WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

«СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕН ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное бюджетное учреждение наук

и

«Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и

микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей и благополучия человека

На правах рукописи

Киселева Ирина Анатольевна

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДИЕТИЧЕСКОГО

ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ КОКТЕЙЛЯ

БАКТЕРИОФАГОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ТЕХНОЛОГИЯ

ПРОИЗВОДСТВА, ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ

ПРИМЕНЕНИЯ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.б.н. Алешкин А.В.

к.б.н. Воложанцев Н.В.

Москва

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Степень разработанности темы исследования Цели и задачи Научная новизна исследования Теоретическая и практическая значимость работы 8 Методология и методы исследования 9 Объекты исследования Материалы и методы исследования Личное участие Положения, выносимые на защиту Степень достоверности и апробация результатов исследования 37 Публикации Объем и структура диссертации 39

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Проблема глобализации ОКИ и пищевых токсикоинфекций 4

1.2. Бактериофаги и их роль в биосфере 53 1.2.1. История открытия бактериофагов 53 1.2.2. Классификация бактериофагов 57 1.2.3. Механизм взаимодействия бактериофагов и бактерий 59

1.3. Подходы к оценке безопасности использования бактериофагов для человека и животных 6

1.4. Опыт использования бактериофагов в клинической практике 64

1.5. Перспективы профилактического применения бактериофагов 72

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 79

Глава 2. РАЗРАБОТКА СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ПРОДУКТА

ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ

БАКТЕРИОФАГОВ

2.1. Отбор производственно-перспективных штаммов бактериофагов 2.1.1. Определение и характеристика бактерий-мишеней 80 2.1.2. Изолирование бактериофагов из окружающей среды 86 2.1.3. Фенотипическая характеристика фагов-кандидатов 88 характеристика производственноМолекулярно-генетическая перспективных штаммов бактериофагов 107

2.2. Разработка метода получения фаговой биомассы с высокой литической активностью и предельно низким содержанием токсинов 116

2.3. Конструирование рецептуры и технология получения готовой формы специализированного продукта диетического профилактического питания 121 2.3.1. Отработка рецептуры специализированного продукта диетического профилактического питания Пилотная технология получения специализированного продукта 2.3.2.

диетического профилактического питания 131 2.3.3. Определение срока годности специализированного продукта диетического профилактического питания

2.4. Оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания на лабораторных животных 138 2.4.1. Оценка токсического влияния 138 2.4.1.1. Острая токсичность 2.4.1.2. Подострая токсичность 140 2.4.1.3. Влияние продукта на нормальную микрофлору кишечника мышей

–  –  –

Микробиологическая безопасность пищи в ХХI веке остается ведущей проблемой гигиены питания. Появление новых технологий хранения на холоду, упаковки в пленку, минимальной переработки охлажденного сырья, длительной транспортировки, а также несоблюдение элементарной гигиены работниками пищеблоков, увеличивают возможность появления и/или накопления в пище возбудителей пищевых инфекций, таких как сальмонеллы, эшерихии, шигеллы, кампилобактер, листерии, стафилококки и т.д. Применение антибиотиков в пищевой отрасли, сельском хозяйстве не решает эту проблему, снижая уровень экологической чистоты продукции и провоцируя появление новой категории патогенов – штаммов условно-патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам [1, 5, 8, 87, 88].

В качестве альтернативы классическим антибактериальным средствам существуют природные биологические агенты – бактериофаги, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток и обладающие выраженными бактерицидными свойствами в цикле фаговой инфекции. [1, 4, 8, 24]. Всесторонние исследования бактериофагов, проведенные в течение 100 лет с момента их открытия Ф. Твортом и дЭреллем в 1915 г., позволили решить многочисленные задачи в микробиологии, вирусологии, биотехнологии, генетики и других отраслях прикладных и фундаментальных исследований [6, 10, 58, 95].

Разработанные в 30-ые годы прошлого столетия в СССР иммунобиологические лекарственные препараты (ИБЛП) на основе бактериофагов широко применяются для лечения острых кишечных и пищевых токсикоинфекций, гнойно-септических и других заболеваний [24, 31, 32, 36, 37, 54, 56]. Как в нашей стране, так и за рубежом продолжает активно развиваться направление фагодиагностики [55, 84, 100]. В Америке, Канаде и странах Евросоюза с конца 1990-х годов рост числа спорадических случаев и вспышек кишечных инфекций послужил поводом для развития нового сегмента пищевых 6 добавок, содержащих бактериофаги. Ряд таких препаратов уже зарегистрирован Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US FDA) и Европейской организацией по безопасности продовольствия (EFSA) в форме вспомогательных технологических средств и специализированных продуктов диетического профилактического питания [160, 176, 207, 208].

Степень разработанности темы исследования Учитывая обширный мировой и отечественный опыт, накопленный по изучению лечебных и профилактических свойств бактериофагов, а также достижения современной молекулярной биологии, отечественные иммунобиологические лекарственные препараты на основе бактериофагов, представляющие собой стерильные фильтраты фаголизатов соответствующих видов бактерий, все же не имеют молекулярно-генетического подтверждения вирулентной природы входящих в них штаммов, обладают низкой эффективностью, содержат эндо- и экзотоксины бактерий-хозяев, а также белковые (антигенные) комплексы питательных сред, что в ряде случаев провоцирует усиление интоксикационного синдрома и вызывает аллергические реакции у пациентов [14, 57]. Совершенствование технологического процесса получения фаголизатов с высоким титром вирусных частиц, использование непатогенных индикаторных культур, введение этапов специфической очистки от эндо- и экзотоксинов, а также молекулярно-генетического подтверждения вирулентной природы бактериофагов и отсутствия известных локусов патогенности в фаговых геномах, позволят обеспечить высокий уровень безопасности и эффективности фаговых композиций, необходимый для их внедрения в качестве средств профилактики и лечения широкого круга инфекционных заболеваний.

Целью диссертационной работы является разработка рецептуры специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов, технологии производства и процедур контроля, обеспечивающих его безопасность и эффективность в качестве средства профилактики инфекций, передающихся пищевым путем.*

Задачи исследования:

1. Сконструировать специализированный продукт диетического профилактического питания на основе бактериофагов. Оценить безопасность потенциальных стартерных микробных культур и их фаголизатов.

2. Оптимизировать технологию культивирования отобранных штаммов бактериофагов. Оценить специфическую антибактериальную эффективность созданного фагового коктейля.

3. Апробировать предложенные алгоритмы применения специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов с целью его последующего внедрения в эпидемиологическую практику в качестве средства для снижения риска развития пищевых инфекций.

4. Подобрать форму выпуска специализированного продукта диетического профилактического питания. Установить оптимальные режим и сроки гарантийного хранения. Провести санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию разработанной рецептуры.

Научная новизна исследования:

Впервые в Российской Федерации создан специализированный продукт диетического профилактического питания на основе бактериофагов.

Разработаны процедуры оценки безопасности производственно перспективных штаммов фагов и коктейля фаголизатов, включающие микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические тесты, а также испытания на лабораторных животных.

На основании нового способа культивирования увеличена урожайность бактериофагов, исключены экзотоксины и предельно снижены концентрации эндотоксина в готовом продукте.

__________________________________________________________________

* - в англоязычной литературе - food-borne infections (FBI).

На базе ведущих научно-практических учреждений здравоохранения РФ разработан алгоритм фагопрофилактики с использованием специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Проведенные исследования и разработанная нормативно-техническая документация обеспечили не только прохождение процедуры независимой экспертизы и государственной регистрации специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» (СГР № RU.77.99.19.004.Е.001234.02.13 от 20.02.2013 г), но и позволили сформировать теоретические предпосылки для создания в Российской Федерации нового класса продуктов – фагобиотиков.

Разработанный специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов за счет фагопрофилактики декретированных контингентов работников предприятий пищевой промышленности, общественного питания, лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), образовательных учреждений (ОУ), сферы бытового обслуживания и других позволит снизить риск развития спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем, а также предотвратить возможность возникновения очагов ОКИ в условиях чрезвычайных ситуаций (наводнений, землетрясений, техногенных катастроф, вооруженных конфликтов и т.д.).

Внедрение в практику процедуры оценки безопасности производственноперспективных штаммов позволит обеспечить отбор исключительно вирулентных бактериофагов для фагосодержащих продуктов и уменьшить вероятность формирования в окружающей среде, в организме человека фагорезистентных штаммов патогенных бактерий.

Использование биотехнологическими предприятиями оптимизированного технологического процесса получения фаголизатов позволит, с одной стороны, улучшить качество получаемого продукта путем его очистки от эндотоксина, а также иммуногенных компонентов питательных сред, провоцирующих развитие 9 интоксикационного синдрома и аллергических реакций у пациентов, а с другой, уменьшить себестоимость продукта за счет увеличения его литической активности.

Методология и методы исследования Методология диссертационной работы спланирована в соответствии со структурой и задачами исследования. Предметом исследования стала разработка специализированного продукта диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов. Объектами исследования выступали штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также бактериофаги, изолированные нами из объектов окружающей среды и клинического материала.

Научная литература, посвященная исследованиям бактериофагов, была проанализирована формально-логическими методами. В работе использованы микробиологические, иммунохимические, молекулярно-генетические, массспектрометрические, электронно-микроскопические и статистические методы исследования.

Объекты исследования Штаммы патогенных и условно-патогенных бактерий-мишеней

–  –  –

Бактерии рода Salmonella В опытах использовали 59 штаммов S.enterica наиболее распространенных и клинически значимых сероваров –Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Moscow, Choleraesuis, Paratyphi. Бактерии рода Salmonella характеризуются типичными для них морфологическими свойствами – это мелкие, подвижные, грамотрицательные палочки. Все они обладали ферментативной активностью, характерной для представителей этого рода, являлись лактозонегативными (их диагностический признак). Все сальмонеллы, вызывающие ОКИ и ПТИ, вирулентны. К факторам вирулентности относятся микрокапсула, белки наружней мембраны клеточной стенки. Для работы были отобраны представители возбудителей сальмонеллезов различных сероваров, которые отличались друг от друга наличием у них разных О- и Н-антигенов.

Бактерии рода Shigella В опытах использовали 19 штаммов шигелл (Sh. sonnei, Sh. flexneri, Sh.

dysenteriae). Бактерии рода Shigella обладали типичными для данного рода биологическими свойствами. Это грамотрицательные, неподвижные палочки, не сбраживающие лактозу, маннит-положительные, не образующие индол и сероводород, не растущие на средах, в которых источников углерода является цитрат аммония, имеющие антигенную структуру, представленную О- антигеном.

Бактерии рода Escherichia coli В работе использовали Escherichia coli с нормальными ферментативными свойствами (штаммы и изоляты, выделенные из клинического материала и объектов внешней среды) и штаммы патогенных E. coli: 4 штамма Escherichia coli O104:H4, штамм Escherichia coli O104:Н12, 29 штаммов Escherichia coli О157:Н7, 51 штамм Escherichia coli других серогрупп: О111, О26, О126, О25, О78, О1, О4, О138, О79, О115, О141, О147, О6, О139, О103, О55, О145, О128, О121, О127.

Бактерии рода Escherichia coli обладали характерными для данного рода биологическими свойствами это грамотрицательные, мелкие, подвижные и не подвижные палочки. Выделенные штаммы типичных кишечных палочек обладали характерными ферментативными свойствами: лактозоположительны, лизинположительны, малонат отрицательны, подвижны, на кровяном агаре не дают «зоны гемолиза». Изменение ферментативных свойств, появление гемолизирующей активности рассматривалось как проявление у штаммов факторов патогенности.

Работа с патогенными штаммами E. coli O104:H4, O157:H7 и E. coli других сероваров велась диссертантом на базе лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) (руководитель – к.б.н. Воложанцев Н.В.) и совместно с коллегами Национального клинического центра здравоохранения г. Рима (Италия).

Микроорганизмы рода Staphylococcus В опытах использовали 49 штаммов Staphylococcus aureus, 50 изолятов золотистого стафилококка, выделенных от пациентов. Микроорганизмы рода Staphylococcus обладали типичными для данного рода биологическими свойствами: факультативные анаэробы, грамположительные кокки, при микроскопировании располагаются парами или небольшими скоплениями в виде гроздьев винограда. При росте на ЖСА – круглые, выпуклые колонии с характерным золотистым пигментом. Коагулазоположительные, на кровяном агаре давали зону гемолиза.

Бактерии рода Listeria В опытах использовали 34 штамма листерий, 15 изолятов листерий, выделенных из клинического материала и объектов внешней среды. Бактерии рода Listeria обладали типичными для данного рода биологическими свойствами.

Выделенные штаммы характеризовались по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам. Дополнительно ставили тест на наличие гемолиза, подвижность (при 22 0С давали подвижность на ПЖА, а при 37 0С подвижность отсутствовала). Патогенные штаммы листерий обладали гемолитическими свойствами. Также видовая принадлежность штаммов листерий была подтверждена методом MALDI-TOF.

Для исследований было взято 2000 клинических и 1000 образцов, полученных из объектов внешней среды и продуктов питания.

Производственные штаммы бифидобактерий и лактобацилл В работе были использованы производственные штаммы из государственной коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, коллекции промышленных

–  –  –

Производственно-перспективные штаммы бактериофагов. В ходе работы из образцов клинического материала, сточных вод и других объектов окружающей среды были выделены вирулентные бактериофаги, специфически лизирующие бактерии-мишени (таблица 3).

Таблица 3. Характеристика изолированных штаммов бактериофагов

–  –  –

сальмонеллезный бактериофаг эффективный против Salmonella SE40, Еnteritidis («ГКПМ-Оболенск» инв.№ Ph 59);

сальмонеллезный бактериофаг ST11, эффективный против Salmonella Тyphimurium («ГКПМ-Оболенск» инв.№ Ph 60);

сальмонеллезный бактериофаг Si3 лизирует культуры Salmonella Infantis («ГКПМ-Оболенск» инв.№ Ph 65);

поливалентный бактериофаг Escherichia coli EсD7 обладает литической активностью по отношению к шига-токсин продуцирующим штаммам E. coli

O104:H4; О157:Н7, а также к клинически значимым E. coli других серогрупп:

О121, О145, О103. Кроме того, он лизирует штаммы возбудителей дизентерии человека - Shigella sonnei и Shigella flexneri («ГКПМ-Оболенск» инв.№ Ph 64);

бактериофаг Escherichia coli V18 - специфичен для бактерий E. coli О157:Н7 («ГКПМ-Оболенск» инв.№ Ph 25).

Стафилококковый бактериофаг Staphylococcus aureus СН1, вирулентный для клинически значимых штаммов S. aureus, в том числе метициллинрезистентных 15 (MRSA) штаммов. Был задепонирован 4 июня 2012 г., номер в коллекции «ГКПМ-Оболенск» Ph 66. Организация – депозитор ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск Роспотребнадзора;

Специфический бактериофаг Listeria monocytogenes Lm1, вирулентный в отношении клинически значимых штаммов monocytogenes. Был Listeria депонирован 9 апреля 2012г. номер УГСХА-07, Организация-депозитор ФГБОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия.

Лабораторные животные В диссертационном исследовании были задействованы лабораторные животные. Работу с лабораторными животными проводили совместно с сотрудниками лаборатории биологических испытаний ФБУН ГНЦ ПМБ (заведующий лабораторией А.И. Борзилов) в виварии, предназначенном для содержания мелких грызунов и лагоморфов конвенциональных и SPF категорий.

Виварные помещения оснащены современным оборудованием, обеспечивающим индивидуальную вентиляцию клеток и контролируемые условия содержания животных. В экспериментах задействовали аутбредных мышей массой 17-20 г и морских свинок с массой тела 280-300 г, полученных из сертифицированных питомников. Все животные получали еду и воду ad libitum.

Материалы и методы исследования Питательные среды Для бактериологических исследований при выполнении работы были использованы жидкие и плотные питательные среды общего назначения: мясопептонный бульон; 1,5 % и 2 % мясопептонный агар; 2 % мясопептонный агар и мясопептонный бульон с глюкозой; среда Эндо (НПО «Микроген», производство г. Махачкала); трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому; 2% МПА с кровью (кровяной агар); желточно - солевой агар Чистовича. Для определения ферментации углеводов использовали цветные среды Гисса с рамнозой, сорбитом, лизином, малонатом натрия и лактозой; среда ОКА (Blood Agar Base); сахарозожелатиновая среда. В таблице 4 приведен состав основных питательных сред.

–  –  –

Примечание: *- для приготовления мясной воды требуется 1 кг мясного фарша.

Его заливали 2 л водопроводной воды. Кипятили в течение 1 часа. После кипения воду остужали, фильтровали, доводили водой до 2 л, разливали по флаконам и стерилизовали 20 мин при 120 0С. Стерильная мясная вода хранится длительное время.

Методы исследования Родовую принадлежность культур устанавливали на основе морфологических и культурально-биохимических свойств Видовую идентификацию [68].

бактериальных культур изучали ферментативными и серологическими методами исследования, а также использовали ПЦР (полимеразная цепная реакция) со специфическими праймерами, MALDI-TOF.

Для выделения и изучения основных свойств бактериофагов использовали методы, описанные Адамсом М. [127], Гольдфарбом Д.М. [34], Лабинской А.С. и др. [68], Каттер Э., Сулаквелидзе А. и Карлсон К. [58].

Методы выделения и идентификации бактериальных культур Для выделения и идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae из клинического материала, пищевых продуктов, объектов внешней среды использовали общепринятые методики и элективные среды для выделения представителей семейства кишечных бактерий Твердый материал [68].

(экскременты) измельчали, делали разведение 1:10. Дифференциальнодиагностическую среду Эндо разливали по чашкам Петри. После того, как чашки застывали, их подсушивали и наносили 0,05-0,1 мл исследуемой пробы, тщательно растирали шпателем, затем этим же шпателем растирали материал по второй и третьей чашке для получения изолированных колоний (метод выделения чистой культуры по способу Дригальского). Посевы инкубировали в термостате при 37 С 18-20 часов. Для изучения ферментативных свойств этих микроорганизмов использовали сложные, многокомпонентные питательные среды, содержащие мочевину, сульфат железа, индикатор Андреде и т.п. Для более полной биохимической характеристики культур использовали среды Гисса с рамнозой, сорбитом, лизином, малонатом Na, лактозой. Подвижность микроорганизмов определяли, используя полужидкий (0,2-0,5 %) мясопептонный агар [68]. Агглютинацию проводили с помощью поливалентных и типовых сывороток производства РАО «Биопрепарат» Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток.

Для выделения штаммов золотистого стафилококка из клинического материала, объектов внешней среды, полуфабрикатов использовали бактериологический метод – посев патологического материала на питательные среды с последующим выделением чистой культуры и изучением свойств, характеризующих ее патогенность [68]. Для этой цели были использованы:

элективная среда желточно-солевой агар (ЖСА) Чистовича и 5 % кровяной агар.

По методике, описанной выше, засевали материал и культивировали при 37 0С на ЖСА 2-ое суток, на кровяном – сутки. Из колоний с типичными для стафилококков признаками (гемолиз - на кровяном агаре, лецитовителлазная реакция на ЖСА) делали мазки и микроскопировали по Граму. Одним из обязательных тестов на патогенность стафилококков является реакция плазмокоагуляции. Для постановки этой реакции использовали сухую цитратную плазму кролика, выпускаемую ФГУП «Аллерген».

Для выделения штаммов листерий из полуфабрикатов, фарша, рыбы, образцов почвы тоже использовали бактериологический метод. Биологический материал, в котором могли находиться данные микроорганизмы, после подготовки высевали на селективные питательные среды для выделения листерий. Мы использовали среду Оксфорд фирмы Himedia с последующим выделением чистой культуры и изучением свойств этих микроорганизмов. Колонии, характерные для листерий, проверяли на подвижность при разных температурных условиях (при температуре 20-25 0С эти микроорганизмы подвижны, а при 37 0С подвижность отсутствует), на наличие гемолиза. Патогенные штаммы листерий обладали гемолитическими свойствами.

Кроме того определение видовой идентификации штаммов микроорганизмов проводили на приборе VITEK MS («bioMerieux», Франция) согласно инструкции производителя оборудования (современный метод масс-спектрометрии).

Предварительно проводили пробоподготовку: суточную бактериальную культуру суспендировали в эппендорфе в 300 мкл деионизованной воды, далее прогревали в микротермостате при 95 0С в течение 25 минут, охлаждали и добавляли 900 мкл этилового спирта; пробы хорошо встряхивали и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 2 мин; полностью удаляли супернатант и подсушивали;

добавляли 25 мкл 70 % муравьиной кислоты и перемешивали пипетированием, далее инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут, добавляли 25 мкл N-ацетонитрила, перемешивали пипетированием и центрифугировали в течение 2 мин при 13000 об/мин. Подготовленные образцы наносили на слайды.

Для каждого вида микроорганизмов был сформирован характерный набор белков (биомаркеров), полученный на основе анализа не менее 50 масс-спектров этого вида, а каждый образец тщательно идентифицирован с помощью сиквенса 16S рРНК. Структурированная таким образом база данных позволяла быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы. Идентификация образца проводилась непосредственно в приборе. Масс-спектр сравнивался со спектрами из базы данных, и на основании сведений о массах характеристических белков происходила идентификация микроорганизмов.

Метод MALDI-TOF проводили на базе РНИМУ имени Н.И. Пирогова диссертантом при участии руководителя лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекции ФБУН МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского д.м.н Борисовой О.Ю.

Методы изолирования бактериофагов из окружающей среды Прямой метод выделения бактериофагов.

Исследуемую жидкость фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм, «Millipore»). Твердый исследуемый материал (образцы почвы, пищевые и рыбные продукты, оформленные испражнения) предварительно измельчали, эмульгировали, фильтровали через бумажный фильтр, а затем через бактериальный. Наличие фага в полученном фильтрате определяли по методу Отто или Грациа (см. ниже).

Выделение бактериофагов методом обогащения «без подсева»

Исследуемый материал засевали в пробирки с жидкой питательной средой, которая являлась наиболее полноценной для роста тест-культур данного вида, бактериофаги к которым мы хотели выделить. Посевы ставили в термостат при 37 0С на 18-20 часов, в случае выделения листериозного бактериофага ставили в термостат при 25-26 0С. По истечении указанного срока пробирки вынимали из термостата, центрифугировали, надосадок фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм). Полученные таким образом фильтраты испытывали на наличие в них бактериофагов к различным штаммам данного вида микроорганизмов по методикам, описанным ниже. Метод основан на создании благоприятных условий для размножения бактерий, которые находились в исследуемом материале и соответствующего выделяемого бактериофага.

Выделение бактериофагов методом обогащения с «подсевом»

Жидкий исследуемый материал непосредственно, а твердый после его подготовки (измельчение) засевали в МПБ. Одновременно с исследуемым материалом в питательную среду вносили 0,2-0,5 мл или полную бактериальную петлю суточной культуры бактерий, чувствтительных к выделяемому бактериофагу (не более 5-7 бактериальных штаммов в одну емкость).

Для контроля культуру бактерий, применяемую для обогащения, засевали в стерильную питательную среду. Флаконы с посевами ставили в термостат при 37 0 С, а для листерий при 25-26 0С на 18-20 часов. После инкубации содержимое флаконов фильтровали через бактериальный фильтр. Полученный фильтрат исследовали на наличие бактериофага к бактериальным культурам, взятым для обогащения. Сущность данного метода заключается в предварительном обогащении исследуемого материала клетками того микроорганизма, бактериофаг к которому мы искали. Бактерии размножались в питательной среде, и вместе с ними увеличивалось количество бактериофага. Обнаружить бактериофаг в полученном фильтрате можно в жидких или на плотных питательных средах.

Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде:

Две пробирки с МПБ засевали одной и той же культурой микроорганизма, гомологичной искомому фагу. Одновременно в одну из пробирок вносили исследуемый фильтрат. Вторая пробирка, содержащая питательную среду и засеянная культурой микроорганизма, являлась контролем. Обе пробирки ставили в термостат при 37 0С. Учитывали результаты через 4, 6, 18 и 24 часа. Учет результатов (по Уварову) следующий [68]:

1. Содержимое первой пробирки абсолютно прозрачно, а в контроле – помутнение питательной среды. Полученные данные говорили о нахождении в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности.

2. В опытной пробирке помутнение среды менее выражено по сравнению с контрольной. Это свидетельствовало о нахождении в исследуемом фильтрате бактериофага средней активности.

3. При одинаковом помутнении в обеих пробирках для окончательного заключения о наличии или отсутствии бактериофага производили дополнительные исследования: высев на плотную питательную среду содержимого обеих пробирок. Для этого по 0,1 мл образцов капали стерильной пипеткой на чашки Петри с МПА, растирали шпателем, чтобы получить сплошной рост микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 37 0С 24 часа. Посев из контрольной емкости давал сплошной рост микроорганизмов на чашке Петри. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста бактерий появлялись стерильные пятна – колонии бактериофага.

Обнаружение бактериофага на плотной питательной среде по методу Отто [68]:

1,5 % мясопептонный агар разливали в чашки Петри. После застывания чашки с питательной средой засевали 16-18- часовой бульонной культурой, чувствительной к искомому фагу. Для этого 2-3 капли культуры наносили на чашку и растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась, и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили исследуемый фильтрат.

После того, как жидкость впиталась в среду, чашки перевертывали вверх дном и ставили в термостат при 37 0С на 18-24 часа. После инкубации производили учет результатов: полное отсутствие культуры в месте попадания капли (пятно лизиса) говорило о том, что в исследуемом фильтрате находится бактериофаг, полностью лизирующий бактериальную культуру, появление в этом участке мелких стерильных пятен – колоний бактериофага - о не полном лизисе культуры или о том, что концентрация бактериофага в искомом фильтрате не достаточно высока.

Определение спектра литической активности бактериофагов Спектр литической активности является одной их важных характеристик бактериофагов.

Определение спектра литической активности проводили:

- методом нанесения фага(spot-тест) на газон бактериальной культуры. В чашки Петри разливали 1,5 % МПА. После застывания и подсушивания агара на чашки Петри наносили по 0,1 мл 16-18 часовой бульонной культуры микроорганизмов, растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили бактериофаги.

После того, как жидкость впиталась в среду, чашки перевертывали вверх дном и ставили в термостат при 37 0С на 18-24 часа. На следующие сутки производили учет результатов – наличие или отсутствие «пятна лизиса».

- с учетом эффективности фаговой инфекции: по 10 мкл из последовательных десятикратных разведений фаголизата наносили на газон бактериальной культуры в полужидком (0,7 %) агаре. Учет производили после инкубации чашек при 37 0С или 25-26 С (в случае листериозного бактериофага) в течение ночи.

Бактериальные штаммы, на которых негативные зоны наблюдались в нескольких разведениях, считались чувствительными. Штаммы, на которых зоны лизиса наблюдали при нанесении нативного препарата (не разведенного), считали условно чувствительными. Штаммы, где зоны лизиса отсутствовали, считали резистентными.

Определение литической активности бактериофагов Также одной из характеристик бактериофагов является определение литической активности или титра. Титр бактериофага – это количество активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемой жидкости, или величина наибольшего разведения исследуемой жидкости, при котором бактериофаг проявляет свои литическое действие. Полученную величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает кратность разведения фага.

Наибольшее распространение для определения литической активности бактериофагов получили способ титрования в жидкой среде, предложенный Аппельманом, и метод агаровых слоев Грациа [68].

Метод Аппельмана Метод основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в питательный бульон, засеянный одной и той же дозой бактериальной культуры, чувствительной к данному фагу [68]. Для этого брали 10 пробирок с 4,5 мл МПБ в каждой. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого фага, содержимое пробирки тщательно перемешивали. Из этой пробирки 0,5 мл переносили в следующую и т.д. Таким путем готовили ряд 10-кратных разведений фага (10-1-10В каждую пробирку приготовленного ряда вносили по 0,1- 0,2 мл 18-20-ти часовой бульонной культуры, чувствительной к данному фагу. Для контроля брали 2 пробирки с МПБ, в одну из которых вносили 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку 0,1-0,2 мл микробной культуры (контроль культуры).

Все пробирки помещали в термостат при 37 0С на 4-5 ч или комнатной температуре на 24 часа. В случае проверки активности листериозного бактериофага раститрованный ряд пробирок оставляли при комнатной температуре. Титр фага определяли по наибольшему разведению препарата, в котором обнаруживалась литическая активность.

Метод Грациа (метод агаровых слоев) Этот метод основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.

Накануне опыта готовили питательные среды. В чашки Петри разливали 1,5 % МПА по 25 мл среды. Среду в чашках подсушивали в термостате до полного удаления конденсата. Агар должен быть абсолютно сухим, так как даже незначительное увлажнение может изменить количественные показатели содержания частиц фага в исследуемой жидкости. Брали 0,7 % МПА в пробирках по 2,5 мл в каждой, расплавляли его на водяной бане и охлаждали до 48-50 оС. Из жидкости, содержащей титруемый бактериофаг, готовили в пробирках ряд последовательных разведений (как в методе Аппельмана). Затем в пробирку с 0,7% МПА вносили 1 мл соответствующего разведения исследуемого бактериофага, слегка перемешивали, добавляли 0,1-0,2 мл 1-миллиардной взвеси культуры, чувствительной к бактериофагу, опять слегка перемешивали и содержимое пробирки выливали в чашку с МПА (вторым слоем). Смесь равномерно распределяли по поверхности агара и оставляли чашку в горизонтальном положении на 40-50 мин, то есть до полного охлаждения агара.

Затем чашки слегка подсушивали и инкубировали в термостате при 37 0С в течение 18-20 ч. На фоне равномерного роста микробов отмечались пятна, где рост отсутствовал (полный лизис). При большом количестве бактериофага наступал лизис микроорганизмов на всей поверхности агара. Когда количество фаговых частиц невелико, то участков лизиса мало и можно рассчитать количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) фага в 1 мл препарата, допуская, что каждый участок лизиса образовывался в результате действия одной частицы фага. Допустим, что на агаре в чашке имелось 30 пятен лизиса (колоний фага) при исследовании фильтрата в разведении 10-7. Следовательно, титр фага будет равен 310-8, т.е. в 1 мл фага содержится 3108 БОЕ.

Методы оценки стабильности бактериофагов к агрессивным факторам внешней среды Температурная устойчивость бактериофагов Степень устойчивости бактериофагов к воздействию высокой температуры проводили следующим способом: исследуемые бактериофаги разводили 1:10 в МПБ (рН 7,2-7,4), для того, чтобы получить бактериофаг определенной концентрации. Затем пробирки с фагами прогревали на водяной бане и термостате «Гном» в диапазоне измеряемой температуры 50 – 85 0С с интервалом 5 0С в течение 45 минут. Параллельно титровали контроль – фаголизат без прогревания.

Количество негативных колоний (титр бактериофага) определяли методом агаровых слоев по Грациа.

Устойчивость бактериофагов к воздействию хлороформа Из данных литературы известно, что большинство бактериофагов устойчивы к хлороформу [130, 34, 55, 58]. Поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных микроорганизмов. Определение чувствительности бактериофагов к данному химическому веществу проводили методом обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном перемешивании. Для этого брали по 3 пробирки с 4,5 мл МПБ, в каждую вносили по 0,2 мл испытываемого бактериофага и 0,2 мл бактериальной культуры, чувствительной к данному фагу (индикаторная культура). Пробирки культивировали при 37 0С 18-20 часов. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,5 мл хлороформа. Время экспозиции с хлороформом при непрерывном встряхивании соответственно: 1-ая пробирка – 15 минут; 2-ая пробирка – 30 минут; 3-ья пробирка – 45 минут. Полученную смесь откручивали на центрифуге 30 минут при 5000 - 6000 об/мин. Собирали супернатант. Активность бактериофага определяли по методу Грациа. Контролем служили бактериофаги, полученные с использованием бактериальных фильтров.

Устойчивость бактериофагов к действию рН Устойчивость бактериофагов к воздействию разных значений рН проводили, пользуясь классическими методиками Д.М. Гольдфарба, М. Адамса [130, 34, 55].

Была изучена устойчивость фаговых взвесей в безбелковой среде при разных значениях рН. Использовали 0,1 М цитратный буфер рН – 3,61; 0,1 М цитратный буфер рН 5,2; 0,1 М Na – карбонатный буфер рН - 9,6 и фаговый SM буфер рН – 8,0.

К 0,9 мл буфера добавляли 0,1 мл испытуемого фаголизата. Инкубировали 15 мин, 1 час при комнатной температуре; 24 часа, 10 суток и 30 суток при хранении в холодильнике. После экспозиции отбирали пробы по 0,1 мл и вносили в пробирки с 0,9 мл фагового SM буфера для нейтрализации рН. Перемешивали и определяли титр бактериофагов методом Грациа.

Методы определения экзо- и эндотоксинов в полученных фаголизатах В процессе разрушения клеточных стенок бактериофагом освобождаются липополисахариды у грамотрицательных бактерий и белки, обладающие токсигенными свойствами грамположительных бактерий (например, белки А, В, С, D, Е у золотистого стафилококка). Они являются высоко пирогенными веществами, температуростабильными, а малые размеры их молекул позволяют легко проходить через мембраны, используемые для стерилизации растворов (0,22 мкм).

Метод определения эндотоксинов В процессе лизиса бактериофагами грамотрицательных бактерий их фаголизаты содержат большое количество эндотоксинов. Пирогенность определяли по фармакопейной методике (ГФ XI) с помощью биологического метода, основанного на изменении температуры тела кролика после введения испытуемых препаратов. Но этот метод имеет ряд недостатков. С 1980 г.

фармакопея США XX включила новый метод определения эндотоксинов с помощью реакции гелирования лизата амебоцитов крови мечехвоста Limulus В основе этого теста лежит способность лизата polyphemus (ЛАЛ-тест).

амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. Ведущей компанией в России на сегодняшний день, занимающейся проблемами, связанными с ЛАЛ-тестом, является научнопроизводственная организация «ЛАЛ-центр». Определение эндотоксина проводили на базе данной лаборатории, результаты учитывали самостоятельно.

Метод определения экзотоксинов При культивировании S.aureus выделяет экзотоксины. По своей химической природе - это белки, обладающие энтеротоксигенными свойствами Известно несколько серологических типов энтеротоксинов (SE), обозначаемых А, В, С1, С2, С3, D и Е. При определении количественного содержания экзотоксинов в фаголизате мы использовали сэндвич-иммуноферментный анализ для идентификации стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, D, Е (пользовались тест-системой RIDASCREEN® SET А, В, С, D, Е, производства R-Biopharm AG, Германия).

Для подтверждения отсутствия веротоксинов в конечном продукте использовали иммунохроматографический экспресс-тест для качественного in vitro определения токсинов. Этот тест также разработан фирмой R-Biopharm AG (Германия) – RIDARQWICK Verotoxin/ O157 Combi. Он основан на связи специфичных антител, нанесенных на тест-кассету с целевыми антигенами, если такие присутствуют в образце продукта или искомом материале. Данный тест был апробирован в институте гигиены университета г. Мюнстера, который подтвердил его высокую чувствительность (RIDARQWICK Verotoxin/ O157 №2203doc 2/15/2010 2:13:00 РМ). Определение проводили в соответствии с инструкцией производителя (http://www.analytica.ru/instructions/ bespribornaya_express_diag/RBiopharm/RIDA_QUICK_Verotoxin_O157_N2203.pdf).

Молекулярно-генетические методы исследования В настоящее время в связи с активным развитием молекулярно-генетических методов исследования все шире стало их использование для подтверждения видовой принадлежности различных микроорганизмов к определенным таксонам, а также идентификации и характеристики микроорганизмов. В диссертационной работе были проведены: полимеразная цепная реакция (ПЦР) для идентификации штамма E. coli K12 C600; ПЦР для подтверждения отсутствия генов токсичности в геномах бактериофагов; анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для характеристики штаммов бактериофагов; полногеномное секвенирование штаммов бактериофагов с использованием методов высокопроизводительного секвенирования и секвенирования по Сэнгеру.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР для идентификации штамма E. coli K12 C600 Бактериальную ДНК выделяли методом кипячения (Маниатис Т., 1984 г.) [72] из 24-часовой культуры штамма E. coli K12 C600, выращенной в мясопептонном бульоне. Для этого с помощью одноразовой инокуляционной петли культуру объемом 1 мкл суспензировали в 150 мкл деионизированной воды и инкубировали 20 минут при 95 °С, после чего центрифугировали при 9659 g в течение 5 минут.

Выявление штаммоспецифичного фрагмента гена orf264 осуществляли при помощи полимеразной цепной реакции с использованием известных пар праймеров [179], приведенных в таблице 5. Реакционная смесь содержала 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 1 Ед. Taq DNA полимеразы (производства «Fermentas», Литва), 1 мкл ДНК; использовали по 10 пмоль каждого праймера. Окончательный объем реакционной смеси составлял 50 мкл.

Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Условия амплификации:

94 0С – 3 мин (1 цикл); 94 0С – 30 сек, 60 0С – 30 сек, 72 0С – 1,5 мин (35 циклов);

72 0С – 10 мин.

Таблица 5. Пары праймеров, использованные для идентификации штамма E.

coli K12 C600 Название Олигонуклеотидная последовательность, Размер ампликона, праймера 5-3 п.н.

K12IS-L cgc gat gga aga tgc tct gta

–  –  –

Детекцию результата амплификации проводили путем постановки горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле при 160 V в течение 1 часа в буфере TAE с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Результат реакции учитывали с помощью гельдокументирующей системы Vilber Lourmat Quantum ST4-1100/26M.

Молекулярно-генетические исследования бактериофагов Выделение ДНК бактериофагов Для подготовки фаговых вирионов к ПЦР, полногеномному секвенированию и секвенированию по Сэнгеру проводили микрофильтрацию фаголизата через стерилизующий фильтр (0,22мкм), после чего проводили ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия [206]. ДНК бактериофагов выделяли при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США) согласно протоколу производителя.

ПЦР для детекции генов бактериальных факторов вирулентности в геномах бактериофагов Выявление фрагментов генетических детерминант бактериальных факторов вирулентности осуществляли при помощи полимеразной цепной реакции с

–  –  –

Детекцию результата амплификации проводили путем постановки горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле при 160V в течение 1 часа в буфере TAE с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Результат реакции учитывали с помощью гельдокументирующей системы Vilber Lourmat Quantum ST4-1100/26M.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Для проведения ПДРФ анализа геномов бактериофагов использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: HindIII, EcoRI, EcoRV, SmiI, BglII, BcuI производства «Fermentas» (Литва).

Полногеномное секвенирование В диссертационной работе для молекулярно-генетической характеристики производственно-перспективных штаммов бактериофагов проводили их полногеномное секвенирование. Для получения полногеномных нуклеотидных последовательностей бактериофагов использовали один из методов высокопроизводительного секвенирования sequencing; в (high-throughput англоязычной литературе чаще употребляется термин «next generation sequencing», сокращенно NGS) – полупроводниковое секвенирование (Ion Torrent Sequencing).

Метод полупроводникового секвенирования основан на связи химической и цифровой информации (рН секвенирование). Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что можно детектировать, и таким образом различать нуклеотиды.

Использованный метод NGS включал в себя следующие этапы (рисунок 1):

1. тотальное выделение фаговой ДНК;

2. создание библиотеки случайных фрагментов (фрагментация ДНК, выбор фракции фрагментов необходимой длины и лигирование адаптерных последовательностей);

3. подготовка субстрата для секвенирования;

4. непосредственно секвенирование;

5. анализ данных методами биоинформатики;

Данный метод позволяет одновременно секвенировать геномы нескольких бактериофагов.

–  –  –

Рисунок 1 Этапы полупроводникового секвенирования Затем готовили штрих-кодированные библиотеки случайных фрагментов для секвенирования при помощи набора Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Life Technologies, США). Субстрат для секвенирования получали из подготовленных библиотек при помощи набора Ion PGM Template OT 200 Kit (Life Technologies, США) с использованием устройства Ion OneTouch (Life Technologies, США).

Секвенирование образцов осуществляли на секвенаторе второго поколения Ion Torrent PGM (Life Technologies, США) с использованием чипов Ion 314 Chip (Life Technologies, США). Данные этапы проводили согласно протоколу производителя.

В ряде случаев необходимо проведение ресеквенирования некоторых участков генома. Мы использовали секвенирование по методу Сэнгера для ресеквенирования потенциального гена эндолизина колифага V18, имеющего низкую глубину покрытия после высокопроизводительного секвенирования.

Секвенирование проводили с помощью ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit на секвенаторе ABI PRISM (Applied Biosystems, США). При секвенировании использовали праймеры (таблица 7) в концентрации 3,2 пкмоль/мкл и готовые ампликоны (с концентрацией ДНК не менее 10 мкг/мкл), полученные при постановке ПЦР для выявления специфических фрагментов гена эндолизина. Праймеры, используемые для получения ампликонов и секвенирования, представлены в таблице 7.

Таблица 7. Праймеры для ресеквенирования гена эндолизина колифага V18.

Название Олигонуклеотидная праймера последовательность, 5-3 ec2_en1_fw gga agg ttt agt agg taa cgg ec2_en1_rw gcc aac aga aaa tct ttc atg g ec2_en2_fw atg aaa ctt gat aaa aat gtt caa cg ec2_en2_rw gaa cgg cat tta tgg ata gc Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, преобразовывали в формат FASTA и использовали для сборки гена эндолизина бактериофага V18.

Биоинформационный анализ В ходе биоинформационного анализа проводили фильтрацию качества прочтений. Для сборки фаговых геномов de-novo использовали риды с качеством прочтения нуклеотидов не ниже Q20 и длинной не менее 50 оснований. Сборку геномов осуществляли с использованием программного обеспечения Newbler (Roche/454 GS-FLX). Сравнение собранных геномов бактериофагов с геномами известных аннотированных бактериофагов проводили при помощи алгоритма и баз данных нуклеотидных blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) последовательностей (Национальный центр биотехнологической NCBI информации, США). Визуализацию глубины покрытия и выравнивания собранных нами геномов с известными проводили с использованием программного обеспечения BRIG [131].

Поиск открытых рамок считывания с целью аннотирования геномов проводили при помощи программного обеспечения UGENE (Унипро, Россия).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНУРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор с.-х. наук, профессор КАХАРОВ К.Х. Душанбе, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ...»

«ПОЕДИНОК НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА УДК 602.3:582.282/284:57.086.83]:[681.7.069.24+577.34 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СЪЕДОБНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ МАКРОМИЦЕТОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук Научный консультант Дудка Ирина...»

«Жукова Дарья Григорьевна ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ У БОЛЬНЫХ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В УСЛОВИЯХ МНОГОПРОФИЛЬНОГО СТАЦИОНАРА 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.