР 2.3.12432-08) (таблица 30).

Санитарно-гигиеническая экспертиза разрабатываемого специализированного продукта диетического профилактического питания проведена на соотвтетствие требованиям ТР ТС 027/2012 «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе, диетического лечебного и диетического профилактического питания» (гл.2, 3, 4, 5) [116].

Таблица 30. Пищевая и энергетическая ценность специализированного продукта диетического профилактического питания.

Показатели На 100 На су- Физиологическая % от физиологичес

–  –  –

Наименование показателя Характеристика и нормы Результаты Специфическая литическая активность в отношении Staphylococcus, Salmonella, Shigella flexneri, L.monocytogenes, энтеровирулентных E. coli (титр по Грациа), БОЕ/мл По содержанию токсичных элементов, нитратов, пестицидов специализированный продукт диетического профилактического питания соответствует Единым санитарным требованиям (Глава II, раздел 1, индексы 9.11, 10.8, 10.10), указанным в таблице 32.

–  –  –

Содержание радионуклидов регламентировали по сырью, не превышая допустимых уровней, указанных в Единых санитарных требованиях.

По микробиологическим показателям специализированный продукт диетического (профилактического) питания соответствовал Единым санитарным требованиям (Глава II, раздел 1, индексы 9.11, 10.8, 10.10), и индивидуальным требованиям, которые диктуются особыми свойствами продукта (таблица 33).

–  –  –

Для производства продукта нами не допускалось использование сырья, полученного из генетически-модифицированных источников (ГММ и ГМО).

В ходе определения специфической активности специализированного продукта мы изучали биосовместимось компонентов. В таблице 34 - 36 обобщены результаты этих исследований.

Таблица 34. Морфология негативных колоний штаммов бактериофагов без компонентов и с добавлением компонентов, входящих в рецептуру продукта.

Морфология бляшек До внесения С добавлением С добавлением С Штаммы компонентов стерильного пектина яблоч- добавлением бактериофа- сиропа корня ного (СЭЗ № глицина (ФСП гов солодки (ФС 42- 77.99.13.008Д.0 42-0002-4867

–  –  –

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что компоненты, входящие в рецептуру – сироп корня солодки, пектин яблочный и глицин не влияют на морфологию вирусных частиц, литическую активность и спектр специфической литической активности штаммов бактериофагов и могут быть использованы в рецептуре специализированного продукта диетического профилактического питания.

Характеристики экспериментально-производственных серий продукта изучены и протестированы в независимых лабораториях. Пищевая и энергетическая ценность специализированного продукта диетического профилактического питания (таблица 30) изучена на базе ФГБУ «НИИ питания»

РАМН. Определение токсичных элементов (таблица 32) проведено в филиале ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» в САО, ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора. Микробиологические показатели продукта исследовались на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

На основании полученных результатов разработаны Технические условия на специализированный продукт диетического 9197-163-78095326-2012 профилактического питания. Разработана форма и содержание потребительской этикетки (согласно Единым санитарным требованиям, по ГОСТ Р 51074-2003,

СанПиН 2.3.2.1290-03). Этикетка включает следующие сведения о продукте:

наименование продукта; наименование и местонахождение изготовителя;

товарный знак изготовителя; масса нетто; состав продукции c указанием ингредиентов в порядке их убывания в весовом или процентном выражении;

пищевая (содержание белков, жиров и углеводов) и энергетическая (килокалорий) ценность в 100 г продукта; способ и условия применения; условия хранения, в т.ч.

после вскрытия упаковки; срок годности; дата изготовления и дата упаковывания (число, месяц, год); обозначение настоящих технических условий; информацию о государственной регистрации продукта с указанием номера и даты;

противопоказания для применения; номер партии; надпись «не является лекарственным средством».

Специализированный продукт диетического профилактического питания фасуют в асептических условиях по 100 мл во флаконы из темной пластмассы с крышками вместимостью (100±10) мл по ГОСТ Р 50962-96. Флаконы закупоривают пластиковыми пробками с герметизирующими прокладками и с контролем первого вскрытия. Используем флаконы и пробки из материалов, разрешенных для контакта с пищевыми продуктами по ГОСТ Р 50962-96. На каждую единицу потребительской тары наклеивают этикетку из бумаги по ГОСТ 7625-86. Упаковывают в пеналы из картона (ГОСТ 17768-90) по 1 флакону, в пенал вкладывают листок-вкладыш, содержащий рекомендации по применению продукта. Флаконы в потребительской таре упаковывают с транспортную тару согласно ТУ по 30-50 штук.

Правила приемки и контроля осуществляют по следующим пунктам:

1. Отбор проб для контроля органолептических и физико-химических показателей (проводится по ГОСТ 15113.3-77 и ГОСТ 26809-86)

2. Качество упаковки и состояние маркировки (определяли визуально)

3. Запах (определяют органолептически)

4. Пищевая ценность продукта (определяется расчетным методом). Массовая доля белка в продукте измеряется по методу Кьельдаля (ГОСТ 26889-86).

5.Специфическая литическая активность продукта по отношению к бактериальным тест-культурам и выделенным из организма человека условнопатогенным и патогенным бактериям соответствующих видов титруется по методу Грациа (ФСП 42-0256-2708-02).

6. Определение микробиологических показателей:

отбор проб для микробиологического анализа по ГОСТ Р 54004-2010;

определение количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, КМАФАнМ по ГОСТ 10444.15-94;

определение содержания бактерий группы кишечных палочек по ГОСТ Р 52816-2007;

определение содержания бактерий вида E. coli по ГОСТ Р 52830-2007;

определение содержания Staphylococcus aureus по ГОСТ Р 52815-2007.

определение содержания патогенных микроорганизмов, в т.ч. бактерий рода Salmonella по ГОСТ Р 52814-2007;

определение содержания бактерий вида monocytogenes по Listeria ГОСТ Р 51921-2002;

определение содержания дрожжей и плесневых грибов по ГОСТ 10444.12определение стафилококковых энтеротоксинов по МУК 4.2.2429-08;

определение вероцитотоксинов по МУК 4.2.2963-11;

определение живых клеток продуцентов (S. aureus, S. Infantis, S. Enteritidis, S. Typhimurium, L. innocua, E.coli) по методу прямого посева (МУК 4.1/4.2-588Отбор и подготовка проб для определения содержания токсичных элементов по ГОСТ 26929-94:

свинца по ГОСТ 26929-94, ГОСТ 30178-96;

мышьяка по ГОСТ 26929-94, ГОСТ Р 51766-2001;

кадмия по ГОСТ 26929-94, ГОСТ 30178-96;

ртути по МУ 5178-90.

7. Отбор образцов и определение содержания пестицидов проводят по МУ 2142-80.

Специализированный продукт диетического профилактического питания можно перевозить всеми видами крытого транспорта по ГОСТ 28471-90 при температуре не выше 20 °С не более 7 дней. Хранится в сухом, защищенном от света месте, недоступном для детей, при температуре (4±2) °С и относительной влажности не более 70 %. Срок годности в невскрытой заводской упаковке 1 год.

Срок годности продукта после вскрытия заводской упаковки – не более 7 дней при температуре (4±2) °С.

2.3.2. Пилотная технология получения специализированного продукта диетического профилактического питания Согласно разработанной рецептуре была отработана пилотная технология получения экспериментально-производственных партий специализированного продукта диетического профилактического питания в объеме 500 флаконов по 100 мл. Она представляет собой цепочку этапов от подготовки исходного сырья через наработку посевного материала (стартерных) культур, получения фаголизата, его очистки до фасовки во флаконы и укупорки в потребительскую тару (рисунок 19).

Т.П.О. Подготовка стартерных культур и штаммов бактериофагов Штаммы бактерий, на которых культивируют бактериофаги, лиофилизируют. Для этой цели используют сублимационную сушку CoolSafe 110 Freeze Dryer. Выделенные штаммы микроорганизмов в равных количествах смешивают с защитной средой (сахароза 20%, желатин 1%) разливают во флаконы по 1 мл. Режим высушивания штаммов - 12 часов при давлении 0,03 гПа. Флаконы вальцуют, маркируют с указанием наименования, даты сушки.

Производственно-перспективные штаммы бактериофагов лиофилизируют. Для этой цели используют сублимационную сушку CoolSafe 110 Freeze Dryer. Выделенные штаммы бактериофагов в равных количествах смешивают с защитной средой (сахароза 20 %, желатин 8 %) разливают во флаконы по 2 мл. Режим высушивания штаммов - 12 часов при давлении 0,03 гПа. Флаконы вальцуют, маркируют с указанием наименования, даты сушки, титром.

В.О. 1. Подготовка помещений и оборудования.

Проверка эффективности работы вентиляции и фильтров (до уборки) Обработка бокса и ламинара при помощи дезсредств (Аламинол).

Обработка поверхности перистальтического насоса, укупорки, поддонов для флаконов и емкости для крышек.

В.О. 2. Подготовка посуды Мойка стеклянной посуды, пластиковой перед стерилизацией Стерилизация стеклянной посуды, марли нужной для всего процесса Стерилизация бутылей и частей перистальтического насоса (силиконовый шланг) в автоклаве Сухая стерилизация гамма-лучами пластиковых флаконов и крышек (производится по контракту) Контроль на микробиологическую чистоту Глицина: для этого навеску глицина растворяют в 20 мл стерильного физиологического раствора. Из этого объема делают высев на чашки с питательными средами (кровяной агар, Сабуро) методом spot-теста. Инкубируют при 37 0 С сутки на кровяном агаре и при 25 0 С - 3-ое суток на среде Сабуро. Затем проводят контроль на наличие или отсутсвие бактериального роста.

Флаконов и крышек для розлива продукта 5 флаконов из партии отбирают в боксе из двойного пакета. Заливают 10 мл стерильного МПБ (можно использовать LB-бульон, тиогликолевую среду). Флаконы закрывают, тщательно встряхивают, ставят в теромстат при 37 0 С и 250 С на 48 часов. Затем делают высев на чашки с питательными средами (кровяной агар, Сабуро) методом spot-теста.

Инкубируют при 37 0 С сутки на кровяном агаре и при 25 0 С - 3-ое суток на среде Сабуро.

После инкубации контролируют наличие или отсутствие роста на чашках.

Стерильным пинцетом выбирают 5 крышек из партии, замачивают в емкости с 250 мл стерильной жидкой питательной средой (МПБ, LB-бульон, тиогликолевая среда). Емкость закрывают, ставят в термостат при 37 0 С и 25 0 С на 48 часов. Затем производят высев по схеме, представленной выше.

В.О. 3. Приготовление питательных сред, навесок Подготовка и стерилизация питательных сред (МПА, МПБ, Сабуро) Навески глицина, пектина проводятся в ламинаре или боксовом помещении при наличии весов разной максимальной массой взвешивания от 10 мг до 30 кг.

В.О. 4. Подготовка вспомогательных компонентов В пять 15-литровых стеклянных бутылей наливают 9 460 мл дистиллированной воды, добавляют в каждую по 40 мл сиропа корня солодки. В шейкере разбивают пектин (согласно рецептуре) до гомогенного состояния, растворяют его в 200 мл дистиллированной воды, затем равномерно по 40 мл добавляют в каждую бутыль Контроль рН. Интервал значений рН 7,0-7,4 Дополнительно готовят пять флаконов с дистиллированной воды по 100 мл каждый.

Все емкости с внесенными компонентами отправляют на автоклавирование (121 °С 20-30 мин) 1 этап Т.П. Подготовка 7 фаголизатов, составляющих основу продукта Метод получения фаголизатов описан в главе 3.2 Контроль специфической активности полученных фаголизатов (см.

гл.2) 2 этап Т.П. Подготовка очищенной от эндотоксина смеси стерильных фильтратов фаголизатов Полученные штаммы бактериофагов (этап 1) в концентрации 10 10 -1011 БОЕ/мл асептически отбирают стерильными пипетками и смешивают в количествах так, чтобы в готовом продукте активность вирусных частиц была не ниже 10 6 по Грациа. Полученную смесь фаголизатов фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм и очищают методом аффинной хроматографии от эндотоксинов (подробно метод описан в гл.2.4.6.) Полученный концентрат фаголизатов контролируют на токсичность (острая токсичность), на микробиологическую чистоту, специфическую активность.

3 этап Т.П. Смешение компонентов готового специализированного продукта Полученные стерилизованные бутыли с вспомогательными компонентами остужают.

В 5 флаконов со 100 мл стерилизованной дистиллированной воды вносят, соблюдая правила асептики, навески глицина. Туда же вносят равными частями очищенную смесь стерильных фильтратов фаголизатов (на партию специализированного продукта вносят расчетное количество фаголизата, в зависимости от его специфической активности 70-80 мл). Емкости тщательно шуттелируют в течение 5 минут при 150 об/мин после чего вносят их содержимое в 15-ти литровые бутыли с стерилизованной смесью дистиллированной воды, солодки и пектина.15-ти литровые бутыли шуттелируют10 мин при 120 об/мин.

4 этап Т.П. Розлив и укупорка готового продукта Розлив готового специализированно продукта осуществляется в 100 мл стерилизованые флаконы из темного пластика с помощью перистальтического насоса.

Укупорка пластиковыми пробками с герметизирующими прокладками и контролем первого вскрытия производится полуавтоматом

–  –  –

З.О. Контроль готового продукта Контроль готового продукта осуществляется по органолептическим и физикохимическим показателям, по содержанию токсичных элементов, нитратов, пестицидов, по микробиологическим показателям, микробиологической специфической активности Рисунок 19 Технология получения партии (500 флаконов) специализированного продукта диетического профилактического питания

Примечание:

В.О. – вспомогательная операция; Т.П. – технологический процесс;

У.М. – упаковка, маркировка; З.О. – заключительная операция Т.П.О. – технологическая подготовительная операция Отличительной чертой разработанной схемы получения специализированного продукта является низкая себестоимость, обусловленная как отсутствием сложной аппаратной схемы, так и высоким титром производимого фаголизата при минимальных затратах электрической энергии, обусловленным культивированием бактериофагов на плотной питательной среде (см. раздел 3.2).

В ходе диссертационной работы по данной технологии выпущено 12 экспериментально-производственных партий специализированного продукта.

Качество готового специализированного продукта, проверенное в ходе внутреннего (производственного) контроля в Филиале ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» в САО г. Москвы, соответствовало зарегистрированным в установленном законом порядке Техническим условиям и «Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)».

Подготовлена и утверждена Технологическая инструкция, являющаяся неотъемлемой частью нормативно-технической документации, представляемой при санитарно-гигиенической экспертизе и государственной регистрации специализированного продукта диетического профилактического питания.

135 2.3.3. Определение срока годности специализированного продукта диетического профилактического питания На завершающей стадии этапа по конструированию рецептуры и разработке технологии получения специализированного продукта диетического профилактического питания необходимо было определить срок годности готовой формы, при котором качество продукции удовлетворяет установленному в Технических условиях (ТУ). Для этого необходимое количество образцов из экспериментально-производственных партий специализированного продукта хранили в течении 18 месяцев при температуре 4 ± 2°С, периодически отбирая часть из них для контроля утвержденных в ТУ параметров. В таблице 37 представлены данные по изучению специфической литической активности бактериофагов в разные сроки с момента выпуска партии продукции.

Таблица 37. Специфическая литическая активность штаммов бактериофагов, входящих в продукт, при хранении (по Грациа).

Штаммы Титр бактериофагов, входящих в серию продукта при разных сроках бактерио- хранения, БОЕ/мл фагов 1 мес. 3 мес. 6 мес. 9 мес. 12 мес. 18 мес.

Сальмонел- 4,6107 ±2,6 4,6107 ±1,7 5,0107 ±1,1 4,0107 ±0 3,7107 ±6,3 4,0107 ±0 лезный St11 Сальмонел- 6,7107 ±1,7 7,0107 ±0 7,0107 ±1,3 6,3107 ±6,5 6,0107 ±1,1 5,1107 ±1,3 лезный SE40 Сальмонел- 5,7107 ±2,4 6,3107 ±1,7 6,3107 ±6,5 6,0107 ±1,1 5,6107 ±2,3 2,8107 ±1,8 лезный Si3 Эшерихиоз- 5,6106 ±1,3 5,6106 ±2,3 4,7106 ±6,5 4,3106 ±6,5 3,0106 ±0 3,0106 ±1,3 ный V18 Эшерихиоз- 6,7106 ±1,7 6,3106 ±1,7 5,1106 ±1,4 4,2106 ±1,5 3,7106 ±1,7 3,4106 ±2,1 ный EсD7 Стафилокок- 2,3106 ±1,7 2,3106 ±1,3 1,8106 ±1,7 2,0106 ±1,1 2,0106 ±1,3 1,6106 ±1,3 ковый CH1 Листериоз- 6,6106 ±1,7 6,3106 ±1,3 4,3106 ±2,4 4,0106 ±1,3 2,5106 ±2,1 1,6106 ±1,1 ныйLm1 Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что в процессе хранения готового продукта при температуре 4±2 °С специфическая активность всех штаммов бактериофагов не опускалась ниже нормативных значений (содержание БОЕ в 1 мл продукта 106). Так же образцы продукта, заложенные на хранение, проверяли согласно Единым санитарным требованиям (Глава II, раздел 1, индексы 9.11, 10.8, 10.10) по микробиологическим показателям (таблица 38) и по органолептическим и физико-химическим показателям (таблица 39).

Таблица 38. Микробиологические показатели продукта при хранении*

–  –  –

Примечание: *- среднее значение результатов по трем опытным сериям По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что при хранении готового продукта и соблюдении необходимых температурных условий его органолептические и физико-химические показатели не меняются, микробиологическая чистота продукта остается в норме даже при отсутствии консервантов.

Хранение готового препарата в течении 18 месяцев при соблюдении необходимых температурных условий без существенных изменений ключевых параметров качества позволили нам включить в НТД на специализированный продукт длительность гарантийного срока хранения 12 месяцев, что определяется руководящими документами, рекомендующими подтверждать стабильность продукта в течение гарантийного срока + 50%.

138 В заключение раздела следует отметить, что на основании полученных результатов разработана научно-техническая документация (НТД) на специализированный продукт диетического профилактического питания «Фудфаг» в составе Рецептуры, Технических условий 9197-163-78095326-2012 и Технологической инструкция. Вместе с контрольными образцами готовой продукции они были представлены на санитарно-гигиеническую экспертизу в ФГБУ «НИИ питания» РАМН, по заключению которой было получено положительное Санитарно-эпидемиологическое заключение.

–  –  –

Безопасность полученного специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» была апробирована в опытах на лабораторных животных. Исследование токсической опасности специализированного продукта проводили в опытах по изучению острой и хронической (подострой) токсичности на лабораторных животных. В процессе работы мыши и морские свинки получали еду и воду ad libitum. Животные находились в виварных помещениях, оснащенных современным оборудованием.

–  –  –

Острую (аномальную) токсичность специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» оценивали в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации [38] с использованием двух видов лабораторных животных – мышей и морских свинок. Здоровые белые мыши массой 17-20 г были разделены на 3 группы по 5 животных в каждой.

Мышам из первой группы препарат вводили по 1,0 мл внутрибрюшинно, животным из второй группы - по 1,0 мл подкожно в область спины, из третьей – 0,5 мл per os. Токсическое действие препарата оценивали по появлению признаков интоксикации, снижению массы и их гибели в течение 7 суток. В контрольной группе было 6 здоровых мышей, по 2 на каждую группу. Вместо продукта вводили физиологический раствор в тех же количествах.

Испытание препарата также было проведено на 6 здоровых морских свинках с массой тела 280-300 г. Каждому животному вводили внутрибрюшинно одну максимальную разовую дозу испытуемого средства (5,0 мл) и наблюдали в течение семи суток после инъекции. В конце срока наблюдения животные были взвешены. 4 животных служили контрольной группой (таблица 40).

–  –  –

Таким образом, на основе результатов проведенных нами экспериментов можно сделать вывод о том, что специализированный продукт при любых путях однократного введения максимально возможной для животных дозы не является токсичным.

–  –  –

Оценку хронической токсичности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ»[120]. Испытание проводили на 10 здоровых белых мышах массой 20-24 г. Продукт вводили животным внутрижелудочно один раз в день по 0,5 мл в течение 14 дней. 4 мыши из контрольной группы получали внутрижелудочно по 0,5 мл физиологического раствора в том же режиме. У экспериментальных животных ежедневно регистрировали массу тела (рисунок 20), наличие клинических симптомов общей интоксикации, а также возможную гибель животных (таблица 41).

Таблица 41. Схема эксперимента по изучению хронической токсичности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» на лабораторных животных (мышах).

–  –  –

Рисунок 20 Изменение веса мышей в ходе изучения хронической токсичности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг».

На 15 и 21 сутки после введения препарата проводили макроскопическое и микроскопическое исследование органов мышей после эвтаназии углекислым газом. Полученные результаты показали, что ежедневное внутрижелудочное введение исследуемого специализированного продукта на основе бактериофагов в течение 14 суток не приводило к гибели животных и не влияло на состояние их здоровья. Поведенческие реакции, внешний вид мышей, а также общий вес мышей в экспериментальной и контрольной группе не отличались. Вскрытие мышей на первые и седьмые сутки после окончания введения препарата показало отсутствие видимых изменений в органах брюшной и грудной полости, а также в головном мозге.

Печень, легкие, сердце, тимус, селезенка, корень языка, желудок, тонкий и толстый кишечник, брыжейка, головной мозг выживших животных были подвергнуты гистологическому исследованию (рисунок 21).

–  –  –

Рисунок 21 Микроскопическая картина гистологических срезов толстой кишки (а), лимфатического узла (б), головного мозга (в), и легких (г) мышей, получавших специализированный продукт в течение 14 дней (на всех срезах патологические изменения отсутствуют).

Микроскопическое исследование гистологических препаратов органов, взятых для исследования на 15-е и 21-е сутки эксперимента, не выявило патологических изменений.

Таким образом, изучение хронической (подострой) токсичности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» также не выявило негативного воздействия испытуемого препарата на организм экспериментальных мышей при его внутрижелудочном введении на протяжении 14 суток.

2.4.1.3. Влияние продукта на нормальную микрофлору кишечника лабораторных животных Влияние специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» на бактериальную флору кишечника in vivo изучали на модели белых беспородных мышей (22-27 г). Препарат давали per os пяти животным в течение 10 суток. Контрольные животные (2 особи) препарат не получали. На начальные (до введения препарата), 4-е, 10-е и 14-е (через 4 дня после последнего введения препарата) сутки эксперимента у контрольных и опытных мышей отбирали фекалии для проведения бактериологического анализа. Состояние бактериальной микрофлоры кишечника животных оценивали по количеству клеток кишечной палочки, энтерококков, энтеробактера аэрогенес, клебсиелл, лактобацилл и бифидобактерий в 1 грамме фекалий. Суспензии, полученные из гомогенизированных в физиологическом растворе фекалий, титровали и высевали на соответствующие селективные питательные среды. При проведении данного исследования пользовались методикой постановки анализа на микробиоценоз кишечника [81]. Результаты исследования представлены в таблице 42.

–  –  –

Исходя из полученных данных, мы можем сделать вывод о том, что пероральное назначение специализированного продукта в течение 10 суток не влияло на нормальную микрофлору кишечника мышей. Кроме того, исследуемый продукт не оказывал негативного воздействия на физическое состояние мышей:

все опытные и контрольные животные имели здоровый вид и прибавляли в весе на протяжении всего эксперимента.

2.4.2. Фармакокинетические исследования.

Фармакокинетику специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» изучали на модели беспородных мышей после однократного внутрижелудочного введения 0,5 мл препарата. Количество фаговых частиц в фекалиях животных определяли до, а также через 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов после введения. Количество фагов в экскрементах определяли по методу Грациа. Динамика персистенции фагов в кишечнике мышей после однократного внутрижелудочного введения специализированного продукта представлена в таблице 43.

–  –  –

В результате проведённых экспериментов было установлено, что в фекалиях мышей в наибольшей концентрации определяются сальмонеллёзные фаги. В меньшем количестве в мышиных экскрементах были представлены листериозный, эшерихиозные и стафилококковый бактериофаги.

Максимальная концентрация в кишечнике мышей для всех типов фагов (за исключением стафилококкового фага) отмечена через 9 часов после приема продукта. Стафилококковый бактериофаг в максимальном количестве определялся не позднее 6 часов после введения. В дальнейшем количество фаговых частиц снижалось, и к 48 часам в мышиных фекалиях оставались единичные вирусные частицы только сальмонеллёзных фагов. Это свидетельствует о том, что бактериофаги, перорально поступающие в желудочнокишечный тракт не выводятся сразу с экскрементами, а персистируют в организме даже при отсутствии гомологичных к бактериофагам культур в течение 48 часов.

147 2.4.3. Оценка эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг»

Оценку эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» проводили на модели сальмонеллезной и эшерихиозной инфекции у мышей.

–  –  –

Специфическая эффективность специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» изучена в эксперименте по фаготерапии экспериментальной сальмонеллёзной инфекций у беспородных белых мышей весом 20-24 г. В качестве возбудителя сальмонеллёза использовали устойчивый к рифампицину штамм Salmonella Enteritidis 92 Rif r. Летальная доза (ЛД50) этого штамма, вызывающая смерть у 50 % мышей при внутрибрюшинном заражении составляет 5101 КОЕ/мл, при внутрижелудочном – около 107 КОЕ/мл.

Экспериментальный сальмонеллёз у мышей вызывали внутрижелудочным введением ночной агаровой культуры в дозе 1109 КОЕ/мл (100 ЛД50).

Специализированный продукт диетического профилактического питания «Фудфаг» в объёме 0,5 мл вводили животным внутрижелудочно каждые 24 часа на протяжении 5 дней. Эффективность применения продукта оценивали по количеству выживших животных в группе и по остаточной обсеменённости внутренних органов, крови и фекалий бактериями S. Enteritidis 92 Rif r.

Выживших мышей эвтаназировали методом СО 2-ингаляции. Печень, селезёнку, кровь из сердца и суспензию фекалий животных высевали на пластинки ГРМагара с добавлением рифампицина (100 мкг/мл). Посевы инкубировали в течение 48 часов при температуре 37 0С.

В эксперименте были использованы две схемы введения продукта:

профилактическая (начало введения продукта за 24 часа до заражения) и лечебная (начало введения продукта через 48 часов после заражения). Модельные животные были распределены по 10 самок на группу. Контрольная группа после заражения получала вместо специализированного продукта физиологический раствор в объёме 0,5 мл внутрижелудочно. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток после окончания применения препарата (таблица 44)

–  –  –

Полученные результаты показали, что выбранная экспериментальная модель сальмонеллёза является адекватной. Мыши заболевают данной инфекцией и погибают в течение 6-12 суток (средний срок гибели – 8 суток в контрольной группе) после внутрижелудочного заражения (100 % смертность). У погибших животных из всех групп культура S. Enteritidis 92 Rif r высевалась из печени, селезёнки и крови, что свидетельствует о генерализации инфекции. При лечебной схеме введения продукта, средний срок гибели животных при 100 % смертности составил 9,6 дня, т.е. на 1,6 дня больше, чем контрольных. При профилактическом режиме использования препарата выжило 70 % мышей, средний срок гибели павших мышей составил 11,4 дня. Бактериологический анализ органов и фекалий выживших животных на 14 сутки после окончания терапии подтвердил 100 % санацию.

Таким образом, в результате проведенного исследования доказана эффективность специализированного продукта диетического профилактического 149 питания «Фудфаг» при профилактическом (в большей степени) и при лечебном (в меньшей степени) применении на фоне сальмонеллеза.

–  –  –

Специфическая эффективность специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» была изучена также в модельном эксперименте эшерихиозной инфекции. За прототип был взят эксперимент, проведенный Дроздовой в 1988 г. [49]. При моделировании кишечной инфекции у мышей в качестве микроба-заместителя был использован непатогенный штамм E.coli К12 С600. В эксперименте использовали 40 белых мышей весом 16-18 г, по 20 в контрольной и опытной группе. Экспериментальную инфекцию вызывали путем перорального ежедневного введения 0,5 мл E.coli K12 C600 в титре 5х107 КОЕ/мл натощак в течение 3-х дней. Опытная группа подвергалась такому же заражению на фоне профилактического приема специализированного продукта «Фудфаг» в дозе 0,5 мл на прием до, вовремя и спустя сутки после периода инфицирования. Животные в контрольной группе вместо специализированного продукта получали физиологический раствор. В опыт отбирали животных, не имеющих по данным бактериологического посева в исходном анализе кала лактозонегативных штаммов E. coli (табл.45).

Таблица 45. Схема изучения специфической эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» в модельном эксперименте эшерихиоза у мышей.

–  –  –

В ходе проведенного эксперимента (таблица 45) установлено: на 6-е сутки в фекалиях животных контрольной группы обнаружены лактозонегативная E. coli в количестве 3103 ±1,9 КОЕ/г и E. coli с нормальными ферментативными свойствами в количестве 5104 ±4,5 КОЕ/г (при р 0,05), в то время как в фекалиях мышей опытной группы идентифицировали исключительно E. coli с нормальными ферментативными свойствами в количестве 4,3105±6,5 КОЕ/г (при р 0,05). Необходимо отметить, что в пробах кала, полученных на 6-ые сутки эксперимента от мышей из опытной группы, бактериофаги присутствовали в 100 % случаев. Через 48 часов после окончания приема «Фудфага» эшерихиозный бактериофаг обнаруживали лишь в 20 % образцов. На рисунке 22 представлены фотографии с чашками Петри, засеянными штаммом E.coli K12 C600, на который каплями нанесены супернатанты фекалий мышей, демонстрирующие наличие эшерихиозного бактериофага через 24 часа (А) и 48 часов (В) после окончания эксперимента.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |
 

Похожие работы:

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ФЕДИН Андрей Викторович КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09 – аллергология и иммунология 14.01.03 – болезни уха, горла и носа ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«Искам Николай Юрьевич ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ АЦИД-НИИММП НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ГОВЯДИНЫ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства; 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов. ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.