WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая ...»

-- [ Страница 4 ] --

Сравнивали количество CD4+ и CD8+ лимфоцитов, несущих на поверхности CD69 рецептор, без стимуляции и после стимуляции их in vitro КНК F. tularensis.

Молекула активации CD69 активно экспрессировалась на поверхности CD4+T лимфоцитов, стимулированных КНК in vitro, только в группе мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ.

Количество CD4+ T лимфоцитов, экспрессирующих CD69 рецептор, в группе вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ мышей составил (14±3) % после стимуляции их in vitro КНК F.

tularensis. Количество лимфоцитов мышей, Y. pestis EV интактных или иммунизированных линии НИИЭГ или S. entheritides 92, экспрессирующих CD69, достоверно не изменялось под влиянием КНК в условиях in vitro. Как видно из рисунка 11, в присутствии КНК F. tularensis, экспрессия CD69 на CD8+ T лимфоцитах увеличивалась как в группе F. tularensis мышей вакцинированных 15 НИИЭГ, так и у мышей, иммунизированных Y. pestis EV линии НИИЭГ, по сравнению с содержанием CD3+CD8+CD69+ клеток, культивированных 24 ч без добавления КНК F. tularensis in vitro.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что выявление противотуляремийного клеточного иммунитета лучше проводить на основании усиления экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов в ответ на стимуляцию клеток КНК in vitro.

Таким образом, оценка клеточного противотуляремийного иммунитета может проводиться на основании усиления экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов и синтеза CD3+CD4+ лимфоцитами ИФН- и ФНО- в ответ на стимуляцию КНК F. tularensis in vitro.

Рисунок 11 – Содержание субпопуляций CD4+ и CD8+ субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих на поверхности CD69 рецептор

3.7. Разработка методов in vitro для оценки эффективности иммунологической перестройки у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ Задачи исследования – выбрать методы отражающие эффективность иммунологической перестройки у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ.

Известно, что иммунизация мышей высокими дозами F. tularensis 15 приводит к формированию инфекционного процесса, а низкими дозами – вакцинальному. В формировании протективного антитуляремийного иммунитета важную роль играют оба звена иммунной системы – гуморальное и клеточное. В связи с этим мы оценивали выраженность формирования антитуляремийного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей линии BALB/c в зависимости от дозы иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ.

На рисунке 12 приведена динамика изменения веса у мышей иммунизированных подкожно или внутрикожно бактериями F. tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5, 15, 45 и 135 КОЕ/мышь.

Одним из интегральных показателей степени воспаления организма является изменение веса. Сохранение нормальных показателей массы животных при внутрикожном введении бактерий в дозах 5 и 15 КОЕ/мышь свидетельствует об отсутствии значимого воспалительного процесса. При подкожном введении живой туляремийной вакцины не зависимо от дозы иммунизации у мышей происходило снижение веса и формирование выраженного воспалительного процесса. В группах мышей с выраженным снижением веса наблюдали гибель единичных животных на 6-8 сутки после иммунизации (по первой из пяти мышей в группах, иммунизированных по 45 и 135 КОЕ/мышь, не зависимо от способа введения вакцины).

А Б

–  –  –

Основными регуляторами иммунного ответа и воспалительных реакций являются цитокины. У мышей иммунизированных живой туляремийной вакциной как подкожно, так и внутрикожно, под влиянием КНК отмечали специфическое усиление синтеза спленоцитами провоспалительных цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и некоторое увеличение противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (рисунок 13 ).

Рисунок 13 – Влияние дозы и способа иммунизации мышей штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ на уровень синтеза провоспалительных (ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-17) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов спленоцитами животных под влиянием КНК in vitro F. tularensis У мышей, иммунизированных 15 НИИЭГ подкожно, спленоциты в присутствии КНК усиливали также синтез ИЛ-4 и статистически более выражено синтез ИЛ-6.

Для оценки специфического гуморального иммунитета у животных после иммунизации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ выявляли специфические антитела к туляремийным антигенам в сыворотках крови. Подкожный способ введения живой туляремийной вакцины мышам индуцировал высокую концентрацию специфических антител в сыворотках у животных, иммунизированных бактериями в дозе 135 КОЕ/мышь, а внутрикожный – в дозах от 15 до 135 КОЕ/мышь (рисунок 14). Уровень специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных подкожно в дозе 135 КОЕ/мышь, был существенно выше, чем у мышей, иммунизированных внутрикожно в той же дозе.

Одним из индикаторов наличия специфических клеток памяти к F. tularensis является усиление пролиферативной активности лимфоцитов после их стимуляции туляремийным антигеном. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов, выделенных из селезенок иммунизированных мышей, показал, что под влиянием КНК достоверно увеличивалась пролиферативная активность лимфоцитов (таблица 5).

Лимфоциты мышей, иммунизированных внутрикожно F. tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5-15 КОЕ/мышь, проявляли более выраженную пролиферативную активность в присутствии КНК по сравнению с лимфоцитами животных, иммунизированных этой же вакциной в тех же дозах подкожно. Максимальный пролиферативный ответ лимфоцитов на КНК не зависимо от способа иммунизации наблюдали в группе мышей, иммунизированных F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 45 КОЕ/мышь. Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных 135 КОЕ/мышь F. tularensis 15 НИИЭГ, проявляли менее выраженную пролиферативную активность в ответ на КНК.

А Б А – мыши, иммунизированные подкожно и Б – внутрикожно.

Рисунок 14 – Влияние иммунизирующей дозы F. tularensis 15 НИИЭГ на количество антител к КНК в сыворотке крови мышей

–  –  –

Вероятно, при введении мышам 135 КОЕ/мышь F. tularensis 15 НИИЭГ, в организме животных развиваются выраженные воспалительные реакции, которые приводят к иммуносупрессии.

У лимфоцитов, имеющих специфические рецепторы, при контакте с антигенами возбудителя инфекции происходит стимуляция TCR/ВCR рецептора, а затем экспрессия CD69 маркера на поверхности клетки [99]. В спленоцитах, полученных от иммунизированных мышей в отличие от интактных, процентное содержание CD19+CD69+ субпопуляции В-клеток в присутствии КНК достоверно увеличивалось по сравнению с популяцией лимфоцитов не активированных КНК (таблица 5). Максимальная активация В-клеток отмечалась у мышей, иммунизированных в дозах 15 и 45 КОЕ/мышь, хотя максимальные тиры антител к КНК наблюдали после иммунизации животных 135 КОЕ/мышь.

В спленоцитах, полученных от мышей, иммунизированных подкожно или внутрикожно F. tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5 или 15 КОЕ/мышь, в присутствии КНК наблюдали увеличение субпопуляции Т-хелперов, экспрессирующих CD69 рецептор (табл. 5). При увеличении иммунизирующей дозы бактерий уровень клеток с CD69 рецептором не увеличивался.

КНК F. tularensis индуцировал некоторое усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности цитотоксических лимфоцитов в группах интактных мышей (таблица 5). Однако активация КНК спленоцитов иммунных мышей приводила к еще более выраженному и достоверному повышению количества CD3+CD8+ CD69+ лимфоцитов вне зависимости от дозы препарата, по сравнению с интактными животными. Максимальную активацию цитотоксических лимфоцитов наблюдали в группах мышей, иммунизированных дозами 15-45 КОЕ/мышь.

На рисунке 15 отображено количество бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ, высеваемых из селезенки мышей, через разные промежутки времени после подкожного или внутрикожного заражения разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ.

А Б Рисунок 15 – Количество КОЕ F. tularensis 15 НИИЭГ, высеваемых из селезенки мышей, через разные промежутки времени после подкожного (А) или внутрикожного (Б) заражения разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ Из полученных данных можно заключить, что при одинаковых дозах введения бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ количество высеваемых бактерий на третьи и седьмые сутки иммуногенеза меньше после внутрикожной иммунизации.

Иммунизация мышей F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь внутрикожно приводила к увеличению селезенки, истощению тимуса начиная с 11 суток, и не влияла на изменения морфологии и размеров печени и лимфатических узлов. При подкожном введении мышам F. tularensis 15 НИИЭГ в той же дозе селезенка увеличивалась, а тимус истощался, начиная с седьмых суток при сохранении нормальной морфологии и размеров печени и лимфатических узлов. При более высоких дозах иммунизации морфологические изменения в органах при подкожном и внутрикожном введении были идентичными. К седьмым суткам после иммунизации отмечалось увеличение селезенки, печени и лимфоузлов на фоне истощения тимуса.

Таким образом, после внутрикожной иммунизации мышей F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь не обнаруживались антитела к КНК в крови животных, но выявлялся клеточный ответ на стимуляцию спленоцитов КНК в реакциях in vitro (усиление пролиферативной активности, синтез ИЛ-17, появление CD69 рецептора на поверхности Т и В лимфоцитов). Сформированный специфический клеточный иммунитет был способен защитить животных от заражения вирулентным штаммом F. tularensis 503.

При низких дозах иммунизации у мышей возникает популяция специфических В лимфоцитов, активирующихся в присутствии КНК, но не синтезирующих антитела против КНК.

В зависимости от степени воспаления, регистрируемого по уровню падения веса и изменению цитокиновой активности, у мышей наблюдается усиление (при низких дозах иммунизации) или подавление (при дозе 135 КОЕ/мышь) клеточных реакций in vitro на КНК, а уровень гуморального ответа – усиливается по мере увеличения иммунизирующей дозы.

3.8. Оценка напряженности иммунитета к туляремии у мышей через разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ и показателями противотуляремийного иммунитета в системе in vitro Задачи исследования – оценить длительность проявления гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у мышей после иммунизации животных вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ.

На протяжении эксперимента (с 30 по 180 дни после иммунизации живой туляремийной вакциной) у мышей в сыворотке крови выявляли антитела к туляремийным антигенам (рисунок 16). Концентрация специфических антител практически не изменялась в течение всего времени наблюдения.

Рисунок 16 – Уровень антител к КНК в сыворотке крови у мышей в разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ Оценкудинамики формирования специфического клеточного иммунитета проводили на основании выявления количества CD69 позитивных Т лимфоцитов и В лимфоцитов после стимуляции спленоцитов КНК in vitro (таблица 6).

–  –  –

КНК индуцировал выраженное усиление экспрессии CD69 маркера на поверхности CD19+ В лимфоцитов, выделенных от иммунных мышей, как в ранние, так и в отдаленные сроки исследований после иммунизации животных F. tularensis 15 (таблица 6). КНК также способствовал активации В лимфоцитов интактных мышей, но усиление экспрессии CD69 рецептора на их поверхности было достоверно менее выраженным по сравнению с В лимфоцитами, полученными от иммунных животных.

У иммунных мышей на поверхности Т хелперов во все сроки исследований наблюдали специфическое усиление экспрессии CD69 рецептора в присутствии КНК.

На поверхности цитотоксических лимфоцитов CD69 рецептор усиливал экспрессию как на клетках, полученных от иммунных, так и от интактных животных.

Анализ цитокиновой активности спленоцитов, полученных от иммунных мышей, показал специфическое усиление синтеза ИЛ-17 и ИФН- под влиянием КНК даже у животных иммунизированных пол года назад (рисунок 17). ИЛ-17 Значительно усиливается в первые 2-3 месяца после иммунизации животных, а затем падает, но не ниже 200 пкг/мл, что выше значений у интактных животных (5,3 пкг/мл). Отмечали усиление синтеза ИЛ-10 спленоцитами мышей под влиянием КНК в первые два месяца после иммунизации животных, а также усиление синтеза ИЛ-12 через 30, 60, 90 и 120 дней после иммунизации. КНК не изменял уровень активности синтез ИЛ-4 спленоцитами экспериментальных животных.

Рисунок 17 – Концентрация цитокинов в культуре спленоцитов под влиянием КНК в разные сроки после иммунизации животных F. tularensis 15 Оценивали пролиферативную активность лимфоцитов, полученных от мышей в разные сроки после иммунизации животных F. tularensis 15, в ответ на КНК в системе in vitro (рисунок 18). Высокие показатели пролиферативного ответа лимфоцитов на КНК наблюдали на 30 сутки после иммунизации мышей F. tularensis 15 НИИЭГ. Начиная с 60 суток после введения живой туляремийной вакцины лимфоциты животных в меньшей степени усиливали пролиферацию в ответ на их стимуляцию КНК in vitro.

Рисунок 18 – Пролиферативная активность лимфоцитов мышей в разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 в реакции in vitro под влиянием КНК Таким образом, на протяжении полугода у всех мышей, иммунизированных F. tularensis 15, выявлялся высокий уровень антител к КНК. В ответ на стимуляцию КНК in vitro спленоцитов, полученных от иммунизированных против туляремии мышей, отмечали усиление экспрессии CD69 маркера на поверхности В лимфоцитов, специфическое усиление CD69 рецептора на поверхности Т хелперов, усиливающееся к 120 дню после иммунизации, увеличение CD69-позитивной субпопуляции цитотоксических лимфоцитов, наиболее выраженное в первые три месяца после иммунизации мышей, специфическое усиление синтеза ИЛ-17 и ИФН- на протяжении всех сроков наблюдения.

Уровень пролиферативной активности лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных F. tularensis 15, в ответ активацию клеток КНК был максимально высоким на 30 сутки после иммунизации.

3.9. Выявление иммунологических маркеров, коррелирующих с защитой от заражения туляремией мышей, иммунизированных разными препаратами против туляремии Задачи исследования – провести сравнительный анализ влияния антигенов F. tularensis на изменения экспрессии маркеров CD69, CD154, CD28 на поверхности CD4 и CD8 T лимфоцитов, полученных от мышей интакных и иммунизированных препаратами F. tularensis 1523A и/или F. tularensis 15 линии НИИЭГ.

Разные схемы иммунизации препаратами обуславливали формирование противотуляремийного иммунитета разного уровня напряженности. Оценивали корреляцию изменений фенотипа лимфоцитов с защитой от интраназального заражения вирулентным штаммом F. tularensis Schu.

Иммунизация F. tularensis 1523A и F. tularensis 15 линии НИИЭГ и протективность против интраназального заражения F. tularensis Schu Мышей BALB/c иммунизировали F. tularensis 1523A однократно или двукратно, или сначала иммунизировали F. tularensis 1523A, а через 4 недели F. tularensis 15 линии НИИЭГ. Для выявления протективности противотуляремийного иммунитета через месяц животных заражали F. tularensis интраназально Schu. Как показано в таблице 7 мыши, иммунизированные дважды F. tularensis 1523A, были полностью защищены от интраназального заражения (100 % выживаемость). Мыши, иммунизированные F. tularensis 1523A, а затем F. tularensis 15 линии НИИЭГ также частично были защищены (выживаемость 60 %) от интраназального заражения Schu. После F. tularensis однократной иммунизации животных 1523A последующее заражение мышей F. tularensis Schu приводило к гибели всех животных.

Секреция цитокинов in vitro. Сравнивали синтез цитокинов спленоцитами, выделенных от иммунизированных и интактных мышей, через 48 ч инкубирования клеток в среде без и в присутствии тулярина. С использованием СBA-анализа оценивали концентрацию цитокинов ИЛ-1, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-17, ИФН- и ФНО- в супернатантах культур клеток. Концентрация цитокинов в

–  –  –

Только в группе мышей, иммунизированных дважды F. tularensis 1523 выявлялась спонтанная продукция ИЛ-1 и ИЛ-5 спленоцитами: 36,32 пкг/мл и 74,67 пкг/мл, соответственно.

В группе интактных мышей обнаружили усиление секреции ИЛ-6, ИФН- и ФНО- спленоцитами в присутствии тулярина в среде. Статистический анализ достоверности изменений между группами животных показал, что уровень ИФН- был выше в супернатате спленоцитов мышей, иммунизированных F. tularensis 1523A или F. tularensis 1523A и F. tularensis 15 линии НИИЭГ, по сравнению с данными группы интактных мышей (299,17 и 55,67 против 10,78 пкг/мл).

Количество ИЛ-17 в супернатанте тулярин-индуцированных спленоцитов был выше у всех иммунизированных мышей, чем в супернатанте тулярининдуцированных спленоцитов интактных животных. Секреция ФНО- и ИЛ-6 увеличивалось в супернатанте спленоцитов всех групп мышей под влиянием тулярина.

Стимуляция лимфоцитов. Для выявления клеточного источника ИФН- и ФНО- мы проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов и цитометрический анализ. Добавление тулярина к спленоцитам мышей, иммунизированных дважды F. tularensis 1523A или F. tularensis 1523A и F. tularensis 15 НИИЭГ приводило к значительному увеличению продукции ИФН- и ФНО- T-клетками (T хелперами (CD3+CD4+) и цитотоксичесими лимфоцитами (CD3+CD8+)) по сравнению с данными интактных мышей (рисунок 19).

Мы провели сравнительный анализ экспрессии CD69, TLR-2, CD28, CD154 на поверхности Т лимфоцитов после стимуляции тулярином. Добавление тулярина к спленоцитам, выделенным от мышей, иммунизированных дважды F. tularensis 1523A, приводило к усилению экспрессии CD69 на поверхности Т-лимфоцитов в отличие от других групп животных (рисунок 20). Сравнительный анализ экспрессии TLR-2, CD28, CD154 на поверхности Т-клеток не выявил достоверных изменений между группами мышей.

–  –  –

Бактерии F. tularensis 15 НИИЭГ используются для вакцинации против туляремии в России и характеризуются способностью индуцировать протективный иммунный ответ против туляремийной инфекции. Тем не менее F. tularensis 15 НИИЭГ не защищает полностью против аэрозольного заражения вирулентным типом А F. tularensis, кроме того механизм аттенуации F. tularensis 15 НИИЭГ до конца не выяснен. В связи с этим вопрос разработки более совершенной туляремийной вакцины до сих пор является актуальным.

Большинство ученых пытается сконструировать и использовать авирулентные штаммы F. tularensis, в которых за счет мутаций повышается иммуногенность и снижается реактогенность [201].

Для изучения патогенеза и иммуногенеза туляремийного вакцинального и инфекционного процессов в качестве биомоделей чаще всего используют мышей.

Это связано с тем, что процессы развития вакцинального и инфекционного процессов у людей и мышей (особенно при использовании мышей линии BALB/c) схожи [96]. После иммунизации мышей живой туляремийной вакциной у животных формируется длительный протективный иммунитет против подкожного (но не аэрозольного) заражения высоковирулентным штаммом F. tularensis tularensis.

Выраженность иммунологической перестройки после иммунизации авирулентными штаммами F. tularensis выявляют по наличию специфических антител и активации клеточных реакций.

F. tularensis, Главным иммунодоминантным антигеном к которому синтезируются специфические антитела после заболевания или вакцинации людей является ЛПС туляремийного микроба [3]. Поэтому серологическая диагностика туляремии у человека и животных основана на выявлении антител против ЛПС или их эпитопов [34]. ИФА на основе ЛПС F. tularensis характеризуется чувствительностью 96,5-99,0 % и специфичностью 96-97 % [327, 348].

F. tularensis Антигенная структура помимо ЛПС представлена специфическими полисахаридами и антигенами белковой природы [145]. Поэтому антитела синтезируются не только против ЛПС туляремийного микроба, но также против белков внешней мембраны F. tularensis. Иммуноферментный анализ на основе комплекса белков внешней мембраны обладает 100 % специфичностью и чувствительностью [79, 327]. О высокой иммуногенности белков F. tularensis свидетельствует формирование у мышей протективного иммунитета против аэрозольного заражения F. tularensis типа А после иммунизация мышей белками внешней мембраны с примесью ЛПС F. tularensis [207].

В наших исследованиях мы выявляли специфические антитела к тулярину, ЛПС, ультразвуковому дезинтеграту (УЗД) и кислотонерастворимому комлпексу (КНК) F. tularensis у мышей н 28 сутки после иммунизации вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ. Было показано, что препараты КНК и ЛПС F. tularensis прекрасно подходят для выявления противотуляремийных антител у мышей.

Использование тулярина или УЗД F. tularensis для выявления антител в сыворотке крови мышей приводило к большому количеству ложноположительных и ложно-отрицательных результатов. По всей вероятности, это связано с содержанием всего комплекса антигенов F. tularensis, часть из которых может давать перекрестные реакции. Кроме того, тулярин характеризовался низкой чувствительностью в реакции ИФА, что, вероятно, было связано с низкой сорбционной активностью тулярина на пластик. Таким образом, для оценки туляремийного гуморального иммунитета в иммуноферментном анализе можно использовать КНК и ЛПС F. tularensis.

Формирование протективного противотуляремийного иммунитета возможно только при участии и гуморального и клеточного звеньев иммунитета одновременно. Это подтверждается тем фактом, что иммунизация мышей только ЛПС F. tularensis (с дальнейшим синтезом специфических антител) не защищает мышей от аэрозольного заражения F. tularensis типа А или Б, но при иммунизации мышей конъюгированного ЛПС F. tularensis с бычьим сывороточным альбумином или ЛПС совместно с иммуностимулирующим комплексом, способствующих активации клеточного звена иммунитета, у животных формировался протективный иммунный ответ против аэрозольного заражения F. tularensis типа Б (но не типа А) [107, 154].

Таким образом, для оценки напряженности иммунитета выявления только антител к ЛПС F. tularensis не достаточно. Наличие антител к ЛПС F. tularensis или к белкам не позволяет с уверенностью заключить о наличии противотуляремийного иммунитета. При проникновении в организм F. tularensis практически сразу фагоцитируютсмя макрофагами, что способствует уклонению возбудителей от связывания со специфическими антителами. Кроме того, в процессе размножения внутри марофагов на поверхности F. tularensis могут появляться новые белки, которые также препятствуют взаимодействию специфических антител с ЛПС или другими поверхностными структурами [416].

Для формирования протективного противотуляремийного иммунитета необходимо синергичное участие клеточного и гуморального иммунитета.

Формирование протективного иммунитета к туляремийной инфекции возможно при наличии и специфических антител и клеточных реакций [351].

Для выявления специфического клеточного противотуляремийного иммунитета предлагались различные методы, однако до сих пор не выявлены параметры перестройки клеточного звена иммунитета, которые бы четко коррелировали с напряженностью иммунитета к туляремии.

Учитывая ведущую роль Т лимфоцитов в формировании протективного противотуляремийного иммунного ответа, мы пытались выявить наиболее информативные методы оценки напряженности специфического клеточного иммунитета и длительность проявления этих реакций после иммунизации животных.

Для формирования протективного иммунитета к возбудителю туляремии у мышей необходимо участие обеих субпопуляций T лимфоцитов CD4+ и CD8+. Об этом свидетельствует то факт, что у дефицитных мышей по одной из субпопуляций снижается выживаемость после заражения вирулентным штаммом F. tularensis [67, 106]. Цитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+) за счет гранулизина в процессе лизиса инфицированных клеток уничтожают и бактерии.

Кроме того цитотоксические лимфоциты в процессе активации секретируют провоспалительные цитокины ФНО-, ФНО-, ГМ-КСФ, ИФН-, обеспечивая дополнительную активацию макрофагов и развитие протективного противотуляремийного иммунитета [114]. В связи с важностью обеих субпопуляций лимфоцитов в формировании иммунитета к туляремии мы оценивали влияние антигенов F. tularensis на субпопуляции Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов.

В процессе активации Т лимфоцитов происходит изменение экспрессии поверхностных маркеров. Одним из ранних маркеров активации клеток является рецептор CD69. Выявление экспрессии рецептора CD69 на поверхности Т и В лимфоцитов свидетельствует об усилении их эффекторной активности [195].

CD69 появляется на поверхности антиген-специфически стимулированных Т-клеток, который, появившись на поверхности, работает как ко-стимулирующая молекула, усиливающая Т-клеточную активацию и пролиферацию [369].

Выявление CD69 на поверхности CD4 лимфоцитов, стимулированных туберкулином, используется для оценки сенсибилизации организма к возбудителю туберкулеза [64]. Этот метод не использовался для выявления специфического поствакцинального и постинфекционного противотуляремийного клеточного иммунного ответа.

В наших исследованиях было показано, что под влиянием тулярина и КНК происходило специфическое усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов, полученных от мышей иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ. Под влиянием антигенов туляремийного микроба количество CD69-позитивных цитотоксических лимфоцитов увеличивалось как в культуре клеток, полученных от иммунных (более выраженное в процентном отношении), так и от контрольных мышей.

При вторичном иммунном ответе к F. tularensis немедленную защиту против возбудителей инфекции обеспечивают Т хелперы памяти, продуцируя тот спектр цитокинов, который закрепился в результате первичного ответа, и, дифференцируясь в эффекторные Т хелперы, выполняющие роль усилителей иммунного ответа [19]. Ведущим защитным механизмом противотуляремийного иммунитета является клеточно-опосредованный ответ Th1-типа. Главный гуморальный медиатор этого пути – ИФН-. Основными функциями ИФН- в развитии адаптивного иммунного ответа является усиление экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) I и II классов на антиген презентирующих клетках, а так же активации синтеза ими цитокинов, необходимых для презентации антигена Т-лимфоцитам. В ходе развития первичного иммунного ответа Т-лимфоциты дифференцируются в эффектортные клетки. ИФН- способствует дифференцировке «наивных» Th0 в Th1, препятствуя появлению Th2 или подавляя их функции, оказывает помощь в генерализции CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов.

Результаты наших исследований показали, что только в культуре спленоцитов, выделенных от иммунизированных мышей под влиянием тулярина или КНК происходило специфическое увеличение субпопуляции CD3+CD4+, синтезирующей ИФН- и ФНО-.

Тулярин и КНК содержат в своем составе большое количество антигенов F. tularensis. Некоторые антигены F. tularensis характеризуются антигенным сродством с Yersinia pestis и Salmonella entheriditis, что может быть причиной перекрестных серологических и клеточных реакций [411]. Мы провели цитометрический анализ спленоцитов, полученных от интактных мышей и животных, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ, Y. pestis 15 НИИЭГ или S. entheriditis 92, на выявление CD69-позитивных Т лимфоцитов. Нами было показано, что тулярин и КНК специфически усиливают синтез ИФН- и ФНОлимфоцитами и экспрессию CD69 маркера субпопуляцией CD3+CD4+.

Для оценки напряженности противотуляремийного иммунитета у людей в некоторых случаях используют накожную реакцию с тулярином, которая представляет собой реакцию гиперчувствительности замедленного типа. В реакции гиперчувствительности замедленного типа происходит активация фагоцитов и Т хелперов первого типа – Th1, приводящая к продукции ИФН-, ФНО- и усилению экспрессии CD69 [216]. Предлагаемая нами реакция с тулярином in vitro, позволяющая выявить специфическую экспрессию рецептора CD69 на поверхности CD4+субпопуляции Т-лимфоцитов и усиление синтеза ИФН- и ФНО- лимфоцитами CD3+CD4+, по всей видимости, является отражением накожной реакции с тулярином и может использоваться для выявления постинфекционного или поствакцинального иммунитета к туляремии.

Живая туляремийная вакцина генетически утратила патогенные свойства, и введение штамма F. tularensis 15 НИИЭГ человеку не приводит к развитию инфекционного заболевания. Тем не менее, вакцинный штамм сохранил способность размножаться в месте введения, в регионарных лимфатических узлах и внутренних органах.

После введения вакцины в организме развивается вакцинальный процесс, который длиться несколько недель, не приводит к развитию инфекционного процесса, и обеспечивает формирование напряженного иммунитета. У мышей после введения живой туляремийной вакцины в малых дозах формируется вакцинальный процесс, а после иммунизации большими дозами бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ формируется инфекционный процесс близкий к туляремии у людей [178]. Поэтому мыши широко используются в качестве экспериментальной модели для оценки протективности поствакцинального иммунитета [134, 144, 189].

В своих экспериментах мы сравнивали изменение иммунологических показателей у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ, т.е. формирование иммунного ответа при вакцинальном и инфекционном процессах. Также мы сравнили выраженность иммунологических реакций в зависимости от пути введения бактерий (подкожная и внутрикожная иммунизации).

Результаты исследований показали, что с увеличением дозы иммунизации как при подкожном введение, так и при внутрикожном введении живой туляремийной вакцины, увеличиваются концентрация антител в крови у животных. При введении низких доз вакцинного штамма (5 КОЕ/мышь) у некоторых мышей специфические антитела не выявляли.

В процессе формирования противотуляремийного иммунного ответа кроме синтеза антител В лимфоциты выполняют и другие функции [253]. В частности, В лимфоциты регулируют функциональную активность Т лимфоцитов, выступая в роли предоставляющих антиген клеток, несущих на поверхности костимулирующие молекулы [277] и синтезирующих цитокины [85, 355, 384], способствуя пролиферации и проявлению эффекторной функции Т лимфоцитами.

Мы оценивали появление на поверхности В лимфоцитов маркера ранней активации клеток CD69 в ответ на активацию клеток КНК. Известно, что на покоящихся лимфоцитах периферической крови CD69 рецептор не экспрессируется, но появляется в течение 1-2 часов после активации лимфоцитов.

CD69 является ранним маркером пролиферации лимфоцитов, участвует в механизме увеличения концентрации внутриклеточного Ca++, синтезе различных цитокинов и их рецепторов [99].

Было выявлено, что в ответ на стимуляцию клеток КНК на поверхности В лимфоцитов, полученных от интактных мышей, CD69 маркер появлялся у небольшого количества клеток ((4,5±0,54) %). В культуре спленоцитов, полученных от мышей иммунизированных разными дозами живой туляремийной вакциной, отмечали значительное увеличение количества CD19+ лимфоцитов, экспрессирующих СD69+ маркер в ответ на стимуляцию клеток КНК (от (17,1±3,51) до (44,12±5,4) % в зависимости от дозы иммунизации). Наиболее выраженное увеличение CD19+CD69+ субпопуляции наблюдалось в клеточных культурах спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных дозами 15 и 45 КОЕ/мышь. После иммунизации мышей живой туляремийной вакциной в дозах 5 и 135 КОЕ/мышь количество В лимфоцитов, экспрессирующих CD69+ в ответ на активацию клеток КНК, было меньшим, что свидетельствовало о менее выраженной активации В лимфоцитов, обусловленной по свей видимости недостаточной высокой/низкой дозой иммунизации. В наших экспериментах также было показано, что ЕD50 для живой туляремийной вакцины составляет 18 КОЕ/мышь.

В ряде работ предполагается, что Т-клеточный ответ in vitro на специфический антиген коррелирует с постинфекционной или поствакцинальной протективностью против заражения инфекцией [265, 403]. В нашей работе мы сравнивали изменения в экспрессии CD69 маркера Т хелперами и цитотоксическими лимфоцитами, полученными от интактных и иммунных мышей, под влиянием КНК. CD69 рецептор представляет собой мембранный протеин II типа, экспрессирующийся на поверхности Т лимфоцитов сразу после стимуляции их TCR рецептора. Кроме того экспрессия CD69 рецептора Т хелперами является сигналом к продвижению клетки по направлению к костному мозгу [276]. Таким образом, CD69 рецептор играет важную роль в формировании профессиональных Т-клеток памяти.

Нами было обнаружено, что Т лимфоциты, полученные от интактных животных, в присутствии КНК не усиливают экспрессию CD69 рецептора.

Т лимфоциты, полученные от животных иммунизированных живой туляремийной вакциной в любой дозе, в присутствии КНК начинали экспрессировать CD69 рецептор на поверхности клетки. Максимально выраженное усиление экспрессии CD69 маркера в присутствии КНК отмечали в субпопуляции цитотоксических лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной в дозе 15 и 45 КОЕ/мышь. На поверхности Т хелперов иммунных мышей в присутствии КНК также наблюдали усиление экспрессии CD69 маркера, но не так выраженно.

Исходя из приведенных данных, можно предположить, что используя метод по выявлению количества CD3+CD4+CD69+ и CD19+CD69+ клеток, появляющихся в ответ на активацию их in vitro КНК, можно подбирать оптимальную дозу для эффективной иммунизации мышей против туляремии.

Анализ пролиферативной активности лимфоцитов показал, что наиболее выраженная пролиферация лимфоцитов (60,44 %) в ответ на КНК отмечалась у мышей, иммунизированных подкожно или внутрикожно живой туляремийной вакциной в дозе 45 КОЕ/мышь.

Основными регуляторами иммунного ответа и воспалительных реакций являются цитокины [29]. У мышей иммунизированных живой туляремийной вакциной как подкожно, так и внутрикожно, отмечали специфическое усиление синтеза спленоцитами провоспалительных цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и некоторое увеличение противовоспалительного цитокина ИЛ-10 под влиянием КНК.

Сравнительный анализ влияния пути введения вакцины при одинаковых дозах на выживаемость и изменение веса животных позволил заключить о более безопасной внутрикожной иммунизации мышей.

Таким образом, после внутрикожной иммунизации мышей F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь не обнаруживались антитела к КНК в крови животных, но выявлялся клеточный ответ на стимуляцию спленоцитов КНК в реакциях in vitro (усиление пролиферативной активности, синтез ИЛ-17, появление CD69 рецептора на поверхности Т и В лимфоцитов). Сформированный специфический клеточный иммунитет был способен защитить животных от заражения высоковирулентным штаммом F. tularensis 503.

При низких дозах иммунизации у мышей возникает популяция специфических В лимфоцитов, активирующихся в присутствии КНК, но не синтезирующих антитела против КНК.

В зависимости от степени воспаления, регистрируемого по уровню падения веса и изменению цитокиновой активности, у мышей наблюдается усиление (при низких дозах иммунизации) или подавление (при дозе 135 КОЕ/мышь) клеточных реакций in vitro на КНК, а уровень гуморального ответа усиливается по мере увеличения иммунизирующей дозы.

Мы проанализировали длительность проявления клеточных и гуморальных реакций у мышей после иммунизации F. tularensis 15. На протяжении полугода у всех мышей, иммунизированных F. tularensis 15, выявлялся высокий уровень антител к КНК. В ответ на стимуляцию КНК in vitro спленоцитов, полученных от иммунизированных против туляремии мышей, отмечали усиление экспрессии CD69 маркера на поверхности В лимфоцитов, специфическое усиление CD69 рецептора на поверхности Т хелперов, усиливающееся к 120 дню после иммунизации, увеличение CD69-позитивной субпопуляции цитотоксических лимфоцитов, наиболее выраженное в первые три месяца после иммунизации мышей, специфическое усиление синтеза ИЛ-17 и ИФН- на протяжении всех сроков наблюдения. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных F. tularensis 15, в ответ активацию клеток КНК был максимально высоким на 30 сутки после иммунизации.

Во все сроки исследований (с 30 по 180 дни после иммунизации) отмечали F. tularensis 100 % выживаемость иммунизированных 15 мышей после подкожного заражения животных F. tularensis 503 в дозе 1000 Dсl.

Таким образом, защита мышей против F. tularensis 503 коррелировала с F. tularensis, наличием антител к ЛПС и КНК усилением экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов, синтезом ИФН- и Ил-17 спленоцитами в ответ на активацию клеток КНК.

После подкожного заражения иммунных мышей F. tularensis Schu в дозе 1000 Dсl выжило 100 % животных (на 30 сутки после иммунизации F. tularensis 15). Заражение мышей F. tularensis Schu на 60 сутки после иммунизации защищало 70 % животных от инфекции, на 90 сутки – 47 %, на 120, 150 180 сутки

– 20-27 %.

F. tularensis Заражение иммунных мышей Schu в дозе 1000 Dсl интраназально сообщало 75 % защиту на 30 сутки после иммунизации, 50 % – на 60, 90 и 120 сутки и 25 % выживаемость животных через 150 дней после иммунизации.

Таким образом, защита мышей против F. tularensis Schu коррелировала с наличием антител к ЛПС и КНК F. tularensis, усиленным синтезом ИФН-, Ил-17 (около 5000 пкг/мл) спленоцитами и высокой пролиферативной активностью лимфоцитов в ответ на активацию клеток КНК.

Для выявления корреляции между напряженнностью иммунитета к возбудителю туляремии и показателями клеточного и гуморального иммунитета мы иммунизировали мышей препаратами против туляремии, характеризующимися различной протективностью.

мышей F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis Мышей иммунизировали 1523A – мутантным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ с делетированной копией гена iglC и инактиваированным геном recA. Иммунизация мышей дважды F. tularensis 1523A обуславливала 100 % защиту животных от интраназального заражения 3000 КОЕ F. tularensis Schu. Иммунизация мышей F. tularensis 1523A, а затем F. tularensis 15 НИИЭГ способствовала формированию протективного иммунитета против заражения F. tularensis Schu у 60 % животных. Однократная иммунизация животных F. tularensis 1523A не было достаточным для формирования защиты от интраназального заражения F. tularensis Schu.

Учитывая, что у всех внутриклеточных патогенов в контроле инфицирования организма большую роль играет синтез провоспалительных реакций и цитокинов Th1 типа на ранних этапах заражения [15] мы проанализировали влияние антигенов F. tularensis на синтез цитокинов. Прежде всего мы проанализировали ИФН-, который используют для оценки противотуляремийного иммунитета [114] и ИЛ-17, который играет также большую роль в формировании противотуляремийного иммунитета. Именно ИЛ-17 активирует синтез ИФН- и ИЛ-12 макрофагами, таким образом связывая Th17 и Th1 ответы in vivo [278]. ИЛ-17 усиливает действие многих иммунных сигнальных молекул, индуцирует выработку цитокинов ИЛ-6, ГМ-КСФ, ИЛ-1, ТГФ-, ФНО-, хемокинов и простагландинов фибробластами, эндотелиальными клетками, кератиноцитами, макрофагами. ИЛ-17 синтезируется субпопуляцией CD4+ Т лимфоцитов, так называемых Th17 лимфоцитов [17, 20]. ИЛ-17 также продуцируется -Т-клетками, CD8+ Т-клетками, натуральными киллерами (NK-клетками) и NK-T-клетками. В определенных условиях ИЛ-17 может также вырабатываться тучными клетками, альвеолярными макрофагами и нейтрофилами [275]. ИЛ-17 выполняет ведущие функции в формировании специфического Th17 типа иммунного ответа, отличного от Th1, Th2.

Мы проанализировали концентрации ИЛ-1, ИЛ-5, ИЛ-6, ИФН-, ФНО- и ИЛ-17 в супернатантах тулярин-индуцированных и спонтанно-активрованных спленоцитах. Было обнаружено, что в результате стимуляции тулярином in vitro содержание ИФН- и ИЛ-17 значительно увеличивалось в супернантанте спленоцитов мышей, иммунизированных дважды F. tularensis 1523A (299,17 и 120,87 пкг/мл, соответственно) или иммунизированных F. tularensis 1523A и F. tularensis 15 НИИЭГ (55,67 и 158,04 пкг/мл, соответственно) по сравнению с данными интактной группы мышей (10,78 пкг/мл – для ИФН- и не выявляемая концентрация – для ИЛ-17). Синтез ИЛ-17 и ФНО- сленоцитами увеличивался в ответ на реактивацию клеток тулярином во всех группах иммунизированных мышей. Внутриклеточное окрашивание показало, что синтез ФНО- и ИФН- в субпопуляции CD4+ лимфоцитов увеличивался только в группах мышей, характеризующихся 100 % постиммунизационной протективностью против интраназального заражения F. tularensis Schu (100 %).

Активация Т лимфоцитов осуществляется при сочетанном взаимодействии некоторых рецепторов на поверхности Т лимфоцита с рядом комплементарных молекул на поверхности антигенпредставляющей клетки. Интерфейс между Т лимфоцитом и антигенпредставляющей клеткой со стороны Т лимфоцита состоит из TCR, CD4 или CD8, CD28, CD40L (CD154), CD45 [30].

CD154 является лигандом для CD40 молекулы, при взаимодействии которых появляются дополнительные стимулирующие сигналы, активирующие B лимфоциты [191]. CD154 экспрессируется на активированных Т-клетках, тучных клетках и базофилах. Сигнал, передаваемый в В лимфоцит через молекулу CD40, в конечном итоге обеспечивает включение в В лимфоцитах ряда событий первостепенной важности: переключение классов иммуноглобулинов, индукцию пролиферации и дифференцировки при гуморальном иммунном ответе [69, 339].

Этот сигнал важен также для развития В-клеток памяти и защиты В лимфоцитов от апоптоза. CD40-CD154 взаимодействие способствует активации костимулирующих молекул, активации антигенпрезентирующих клеток, а также влияет на Т-опосредованный эффекторный ответ [407].

CD28 участвует в формировании связи Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками. Кроме того активация CD28 рецептора необходима для T-клеточного ответа на антиген и В-клеточного ответа на антиген по Т-зависимому типу [248].Сравнительный анализ экспрессии CD28 на поверхности Т-клеток не выявило достоверных изменений между группами мышей.

Мы выявили, что в результате стимуляции спленоцитов тулярином экспрессия CD69 рецептора увеличивалась у CD4+T-клеток, выделенных от мышей, иммунизированных дважды F. tularensis 1523A или F. tularensis 1523A и F. tularensis 15 НИИЭГ и имеющих высокий уровень защиты против аэрозольного заражения F. tularensis Schu (100 и 60 %, соответственно). Мы проанализировали костимулирующие молекулы CD28 и CD154. Экспрессия обеих молекул CD28 и CD154 увеличивалась на поверхности Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию тулярином во всех группах животных.

Таким образом, в соответствии с полученными нами даннымио наличии клеточного противотуляремийного иммунитета можно судить на основании усиления синтеза цитокинов ИФН- и ИЛ-17 и увеличению экспрессиии CD69 рецептора CD3+CD4+ клетками в ответ на рестимуляцию спленоцитов тулярином или КНК.

Глава 4. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО

ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОГО ИММУНИТЕТА У ЛЮДЕЙ,

ВАКЦИНИРОВАННЫХ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ

4.1. Оценка гуморального противотуляремийного иммунитета 4.1.1. Выявление антител к антигенам F.tularensis в сыворотке крови людей Задачи исследования данного этапа работы состояли в выявлении уровня антител к антигенам ультразвукового дезинтеграта (УЗД) F. tularensis 15/10, ЛПС и кислотонерастворимого комплекса (КНК) F. tularensis в крови доноров. Мы проанализировали наличие антител против белков F. tularensis в сыворотках крови неиммунных доноров и иммунизированных живой туляремийной вакциной.

Использование УЗД F. tularensis для выявления антител показало низкую специфичность реакции, так как у 31 % контрольных доноров ранее не болевших туляремией и не вакцинированных против этой инфекции, выявлялись антитела в титрах от 1:100 до 1:1600 (таблица 8).

Таблица 8 – Выявление антител к антигенам F.tularensis в сыворотках крови доноров Доноры Титры антител

УЗД КНК ЛПС

Вакциниро- 1:160-1:5120 1:160-1:5120 у 10 % 1:400-1:5120 у 8 % ванные не выявляются не выявляются Контроль не выявляются у не выявляются у не выявляются у 69 % доноров; у 31 % 73 %; у 27 % – от 95 %; у 5 % – от

– от 1:100 до 1:1600 1:100 до 1:800 1:100 до 1:800 У всех вакцинированных против туляремии доноров титры антител к УЗД F. tularensis колебались в пределах 1:160-1:5120.

F. tularensis Использование КНК для выявления специфических противотуляремийных антител показало, что у контрольных невакцинированных доноров наблюдается положительная реакция в 10 % случаев и титры антител к КНК колеблются в пределах 1:100-1:800. У доноров вакцинированных против туляремии титры антител к КНК выявлялись в 90 % случаев и колебались в пределах 1:160-1:5120.

Использование ЛПС F. tularensis для выявления антител против туляремии показало наиболее специфические результаты. Только у 5 % контрольных доноров ранее не болевших туляремией и не вакцинированных против этой инфекции, выявлялись антитела к ЛПС в титрах 1:100-1:800. У вакцинированных против туляремии доноров антитела к ЛПС выявлялись в 92 % случаев. Через 1 месяц после вакцинации против туляремии у людей титры к ЛПС в сыворотке крови колебались в пределах 1:400-1:15120.

Мы провели сравнительный анализ уровня антител к КНК и ЛПС F. tularensis у многократно и первично вакцинируемых доноров против туляремии до вакцинации и после. У всех доноров вакцинированных впервые против туляремии уровень антител к КНК через 1 месяц после иммунизации поднимался до титра 1:800 и выше. У доноров, постоянно вакцинируемых против туляремии, уровень антител к КНК после вакцинации увеличивался менее выраженно (1:80-1:320).

Таким образом, анализ антител к УЗД, КНК, ЛПС F. tularensis у людей, вакцинированных против туляремии показал, что наиболее информативным для скрининга гуморального иммунитета против туляремии является выявление F. tularensis.

специфических антител к ЛПС Однако у 8% доноров, вакцинированных против туляремии, антитела к ЛПС не выявлялись.

4.1.2. Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей 4.1.2.1. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов Задачи исследования – сравнить изменение экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов, полученных от вакцинированных против туляремии и невакцинированных доноров, под влиянием антигенов F. tularensis.

У вакцинированных и невакцинированных доноров процентное содержание В лимфоцитов в цельной крови, экспрессирующих маркер ранней активации, колебался в диапазоне (3,68±2,56) %. После инкубирования гепаринизироавнной цельной крови в полной питательной среде в течение 24 ч процентное содержание В лимфоцитов, экспрессирующих CD69 рецептор, достоверно не изменялось и составляло (5,67±3,58) % от общей популяции CD19+ клеток.

После инкубирования в течение 24 ч клеток крови, полученных от иммунизированных живой туляремийной вакциной людей, в присутствии тулярина содержание CD19+CD69+ клеток составило (4,62±2,64) %, а в присутствии КНК – (5,70±2,25) %. У контрольных доноров содержание CD19+CD69+ популяции клеток после инкубирования крови в присутствии тулярина составило (3,89±3,04) %, а в присутствии КНК – (2,70±2,07) %.

В таблице 9 приведены индексы активации В лимфоцитов. Сравнение между данными титров антител к ЛПС и КНК F. tularensis в сыворотке крови донора и изменением экспрессии CD69 рецептора на поверхности В лимфоцитов в присутствии антигенов F. tularensis не позволило установить корреляцию между данными. В лимфоциты, выделенные от двух из шести невакцинированных против туляремии доноров, усиливали на поверхности экспрессию CD69 рецептора под влиянием тулярина (коэффициенты активации 2,17 и 2,54).

–  –  –

В лимфоциты, полученные от вакцинированных людей, в присутствии тулярина или КНК в 14 % и 23 % случаев, соответственно, не усиливали экспрессию CD69 маркера на поверхности клетки.

Таким образом, в присутствии тулярина или КНК на поверхности В лимфоцитов, полученных как от контрольных, так и от иммунизированных живой туляремийной вакциной доноров, в некоторых случаях появлялся маркер ранней активации CD69.

4.1.2.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности лимфоцитов и моноцитов Задачи исследования – сравнить изменение экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов и моноцитов, полученных от вакцинированных против туляремии и невакцинированных доноров, под влиянием антигенов F. tularensis.

Анализ изменения процентного содержания СD138+ моноцитов крови, полученной от людей, неиммунных и иммунизированных живой туляремийной вакциной в ответ на активацию клеток in vitro тулярином или КНК F. tularensis в течение 24 ч, показал неспецифическое усиление экспрессии СD138 маркера на поверхности моноцитов (рисунок 21).

Б А

А – полученные от здоровых не вакцинированных доноров, Б – иммунизированные живой туляремийной вакциной людей, после инкубирования клеток в течение 24 ч в среде (тонкие линии), в среде с КНК (толстые линии) или с тулярином F. tularensis (штрих-линии).

Напротив делений оси 1 указаны проценты. На каждой оси двумя маркерами отображены индивидуальные данные, полученные от одного донора.

Рисунок 21 – Процентное содержание субпопуляции моноцитов, экспрессирующих CD138+ Количество CD19+СD138+ клеток, полученных от доноров, не иммунных и иммунизированных живой туляремийной вакциной, после инкубирования в полной питательной среде составило (2,35±1,32) %. Под влиянием тулярина или КНК процентное содержание CD19+СD138+ клеток в крови, полученной от вакцинированных против туляремии или невакцинированных доноров, статистически достоверно не изменялось.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |
 

Похожие работы:

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.