WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

«СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕН ...»

-- [ Страница 3 ] --

Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилатсинтетаза. Они появляются в клетке через 5-7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНКполимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения.

Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот.

Репликация нуклеиновых кислот реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот.

Выход дочерних популяций бактериофага. Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг.

Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает от нескольких минут до нескольких часов. После образования потомства клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки могут принимать участие различные факторы, например:

фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов, либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий). После распада клетки новые зрелые частицы бактериофага выходят наружу. Количество новых фаговых частиц, образуемых одной клеткой при фаговой инфекции, называют выходом фага или его урожайностью. [43, 71].

Фаги различаются по своей чувствительности к различным химическим и физическим агентам. По степени устойчивости к действию различных факторов внешней среды и химических веществ фаги занимают место между вирусами и не споровыми бактериями. Они устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, большинство из них не инактивируется холодными водными растворами глицерина и этилового спирта. На многих из них не действуют такие ферментные яды, как цианид, фторид, динитрофенол, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но легко разрушаются при кипячении, действии кислот, при УФ - облучении и автоклавировании. Фаги высокочувствительны к формалину. Инактивация большинства фагов наступает при температуре 65-70 °С [34, 72, 130].

–  –  –

Как указывалось ранее, фаги широко распространены на Земле [180]. Они являются симбионтами человека и животных, и были обнаружены в ЖКТ, на коже, в моче и во рту млекопитающих [67, 136, 216]. Строгая специфичность взаимодействия бактериофага только с прокариотом-хозяином ограничивает возможность его отрицательного воздействия на эукариотические клетки макроорганизма [102].

Вместе с тем, при использовании бактериофагов в лечебных и профилактических, в том числе, дезинфекционных мероприятиях, необходимо учитывать возможность возникновения следующих негативных эффектов.

Первый - возможно инфицирование бактериофагами бактерий нормальной микрофлоры ЖКТ человека при пероральном приеме препарата [129, 144].

Однако селекция производственных штаммов фагов позволяет отобрать вирусные частицы с максимально узким диапазоном специфической литической активности, ограниченной в рамках вида или даже штамма бактерии-хозяина [84].

Случайное включение в фаговый коктейль штаммов, поражающих нормальную микрофлору человека, исключено [66, 53, 111]. Более чем 70-летний опыт применения моно- и поливалентных фаговых рецептур, как лекарственных средств в терапии ОКИ и декомпенсированных форм дисбактериоза в России и Советском Союзе, а также в Польше, подтверждает невозможность реализации неспецифической литической фаговой активности в отношении нормальной микрофлоры человека [1, 7, 22, 181, 182].

Второй потенциальный механизм развития побочных эффектов при использовании бактериофагов – это стимуляция вирусными частицами иммунных реакций человека.

Польские исследователи в своих работах показали, что бактериофаги влияют на выработку цитокинов, пролиферацию Т-клеток, синтез антител, фагоцитоз и респираторные взрывы фагоцитов [141]. Важно, что в процессе местной и системной фаготерапии не были выявлены существенные анафилактические реакции, за исключением эндотоксической, связанной как с качеством используемой фаговой композиции, так и с реакцией бактериолиза (реакция Яриша-Герксгеймера) in situ [186]. Контролируя концентрацию фаговых частиц в препарате до титра, высеваемого в норме из организма человека (10 3-106 БОЕ/мл), можно регулировать количество эндотоксина, который образуется при бактериолизе.

Третий путь формирования побочных эффектов при применении бактериофагов – это модуляция вирулентности бактерии-хозяина вследствие модификации фенотипа бактерий за счет внедрения в ДНК хозяина профагового генома, содержащего гены вирулентности, или трансдукции таких генов (например, генов токсинов) от лизогенных патогенных бактериальных культур к непатогенным (т.н. горизонтальный перенос генов) [122, 185]. Предотвращение этого процесса напрямую связано с направленной селекцией производственных штаммов, подразумевающей включение в коктейль только литических фагов, не образующих ни при каких условиях устойчивых лизогенов на бактериальной культуре. Решение этого вопроса напрямую связано с современными методами изучения штаммов бактериофагов. Использование полногеномного секвенирования и биоинформационного анализа позволяет подтвердить, что фаг вирулентный, а также исключить наличие генов токсинов и других известных факторов вирулентности в геноме бактериофага, что максимально обезопасит применение бактериофагов [126].

Четвертый негативный эффект – это возможность попадания в организм человека токсинов бактерии-хозяина, содержащихся в стерильном фильтрате фаголизата. Данная проблема решается качественным контролем готового фагового коктейля на содержание эндо- и экзотоксинов. Современные методы очистки фаголизата, например, аффинная хроматография, позволяют контролировать количество эндотоксина в 1 мл продукта, согласно регулирующим правилам страны-производителя (так, по документам EFSA в одном миллилитре очищенного бактериофага должно содержаться не более 50 единиц эндотоксина (ЕЭ)) Если для наращивания биомассы [7,140].

бактериофагов использовать непатогенные бактериальные культуры (например, E.coli K-12 для эшерихиозного и L. innocua для листериозного), то можно избавиться от экзотоксина в конечном продукте [143, 149]. Количество же эндотоксина, выделяющегося in situ, не подлежит количественному определению, однако может быть отрегулировано с помощью дозы и кратности приема бактериофагового продукта [5].

1.4.Опыт использования бактериофагов в клинической практике

Рассмотрев вопрос о безопасности бактериофагов и препаратов на их основе, можно перейти к вопросу об использовании их в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных, сельскохозяйственных культур [61, 132, 185]. Весь спектр лечебных мероприятий такого рода обозначается исследователями как фаготерапия [8, 185].

В период с 20 годов прошлого столетия фаги начали активно применяться как лечебные препараты. С 1917 по 1956 гг. в мире было опубликовано более 800 работ по данной теме, которые с неподдельным интересом обсуждались медицинским сообществом. Однако «лечение с помощью естественных врагов бактерий» так и не получило дальнейшего развития за пределами Советского Союза [1].Если на Западе эра фаготерапии закончилась в момент открытия пенициллина, то в СССР, в 40-90-ые годы ХХ столетия фаги успешно применялись, как лекарственные препараты. Каплан А.С. в 1941 году, а позднее Карпов С. П. и Яворская Б. М.(1949) разрабатывали стратегию фаготерапии при пероральном приеме препаратов. Они продемонстрировали выживаемость бактерифагов в организме человека и животных в течение максимум 10 дней от момента их введения с постепенным снижением их титра после полной элиминации бактерии-хозяина, кроме того, на модели лабораторных мышей ими подтвержден высокий эффект от перорального приема сальмонеллезных бактериофагов [10].Одно из наиболее масштабных клинических испытаний по оценке лечебного эффекта дизентерийных фагов проведено Сапиром И.Б. (1939).

Всего автором описано более 1000 случаев лечения дизентерии бактериофагами в двух больницах г. Москвы. Группа пациентов включала лиц обоего пола в возрасте от новорожденных до 79 лет. В каждой возрастной группе применялась стандартная фаготерапия с использованием дизентерийного бактериофагового препарата, разработанного МНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Автор отмечал, что после первого дня лечения фагами количество пациентов с кровавым стулом уменьшилось со 100 до 74 человек; на 5 день фаготерапии только 4 пациента продолжали страдать этим синдромом, а через неделю – 95 % пациентов не обнаруживали патологических симптомов и могли быть выписаны из больницы [11].

Основоположником фаготерапии в СССР принято считать грузинского микробиолога Георгия Элиава – ученика Феликса Д`Эрелля. По его инициативе в 30-е годы прошлого столетия был создан институт исследования бактериофагов в Тбилиси, который в 1951 году вошел в состав группы Институтов вакцин и сывороток [6]. Сначала на базе Тбилисского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. Г. Элиава и Уфимского научноисследовательского института вакцин и сывороток им И.И Мечникова, а позднее и в Российской Федерации на филиалах предприятия ФГУП «Микроген»

(Нижегородском, Пермском, Уфимском) производились и производятся до сих пор свыше десятка наименований лекарственных средств, как на основе отдельных видов бактериофагов, так и их комбинаций [22, 24]. Среди них жидкие и таблетированные формы лечебных моновалентных препаратов стафилококкового, стрептококкового, коли, клебсиеллезного, сальмонеллезного,

–  –  –

1.5. Перспективы профилактического применения бактериофагов Кроме лечебного аспекта применения бактериофагов, существуют примеры их использования в профилактических целях. Это санитарно-гигиеническое применение бактериофагов в пищевой промышленности, сфере общественного питания, в детских и воинских коллективах, а также лечебно-профилактических учреждениях [207, 182, 183, 31, 13, 27]. В западной литературе введен термин «биоконтроль» под которым подразумевается использование бактериофагов как непосредственно человеком в виде пероральных (пищевой добавки) или иных форм фагокомпозиций (зубная паста, крем, дезодорант и т.д.) [51], так и для обработки сельскохозяйственных культур и животных (до сбора урожая и забоя), инструментария и оборудования больниц, предприятий пищевой промышленности, полуфабрикатов или готовых продуктов питания с целью сокращения количества присутствующих на этих объектах определенных штаммов патогенных бактерий, в том числе, вызывающих пищевые инфекции, а также для фагодиагностики потенциально опасных микроорганизмов [4, 7, 24, 100, 104, 107, 167]. Все эти мероприятия, за исключением диагностики, носят ярко выраженный профилактический, а не лечебный характер.

За рубежом, в Канаде, США, Великобритании, в странах ЕЭС, широко используются бактериофаги в комплексе санитарно-профилактических меропритяий, которые включают в себя четыре основные сферы деятельности [169, 182, 183]:

1.Бактериофаг-опосредованный биоконтроль – использование фагов для борьбы с бактериями, поражающими сельскохозяйственные растения и животных, на этапе предшествующем их попаданию на перерабатывающие заводы (овощи, фрукты до сбора урожая; мясной и молочный скот, домашняя птица до забоя) [208]. Примером фаг-опосредованного биоконтроля может служить зарегистрированный в декабре 2005 года Агентством охраны окружающей среды США (US EPA) биопестицид AgriPhage, содержащий коктейль вирулентных фагов, лизирующих Xanthomonas campestris pv. vesicatoria и Pseudomonas syringae pv. Tomato, поражающих плоды томата и перца (т.н.

«черная» бактериальная пятнистость) [208].

2. Фаговый биопроцессинг – применение бактериофагов для деконтаминации овощей, фруктов, мяса, рыбы в процессе их заводской переработки перед упаковкой готовой к употреблению продукции. Примером фагового биопроцессинга может служить зарегистрированная в 2006 году Управлением по продовольствию и медикаментам США (US FDA) фагосодержащая пищевая добавка (вспомогательное техническое средство – processing aid) на основе поливалентного листериозного коктейля – ListShield (LMP-102, производитель Intralytix, США) «Listeria monocytogenes Specific Phage Preparation», включающего 6 различных фагов, к которым чувствительны 170 штаммов L. monocytogenes. Она позволяет производить обработку готового к употреблению (т.н. ready-to-eat products) мяса домашних животных и птиц и применяется на мясокомбинатах, птицефабриках для деконтаминации полуфабрикатов, колбас, мясных нарезок путем аэрозольной обработки их поверхности [170, 207].

Профилактический прием бактериофагов людьми в качестве 3.

пробиотического продукта диетического питания в целях предотвращения инфицирования, как в очагах спорадических случаев заболевания, так и при групповой и вспышечной заболеваемости. Американские коллеги на экспериментальной модели листериоза мышей показали целесообразность применения листериозного бактериофага, как профилактического средства.

Исследование включало 7-90-дневный прием листериозного коктейля ListShield.

В первом опыте участвовало 3 группы животных: 15 мышей контрольной группы получали фосфатный буфер 3 дня до и 3 дня после инфицирования через желудочный зонд штаммом Listeria monocytogenes Lm370 в количестве 105 КОЕ/мл; 20 мышей опытной группы получали ListShield в титре 105 БОЕ/мл через желудочной зонд 3 дня до и 3 дня после заражения, как и в контрольной группе;

третья группа (группа сравнения) 10 мышей, пролеченная ампициллином (однократно, внутрижелудочно, 25мг/г) на следующий день после листериозного инфицирования. Эксперимент показал равный антилистериозный эффект у мышей 2 и 3 групп на 7 сутки по количеству клеток Lm370, обнаруженных в печени, селезенке и кишечнике после вскрытия животных. В тоже время, мыши, получавшие ампициллин, статистически достоверно потеряли в весе из-за диареи, вызванной ятрогенным дисбиозом. У мышей из 2 группы (принимавших ListShield) нарушений нормального разнообразия кишечной микробиоты выявлено не было. В 90-дневном опыте 15 мышей из опытной группы получали бактериофаг в концентрации 105 БОЕ/мл 2 раза в неделю с питьевой водой, 15 мышам из группы контроля добавляли в воду фосфатный буфер. В процессе 90дневного эксперимента существенных различий в динамике весовых показателей, лейкоцитарной формуле крови, тканевым срезам внутренних органов и профилям денатурирующего градиентно-гелевого электрофореза микробиоты толстой кишки у мышей контрольной и испытуемой групп не выявлено, что позволило авторам сделать вывод о возможности длительного применения фагового коктейля у млекопитающих без каких-либо побочных эффектов. Таким образом, в модельном эксперименте на мышах была подтверждена гипотеза о том, что регулярный длительный пероральный прием бактериофагов (в точности воспроизводящий употребление пробиотических продуктов диетического питания как части ежедневного пищевого рациона человека) безопасен и может использоваться для специфического предотвращения распространения патогенных бактерий через слизистую желудочно-кишечного тракта у млекопитающих [187].

Наглядным примером может служить разработанный компанией Intralytics пробиотический продукт диетического питания на основе шигеллезного бактериофага («phage-based probiotic dietary supplement» цитата по оригиналу) ShigActive, который в настоящее время проходит 3 фазу клинических испытаний в рамках проекта широкомасштабного использование данного фагопрофилактического продукта в армии США [7, 176].

Идея профилактического приема бактериофагов, в частности, сальмонеллезного, брюшнотифозного и др., не нова и использовалась в Вооруженных Силах и других организованных коллективах (детские сады, ясли, отделения стационаров) еще в период Советского Союза [13, 16, 98, 111].

Применение поливалентного дизентерийного бактериофага в эпидемических очагах позволяло снизить заболеваемость дизентерией в среднем в 3-12 раз. В периоды сезонного подъема заболеваемости обязательному фагированию подвергались работники пищеблоков, военнослужащие, дети в дошкольных учреждениях и лица, занятые обслуживанием водопроводных сооружений и хозяйственно-бытовых объектов [1, 7, 16].

В 1963-1964 гг. в программе клинических испытаний по профилактике бактериальной дизентерии в Тбилиси приняли участие 30 769 детей в возрасте от 6 месяцев до 7 лет. Дети, проживавшие на одной стороне улицы (17 044 человек) были включены в опытную группу и получали шигеллезный бактериофаг в таблетках (торговое название поливалентный дизентерийный) раз в неделю в течение109 дней, в то время как дети, проживавшие на другой стороне улицы, были включены в контрольную группу и получали плацебо. Применение бактериофага с профилактической целью позволило в 3,7 раз снизить заболеваемость детей клинически подтвержденной дизентерией и в 2,6 раз дизентерией, подтвержденной бактериологически. Так, заболеваемость клинически подтвержденной дизентерией детей в опытной группе составила 1,8 0 /00, а в контрольной группе - 6,7 0/00, а заболеваемость бактериологически подтвержденной дизентерией - 0,7 0/00 и 1,8 0/00, соответственно. Воздействие бактериофагов привело к снижению числа случаев диареи другой этиологии (15 и 45 случаев на 1000 детей в возрасте от полугода до года в опытной и контрольной группах), что, по предположению исследователей, послужило свидетельством защитного эффекта шигеллезного бактериофага против ряда серотипов Е. coli.

Наиболее выраженный профилактический эффект был зафиксирован у детей до 3 лет [16].

С июня по ноябрь 1965 года в Горьковской области в 58 ясельных коллективах было проведено сравнительное исследование эффективности фагопрофилактики двумя препаратами одновременно (дизентерийным и колипротейным).

Бактериофаги давали 3547 детям (30 яслей) 1 раз в неделю в течение 5 месяцев в дозе от 5 (дети младше полугода) до 25 мл (дети старше 3 лет) каждого, группой сравнения послужили 1942 ребенка (23 ясельных коллектива), не получавших бактериофаги. Заболеваемость детей, получавших бактериофаг (учитывались все желудочно-кишечные заболевания, в т.ч. неподтвержденные бактериологически), в период наблюдения составила 4,4%, а в группе сравнения 13,5%. Во столько же раз (3,3) была ниже заболеваемость, микробиологически подтвержденными дизентерией и колиэнтеритами [98].

Летом 1982-1983 г.г. три тысячи военнослужащих из разных регионов СССР (Украины, Средней Азии, Урала и Дальнего Востока) приняли участие в программе по оценке профилактического применения поливалентного дизентерийного бактериофага в форме таблеток с кислотоустойчивым пектиновым покрытием. Схема приема: 2 таблетки одномоментно один раз в 3 или 5 дней (2 опытные группы равного количества) за 1,5-2 часа до еды. В контрольной группе солдаты получали таблетки с глюконатом кальция (плацебо).

Опытные и контрольные группы формировались методом случайной выборки.

Все военнослужащие находились в тождественных эпидемиологических условиях. Уровни заболеваемости в опытных и контрольных группах в период эпидемического подъема статистически достоверно различались (р 0,001), достигая на Дальнем Востоке в ряде воинских коллективов отличий в 9,5 раз (заболеваемость в опытной группе на фоне возникшей в подразделении вспышки острой дизентерии, вызванной потреблением инфицированной Sh. flexneri воды), при фагировании 1 раз в 3 дня была ниже, чем в контрольной в 9,5 раз, при фагировании по схеме 1раз в 5 дней в 5,7 раза. Использование сальмонеллезного бактериофага в аналогичных целях привело к снижению заболеваемости сальмонеллезом по стране в 2-4 раза [13].

Показателен опыт применения адаптированных к госпитальной микрофлоре бактериофагов в Нижегородской детской областной клинической больнице (отделение реанимации новорожденных) в период осложнения эпидемиологической ситуации, где наряду с обычными противоэпидемическими мероприятиями, были использованы и бактериофаги. Фагирование внешней среды всех функциональных помещений отделения проводилось «Интестибактериофагом» и «Бактериофагом синегнойным». В профилактических целях синегнойный бактериофаг применяли всем новорожденным через рот при поступлении в отделение, а также фагировали новорожденных, контактных по палате с больными с синегнойной инфекцией; препарат применяли в увлажнительных камерах аппаратов искусственной вентиляции и путем распыления во внешней среде палаты, в которой находился больной. Снижение заболеваемости внутрибольничной инфекцией синегнойной этиологии в 11 раз, а также уменьшение в стационаре контаминированности объектов внешней среды показало высокую эффективность применения бактериофагов, адаптированных к госпитальной микрофлоре [2, 3, 8].

Впервые в отечественной и мировой практике профилактика нозокомиального сальмонеллеза осуществлялась у всех больных отделений ГВКГ им. Н.Н.

Бурденко, где были выявлены случаи данной инфекции. При этом бактериофаг назначали по следующей схеме: первые 5 дней по 40-50 мл жидкого или 2 таблетки сухого бактериофага 2-3 раза в день. Тяжелым больным, которые не могли принимать препарат перорально, его вводили через зонд 2-3 раза в день по 30-50 мл. В дальнейшем препарат продолжали применять в указанных дозах 1 раз в день в течение всего пребывания пациента в стационаре. Схема приема 40-50 мл (2 таблетки) 1 раз в день применялась и в отношении пациентов, вновь поступающих в карантинные отделения стационара, с первого дня их пребывания.

Санация с использованием антибиотиков и последующие наблюдения в динамике за переболевшими лицами из числа медицинского персонала ГВКГ им. Н.Н.

Бурденко, как показывает практический опыт, процесс организационно достаточно сложный, трудоемкий, малоэффективный и не безвредный в отношении общего воздействия на организм человека. Для санации медицинского персонала использовали сухой бактериофаг в дозе по 2-4 таблетки 3 раза в день в течение 5-7 дней. В последующем осуществляли переход на профилактическое использование препаратов, обеспечиваемое приемом 2 таблеток 3 раза в неделю в течение времени существования эпидемического очага в стационаре. Санировано более 2500 сотрудников. Динамическое наблюдение в течение последующих 12 месяцев после проведения данных мероприятий не выявило случаев бактерионосительства или заболевания манифестными формами сальмонеллеза среди медицинского персонала, что подтверждает эффективность профилактического применения сальмонеллезного бактериофага [2, 3, 8].

Таким образом, сама по себе процедура фагопрофилактики условно здоровых детей и взрослых, продолжавшаяся месяцами, сопоставима со схемой приема пробиотических продуктов диетического питания, регистрационно узаконенная в Российской Федерации лишь в конце 1990-х годов [13, 98]. Процедура с использованием бактериофагов может рассматриваться обоснованием идеи введения их в пищевой рацион без назначения врача, принадлежащей американским ученым (Sulakvelidze и Kutter) [8, 101, 132, 168].

В настоящее время в мире насчитывается всего несколько стран – США, Великобритания, Грузия, Россия, Австралия, Индия, Израиль, Нидерланды, Канада, в которых существуют компании, производящие лекарственные и ветеринарные препараты, диагностикумы и пищевые добавки на основе бактериофагов. Рост числа антибиотикоустойчивых штаммов золотистого стафилококка, сальмонелл, синегнойной палочки, энтерококков, кампилобактера, ацинетобактера и многих других микроорганизмов предполагает создание фаговых препаратов в качестве альтернативы классическим антибактериальным средствам.

На наш взгляд, накопилось уже достаточное количество экспериментальных и практических данных, обосновывающих необходимость дальнейшего совершенствования способов применения и рецептур бактериофаговых препаратов. Бактериофаги необходимо рассматривать как пробиотики и можно использовать в качестве основного действующего вещества для создания специализированного продукта диетического профилактического питания.

79

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ПРОДУКТА

ДИЕТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ

В процессе выполнения диссертационной работы нами был разработан пайплайн для нелекарственных продуктов на основе бактериофагов, который, включает все этапы, необходимые и достаточные для обеспечения безопасности и эффективности разрабатываемой готовой формы. Схема получения нелекарственных продуктов на основе бактериофагов представлена на рисунке 3.

–  –  –

Рисунок 3 Схема получения нелекарственных продуктов на основе бактериофагов

2.1.Отбор производственно-перспективных штаммов бактериофагов 2.1.1. Определение и характеристика бактерий-мишеней Одной из первоочередных задач диссертационной работы было создание банка потенциальных бактериальных штаммов-мишеней, так как целью диссертационной работы являлась разработка рецептуры специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов, технологии производства и процедур контроля, обеспечивающих его безопасность и эффективность в качестве средства профилактики инфекций, передающихся пищевым путем. По собранным нами в рамках собственного исследования данным по городу Москве среди общего числа вспышек инфекционных заболеваний за 2010 г. 45 % были вызваны бактериальными агентами: сальмонеллами, шигеллами, золотистым стафилококком. В 2011 г. на

–  –  –

На основании анализа эпидемической обстановки, включавшего как отечественные, так и зарубежные источники литературы, в состав профилактического продукта вошли штаммы бактериофагов, активные в отношении наиболее значимых с эпидемиологической точки зрения патогенных микроорганизмов, вызывающих ОКИ и пищевые токсикоинфекции – сальмонелл, шигелл, патогенных эшерихий коли, золотистого стафилококка и листерии. С 2006 г. микроорганизмы выделяли из разных источников: из почвы, куриных экскрементов с птицефабрик и экскрементов крупного рогатого скота, из сточных вод («Мосводоканал»), а также клинического материала различного происхождения (образцы кала, мочи, урогенитальные посевы и др.). В процессе формировании коллекции бактериальных штаммов проводили их индикацию и видовую идентификацию. Для штаммов, используемых в качестве посевного материала при культивировании бактериофагов, дополнительно подтверждали отсутствие в них лизогенных факторов. Бактериальные штаммы, обладающие характерными видовыми свойствами, использовали для изолирования и определения спектра литической активности фагов-кандидатов. Бактериальные культуры, на которых удавалось достичь высоких значений титра вирусных частиц производственно-перспективных штаммов бактериофагов по Грациа, отбирали как штаммы-продуценты для получения одноименного бактериофага, лиофилизировали и закладывали на хранение на 2 года.

Для выделения и идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae, золотистого стафилококка, листерий пользовались методиками, описанными выше. В ходе работы было подтверждено, что наиболее часто высеваемыми микроорганизмами из клинического материала, объектов окружающей среды, продуктов питания являлись представители рода сальмонелл, шигелл, листерий, кишечных палочек, золотистого стафилококка.

В ходе работы было выделено и оттипировано 59 штаммов Salmonella enterica сероваров Enteritidis, Typhimurium, Infantis, Choleraesuis, Paratyphi, Moscow; 19 штаммов шигелл (Sh.

sonnei, Sh. flexneri, Sh. dysenteriae), 49 штаммов золотистого стафилококка, 32 штамма эшерихий коли, в т.ч. STEC-штаммов Escherichia coli O104:Н4 – 1, Escherichia coli O104:Н12 – 1, Escherichia coli O157:Н7 – 9, Escherichia coli других сероваров - 12, 40 штаммов листерий, из них Listeria monocytogenes 30. Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических, культурально - биохимических свойств, методами масс-спектрометрии, при необходимости использовали метод ПЦР со специфическими праймерами (подробнее см. методы, описанные во введении).

Одним из важнейших условий отбора бактериального штамма-хозяина для последующего культивирования производственно-перспективных бактериофагов было подтверждение отсутствия профагов, интегрированных в геном бактериальной клетки. Определить наличие профага в бактериальной культуре можно путем воздействия на клетку химическими или физическими факторами, индуцирующими механизм репликации фаговой ДНК и последующий лизис бактериальной клетки с выходом нового поколения вирусных частиц. В качестве химического фактора воздействия мы использовали митомицин С в дозе не превышающей 1 мкг/мл. Суть модифицированного нами метода заключается в следующем: штамм микроорганизма, который мы проверяли на лизогению, рассевали на МПА до единичных колоний и инкубировали 18-20 часов при 37 0С.

Затем единичные колонии пересевали секторами на МПА для получения потомства одной клетки. Инкубировали в термостате 18-20 часов при 37 °С.

Бактериальную культуру, хорошо выросшую на секторе без видимых негативных колоний, засевали в пробирку с МПБ, содержащим 0,5 мкг/мл митомицина С, в количестве одной бактериальной петли. После инкубации пробирок в течение 4-6 часов при 37 0С добавляли в них хлороформ из расчета 100 мкл на 1 мл (при условии, что искомый бактериофаг устойчив к хлороформу), чтобы инактивировать микробные клетки. Интенсивно встряхивали пробирку в течение 20 мин и центрифугировали 30 мин при 5000-6000 об/мин. Полученный таким образом супернатант фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм) и исследовали на наличие в нем бактериофага. Для этого, исследуемый на лизогению штамм сеяли на чашку Петри газоном, разделив чашку на 3 сектора: на 1-ый сектор наносили каплю фаголизата, к которому заведомо чувствительна исследуемая бактериальная культура (положительный контроль); на 2-ой сектор наносили каплю физиологического раствора с 0,5 мкг/мл митомицина С (отрицательный контроль) и на 3-ий сектор наносили каплю полученного нами фильтрата. Давали каплям впитаться и ставили в термостат при 37 °С на 18-20 часов. После инкубации учитывали результаты: если под действием митомицина С нам удавалось индуцировать профаг в лизогенной культуре, то частицы умеренного бактериофага, вернувшегося в литический цикл, должны оказаться в фильтрате и тогда в секторе 3 в месте его нанесения будет визуализироваться лизис бактериальной культуры, а если бактериальная клетка не несет в себе профаг, то в месте нанесения фильтрата будет сплошной рост бактериальной культуры; в секторе 1 должна быть зона лизиса; в секторе 2 – сплошной рост бактериальной культуры.

В процессе модификации метода [175] использовали различные концентрации митомицина С (1 мкг/мл и 0,5 мкг/мл).

В качестве бактериального штамма-хозяина, соответствующего всем необходимым требованиям для культивирования бактериофага, активного в отношении серовара Infantis, был отобран штамм S.Infantis 1271, номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» №В-7713, для бактериофага, активного в отношении серовара Enteritidis – S. Еnteritidis M4, номер в коллекции «ГКПМОболенск» В 7156, для бактериофага, активного в отношении серовара Typhimurium – S. Typhimurium Г1, номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» В-7711.

Лаборатория клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов имеет, как и многие другие структуры биотехнологического профиля, аккредитацию на работу с микроорганизмами III-IV группы патогенности, из которых согласно последним санитарным правилам были исключены STECштаммы.

Последнее положение, а также высокое содержание шига-токсина в фаголизате штамма-кандидата при культивировании на STEC-штаммах, потребовало от нас дополнительного поиска штаммов непатогенной кишечной палочки в качестве бактерии-хозяина для культивирования на них одноименного штамма бактериофага, обладающего, с одной стороны, широким спектром литической активности, включающем лизис STEC-штаммов, а с другой, не инфицирующем E. coli, входящую в нормофлору человека. В результате проведенной серии экспериментов мы отобрали известный лабораторный штамм E. coli К12 С600 (номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» В-7158). Работы с патогенными штаммами Escherichia coli O104:H4, O157:H7, STEC других сероваров О111, О26, О126, О25, О78, О1, О4, О138, О79, О115, О141, О6, О139, О25 выполняли на базе лаборатории молекулярной диагностики и генноинженерных препаратов ФБУН ГНЦ ПМБ (п. Оболенск) (руководитель – Воложанцев Н.В.).

В качестве бактериального штамма-хозяина, соответствующего всем необходимым требованиям для культивирования бактериофага, активного в отношении Staphylococcus. aureus, в т.ч. MRSA-штаммов, был отобран S. aureus 2072 номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» В-7526.

Высокое содержание в фаголизате листериозного фага, выращенного на штамме-хозяине, относящегося к виду Listeria monocytogenes, LLO-токсина, также как и в случае с кишечной палочкой, дополнительно потребовало подбора непатогенного штамма-хозяина. Необходимым характеристикам соответствовал штамм Listeria innocua М-4, номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» В-6643, при культивировании на котором спектр литической активности одноименного бактериофага включал и патогенные виды листерий (см. таблицу18).

Таким образом, в ходе проделанной работы по выделению и изучению штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, с использованием методов, описанных во введении, был сформирован банк бактериальных тестштаммов, необходимый как для последующего изолирования, так и для проверки спектра литической активности фагов-кандидатов, а также закреплены штаммыпродуценты, используемые на следующем этапе диссертационного исследования для культивирования искомых бактериофагов.

2.1.2. Изолирование бактериофагов из окружающей среды

Следующая задача, которую предстояло выполнить в ходе данной работы – это выделение, изучение и отбор по фенотипическим и генотипическим свойствам штаммов бактериофагов, активных в отношении вышеперечисленных микроорганизмов. Опираясь на методики, описанные в гл. 2, мы разработали модифицированную схему выделения бактериофагов. Она позволяла получать новые штаммы фагов из различных объектов окружающей среды, активных в отношении патогенных микроорганизмов. Схема выделения бактериофагов из объектов окружающей среды представлена на рисунке 4. Она включала следующие этапы: пробу (0,1 л) очищали от механических загрязнений, используя воронку, сито, бумажный фильтр, центрифугировали в течение 15 минут при 7155 g, после чего супернатант подвергали стерилизующей фильтрации (размер пор фильтра 0,22 мкм), обогащали бактериальными культурами из банка микроорганизмов, собранных на предыдущем этапе исследования (раздел 2.1.1.), с питательной средой и инкубировали при 37 0С в течение 18-20 часов.

–  –  –

Исследование основных свойств выделенных бактериофагов Рисунок 4 Схема выделения бактериофагов из объектов окружающей среды.

Полученный фаголизат освобождали от нелизированных бактерий и их фрагментов (стерилизующая фильтрация) и тестировали спот-тестом на бактериальном газоне индикаторной культуры. При получении положительного результата (пятна лизиса) фильтрат полученного фаголизата титровали по методу Грациа для характеристики морфологии негативных колоний. На следующих этапах (см. далее раздел 2.1.3), используя спот-тест, определяли спектр литической активности, проверяли устойчивость к хлороформу, стабильность титра при повышенных температурах и оптимальный интервал рН, при котором количество вирусных частиц в фаголизате не уменьшалось. Вирулентную природу и оригинальность изолированного из пробы штамма бактериофага подтверждали полногеномным секвенированием.

На данном этапе были изолированы штаммы-кандидаты бактериофагов, активные в отношении бактерий-мишеней, вызывающих сальмонеллез, эшерихиоз, шигеллез, листериоз и стафилококковую пищевую токсикоинфекцию.

2.1.3. Фенотипическая характеристика фагов-кандидатов

Сальмонеллезные фаги:

Фаг SE40, эффективный в отношении бактерий серотипа Salmonella Enteritidis.

Он был выделен из образца почвы, отобранного в Московской области.

Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10 11-1012 БОЕ/мл на индикаторной культуре Негативные колонии Salmonella Enteritidis M4.

прозрачные, округлые, 3,0-4,0 мм в диаметре (рисунок 5). По данным электронной микроскопии бактериофаг SE40 состоит из икосаэдрической головки и имеет длинный несокращающийся хвост. Такая морфология характерна для фагов семейства Siphoviridae (рисунок 6). Подавляет рост 84 % штаммов серотипа Salmonella Enteritidis (таблица 14).

Фаг ST11, эффективный против Salmonella Typhimurium, был выделен из экскрементов кур с одной из птицефабрик Калужской области. Индикаторной культурой является штамм S. Тyphimurium Г1. Хорошо культивируется, достигая репродукции 1011- 1012 БОЕ/мл. Диаметр негативной колонии 1,0-3,0 мм (рисунок 5). По данным, полученным при электронной микроскопии, бактериофаг состоит из головки в форме икосаэдрического капсида и имеет длинный сокращающийся хвост. Морфология характерна фагам семейства Myoviridae и позволяет отнести к роду Felixounalikevirus (рисунок 6). Лизирует 100% сальмонеллезных штаммов этого серовара (таблица 14).

Фаг Si3 лизирует культуры Salmonella Infantis. Индикаторной культурой является штамм S. Infantis 1271. Выделен из экскрементов крупного рогатого скота в одном из хозяйств Московской области. Так же хорошо воспроизводится, достигая репродукции на штамме-хозяине 1011- 1012 БОЕ/мл. Негативные колонии мутноватые, круглые, с ровными краями. Диаметр составляет 1,0-3,0 мм (рисунок 5). Электронная микроскопия этого бактериофага позволила рассмотреть головку в форме икосаэдрического капсида и сокращающийся хвост. Морфология характерна семейству Myoviridae (рисунок 6). Бактериофаг подавляет рост 64 % штаммов сальмонелл (таблица 14).

Морфология негативных Морфология негативных Морфология негативных колоний фага SE40 колоний фага ST11 колоний фага Si3 Рисунок 5 Морфология негативных колоний сальмонеллезных бактериофагов

–  –  –

Эшерихиозные бактериофаги:

Фаг EсD7 выделен из фекалий кур на культуре штамма Escherichia coli O104:H4, вызвавшего вспышку геморрагического колита среди жителей Германии и Франции весной-летом 2011 г. Этот бактериофаг обладает литической активностью по отношению к шига-токсин продуцирующим штаммам Escherichia

coli O104:H4; О157:Н7, а также к клинически значимым E. coli других серогрупп:

O26, О126, О25. Кроме того, он лизирует бактерии Shigella sonnei и Shigella flexneri, не подавляет рост бактерий непатогенного для человека штамма E. coli М-17, используемого для приготовления пробиотического продукта «Колибактерин». Фаг адаптирован для размножения на непатогенной культуре E. coli К12 С600, достигая репродукции до 1010- 1011 БОЕ/мл. Диаметр негативных колоний 1,0-2,0 мм. Колонии мелкие, четкие, с ровными краями. По данным электронной микроскопии бактериофаг EсD7 имеет сложное строение:

удлиненная головка, комплексная базальная пластинка, сокращающийся хвост, с 6-ью радиальными хвостовыми отростками. Это типичный представитель семейства Myoviridae (рисунок 7). Бактериофаг подавляет рост 100 % штаммов E.

coli O104:H4, E. coli серогрупп: O26, О126, О25 и бактерии Shigella sonnei и Shigella flexneri. Лизирует 89% штаммов E. coli О157:Н7 (таблица 15).

Фаг V18 выделен из сточных вод одного из коровников, расположенных в Московской области. Проявляет специфическую активность в отношении Escherichia coli О157:Н7 – лизирует 100% штаммов, выделенных от людей, животных и из объектов окружающей среды. Фаг адаптирован для размножения на непатогенной культуре Escherichia coli К12 С600, достигая репродукции до 1010- 1011 БОЕ/мл. Диаметр негативных колоний фага V18 2,0-3,0 мм, колонии округлой формы с четкими, ровными краями. По данным электронной микроскопии в своем составе имеет головку в форме икосаэдрического капсида и сокращающийся хвост. Представитель семейства Myoviridae (рисунок 8).

А В Рисунок 7 Морфология негативных колоний (А) и электронномикроскопический снимок (В) колифага EсD7. Контрастирование 2 % ацетатом уранила. 80 000.

А В Рисунок 8 Морфология негативных частиц (А) и электронномикроскопический снимок (В) колифага V18. Контрастирование 2 % ацетатом уранила. 80 000.

Оба описанных колифага культивируются на непатогенном штамме кишечной палочки Escherichia coli К12 С600, сохраняя свои литические свойства в отношении патогенных штаммов шигелл и Escherichia coli (таблица 15).

–  –  –

Примечание: * – в скобках указано число штаммов, использованных в спот-тесте, «+» наблюдается зона лизиса, «» лизис не наблюдался.

Одной из основных характеристик бактериофагов является способность поддерживать широкий спектр литической активности в отношении бактериальных штаммов, выделенных как в стране-производителе коктейля, так и полученных за ее пределами. С 23 по 27 июня 2014 в сотрудничестве с референслабораторией ЕС, включая VTEC - штаммы, Национального института здоровья Рима (Италия), были исследованы как спектры литической активности отдельных колифагов V18 и EсD7, входящих в коктейль, так и продукт в полном штаммовом составе [10,193]. Проверка проводилась на EHEC/EAEC (энтерогеморрагических, энтероагрегативных) штаммах, изолированных в Италии (таблица 16).

Таблица 16. Спектр литической активности бактериофагов V18 и EсD7 по отношению к шига-токсин продуцирующим штаммам Escherichia coli.

–  –  –

Литическую активность определяли методом спот-теста в агаровом слое. В результате проведенного исследования 50 (98 %) из 51 веро-токсин продуцирующего штамма (штамма VTEC) лизировались коктейлем и 44 (86%) из 51 штаммов подавлялись отдельными колифагами V18 и EсD7. Это можно объяснить тем, что суммарный бактерицидный эффект компонентов коктейля существенно превосходил эффект каждого штамма в отдельности.

Стафилококковый бактериофаг СН1, вирулентный для клинически значимых штаммов Staphylococcus aureus, в том числе метициллинрезистентных (MRSA) штаммов. Выделен из гнойного содержимого раны больного пациента в 2011 г. Индикаторная культура – штамм золотистого стафилококка S.aureus 2072.

Он хорошо культивируется, достигая репродукции до 1010- 1011 БОЕ/мл. Диаметр негативных колоний 2,0 мм. По данным электронной микроскопии бактериофаг СН1 состоит из головки в форме икосаэдрического капсида и сокращающегося хвоста. Относится к семейству Myoviridae (рисунок 9).

А В Рисунок 9 Морфология негативных частиц (А) и электронномикроскопический снимок (В) стафилококкового фага СН1. Контрастирование 2 % ацетатом уранила. 80 000.

Литическую активность определяли методом spot-теста, нанося на газонную культуру по 10 мкл штамма бактериофага в титре 109 БОЕ/мл. Даные, полученные при проверке, свидетельствуют о том, что фаг СН1 лизирует 94 % культур штаммов S.аureus (таблица 17), причем 64 из этих штаммов выделены от пациентов и являются клинически значимыми.

Таблица 17. Определение спектра литической активности стафилококкового бактериофага СН 1(по результатам спот-теста).

–  –  –

Листериозный фаг Lm1, вирулентный в отношении штаммов Listeria monocytogenes и других видов листерий (таблица 18), выделен из фекалий овец в Астраханской области. Хорошо адаптирован для размножения на непатогенном штамме L.innocua 2, достигая при определенных условиях (рост на плотной среде МПА с глюкозой при 28 0С) репродукции до 109-1010 БОЕ/мл. Негативные колонии мелкие – 1,0-2,0 мм в диаметре, четкие с ровными краями, округлой формы. По данным электронной микроскопии фаг состоит из икосаэдрической головки и имеет сокращающийся хвост. Является представителем семейства Myoviridae (рисунок 10).

Данный штамм бактериофага обладает высокой литической способностью, лизирует 92 % клинически значимых штаммов Listeria (таблица 18).

–  –  –

С целью подтверждения специфичности литической активности бактериофагов была проведена работа по изучению влияния коктейля, состоящего из отобранных нами штаммов бактериофагов, на рост производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл из ГКНМ. Для проведения работы использовали следующие штаммы лактобацилл и бифидобактерий: Lactobacillus acidophilus NK1, L. acidophilus 100аш, L. acidophilus К3Ш24, L. plantarum 8P-A3, Bifidobacterium adolescentis MC-42, B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. bifidum ЛВА-3, B. longum Я-3, B. breve 79-119, B. infantis 73-15. Изучение влияния коктейля бактериофагов на бифидобактерии и лактобациллы проводили методом серийных разведений in vitro в жидкой среде. Сравнение количественного содержания лактобацилл проводили, используя жидкую среду МРС-2, сравнение количественного содержания бифидобактерий проводили на жидкой среде БС [81]. Для этого в пробирки с разлитой по 4,5 мл и по 9,0 мл среды вносили 0,5 мл и 1 мл коктейля бактериофагов. Контролем служили пробирки с питательной средой без коктейля бактериофагов и с коммерческим бактериофагом «Интести»

(ФГУП НПО «Микроген»). Делали ряд последовательных разведений.

Культивировали в термостате при 37 0С двое суток. Из каждой пробирки с видимым ростом делали мазки и окрашивали их по Граму, затем микроскопировали (таблица 19).

Таблица 19. Сравнение влияния фагового коктейля и «Интести-бактериофага» на рост производственных штаммов лактобацилл и бифидобактерий

–  –  –

B. breve 79-119 B. infantis 73-15 Внесение коктейля и «Интести-бактериофага» в растущие производственные штаммы бифидобактерий и лактобацилл не выявило морфологических и количественных различий культур в сравнении с контролем.

Так же мы изучали влияние коктейля бактериофагов на представителей нормальной микрофлоры ЖКТ - бифидобактерий и лактобацилл, изоляты которых были получены в процессе проведения анализа на дисбактериоз кишечника у 63 пациентов КДЦ МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского. Анализы отбирали без создания специальной выборки и отсева пациентов по каким-либо признакам с 14 мая по 1 июня 2012 года. Для этого в пробирки с разлитой по 4,5 мл среды МРС и по 9,0 мл среды БС вносили 0,5 мл и 1 мл коктейля бактериофагов. Контролем служили пробирки с питательной средой без коктейля бактериофагов и с коммерческим бактериофагом «Интести» (ФГУП НПО «Микроген»). Количественное содержание бифидобактерий определяли, высевая 1 мл суспензии (фекалии пациентов) из разведений 10-5 10-9 в подготовленные ряды пробирок со средой БС. Количественное содержание лактобацилл определяли, высевая 1 мл суспензии (фекалии пациентов) из разведений 10-5 10-8 в подготовленные ряды пробирок со средой МРС-2. После 48 часов инкубирования в термостате при 370С делали мазки из каждой пробирки с видимым ростом, окрашивали их по Граму, затем микроскопировали (таблица 20) Таблица 20. Сравнительная оценка влияния коктейля бактериофагов и «Интестибактериофага» (ФГУП «НПО Микроген») на рост изолятов бифидобактерий и лактобацилл, полученная метод серийных разведений

–  –  –

Примечание: *- в скобках указано количество изолятов Проведенная работа показала, что наш продукт не влиял на рост и не изменял морфологию изолятов бифидобактерий и лактобацилл. «Интести-бактериофаг»

также не изменял морфологию этих микроорганизмов, но, вероятно, проявлял бактериостатическую активность в отношении 10 % изолятов бифидобактерий и 20 % лактобацилл. Хотя это может быть и действие хинозола – консерванта, добавляемого в коммерческие бактериофаги.

Влияние коктейля бактериофагов на E. coli с нормальными ферментативными свойствами, в сравнении с коммерческим «Интести-бактериофагом», исследовали у 34 пациентов КДЦ МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского без создания специальной выборки и отсева пациентов по каким-либо признакам с 14 мая по 1 июня 2012 года. coli с нормальными ферментативными свойствами выделяли, E.

руководствуясь методикой постановки анализа на дисбактериоз кишечника [81].



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.