WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая ...»

-- [ Страница 5 ] --

Таким образом, под влиянием тулярина или КНК происходит неспецифическое усиление экспрессии CD138 маркера на поверхности моноцитов, но не лимфоцитов.

4.1.2.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD86 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов Задачи исследования – проанализировать изменение экспрессии рецепторов CD86 на поверхности В лимфоцитов, выделенных от невакцинированных и вакцинированных живой туляремийной вакциной доноров, под влиянием тулярина.

Как видно из рисунка 22 у большинства доноров, как не вакцинированных, так и вакцинированных туляремийной живой вакциной, наблюдалось усиление экспрессии CD86 рецептора на поверхности В лимфоцитов под влиянием тулярина.

Достоверных различий в увеличении CD19+CD86+ под влиянием тулярина между группами не вакцинированных и вакцинированных туляремийной живой вакциной доноров не выявили, хотя в крови у вакцинированных доноров отмечалась тенденция к более выраженной экспрессии CD86 маркера под влиянием тулярина.

Таким образом, в ответ на добавление в среду тулярина наблюдали усиление CD86 ко-стимулирующего рецептора на поверхности В лимфоцитов, полученных как от невакцинированных доноров, так и от людей иммунизированных живой туляремийной вакциной.

А Б

А – полученны от здоровых невакцинированных доноров и Б – иммунизированных туляремийной живой вакциной людей, после инкубирования клеток в течение 24 ч в среде (светлые маркеры) или в среде с тулярином (темный маркер). Напротив делений оси 1 указаны проценты. На каждой оси двумя маркерами отображены индивидуальные данные, полученные от одного донора.

Рисунок 22 – Процентное содержание субпопуляции CD86+ В лимфоцитов

4.2. Оценка результатов реакции лейкоцитолиза с тулярином Мы проанализировали результаты реакции лейкоцитолиза у пяти доноров невакцинированных и 30 вакцинированных против туляремии людей. У всех контрольных доноров реакция лейкоцитолиза была отрицательной (таблица 10).

В группе вакцинированных против туляремии людей только у 10 из 30 вакцинированных доноров реакция лейкоцитолиза была положительной (таблица 10). Среднее значение положительных реакций у вакцинированных против туляремии доноров составило (32,74±6,21) %.

Таким образом, на 28 сутки после иммунизации сотрудников вакциной туляремийной живой сухой реакция лейкоцитолиза с тулярином была положительной и резко положительной у 30 % доноров.

–  –  –

4.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии поверхностных маркеров Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей, под влиянием тулярина Формирование клеточного противотуляремийного иммунного ответа у человека можно выявить раньше появления специфических антител [114]. Уже через две недели после вакцинации у большинства доноров, иммунизированных живой туляремийной вакциной, выявляется пролиферативная активность лимфоцитов к F. tularensis [366]. Т-клеточный ответ выявляется у доноров в течение длительного периода после туляремийной инфекции или вакцинации (до 25 лет), когда уже не детектируются антитела к F. tularensis [151]. Т лимфоциты памяти при повторном взаимодействии с антигенами возбудителя туляремии начинают активно пролиферировать, преобразовываясь в эффекторные клетки, активно продуцирующие цитокины, такие, как ИФН- [343] и ФНО- [392].

ИФН- и ФНО-, которые в свою очередь, подавляют способность бактерий F. tularensis выживать и размножаться в макрофагах [142].

Учитывая, что в формировании протективного иммунитета против туляремии главную роль играет специфические клеточные реакции, мы пытались выявить специфическую перестройку поверхностных маркеров лимфоцитов, отражающих функциональное состояние клетки. В экспериментах сравнивали изменение уровня синтеза цитокинов и экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов, выделенных от людей, невакцинированных и вакцинированных живой туляремийной вакциной, под влиянием тулярина, КНК F. tularensis.

4.3.1. Сравнительная оценка изменений активации и численности CD45RO+ субпопуляции Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis Задача исследования – сравнить изменение экспрессии СD45RO и HLA-DR рецепторных молекул на поверхности Т лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии и невакцинированных доноров, под влиянием антигенов F. tularensis.

На рисунке 23 представлено изменение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов людей, неиммунных и иммунизированных живой туляремийной вакциной в ответ на активацию клеток in vitro тулярином и КНК в течение 48 ч. Субпопуляции СD3+СD4+СD45RO+ и СD3+СD8+СD45RO+ являются минорными и в крови здоровых доноров не превышают 1-2 % [93].

А Б Рисунок 23 – Изменение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов людей, не иммунных (А) и иммунизированных живой туляремийной вакциной (Б) в ответ на активацию клеток in vitro тулярином в течение 48 ч У контрольных доноров содержание СD45RO+ субпопуляций Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов после инкубирования клеток крови в питательной среде не превышало 1,2 % как в присутствии тулярина и КНК, так и без них. У доноров, вакцинированных живой туляремийной вакциной, через 1 месяц после

–  –  –

Рисунок 24 – Процентное содержание Т хелеперов и цитотоксических лимфоцитов памяти, экспрессирующих HLA-DR рецепторную молекулу Присутствие тулярина в питательной среде в течение 24 ч не приводило к усилению экспрессии HLA-DR рецептора на поверхности СD45RO+ Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, полученных как от невакцинированных, так и от вакцинированных доноров.

В субпопуляции Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов содержание СD45RO+HLA-DR+ лимфоцитов, полученных от вакцинированных доноров составило 4,58 и 3,89 %, от невакцинированных – 3,45 и 2,56 %, соответственно. В популяции лимфоцитов, полученных от вакцинированных, но не контрольных доноров, мы выявили увеличение СD3+СD4+СD45RO+HLA-DR+ клеток под влиянием тулярина через 48 ч инкубирования клеток (12,04 %).

Таким образом, под влиянием тулярина мы выявили специфическое усиление экспрессии HLA-DR рецептора на поверхности Т хелперов (CD3+CD4+) памяти (CD45RО+).

4.3.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 и HLA-DR рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов Задачи исследования – сравнить изменение экспрессии раннего маркера активации CD69 и позднего маркера активации HLA-DR на поверхности Т лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии и невакцинированных доноров, под влиянием антигенов F. tularensis.

Через 24 ч инкубирования в полной питательной среде (рисунок 25) лимфоцитов крови, полученных от вакцинированных живой туляремийной CD4+ вакциной и невакцинированных доноров, процентное содержание Т лимфоцитов (Т хелперов), экспрессирующих CD69 маркер, составило (0,95±0,37) %, а CD8+CD69+ Т-лимфоцитов – (1,23±0,45) %.

Количество CD8+CD69+ Т лимфоцитов под влиянием тулярина или КНК у части доноров ранее не вакцинированных против туляремии не приводило к достоверным изменениям содержания субпопуляции. В 40 % случаев количество CD8+CD69+ Т лимфоцитов увеличивалось в присутствии антигенов туляермийного микроба до (10,32±4,65) %.

В условиях стимуляции in vitro тулярином клеток крови, полученных от ранее не вакцинированных против туляремии людей процент Т лимфоцитов, экспрессирующих CD69, не увеличивался и составил (1,87±0,32) %.

–  –  –

Активация клеток крови, полученной от вакцинированных против туляремии доноров, тулярином или КНК приводила к усилению экспрессии поверхностного маркера CD69 ((12,12±3,34) %) на поверхности Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов ((15,67±8,34) %).

На рисунке 26 представлено изменение экспрессии рецептора HLA-DR на поверхности Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов, выделенных от вакцинированных и не вакцинированных живой туляремийной вакциной доноров, после инкубирования клеток в течение 48 ч без и в присутствии тулярина.

СD3+СD8+HLA-DR+ СD3+СD4+HLA-DR+ Субпопуляции и являются минорными и в крови здоровых доноров не превышают 1-2 % [30]. У контрольных доноров содержание HLA-DR+ субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов после инкубирования клеток крови в питательной среде составило (1,04±0,07) и (1,1 ± 0,45) %, соответственно. У доноров, вакцинированных живой туляремийной вакциной, через 1 месяц после вакцинации содержание субпопуляций Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов позитивных по рецепторам HLA-DR составляло(1,04±0,99) и (1,02±2,40) %, соответственно.

Рисунок 26 – Изменение процентного содержания HLA-DR-позитивных субпопуляций Т лимфоцитов, полученных от доноров, не иммунных (А) и иммунизированных живой туляремийной вакциной (Б) в ответ на активацию клеток in vitro тулярином в течение 48 ч Под влиянием тулярина отмечалось усиление экспрессии HLA-DR рецепторов только на поверхности Т хелперов ((3,97±0,78) %), но не цитотоксических лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии доноров, но не от контрольной группы людей.

4.3.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD107b и CD95 рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т-лимфоцитов Задачи исследования – сравнить влияние антигенов F. tularensis на изменение процентного содержания цитотоксических лимфоцитов, экспрессирующих CD107b рецептор, и Т хелперов, экспрессирующих CD95 рецептор, в крови, полученной от вакцинированных против туляремии и невакцинированных доноров.

Анализ влияния тулярина на экспрессию CD107b маркера на поверхности цитотоксических лимфоцитов не выявил достоверных изменений в клетках, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной доноров (рисунок 27).

Рисунок 27 – Изменение процентного содержания субпопуляций CD3+CD8+CD107b+ крови, полученной от людей, неиммунных и иммунизированных живой туляремийной вакциной в ответ на активацию клеток in vitro тулярином или КНК F. tularensis в течение 24 ч Мы проанализировали влияние тулярина in vitro на изменение экспрессии CD95 рецептора на поверхности Т хелперов, выделенных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной доноров (рисунок 28).

А Б А – полученны от здоровых невакцинированных доноров и Б – иммунизированны живой туляремийной вакциной людей, после инкубирования клеток в течение 24 ч в среде (светлые линии), в среде с тулярином (темный маркер).

Напротив делений оси 1 указаны проценты. На каждой оси двумя маркерами отображены индивидуальные данные, полученные от одного донора.

Рисунок 28 – Процентное содержание субпопуляции Т хелперов, экспрессирующих CD95+ Было обнаружено спонтанное усиление экспрессии CD95 рецептора на поверхности Т хелперов, полученных от вакцинированных доноров по сравнению с лимфоцитами, полученными от невакцинированных людей. Под влиянием тулярина процентное содержание CD3+CD4+CD95+ субпопуляции увеличивалось

–  –  –

У вакцинируемых впервые людей уровень пролиферативной активности под влиянием антигенов не изменялся под влиянием антигенов туляремийного микроба. Под влиянием УЗД F. tularensis в группе вакцинированных против туляремии доноров индекс стимуляции увеличивался до (3,59±1,16).

1 Индекс стимуляции – соотношение процентного содержания пролиферирующих клеток активированных антигеном к процентному содержанию пролиферирующих клеток не активированных антигеном

–  –  –

Как можно заключить из представленных данных под влиянием КНК и тулярина специфически усиливают пролиферативную активность преимущественно В лимфоциты, полученные от вакцинированных F.tularensis 15 НИИЭГ доноров.

4.5. Оценка эффекторной активности лимфоцитов 4.5.1. Оценка синтеза цитокинов лейкоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro Для оценки эффекторной активности лимфоцитов мы проанализировали изменение синтеза ИЛ-4, ИФН- и ИЛ-17 лимфоцитами, полученными от вакцинированных против туляремии людей и невакцинированных доноров, в ответ на стимуляцию их антигенами туляремийного микроба.

Как видно из представленных в таблице 14 данных через 48 ч инкубации в среде без антигенов в культуральной жидкости лимфоцитов, полученных как от иммунных, так и от контрольных доноров, не выявлялись ИФН-, ИЛ-17 и ИЛ-4.

–  –  –

Под влиянием КНК F. tularensis количество ИФН- резко увеличивалось в культуре лимфоцитов, полученных от людей, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ, но не от контрольных доноров. Под влиянием тулярина концентрация ИФН- незначительно увеличивалась в культуре лимфоцитов, полученных от контрольных доноров (50±25,21) пкг/мл, и резко увеличивалась (более 1000 пкг/мл) – в культуре лимфоцитов, полученных от доноров иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ.

ИЛ-17 увеличивался под влиянием тулярина и КНК только в культуре лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии людей. Наличие ИЛ-4 в культуральной жидкости лимфоцитов как в присутствии антигенов туляремийного микроба, так и без не детектировалось.

4.5.2. Уровень синтеза ИФН- и ФНО- Т лимфоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro Мы проанализировали активацию Т лимфоцитов, полученных от иммунизированных против туляремии и неиммунизированных доноров, под влиянием тулярина или КНК F. tularensis в реакции in vitro (рисунок 29).

–  –  –

Рисунок 29 – Примеры цитофлюрограмм, отражающих изменение процентного содержания субпопуляций CD3+ИФН-+ (А-1, Б-1, В-1) и CD3+CD69+ИФН-+ (А-2, Б-2, В-2), полученных от иммунизированных живой туляремийной вакциной (Б, В) и невакцинированных доноров (А) под влиянием тулярина (А, Б) и КНК (В) Количество Т лимфоцитов, синтезирующих ИФН- в среде, колебалось в пределах (2,35±0,98) %. Добавление тулярина или КНК к клеткам крови, полученным от невакцинированных доноров не приводило к достоверному увеличению Т лимфоцитов, синтезирующих ИФН-. Т лимфоциты, полученные от иммунизированных живой туляремийной вакциной доноров, усиливали синтез ИФН- под влиянием тулярина и КНК. Процентное содержание CD3+ИФН-+ лимфоцитов под влиянием тулярина и КНК увеличивалось до (10±3,45) % и (20,56±7,84) %, соответственно.

На поверхности антиген-специфически стимулированных Т-клеток появляется CD69 рецептор, который работает как ко-стимулирующая молекула, усиливающая Т-клеточную активацию и эффекторную активность клетки [369].

CD69+ Анализ Т-лимфоцитов показал, что усиление синтеза ИФНТ лимфоцитами происходит главным образом за счет субпопуляции активированных лимфоцитов CD3+CD69+ (рисунок 29).

Таким образом под влиянием тулярина и КНК происходит специфическое усиление синтеза ИФН- Т лимфоцитами, полученными от иммунизированных против туляремии доноров.

Обсуждение Для профилактики туляремии в России используется живая туляремийная вакцина (штамм F. tularensis 15 НИИЭГ). Иммунизация данной вакциной приводит к формированию у людей длительного протективного иммунитета, аналогичного постинфекционному [176, 259]. Ревакцинацию проводят через пять лет при отсутствии противотуляремийного иммунитета. В противном случае попав в организм, микробы вакцинного штамма F. tularensis будут полностью элиминированы без формирования напряженного противотуляремийного иммунитета [150]. Поэтому оценка противотуляремийного иммунитета необходима как после, так и перед проведением ревакцинации.

В настоящее время о наличии противотуляремийного иммунитета судят по уровню антител в сыворотке крови людей к ЛПС F. tularensis. Однако протективный иммунитет против туляремии обеспечивается в первую очередь за счет специфических реакций клеточного звена иммунитета. В клинической практике описаны случаи, когда в крови пациентов, заболевших туляремийной инфекцией, не выявлялись специфические антитела на протяжении всего заболевания [213, 250]. Поэтому при оценке противотуляремийного иммунитета должен выявляться не только гуморальный, но и клеточный иммунитет к возбудителю туляремии.

В наших исследованиях в крови доноров мы выявляли антитела к антигенам F. tularensis и оценивали специфические клеточные реакции в системе in vitro.

Результаты экспериментов показали, что после иммунизации живой туляремийной вакциной у 80 % людей в организме синтезируются антитела только к ЛПС, у 2 % – только к белкам различной молекулярной массы и у 12 % людей синтезируются антитела к ЛПС и белкам одновременно.

По всей видимости, при отсутствии антител к ЛПС F. tularensis в сыворотке крови вакцинированного против туляремии донора необходимо проводить дополнительные исследования биоматериала на выявление антител к белковым компонентам F. tularensis.

Наши дальнейшие исследования были направлены на поиски маркеров клеток отражающих специфическую активацию лимфоцитов в ответ на рестимуляцию антигенами F. tularensis. Синтезу антител предшествует активация В лимфоцитов с последующей их дифференцировкой. Одним из маркеров, экспрессирующимся при усилении функциональной активности на поверхности В лимфоцитов является CD69 рецептор [26, 187]. Наши исследования показали, что под влиянием тулярина или КНК усиление экспрессии CD69 рецептора может происходить как на поверхности В лимфоцитов полученных как от контрольных, так и от иммунизированных живой туляремийной вакциной доноров.

В процессе активации и дифференцировки В лимфоцитов на их поверхности появляется CD138 рецептор [410], который является специфическим маркером дифференцированных плазматических клеток [205]. Дифференцировка В лимфоцитов в CD138-позитивные клетки происходит под влиянием цитокинов ИЛ-6 [260], ИЛ-21 [129] и ИФН- [212, 415]. Экспрессия СD138 рецептора, который также относится к синдекану-1, свидетельствует об усилении пролиферативной активности лимфоцитов.

В наших исследованиях на 30 сутки после иммунизации людей живой туляремийной вакциной мы не обнаружили повышенного количества плазматических клеток в крови. В системе in vitro под влиянием антигенов туляремийного микроба количество CD138-позитивных В лимфоцитов не увеличивалось.

CD138 экспрессируется не только на плазматических клетках [376], но также и на поверхности активированных моноцитов [206]. Мы выявили, что происходит неспецифическое усиление экспрессии CD138 рецептора на поверхности моноцитов уже через 24 ч инкубирования клеток крови под влиянием тулярина, но не КНК F. tularensis. КНК представляет собой смесь антигенов поверхностных и внутриклеточных, в то время, как тулярин представлен в основном поверхностными структурами бактериальной клетки.

Кроме продукции антител в процессе формирования иммунного ответа В лимфоциты выполняют также ряд других эффекторных и регуляторных функций, не зависящих от синтеза антител [170]. В частности В лимфоциты регулируют функциональную активность Т лимфоцитов, выступая в роли предоставляющих антиген клеток, несущих на поверхности ко-стимулирующие молекулы [277] и синтезирующих цитокины [85, 355, 384], способствуя пролиферации и проявлению эффекторной функции Т лимфоцитами. В лимфоциты в первую очередь участвуют в индукции пролиферации Т лимфоцитов, формируя, поддерживая и реактивируя Th1 и Th2 CD4+ Т лимфоциты памяти с участием антиген-специфического, но антитело-независимого механизма [196, 364, 384].

В лимфоциты выступают в качестве наиболее эффективных антигенпредставляющих клеток в случае малых концентраций антигена [233, 375].

При антигенной презентации и непосредственном контакте В и Т лимфоцита кроме взаимодействия антиген-специфического рецептора Т-клетки с фрагментом антигена и HLA-DR антигеном, необходимо чтобы маркер CD4 клетки-хелпера связался с HLA-DR антигеном В лимфоцита. Кроме того необходима дополнительная ко-стимуляция Т хелперов, которая происходит через молекулы CD28 этих клеток и CD80/CD86 молекул В лимфоцитов [29].

Таким образом, для активации и/или индукции пролиферации CD4+ Т лимфоцитов при первичном или вторичном иммунном ответе необходима экспрессия CD80 и CD86 ко-стимулирующих рецепторов на поверхности В лимфоцитов [277].

В наших исследованиях показано, что в крови, полученной как от вакцинированных против туляремии людей, так и от невакцинированных доноров, под влиянием тулярина увеличивается количество В лимфоцитов, экспрессирующих CD86 ко-стимулирующий рецептор, что позволяет предположить об инициации формирования иммунного ответа к антигенам туляремийного микроба с активацией Т лимфоцитов. Об этом свидетельствует также увеличение CD3+субпопуляции, экспрессирующей CD28 рецептор (лиганд рецептора CD86), под влиянием тулярина или КНК комплекса.

В настоящее время для выявления клеточного противотуляремийного иммунитета у людей в некоторых случаях используют накожную реакцию гиперчувствительности замедленного типа с тулярином [32]. Недостатком реакции с тулярином является развитие аллергических реакций и побочных эффектов у людей, контактировавших ранее с возбудителем туляремии или вакцинированных против туляремии (развития некроза в месте введения тулярина, ухудшение состояния пациентов) [30]. Кожная реакция с тулярином выявляет гиперчувствительность замедленного типа, обусловленную клеточным звеном иммунитета, в том числе Т лимфоцитами. Активацию Т лимфоцитов, полученных от иммунных людей, в ответ на тулярин можно выявить в реакциях in vitro. Одним из таких методов является реакция лейкоцитолиза с тулярином, хотя эта реакция отражает только цитотоксическую активность общего пула эффекторных клеток [32].

О наличии противотуляремийного иммунитета в соответствии с МУ 3.1.2007-05 можно судить по данным реакции лейкоцитолиза, которая является строго специфичной аллергической реакцией. Мы провели реакцию лейкоцитолиза с клетками крови, полученными от 30 иммунизированных живой туляремийной вакциной людей и пяти не вакцинированных доноров. Через 1 месяц после иммунизации доноров вакциной туляремийной живой сухой реакция лейкоцитолиза с тулярином была положительной и резко положительной у 30 % доноров. У остальных вакцинированных доноров и у всех контрольных доноров реакция лейкоцитолиза с тулярином была отрицательной. Таким образом, реакция лейкоцитолиза после вакцинации живой туляремийной вакциной может оставаться отрицательной. Возможно, такие результаты были получены в связи с периодической вакцинацией доноров (на протяжении 25-30 лет).

В наших исследованиях мы пытались выявить маркеры лимфоцитов, отражающих специфическую активацию клеточного противотуялремийного иммунитета. В формировании постинфекционного и поствакцинального противотуляремийного иммунитета ключевую роль играют Т лимфоциты памяти, включая CD4+ и CD8+ T-клетки. Т лимфоциты памяти отличаются от зрелых не иммунных Т лимфоцитов по экспрессии ряда мембранных молекул. В частности на клетках памяти экспрессируется значительное количество рецептора CD45RO.

Молекула CD45 – трансмембранная тирозинфосфатаза, состоящая из одной полипепетидной цепи [155]. Изоформа CD45RА экспрессируется на неимунных зрелых Т лимфоцитах, и на них CD45RА не ассоциирован в мембране ни с TCR, ни с ко-рецепторами. В иммунных Т лимфоцитах изоформа CD45RO ассоциирована с TCR и с ко-рецепторами и способствует существенному снижению (на два порядка и более) порога на активацию лимфоцита антигеном [45]. Т лимфоциты памяти нуждаются в меньшей степени, чем зрелые неиммунные лимфоциты в ко-стимулирующих воздействиях и поэтому легче выходят в продуктивную эффекторную фазу иммунного ответа. Экспрессия CD45RO ингибирует экспрессию других изоформ CD45 [408].

Наши исследования показали, что через месяц после иммунизации доноров живой туляремийной вакциной процентное содержание СD3+СD4+СD45RO+ популяции лимфоцитов в крови достоверно не отличалось от показателей контрольных доноров. Под влиянием тулярина не происходило достоверного увеличения СD3+СD4+СD45RO+ клеток в популяции лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии людей или неимунных доноров.

Решающее значение для формирования и поддержания специфических Т лимфоцитов памяти имеет CD69 рецепторная молекула. CD69 рецептор действует как молекула ко-стимуляции Т-клеточной активации и пролиферации [50]. Индукция CD69 на поверхности недавно активированных лимфоцитов осуществляется через механизм, опосредованный активацией р21ras. Усиление экспрессии CD69 на поверхности клеток ведет к увеличению продукции ИЛ-2, повышению внутриклеточного Ca2+ [187 ].

В наших исследованиях мы выявили, что под влиянием тулярина увеличивается количество CD4+CD69+ субпопуляций Т лимфоцитов, полученных только от вакцинированных против туляремии людей, но не от интактных доноров. Количество CD8+CD69+ Т лимфоцитов под влиянием тулярина или КНК увеличивалось во всех образцах, полученных от иммунизированных против туляремии людей и в 40 % случаев в образцах, полученных от доноров ранее не вакцинированных против туляремии.

CD69 рецептор является молекулой ранней активации, HLA-DR – маркер поздней активации клетки. HLA-DR принадлежит к молекулам гистосовместимости MHC II. Экспрессия HLA-DR характерна для В лимфоцитов, зрелых активированных Т лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и клетокпредшественниц. Экспрессия HLA-DR отражает позднюю и длительную активации клеток. Система HLA участвует в регуляции иммунного ответа [26].

HLA-DR участвует в Т-Т клеточных взаимодействиях в процессе созревания и активации Т-клеток [51, 66]. Уровень экспрессии HLA-DR на мембранах лимфоцитов зависит от функционального состояния клетки и регулируется глюкокортикоидами и ИФН- [13]. Данным антигенам принадлежит существенная роль в механизме ограничения иммунного ответа [51].

Мы выявили, что у вакцинированных против туляремии доноров под влиянием антигенов F. tularensis отмечалось специфическое усиление экспрессии HLA-DR рецептора только на поверхности Т хелперов (CD3+CD4+) памяти (CD45RО+). Это свидетельствует о наличии циркулирующих в крови лимфоцитов памяти, способных стремительно активироваться в ответ на рестимуляцию F. tularensis.

антигенами Усиление экспрессии HLA-DR на поверхности Т хелперов памяти, полученных от вакцинированных людей, в условиях активации клеток in vitro антигенами туляремийного микроба, свидетельствует об эффективном распознавании антигенов клеткой.

Мы также выявили, что у вакцинированных против туляремии доноров под влиянием антигенов F. tularensis отмечается ранняя активация Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, и поздняя активация Т хелперов. У доноров, не вакцинированных против туляремии, под влиянием антигенов F. tularensis ранняя активация Т-лимфоцитов либо вообще отсутствует, либо активируются цитотоксические лимфоциты. Поздней активации лимфоцитов не выявили.

Таким образом, по изменению количества клеток, экспрессирующих CD69 или HLA-DR рецепторы, под влиянием тулярина можно судить о наличии противотуялермийного клеточного иммунитета.

В формировании иммунитета к возбудителю туляремии большую роль играют цитотоксические лимфоциты. Об активации цитотоксических лимфоцитов свидетельствует усиление экспрессии рецептора CD107b на поверхности клетки или внутри ее. Молекула CD107b ассоциирована с лизосомой, которая экспрессируется внутриклеточно, однако, при дегрануляции Т лимфоцитов появляется на поверхности клетки. В наших исследованиях мы не выявили достоверного увеличения субпопуляции Т лимфоцитов с маркером CD107b, экспрессирующегося внутриклеточно или внеклеточно, под влиянием тулярина.

В процессе активации цитотоксические лимфоциты начинают синтезировать и выделять гранзим-В. Гранзим-В запускает программу апоптоза в клетках-мишенях по нерецепторному пути, а экспрессированный на мембране лимфоцитов FasL, взаимодействуя с FasR клетки-мишени, индуцирует Fas-опосредованный апоптоз с участием CD95 рецептора [39].

Мы оценивали влияние тулярина на изменение экспрессии CD95 рецептора на поверхности лимфоцитов, полученных от вакцинированных живой туляремийной вакциной людей или контрольных доноров. Достоверного усиления экспрессии CD95 рецептора на поверхности Т хелперов под влиянием тулярина не обнаружили.

Одним из маркеров активации Т лимфоцитов является CD154 рецептор, который также называется CD40 лигандом или CD40L. CD154 относится к суперсемейству молекул фактора некроза опухоли. CD154 молекула связывается с CD40 рецептором на поверхности антигенпрезентирующих клеток или В лимфоцитов. Взаимодействие между CD40 и CD154 рецепторами контролирует реакции гуморального и клеточного иммунитета включая Т-опосредованную активацию дендритных клеток [329], моноцитов/макрофагов [52], пролиферацию В лимфоцитов, синтез иммуноглобулинов и переключение изотипов иммуноглобулинов [200].

Взаимодействие между рецептором CD40 на поверхности антигенпредставляющей клетки и CD154 рецептором на поверхности Т лимфоцита приводит к усилению синтеза ИЛ-12 антигенпредставляющей клеткой, который в свою очередь запускает синтез ИФН- [353, 354].

Мы выявили специфическое усиление экспрессии CD154 рецептора на поверхности Т хелперов, полученных от иммунизированных живой туляремийной вакциной людей, под влиянием тулярина или КНК.

Традиционным методом оценки клеточного противотуляремийного иммунитета является реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Однако после иммунизации живой туляремийной вакциной у ряда людей отмечается незначительное повышение пролиферативной активности в ответ на рестимуляцию клеток антигенами F. tularensis [366, 367]. Кроме того, тест РБТЛ длительный [358], связан с применением радиоактивных меток и позволяет сделать заключение на основе пролиферативной активности общего пула лимфоцитов: В и Т популяции.

В наших исследованиях было показано, что индекс стимуляции лимфоцитов у некоторых людей, постоянно вакцинирующихся против туляремии, через пять лет после последней иммунизации превышает значения индекса стимуляции лимфоцитов у контрольных доноров, что, вероятно, свидетельствует о сохранении противотуляремийного клеточного иммунного ответа. После иммунизации живой туляремийной вакциной людей с высоким индексом стимуляции к КНК F. tularensis у большинства доноров значения индексом стимуляции лимфоцитов после вакцинации остаются на том же уровне. Цитометрический анализ показал, F. tularensis что пролиферативная активность под влиянием антигенов увеличивается благодаря усилению пролиферативной активности в субпопуляции В лимфоцитов.

Проявление эффекторной активности клетками памяти в ответ на повторный контакт с антигенами возбудителя инфекции свидетельствует о наличии специфического иммунитета [143]. Мы проанализировали изменение синтеза ИЛ-4, ИФН- и ИЛ-17 лимфоцитами, полученными от вакцинированных против туляремии людей и невакцинированных доноров, в ответ на стимуляцию их антигенами туляремийного микроба. Нами было обнаружено, что под влиянием КНК синтез ИЛ-17 и ИФН- специфически усиливается в популяции лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии доноров.

Уровень синтеза ИЛ-17 также специфически усиливался в популяции лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии доноров, под влиянием тулярина. Наличие ИЛ-4 в культуральной жидкости лимфоцитов как в присутствии антигенов туляремийного микроба, так и бес не детектировалось.

Для оценки вклада отдельных супопуляций лимфоцитов в формирование противотуляремийного иммунитета мы проанализировали уровень синтеза ИФНи ФНО- T лимфоцитами CD3+ и CD3+ CD69+. Анализ CD69+ Т лимфоцитов показал, что усиление синтеза ИФН- Т лимфоцитами происходит главным образом за счет субпопуляции активированных лимфоцитов CD3+CD69+. Таким образом под влиянием тулярина и КНК происходит специфическое усиление синтеза ИФН- Т лимфоцитами, полученными от иммунизированных против туляремии доноров.

Таким образом, нами показано, что после иммунизации живой туляремийной вакциной у 2 % людей могут не выявляться антитела к ЛПС.

Однако у этих доноров синтезируются антитела к белкам бактерий F. tularensis.

Нами показано, что реакция лейкоцитолиза с тулярином после иммунизации людей живой туляремийной вакциной положительна в 30 % случаев. Поэтому для оценки противотуляремийного клеточного иммунитета нами предложено оценивать изменение синтеза ИФН- и ИЛ-17 лимфоцитами и усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов и HLA-DR маркера на поверхности СD3+СD4+СD45RO+ клеток в ответ на активацию лимфоцитов КНК.

Глава 5. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У

МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/С ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ КОММЕРЧЕСКОЙ

ЖИВОЙ ИЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ЧУМНЫМИ ВАКЦИНАМИ

В России и странах СНГ для профилактики чумы используют живую чумную вакцину на основе штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, которая обеспечивает напряженный иммунитет против бубонной и легочной чумы за счет стимуляции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета [74]. Однако живая чумная вакцина обладает рядом существенных недостатков. Ревакцинация живой вакциной с интервалом менее 6 месяцев индуцирует иммунный ответ, достаточный для быстрой элиминации бактерий вакцинного штамма из организма. Это препятствует развитию полноценного процесса ревакцинации и не обеспечивает поддержания напряженного иммунитета на уровне, достаточном для защиты от последующего заражения вирулентными штаммами. Кроме того, живая вакцина может вызывать у части иммунизированных побочные реакции различной степени тяжести, а также может вызывать генерализованный инфекционный процесс у лиц с нарушениями иммунного статуса [29, 30].

В последнее время многие исследователи работают над конструированием "химических" (субъединичных) чумных вакцин. Эти вакцины позволяют за счет введения в их состав только индивидуальных иммунодоминантных антигенов Y. pestis значительно снизить реактогенность препарата в целом; эффективны для ревакцинации; могут быть использованы на фоне экстренной профилактики антибиотиками и исключают возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса. Основным их недостатком является то, что большинство индивидуальных антигенов, в отличие от бактериальных клеток, индуцируют преимущественно гуморальный иммунитет [310, 395].

Для формирования протективного противочумного иммунитета необходима специфическая активация клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.

Медиаторами гуморального иммунного ответа являются В-лимфоциты и специфические антитела, синтезируемые ими. Оценку гуморального противочумного иммунитета проводят на основании выявления специфических антител. Медиаторами клеточного иммунитета являются цитотоксические лимфоциты, Т хелперы 1 типа (Тh1), провоспалительные цитокины (в первую очередь ИФН- и ФНО-), активированные макрофаги, натуральные киллеры и ряд других вспомогательных клеток и молекул. Для оценки противочумного клеточного иммунитета предлагалось определять уровень каспазы-3 [373], ФНО-, ИФН- [284], ИЛ-12 [300], в культуре антиген-активированных лимфоцитов, были предприняты попытки найти маркеры клеток специфически усиливающие экспрессию на поверхности лимфоцитов в ответ на реактивацию антигенами Y. pestis [396]. Однако до настоящего времени не найден тест, четко отражающий уровень противочумного клеточного иммунитета.

В данной главе мы сравнили изменения клеточных реакций лимфоцитов, полученных у иммунных и интактных животных в ответ на антигены чумного микроба. Мы провели скрининг изменения клеточной активации, начиная с врожденных реакций, включающих активацию толл-подобных рецепторов, и заканчивая поздними реакциями активации, включающими синтез цитокинов.

Цель данной главы – оценить противочумный гуморальный и клеточный иммунитет у иммунизированных против чумы мышей и выявить показатели отражающие наличие противочумного иммунитета.

Для проведения экспериментов у мышей через четыре недели после последней иммунизации выделяли кровь и селезенки для получения сыворотки и спленоцитов, соответственно. В сыворотке крови выявляли антитела к F1 и V антигенам Y. pestis для оценки гуморального противочумного иммунитета. Для оценки клеточного противочумного иммунитета сравнивали изменения экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов между культурами спленоцитов, полученных от иммунизированных против чумы и интактных животных. Иммунизированных против чумы мышей заражали вирулентным штаммом Y. pestis 231 для выявления корреляции между выживаемостью животных и показателями клеточного и гуморального противочумного иммунитета.

5.1. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-9 рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V Задачи исследования – на основании оценки изменения экспрессии TLR-2 и TLR-9 сравнить влияние УЗД Y. pestis и антигенов F1 и V на врожденные механизмы активации лимфоцитов и моноцитов, полученных от иммунизированных против чумы мышей и интактных животных.

Мы проанализировали влияние УЗД Y. pestis, F1 и V антигенов на изменение экспрессии TLR-2 на поверхности Т лимфоцитов и их субпопуляций, а также моноцитов, полученных от интактных и иммунизированных против чумы мышей в системе in vitro. Как видно из представленной таблицы 15 под влиянием УЗД Y. pestis отмечали усиление экспрессии TLR-2 рецептора на поверхности Т хелперов и моноцитов, полученных от интактных животных и мышей, иммунизированных живой чумной вакциной.

В присутствии V антигена отмечалось усиление экспрессии TLR-2 на поверхности моноцитов и Т лимфоцитов, включая хелперы и цитотоксические лимфоциты, полученных, как от иммунизированных против чумы мышей, так и от интактных животных. Под влиянием F1 антигена не происходило достоверного усиления или снижения экспрессии TLR-2 на поверхности Т лимфоцитов и их субпопуляций, но происходило усиление экспрессии TLR-2 на поверхности моноцитов.

Лимфоциты и моноциты, полученные от интактных животных, в присутствии антигенов чумного микроба практически не изменяли экспрессию TLR-9 рецепторов по сравнению с контрольными клетками, инкубировавшимися в полной питательной среде без добавления антигенов (рисунок 30 А, Б).

–  –  –

Моноциты и лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных против чумы, под влиянием антигенов чумного микроба усиливали экспрессию TLR-9 рецепторов (рисунок 30 В, Г, Д, Е) в отличие от клеток, полученных от интактных животных. Моноциты и лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов, содержащим гидроксил алюминия, под влиянием УЗД, F1 и V антигенов усиливали экспрессию TLR-9 рецепторов (рисунок 30 Д, Е) более выраженно по сравнению клетками, полученными от интактных животных, но менее выраженно по сравнению с клетками, полученными от мышей иммунизированных живой чумной вакциной.

–  –  –

Рисунок 30 – Изменение экспрессии TLR-9 на поверхности Т лимфоцитов (А, В, Д) и моноцитов (Б, Г, Е) интактных мышей (1 А, Б), мышей иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ (В, Г) или препаратом на основе F1 и V антигенов, содержащим гидроксил алюминия (Д, Е) под влиянием антигенов чумного микроба Таким образом, под влиянием УЗД и V антигена Y. pestis отмечали усиление экспрессии TLR-2 рецептора на поверхности Т лимфоцитов и моноцитов, а под влиянием F1 антигена не происходило достоверного изменения экспрессии TLR-2 на поверхности Т лимфоцитов, но происходило усиление экспрессии TLR-2 на поверхности моноцитов, полученных от интактных животных или мышей, иммунизированных живой чумной вакциной. TLR-9 рецептор более выражено усиливал свою экспрессию на поверхности Т лимфоцитов и моноцитов, полученных от иммунизированных против чумы мышей, по сравнению с клетками, полученными от интактных животных.

5.2. Оценка перестройки маркера ранней активации CD69 на поверхности лимфоцитов под влиянием антигенов Y. pestis Задача исследования – сравнить влияние антигенов Y. pestis УЗД, F1 и V на изменение экспрессии раннего маркера активации CD69 на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов в культуре спленоцитов, полученных от иммунизированных против чумы мышей и интактных животных.

Количество CD69-позитивных Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, полученных от иммунных и интактных мышей, через 24 ч инкубирования в среде колебалось в диапазоне (1,25±0,99) %. Под влиянием УЗД Y. pestis отмечали усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности лимфоцитов, полученных как от иммунизированных против чумы мышей (7,58±2,45) %, так и на поверхности лимфоцитов, полученных от интактных животных (6,98±2,11) %.

Под влиянием F1 чумного микроба было выявлено выраженное увеличение активированных цитотоксических лимфоцитов 35,95 % и Т хелперов 12,47 % в ответ на стимуляцию спленоцитов in vitro в группе мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ (рисунок 31). В культуре спленоцитов, полученных от интактных мышей, под влиянием антигенов Y. pestis отмечали некоторое увеличение CD3+CD4+CD69+, но не CD3+CD8+CD69+ субпопуляциии лимфоцитов.

–  –  –

Рисунок 31 – Изменение экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов (А, В, Д) и цитотоксических лимфоцитов (Б, Г, Е) интактных мышей (А, Б), мышей иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ (В, Г) или препаратом на основе F1 и V антигенов, содержащим гидроксил алюминия (Д, Е) под влиянием антигенов чумного микроба

CD69-позитивные лимфоциты расположены под отрезком М1.

Достоверно-значимое увеличение CD69-позитивных лимфоцитов (8,62 % Т хелперов и 24,32 % – цитотоксических лимфоцитов) в ответ на стимуляцию in vitro F1 чумного микроба отмечено также в группе мышей, иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия.

V антиген чумного микроба преимущественно способствовал неспецифической активации цитоткосических лимфоцитов как у интактных мышей (8,32 %), так и у животных иммунизированных EV НИИЭГ (9,58 %) или препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия (6,45 %).

Y. pestis Таким образом, под влиянием F1 антигена происходила специфическая активация цитотоксических лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных против чумы.

5.3. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов мышей в ответ на активацию клеток антигенами чумного микроба Задача исследования – сравнить влияние антигенов Y. pestis F1 и V на изменение уровня пролиферативной активности лимфоцитов в культуре спленоцитов, полученных от иммунизированных против чумы мышей и интактных животных.

Содержание пролиферирующих лимфоцитов, полученных от интактных мышей, после инкубирования в питательной среде не превышало (1,53±0,96) % (рисунок 32). Лимфоциты интактных животных достоверно не увеличивали пролиферативную активность в присутствии F1 или V антигенов Y. pestis.

Лимфоциты, выделенные от мышей, иммунизированных Y. pestis EV или препаратом, содержащим F1 и V антигены Y. pestis, сорбированные на гидроксиле алюминия, достоверно увеличивали пролиферативную активность под влиянием F1 антигена ((9,33±1,67) и (7,73±1,54) %, соответственно).

Рисунок 32 – Процентное содержание пролиферирующих лимфоцитов, выделенных от интактных и иммунизированных мышей Y. pestis EV или препаратом, содержащим F1 и V антигены Y. pestis, адсорбированные на гидроксиле алюминия Лимфоциты инкубировали в полной питательной среде на основе RPMI без добавления антигенов или в присутствии F1 или V антигенов чумного микроба.

Определение пролиферативной активности субпопуляций В и Т лимфоцитов. В зависимости от свойств антигена пролиферативная активность может усиливаться только у В лимфоцитов, только у Т лимфоцитов или одновременно в обеих субпопуляциях. Анализ отдельных субпопуляций показал, что содержание пролиферирующих В лимфоцитов, полученных от интактных мышей, в присутствии F1 антигена составляет (2,96±1,04) %, а Т лимфоцитов – (0,78±0,34) %. Лимфоциты, полученные от мышей иммунизированных Y. pestis EV, усиливали пролиферативную активность под влиянием F1 антигена за счет В лимфоцитов (11,95±2,45) % и Т лимфоцитов (4,15±2,56) % (рисунок 33 А, Б).

Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов Y. pestis, усиливали пролиферативную активность в основном за счет В лимфоцитов (5,67±1,09) % (рисунок 33 В, Г).

В присутствии V антигена изменения пролиферативной активности лимфоцитов, полученных от интактных или иммунизированных мышей, не наблюдали.

–  –  –

(В) (Г) Рисунок 33 – Процентное содержание пролиферирующих В (А, В) и Т лимфоцитов (Б, Г), полученных от мышей иммунизированных Y. pestis EV (А, Б) или препаратом, содержащим F1 и V антигены Y. pestis (В, Г) Закрашенная область – распределение по CFSE-красителю лимфоцитов интактных мышей, активированных F1 антигеном. Контурная линия – распределение лимфоцитов иммунных мышей, активированных F1 антигеном.

Под отрезком находятся пролиферирующие клетки.

Таким образом, клетки, полученные от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, в ответ на активацию антигеном F1 чумного микроба, усиливали пролиферативную активность лимфоцитов как за счет В-субпопуляции, так и за счет Т-субпопуляции. Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированные на гидроокиси алюминия, в присутствии F1 увеличивали пролиферативную активность за счет только В лимфоцитов.

–  –  –

Лимфоциты полученные от мышей, иммунизированных Y.pestis EV НИИЭГ или препаратом на основе F1 и V антигенов Y. pestis, содержащим гидроксил алюминия, в присутствии антигенов чумного микроба усиливали синтез ИФН- за счет субпопуляции Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов. Более выраженное увеличение количества клеток, продуцирующих ИФН-+ под влиянием чумных антигенов, было выявлено в культуре спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ.

В присутствии УЗД и F1 Т лимфоциты, выделенные из селезенок интактных и иммунизированных против чумы мышей, усиливали синтез ФНО- за счет субпопуляции Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов. Наиболее выраженное увеличение количества ФНО--продуцирующих Т лимфоцитов под влиянием УЗД и F1 Y. pestis наблюдали в группе мышей, иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия. В присутствии V антигена Т лимфоциты, полученные из селезенок интактных и иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ мышей, не отмечали увеличения субпопуляций лимфоцитов, синтезирующих ФНО-+. Т лимфоциты, полученные из селезенок мышей иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия, препаратом на основе гидроксила алюминия, выявили появление большого количества лимфоцитов, синтезирующих ФНО-+ под влиянием V антигена.

Количество лимфоцитов, синтезирующих ИЛ-4, под влиянием антигенов Y. pestis, увеличивалось как в популяции спленоцитов, полученных от интактных, так и полученных от иммунизированных мышей.

Таким образом, мы выявили специфическое усиление синтеза ИФНцитотоксическими лимфоцитами, полученными от иммунизированных против чумы мышей, под влиянием F1, V или УЗД Y. pestis.

5.5. Изменение цитокиновой активности спленоцитов под влиянием антигенов Y. pestis Задача исследования – сравнить влияние антигенов Y. pestis на изменение уровня синтеза провоспалительных (ИЛ-12, ИФН-, ИЛ-6, ФНО-, ИЛ-17) и противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-4) цитокинов спленоцитами, полученными от иммунизированных против чумы мышей и интактных животных.

Мы сравнили активности синтеза цитокинов спленоцитами, полученными от интактных мышей и животных, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ или препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия, под влиянием F1, V антигенов или УЗД чумного микроба.

Уровни спонтанной цитокиновой активности спленоцитов, полученных от интактных мышей или животных, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ или препаратом, содержащим F1 и V антигены чумного микроба, после инкубирования их в полной питательной среде в течение 48 ч достоверно не отличались (рисунок 34). Концентрации в супернатанте культуры спленоцитов провоспалительных (Ил-17, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-, ИФН-) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов были низкими.

Добавление в среду культивирования антигенов Y. pestis приводило к усилению синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ФНО- в культурах спленоцитов, выделенных и от интактных и от иммунизированных против чумы мышей. Усиление синтеза ИЛ-10 – противовоспалительного цитокина спленоцитами интактных и иммунизированных животных отмечали только в ответ на стимуляцию клеток УЗД или F1 антигеном Y. pestis, но не V антигеном.

Уровень синтеза ИЛ-4 в присутствии антигенов чумного микроба достоверно не изменялся.

Мы выявили специфическое усиление синтеза ИФН- и ИЛ-17 спленоцитами, полученными от иммунизированных против чумы мышей, в ответ на стимуляцию клеток антигенами Y. pestis. Максимальная концентрация ИФНи ИЛ-17 была обнаружена в супернатанте спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, активированных УЗД чумного микроба.

–  –  –

Рисунок 34 – Изменение концентрации цитокинов в среде культивирования спленоцитов, полученных от интактных и иммунизированных мышей, в присутствии антигенов Y. pestis и без них



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |
 

Похожие работы:

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«ПОЕДИНОК НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА УДК 602.3:582.282/284:57.086.83]:[681.7.069.24+577.34 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СЪЕДОБНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ МАКРОМИЦЕТОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук Научный консультант Дудка Ирина...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.