WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая ...»

-- [ Страница 3 ] --

1.2.5. Поиск маркеров, отражающих наличие протективого противочумного иммунитета Иммунизация мышей отдельно или совместно F1 и V антигенами чумного микроба индуцирует синтез специфически антител и формирование протективного противочумного иммунитета [402]. Хотя наличия специфических антител достаточно для выживания мышей после заражения их вирулентным штаммом Y. pestis [401], для морских свинок [214] и приматов [398] наличия только одних антител против F1 и/или V антигенов недостаточно. Введение F1 и V антигенов, адсорбированных на гидроксиле алюминия, приводит к развитию клеточного иммунного ответа по CD4+ Th2 типу [400].

Использование других типов адъювантов может стимулировать формирование иммунного ответа по CD4+ Th1 типу [146, 148]. В ряде экспериментов было показано, что в формировании протективного противочумного иммунного ответа ведущую роль играет активация CD4+ клеток по Th1 типу. Корреляция между уровнем антител к F1 и V антигенам у мышей с протективностью противочумного иммунитета связана с тем, что антитела участвуют в активации иммунного ответа по Th1 [397]. Исследования, проведенные на приматах, показали, что пассивное введение антител против F1/LcrV в организм животных, не предохраняет их от аэрозольного заражения чумой [73]. Полученные данные позволяют заключить, что выявление антител против F1/LcrV Y. pestis, по крайней мере, стандартными методами ИФА, не достаточно для заключения о наличии протективного противочумного иммунитета. Для заключения о протективности противочумного иммунитета необходимо оценивать также клеточные специфические реакции [396].

Для выявления противочумного клеточного иммунитета были предприняты попытки оценивать цитотоксичность V антигена в отношении клеток перевиваемой клеточной линии макрофагов J774 в присутствии сыворотки крови [399], изменение экспрессии поверхностных маркеров лейкоцитов в присутствии антигенов чумного микроба [400]. Однако никаких воспроизводимых тестов разработано не было. Наиболее интересными были результаты по изменению синтеза ИФН- спленоцитами иммунизированных мышей в ответ на стимуляцию из антигенами чумного микроба [345].

Внутрикожное введение убитых клеток вакцинного штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ (микробный пестин) приводит к формированию повышенной чувствительности кожи, как проявление поствакцинального и постинфекционного иммунитета у людей. Развивающуюся кожно-аллергическую реакцию ранее использовали в качестве показателя иммунитета при чуме. Однако в связи с высокой вероятностью побочных эффектов в настоящее время эта реакция не используется. Развитие аллергических реакций тесно связано с функциональной активацией клеток врожденного иммунитета [30]. Альтернативой кожным пробам могут служить биологически безопасные методы оценки антибактериального иммунитета в условиях in vitro, основанные на выявлении особенностей морфологии активированных и поврежденных нейтрофилов, на количественном измерении степени дегенеративных изменений, развивающихся под влиянием специфического аллергена в ядерном хроматине и/или лизосомальных гранулах активированных нейтрофилов крови человека [22, 23]. Одним из показателей функциональной активации клеток врожденного иммунитета при воспалительных реакциях, развивающихся под влиянием специфических аллергенов, является секреторная дегрануляция нейтрофилов с высвобождением сериновых протеаз из гранул на поверхность клеток и во внеклеточное пространство. В связи с этим предпринимались попытки выявлять противочумный иммунитет по усилению дегрануляции гранулоцитов под влиянием аллергена чумного микроба (микробного пестина) в условиях in vitro [22, 23].

Также препринимались попытки по ценке напряженности противочумного иммунитета у людей по уровню синтеза цитоикнов ИЛ-4 и ИФН- [46].

CD4+ У мышей были идентифицированы эпитопы Т-лимфоцитов, связывающихся с F1 и V антигенами [270, 338]. Было также продемонстрировано, что эпитоп на поверхности CD4+ Т-лимфоцитов для F1 антигена является необходимым для формирования протективного противочумного иммунитета на модели мышей [91].

Y. pestis могут активировать апоптоз макрофагов in vitro за счет активации Yop-белков [388]. При наличии антител против LcrV происходит ингибирование транслокации Yop-белков [113, 292] и апоптоза макрофагов [73, 388].

Исследователями из USAMRIID был предложен цитометрический метод для выявления цитотоксического действия на перевиваемую клеточную линию HL60 в присутствии оцениваемой сыворотки модифицированного штамма Y. pseudotuberculosis, экспрессирующего LcrV Y. pestis [73]. Была найдена корреляция между способностью сыворотки супрессировать апоптоз клеток линии HL60 под влиянием Y. pseudotuberculosis, экспрессирующего LcrV Y. pestis, и выживаемостью rF1/V-вакцинированных приматов после аэрозольного заражения чумой. Тем не менее, некоторые приматы, сыворотки которых не обладали способностью ингибировать апоптоз клеток линии HL60 в исследованиях in vitro, выжили после заражения [73].

У людей антитела против F1 обнаруживают в сыворотке крови не более чем 4 года [304] после заболевания чумой. У вакцинированных против чумы людей антитела против F1 антигены детектируют от 6 месяцев до 1 года после иммунизации [244].

В недавних исследованияхBei Li [244] показано, что через 10 лет после заболевания бубонной чумой 51 из 65 обследованных людей (78,5 %) являлись серопозитивным по F1 антигену. Скрининг антител к различным антигенам чумного микроба в крови людей, переболевших чумой от 1 года до 15 лет назад, позволил показать, что в первый год после заболевания выявляется максимальное количество специфичных антител к различным антигенам Y. pestis. С годами разнообразие антител к антигенам чумного микроба уменьшается и через 15 лет обнаруживались антитела только к F1, LcrV и YopD антигенам. LcrV и YopD кодируются системой секреции III типа и важны для вирулентности Y. pestis.

Выявление антител к F1, LcrV и YopD антигенам свидетельствует о важности данных антигенов для формирования протективного противочумного иммунитета [244].

Попытка оценить клеточный иммунитет по выявлению Т-клеток памяти у переболевших четыре-шесть лет назад людей на основе усиления синтеза ИФНлимфоцитами в присутствии F1 и LcrV не привела к успеху. Это может быть вызвано несколькими причинами. Во-первых, F1 и LcrV могут не быть доминантными антигенами для стимуляции Т-лимфоцитов [244]. Во-вторых, F1 и LcrV могут активировать Т-лимфоциты только в период острой фазы инфекции. У людей, переболевших чумой два года назад, под влиянием F1 и LcrV выявляли усиление синтеза лимфоцитами ИЛ-6, но не ИЛ-2 и ИФН- [386].

Таким образом, можно заключить, что методы определения противочумного клеточного иммунитета не разработаны. Оценка противочумного клеточного иммунитета необходима как на стадии разработки новых вакцинных препаратов, так и для скрининга противочумного клеточного иммунитета у людей.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ШТАММЫ Штаммы. F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 15 23 rec A, F. tularensis Schu, Y. pestis EV линии 15 НИИЭГ, Y. pestis 231 получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия).

F. tularensis 15 НИИЭГ – туляремийный вакцинный штамм, F. tularensis 503

– природный вирулентный штамм. F. tularensis 15 23 rec A, производный вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ, с делетированной копией гена iglC и инактивированным геном rec A. F. tularensis Schu – вирулентный штамм subsp. nearctica.

Y. pestis EV линии 15 НИИЭГ – чумной вакцинный штамм, Y. pestis 231 – вирулентный штамм.

B. anthracis СТИ-1 – вакцинный штамм.

В. anthracis 2-я вакцина Ценковского – тест-заражающий штамм.

2.2. Среды и условия культивирования Штаммы F. tularensis культивировали на FT агаре (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) 16-18 ч при температуре 37 С. Для иммунизации и заражения мышей биомассу суспендировали в фосфатно-солевом буфере.

Штаммы Y. pestis культивировали на агаре Хоттингера (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) с добавлением 1 % гемолизированной крови в течение 48 ч при температуре 37 С.

Штаммы В. anthracis выращивали в течение 3-5 сут на агаре Хоттингера при температуре 37 °С. Биомассу смывали с поверхности агара и дважды отмывали дистиллированной водой. Перед иммунизацией или заражением споры прогревали при температуре 65 °С в течение 30 мин.

2.3. Антигены микроорганизмов F. tularensis Кислото-нерастворимый комплекс (КНК) – белковолипополисахаридная фракция, полученная из осветленного лизата бактерий F. tularensis 15 линии НИИЭГ в результате его закисления до рН 4,5. Препараты КНК предоставлены доктором биологических наук В.М. Павловым (отдел микробиологии чумы ГНЦ ПМБ). Все препараты антигенов чумного микроба получены из лаборатории микробиологии чумы ГНЦ ПМБ.

Тулярин – аллерген туляремийный жидкий для накожного применения, ампула содержит 109 бактерий F. tularensis 15, инактивированных нагреванием.

F1 – капсульный антиген Y. pestis явялется компонентом плазмиды pFra, используется как один из протективных антигенов в большинстве современных субъединичных вакцин для профилактики чумы.

Pla – плазминоген активатор Y. pestis. Фактор, кодируемый плазмидой pPst, способствует деградации фибринового тромба, а также вызывает деградацию Yops белков, что, возможно, позволяет возбудителю “маскировать” от иммунной системы важнейшие компоненты TTSS.

V-антиген Y. pestis – соматический иммуногенный антиген. Подавляет продукцию ИФН- и ФНО-.

УЗД F. tularensis 15, Y. pestis EV получены 8-кратной обработкой штаммов с последующим высевом на питательную среду для подтверждения гибели микроорганизмов.

Аллерген сибиреязвенный – антраксин (СтавНИПЧИ).

Протективный антиген В. anthracis (PA) – носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием.

Летальный фактор В. anthracis (LF) – в смеси со протективным вызывает гибель крыс, белых мышей и морских свинок.

2.4. Лабораторные животные Экспериментальная часть выполнена с использованием в качестве биомоделей 1000 инбредных мышей линии BALb/c весом 18-20 г, полученных из отдела экспериментальных животных вивария ГНЦ ПМБ [25].

В ходе выполнения работы были обследованы вакцинированные волонтеры и не привитые доноры, которых использовали в качестве группы сравнения.

Вакцинацию коммерческими живой чумной вакциной (ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора) и живой туляремийной вакциной (ГУП НПО «Микроген») проводили накожным способом в плановом порядке и согласно приказу Минздрава России от 27.07.2001 № 229 «О национальном календаре профилактических прививок по эпидемическим показаниям» и в полном соответствии с утвержденными инструкциями по применению вакцин. Клинические лабораторные исследования проводились согласно лицензии на медицинскую деятельность № ФС-99-01-006505 от 17.09.2009 г., выданной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на осуществление медицинской деятельности ГНЦ ПМБ.

2.5. Схемы иммунизации животных Мышей иммунизировали живой чумной вакциной однократно, подкожно в дозе 104 КОЕ/мышь. На 28 сутки после иммунизации у части иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и селезенки на исследования. Вторую половину экспериментальных животных заражали вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозе 200 Dcl/мышь подкожно. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суток, погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Все зараженные чумой интактные мыши погибали на четвертый-шестой дни после заражения.

Мышей иммунизировали живой туляремийной вакциной однократно, подкожно или внутрикожно в дозах 5, 15, 45 и 135 КОЕ/мышь. На 28 сутки после иммунизации у половины иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и спленоциты на исследования. Вторую половину экспериментальных животных заражали вирулентным штаммом F. tularensis 503 в дозе 1103 КОЕ/мышь подкожно. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суток, погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Все зараженные туляремией интактные мыши погибали на четвертый-шестой дни после заражения.

Мышей иммунизировали живой туляремийной вакциной однократно, подкожно или внутрикожно в дозе 10 КОЕ/мышь. На 30, 60, 90, 120, 150 и 180 дни после иммунизации у половины иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и спленоциты на исследования. Вторую половину экспериментальных F. tularensis 503 животных заражали вирулентным штаммом в дозе 1103 КОЕ/мышь подкожно. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суток, погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Все зараженные туляремией интактные мыши погибали на четвертый-шестой дни после заражения.

Все животные были поделены на четыре группы (15 мышей в каждой).

F. tularensis 15 23 rec A Мышей иммунизировали подкожно однократно (1103 CFU); двукратно: F. tularensis 15 23 rec A (1103 КОЕ), а через четыре недели F. tularensis 15 23 rec A (1104 КОЕ) или F. tularensis 15 НИИЭГ (1104 КОЕ). На 28 сутки после последней иммунизации по пять мышей из каждой группы использовали для проведения иммунологических исследований.

По 10 мышей из каждой группы заражали интраназально F. tularensis Schu 100 DCL (1 DCL соответствует 30 КОЕ для мышей BALb/c). Все интактные мыши погибали на четвертый-шестой дни после заражения.

Мышей линии BALB/c иммунизировали однократно подкожно протективной дозой (107 спор) коммерческой вакцины B. anthracis СТИ-1. В качестве контрольной группы использовали интактных животных. На 21 сутки иммуногенеза полноценность сформированного у животных приобретенного иммунитета подтверждали в опытах по заражению вирулентным штаммом – В. anthracis 2-я вакцина Ценковского (значение индекса иммунитета составило 125,9.).

2.6. Выделение иммунокомпетентных клеток 2.6.1. Получение спленоцитов Для получения спленоцитов мышиные селезенки измельчали стеклянным гомогенизатором в среде 199 (ПанЭко, Москва), с 40 мкг/мл гентамицина (Дальхимфарм, Хабаровск) и 5 % эмбриональной телячьей сывороткой (BioClot, Germany). Клетки фильтровали через капроновую сеточку, центрифугировали и дважды отмывали средой 199 с 5 % эмбриональной телячьей сывороткой. Осадок ресуспендировали в полной питательной среде (ППС) следующего состава: 90 % среды RPMI 1640 (ПанЭко, Москва), 10 % эмбриональная телячья сыворотка, предварительно инактивированная теплом (56 °С, 30 мин), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10 мМ HEPES (Flow, Англия), 40 мг/л гентамицина, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США), после чего подсчитывали число жизнеспособных клеток с трипановым синим на автоматическом клеточном счетчике CountessTM (Invitrogen, Корея). Количество жизнеспособных лимфоцитов доводили до концентрации 2106 клеток/мл.

2.6.2. Выделение лимфоцитарной массы на градиенте плотности Человеческие лимфоциты (5106 клеток/мл) были выделены из крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Diacoll-1077 (Диа-М, Москва). Для этого цельную кровь смешивали с фосфатносолевым буфером (ФСБ) в соотношении 1:3 и 4 мл смеси наслаивали на градиент плотности в соотношении 1:1. Центрифугировали при температуре 4 С в течение 45 мин. Белесое лимфоцитарное кольцо, образованное на границе раздела двух сред отбирали и отмывали дважды в ФСБ.

2.7. Стимуляция лимфоцитов В качестве стимуляторов использовали антигены F. tularensis и Y. pestis, ЛПС E. coli (Sigma, США), Сon A (Sigma, США), GolgiPlug (BD Вioscience, США), тулярин (Омск, Россия).

(2106 Лимфоцитарную массу клеток/мл) инкубировали в лунках 96-луночного планшета по 200 мкл при температуре 37 °С, во влажной атмосфере, 5 % углекислого газа (СО2) в присутствии 10 мкг/мл антигенов (КНК F. tularensis, V, F1, Pla Y. pestis или УЗД F. tularensis 15 или Y. pestis EV), тулярина (108 КОЕ/мл) или в среде в течение 24 ч – для выявления субпопуляций активированных лимфоцитов по поверхностным маркерам; 48 ч – для анализа внутриклеточных цитокинов, 72 ч – для анализа уровня цитокинов в надосадочной жидкости (супернатанты хранили не более месяца при температуре минус 80 С); шести суток – для определения пролиферативной активности лимфоцитов.

2.8. Цитометрический анализ 2.8.1. Окрашивание поверхностных маркеров Иммунокомпетентные клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным маркерам мыши или человека: CD3, CD28, CD95, CD86, CD80, CD25 (BD Biosciences Farmigen), CD4 APC, CD8 PE, CD69, CD19, CD22 (Caltag, Invitrogen), меченными флюорохромами FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5.

5 или APC, в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, к 100 мкл анализируемой клеточной взвеси добавляли по 1 мкл моноклональных антител. Инкубировали 30 мин при температуре 4 С. Добавляли 2 мл холодного отмывочного буфера и центрифугировали при скорости 400g в течение 5 мин. Сливали супернатант и ресуспендировали клетки в 200 мкл ФСБ и 200 мкл 1 % формальдегида для фиксации. Цитометрический анализ проводили не позднее, чем через 24 ч.

2.8.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов Для выявления процентного содержания Т лимфоцитов, синтезирующих цитокины, за четыре часа до окрашивания моноклональными антителами к клеточной суспензии добавляли ингибитор белкового транспорта BD GolgiPlug (BD Biosciences, США), содержащий брефелдин А. Через четыре часа клеточную суспензию фиксировали и пермеабилизировали добавлением BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, США), а затем отмывали в фосфатно-солевым буфере, содержащим 0,5 % раствор сапонина (BD Biosciences, США). После этих процедур клетки окрашивали моноклональными антителами против поверхностных и внутриклеточных маркеров. По окончании времени экспозиции клеточную суспензию отмывали в фосфатно-солевом буфере, содержащим 0,5 % раствор сопанина, а затем фиксировали в 2 % параформальдегиде (Sigma, США).

2.8.3. Цитометрический анализ экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов Клеточные суспензии с окрашенными поверхностными маркерами и внутриклеточными цитокинами анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur, BD (США) с использованием программы «Cell QuestPro».

Оценивали 15000 событий. Для анализа интересующих нас субпопуляций сначала проводили гейтировали (выделение субпопуляции для последующего статистического анализа) по прямому и боковому светорассеянию, что позволяло выявить клетки определенного размера и гранулярности, соответственно. Затем проводили гейтирование (рисунок 1) по поверхностным маркерам, позволяющим отдельно анализировать субпопуляции (в частности, Т, В лимфоциты, Т хелеперы и цитотоксические лимфоциты).

–  –  –

Рисунок 1 – Гейтирование и анализ процентного содержания Т и В лимфоцитов в пуле спленоцитов методом цитометрического анализа Гейтированные популяции лимфоцитов далее анализировали на наличие поверхностных маркеров или уровень активности синтеза цитокинов. Пример дальнейшего анализа гейтированных лимфоцитов показан на рисунке 2.

Рисунок 2 – Цитофлюорограммы, отображающие Т хелперы, синтезирующие с разной активностью цитокин ИФННа Dot Plot-гистограмме 2 А отображены CD3+CD4+ лимфоциты – Т хелперы (правый верхний квадрант). На рисунке 2 Б и 2 В показаны линейные гистограммы субпопуляции Т хелперов. Клетки, синтезирующие ИФН-, располагаются под отрезком М1. Гистограмма 2 Б свидетельствует о небольшой численности Т-хелперов, синтезирующих ИФН-. Гистограмма 2 В характерна для стимулированных лимфоцитов, которые синтезируют ИФН-.

В наших экспериментах мы сравнивали изменения под влиянием антигенов количества анализируемых субпопуляций клеток, экспрессирующих маркер или синтезирующих цитокин, в группах инактных и иммунизированных животных или доноров.

2.8.4. Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом цитофлюориметрии с использованием CFSE (карбоксифлуоресцеинсукцимидиловый эфир) красителя Принцип метода основан на том, что окрашенные карбоксифлуоресцеином (CFSE) лимфоциты делятся под влиянием митогена и из одной клетки с большей (исходной) интенсивностью свечения образуются две дочерние, интенсивность свечения каждой из которых примерно в два раза ниже исходной. Чем больше делений (митозов) клетка прошла, тем ниже уровень свечения. На цитометрической гистограмме окрашенные CFSE клетки располагаются в виде ряда последовательных пиков с уменьшающейся интенсивностью свечения.

Окрашивание клеток CFSE проводили до начала культивирования спленоцитов в соответствии с инструкцией производителя (BD e-Bioscince, США). Вкратце, 5010 кл/мл окрашивали CFSE в концентрации 5 мкмоль/мл.

Клетки инкубировали при температуре 37 C, в атмосфере 5 % углекислого газа (CO2) и 5 % влажности в течение 10 мин. Затем добавляли 3 мл охлажденной среды RPMI-1640, инкубировали на холоде в течение 5 мин, после чего дважды отмывали охлажденной RPMI-1640, содержащей 10 % фетальной сыворотки.

Центрифугировали при температуре 4 C в течение 5-7 мин при скорости 800 g.

Клетки ресуспендировали в ППС на основе RPMI-1640 до концентрации 110 кл/мл. Затем клеточную суспензию вносили в лунки 96-луночного планшета в соответствии со схемой эксперимента и инкубировали в течение 6 суток (37 С, 5% СO2, 95 % влажности) при необходимости обновляя среду. По окончании инкубирования клеточную взвесь переносили в цитометрические пробирки, добавляли по 500 мкл ФСБ, встряхивали, центрифугировали при температуре 4C в течение 5 мин при 350g. Сливали супернатант, перемешивали и добавляли в каждую пробирку по 150 мкл 1 % раствора формалина. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD, США) с использованием программы Cell QuestPro.

Цитометрический анализ проводили по трем параметрам: малое угловое светорассеяние (FCS), боковое светорассеяние (SSC) и каналу Fl1, выявляющему флуоресценцию КФДАСЭ (рисунок 3).

–  –  –

Рисунок 3 – Пролиферативная активность лимфоцитов Сначала гейтировали лимфоциты по угловому (FCS) и боковому (SSC) светорассеяниям, а затем анализировали количество пролиферирующих внутри гейта лимфоцитов.

В наших экспериментах мы сравнивали изменения под влиянием антигенов количества пролиферирующих лимфоцитов в группах инактных и иммунизированных животных или доноров.

2.8.5. СBA анализ Определение концентраций цитокинов ИЛ-1, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-17, ИФН- и ФНО- проводили в супернатанте культур спленоцитов с использованием набора для выявления Th1/Th2 цитокинов (Bender MedSystem, Германия). В данном анализе для одновременного определения различных цитокинов в пробах малого объема используются одновременно восемь частиц с различной интенсивностью флюоресценции. Каждая частица специфически связывается с одним из цитокинов. Для выявления концентрации цитокинов используют стандарты, имеющиеся в наборе. Анализ проводили в соответствии с инстукцией производителя. Вкратце, в пробирку вносили частицы, меченные антителами к цитокинам, из расчета 1 мкл/тест, инкубировали 2 часа. Затем добавляли 1 мл Wash Buffer в каждую пробирку и центрифугировали при скорости 200 g 5 минут.

Аккуратно отобирали надосадочную жидкость из каждой пробирки. Вносили по 300 мкл Wash Buffer в каждую пробирку и перемешивали на вортексе.

Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре с использованием программы FCAP Array.

2.9. Определение титра антител к антигенам чумного микроба Для определения титра антител использовали твердофазный иммуноферментный анализ. Сыворотки тестировали на планшетах, сенсибилизированных раздельно антигенами V и F1. В качестве контролей использовали сыворотки не иммунизированных мышей и сыворотки животных, которым водили суспензию гидроокиси алюминия без антигенов. При анализе антител у людей в качестве контролей использовали сыворотки, полученные от доноров, не вакцинированных против чумы и не работающих с антигенами чумного микроба.

F1 и V антигены сорбировали на планшеты в течение 1 ч при температуре 37 C в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,6. После каждого этапа планшеты промывали 10 мМ трис-буфером, содержащим 0,15 М хлористого натрия (NaCl) и 0,05 % твина-20, рН 7,2. Начиная с разведения 1:1000, антитела разводили с шагом в 2,5 раза. Каждую сыворотку тестировали на трех различных планшетах.

Продолжительность инкубации с рабочими растворами на всех этапах составляла 1 ч при температуре 37 °C.

Конъюгаты антимышиных антител с пероксидазой хрена разводили 1:3000. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин, ферментативную реакцию останавливали через 15 мин 1 М раствором серной кислоты и определяли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 490 нм. Результаты ИФА оценивали на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» («Пикон», Россия) При измерении использовали функцию автоматического вычитания фона.

2.10. Определение антител к антигенам F. tularensis Выявление специфического связывания КНК, ЛПС, тулярина с антителами в сыворотках мышей проводили общепринятым методом непрямого иммуноферментного анализа. антигены адсорбировали по 10 мкг/мл в лунках 96-луночных плоскодонных полистирольных планшетов для ИФА. Результаты ИФА оценивали по оптической плотности окрашенного раствора на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм.

В качестве контролей использовали сыворотки не иммунизированных мышей. При анализе антител у людей в качестве контролей использовали сыворотки, полученные от доноров, не вакцинированных против туляремии и не работающих с антигенами тулремийного микроба.

2.11. Определение напряженности иммунитета Оценку вирулентности проводили на мышах в условиях лаборатории уровня биологической безопасности BSL3. Мышей заражали подкожно 10-кратно возрастающими дозами суспензии 28-градусных культур Y. pestis 231 в изотоническом растворе хлористого натрия (NaCl) в объеме 0,2 мл на животное (заражающая доза составляла от 2100 до 2105 КОЕ). Каждой заражающей дозой иммунизировали группу, состоящую из 5 животных. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суток, погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Вычисление величин LD50 проводили по методу Кэрбера в модификации Ашмарина. Напряженность иммунитета (индекс иммунитета (ИИ)), т.е. способность вакцинного препарата предохранять животное от заражения массивными дозами вирулентной культуры, определяли по величине заражающей дозы, выраженной в LD50 вирулентного штамма для интактных животных, при заражении которой на 21 сутки выживают не менее 50 % животных, определяли по формуле LD50имм ИИ=, (1) LD50инт где ИИ – индекс иммунитета;

LD50имм – LD50 для животных, иммунизированных исследуемым препаратом препаратом, КОЕ;

LD50инт – LD50 для интактных животных, КОЕ.

На 28 сутки после иммунизации F. tularensis 15 по 10 мышей заражали подкожно штаммом F. tularensis 503 (LD50 меньше 10 КОЕ): интактных – в дозе 10 КОЕ/мышь; иммунизированных штаммом F. tularensis 15 линии НИИЭГ – в дозе 500 КОЕ/мышь (50 LD50). Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Селезенки павших животных гомогенизировали и высевали на FT агар.

2.12. Постановка реакции лейкоцитолиза с тулярином В две лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл 10 % раствора цитрата натрия. В опытную лунку добавляли 50 мкл антигена (тулярина накожного, содержащего 11010 бактерий в 1 мл), а в контроль 50 мкл физиологического раствора. Кровь в количестве 100 мкл вносили в каждую из лунок. Планшет закрывали и помещали на 2 ч в термостат при температуре 37 С.

Кровь в лунках тщательно перемешивали, забирали с помощью микропипеточного дозатора по 20 мкл из каждой лунки поочередно и переносили в лунки для микроагглютинации, содержащие 0,4 мл 3 % уксусной кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета метиленовым синим.

Количество лейкоцитов подсчитывали в обеих лунках в камере Горяева.

Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в кучки, не учитывали.

Коэффициент лейкоцитолиза подсчитывали по формуле Мк Мо (2) К% 100, Мк где K % – коэффициент лейкоцитолиза,%;

Мк – количество лейкоцитов в контрольной лунке;

Мо – количество лейкоцитов в опытной лунке.

Оценка результатов:

K % = 15 % – отрицательный или сомнительный результат;

K % = 16-20 % – слабоположительный;

K % = 21-30 % – положительный;

K % = 31 % и выше – резко положительный.

2.13. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Митогенную активность к тулярину (108 КОЕ/мл), КНК туляремийного микроба (5 мкг/мл) и УЗД F. tularensis 15/10 (107 КОЕ/мл) оценивали методом бласттрансформации лимфоцитов [266]. Человеческие лимфоциты (5106 кл/мл) были выделены из крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Fikoll-pack (1,077) и в концентрации 2105 клеток/мл помещены в 96-луночный планшет для культуры клеток (Costar Copning, США) в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) и 2 мМ L-глутамина. Лимфоциты инкубировали с антигенами в течение 48 ч при температуре 37 С в газовой среде с 5 % углекислого гоза (СО2). В качестве неспецифического стимулятора Т-клеток использовали конканавалин А (Sigma, США) в концентрации 5-10 мкг/мл. Пролиферацию оценивали с помощью добавления [3H]-тимидина (1 мкКи/лунку, «Изотоп», Россия) и последующей 16-часовой инкубации. Радиоактивный изотоп включается в клетки, входящие в митотический цикл деления. Включение [3Н]-тимидина была определено на сцинтиляционном счетчике Rackbeta (LKB, Sollentuna, Швеция). Результаты представлены в виде индексов стимуляции, рассчитанных как отношение импульсов в минуту (CPM-count per minutes) в присутствии антигена и без него.

2.14. Статистический анализ Обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики при помощи программы Microsoft Excel 2007. Критерий Стьюдента применялся в работе для определения статистически значимых различий между средними значениями двух групп. Результаты экспериментов были представлены как средняя величина, стандартное отклонение (ошибка среднего) и достоверность различий между группами, с вычислением доверительного интервала (P), определяемого путем расчета критерия Стьюдента t с помощью программ статистической обработки данных, встроенных в программу Microsoft Excel 2007. Стандартные отклонения P менее чем 0,05 считали статистически достоверными.

Глава 3. ОЦЕНКА ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОГО КЛЕТОЧНОГО И

ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/с ПОСЛЕ

ИММУНИЗАЦИИ ПРЕПАРАТАМИ ПРОТИВ ТУЛЯРЕМИИ

После иммунизации живой туляремийной вакциной формируется специфический гуморальный и клеточный иммунитет. Формирование протективного иммунитета против туляремии связано в первую очередь со специфической перестройкой клеточного звена иммунитета. Поэтому при разработке вакцинных препаратов против туляремии выявление специфического клеточного иммунного ответа является первоочередной задачей, тогда как оценка титров специфических антител играет второстепенную роль.

Традиционным методом оценки клеточного противотуляремийного иммунитета является реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Однако, тест РБТЛ длительный [358] и связан с применением радиоактивных меток.

Также необходимо отметить, что в тесте РБТЛ определяется суммарная пролиферативная активность общего пула лимфоцитов: Т- и В-субпопуляции.

В формировании протективного специфического иммунитета против возбудителей туляремиии основная роль отводится Т лимфоцитам, прежде всего, Th1 субпопуляции [114]. Одной из основных характеристик лимфоцитов Th1 типа является способность к продукции ИФН- – цитокина, который вызывает усиление цитотоксических реакций, опосредованных Т лимфоцитами и NK клетками, а также активацию макрофагов, значительно увеличивая их антибактериальную активность [30].

Усиление синтеза ИФН- и пролиферативной активности лимфоцитов происходит за счет активации Т лимфоцитов, которое начинается с изменения уровня экспрессии поверхностных маркеров, отражающих функциональную активность клеток. В связи с этим в ряде исследований предпринимались попытки выявить корреляцию между изменением экспрессии маркеров лимфоцитов, их пролиферативной активностью, цитокиновой активностью и напряженностью противотуляремийного иммунитета [106, 343, 383].

С появлением современных цитометрических методов исследований стало возможным оценивать функциональную активность отдельных субпопуляций клеток, в том числе клеток памяти. В печати последних лет появились работы, направленные на выявление клеток памяти и оценки изменения их активности при рестимуляции антигенами возбудителя инфекции. В работах K. Enesltt [150], R. Salerno-Goncalves [320], M. Pepper [286] оценивались пролиферативная активность клеток памяти CD45RO+CD4+ или CD45RO+CD8+ T лимфоцитов, синтез ими ИФН-, ФНО- и ИЛ-2 [150, 333, 343] в ответ на рестимуляцию специфическим антигеном, изучали изменение активности цитокинов ИФНлимфоцитов, оценивали изменение дегрануляционной активности цитотоксических лимфоцитов, синтез макрофагального воспалительного белка 1b (MIP 1-b) [106, 343, 383].

Тем не менее, методов оценки специфического клеточного иммунного ответа, четко коррелирующих с напряженностью противотуляремийного иммунитета, не разработано.

Цель исследования данного раздела – сравнить изменения экспрессии маркеров лимфоцитов, пролиферативной активности и цитокиновой активности лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis между группами интактных и иммунизированных против туляремии мышей.

В представленной работе для выявления клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета у экспериментальных мышей использовали F. tularensis тулярин и кислото-нерастворимый комплекс (КНК).

Противотуляремийный клеточный иммунитет оценивали по изменению экспрессии поверхностных маркеров и уровня синтеза цитокинов лимфоцитами в ответ на активацию их антигенами in vitro. Гуморальный противотуляремийный иммунитет оценивали методом ИФА по выявлению антител к антигенам F. tularensis.

Наличие протективного иммунитета у мышей после иммунизации против туляремии подтверждали в экспериментах с подкожным заражением мышей вирулентным штаммом F. tularensis 503 или аэрозольным заражением F. tularensis Schu.

3.1. Выявление антител к антигенам F. tularensis в сыворотке крови иммунизированных против туляремии мышей Задачи исследования – оценить уровень антител к УЗД F. tularensis, тулярину, КНК и ЛПС туляремийного микроба в сыворотке крови мышей, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ.

Выявление антител проводили на 28 сутки после иммунизации мышей F. tularensis 15 НИИЭГ. Использование КНК для оценки специфического гуморального звена иммунитета, показало, что у мышей на 28 сутки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ выявляются антитела к КНК в титрах от 1:200 до 1:1600 (рисунок 4).

–  –  –

Использование ЛПС F. tularensis для оценки специфического гуморального звена иммунитета, показало, что уровень антител к ЛПС F. tularensis колебался в пределах от 1:200 до 1:1600 (рисунок 5).

–  –  –

Использование тулярина или УЗД F. tularensis для выявления антител в сыворотке крови мышей привело к большому количеству ложно-положительных и ложно-отрицательных реакций. По всей вероятности, это связано с содержанием всего комплекса антигенов F. Tularensis, часть из которых может давать перекрестные реакции, а также низким уровнем сорбции тулярина на пластик.

Таким образом, для оценки туляремийного гуморального иммунитета можно использовать КНК и ЛПС F. tularensis.

3.2. Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis Задачи исследования – сравнить влияние тулярина и КНК F. tularensis на изменение экспрессии рецепторов на поверхности Т лимфоцитов в культуре спленоцитов, полученных от иммунизированных против туляремии мышей и интактных животных.

Для формирования протективного иммунитета к возбудителю туляремии необходимо участие не только В, но и T лимфоцитов. Активация Т лимфоцитов сопровождается изменением экспрессии ряда рецепторных молекул на поверхности клетки [15]. Мы провели сравнительный анализ изменений экспрессии TLR-2, CD28, CD154 на поверхности лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis между группами иммунных и интактных мышей.

Сравнительный анализ изменения экспрессии TLR-2, CD28, CD154 на F. tularensis поверхности Т-клеток под влиянием антигенов не выявил достоверных изменений между анализируемыми группами мышей (таблица 1).

Сравнительный анализ изменения экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т-клеток под влиянием антигенов F. tularensis показал различия между группами мышей. Для выявления специфической активации лимфоцитов подбирали дозы антигенов и время инкубирования клеток с антигенами.

На рисунке 6 показано процентное содержание CD4+CD69+ Т лимфоцитов, содержащееся в культуре спленоцитов после инкубирования их в течение 24, 48 и 72 ч в присутствии разных концентраций тулярина и КНК или без антигенов F. tularensis.

Оптимальное время инкубирования мышиных спленоцитов с антигенами составило 24 ч. Тулярин индуцировал усиление экспрессии CD69 маркера на поверхности Т хелперов, полученных от иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ мышей, но не от интактных животных, в концентрации 50 млн. КОЕ/мл.

Препарат КНК специфически активировал Т хелперы лимфоцитов иммунных мышей в концентрации 10 мкг/мл. При выбранных условиях CD3+CD4+ лимфоциты интактных мышей не проявляли неспецифической активации. В частности, через 24 ч инкубирования с тулярином или КНК F. tularensis в популяции спленоцитов, выделенных от иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ мышей, обнаруживалось увеличение CD4+ субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих CD69 маркер на поверхности клеток (количество CD3+CD4+CD69+ составило (( 6,94±1,14) и (9,87±1,22) %, соответственно).

–  –  –

CD4+ субпопуляция лимфоцитов в культуре спленоцитов, полученных от интактных мышей, под влиянием тулярина или КНК F. tularensis не изменяла поверхностный фенотип по CD69 маркеру (количество CD3+CD4+ CD69+ клеток составило ((2,3±1,1) и (1,5±0,35) %, соответственно) по отношению к той же клеточной культуре неактивированных антигенами ((1,05±0,4) %).

А Б А – лимфоциты интактных мышей; Б – лимфоциты мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной.

Рисунок 6 – Изменения процентного содержания CD4+CD69+ Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. Tularensis Спленоциты активировали в течение 24, 48 и 72 ч in vitro тулярином в дозах 5 и 50 млн. КОЕ/мл или КНК в дозах 1, 10 и 50 мкг/мл F. tularensis. По оси ординат указано процентное содержание CD4+ субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD69. По оси абсцисс – название и концентрация стимулирующего антигена в среде.

Таким образом, для выявления специфической активации лимфоцитов достаточно 24 ч инкубирования спленоцитов в присутствии тулярина и КНК F. tularensis при антигенной нагрузке 50 млн. КОЕ/мл – для тулярина и 10 мкг/мл

– для препарата КНК (рисунок 7).

А

–  –  –

Рисунок 7 – Изменения процентного содержания CD8+CD69+ Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. Tularensis Спленоциты активировали в течение 24, 48 и 72 ч in vitro тулярином в дозах 5 и 50 млн. КОЕ/мл или КНК в дозах 1, 10 и 50 мкг/мл. По оси ординат указано процентное содержание CD8+субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD69. По оси абсцисс – название и концентрация стимулирующего антигена в среде.

В отличие от CD4+субпопуляции лимфоцитов цитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+) усиливали экспрессию CD69 рецептора под влиянием тулярина (в дозе 50 млн. КОЕ/мл) как в группе мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, так и в группе интактных животных начиная с 24 ч инкубирования клеток. Тем не менее, количество CD3+CD8+CD69+ клеток у иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ животных ((17,35±4,77) %) было выше, чем у мышей контрольной группы ((11,35±4,85) %).

В присутствии КНК (в дозе 10 мкг/мл) количество CD3+CD8+CD69+ лимфоцитов достоверно увеличивалось относительно не активированных антигенами клеток ((1,67±0,20) %) только в группе мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной ((21,93±5,16) %).

Таким образом, для выявления специфической активации Т хелперов достаточно 24 ч инкубирования спленоцитов в присутствии тулярина и КНК F. tularensis при антигенной нагрузке 50 млн. КОЕ/мл – для тулярина и 10 мкг/мл

– для препарата КНК. Под влиянием КНК выявляется также специфическая активация цитотоксических лимфоцитов у иммунных мышей.

3.3. Оценка клеточного противотуляремийного иммунитета по активации синтеза ИФН-, ФНО- и ИЛ-17 в ответ на рестимуляцию лимфоцитов in vitro тулярином и КНК F. tularensis 15 НИИЭГ Задачи исследования – провести сравнительный анализ изменения уровня синтеза ФНО-, ИФН-, ИЛ-17 между культурами спленоцитов, полученных от мышей интактных и иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ, под влиянием тулярина и КНК F. tularensis.

Концентрации ФНО-, ИФН-, ИЛ-17 в культуре спленоцитов, полученных от мышей интактных и иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ, после

–  –  –

ИЛ-17 детектировался в высоких концентрациях в культуральной жидкости спленоцитов, выделенных от мышей иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ, и инкубировавшихся 48 ч в питательной среде в присутствии тулярина или КНК F. tularensis (таблица 2). Спленоциты, полученные от интактных мышей, и инкубировавшиеся в присутствии антигенов F. tularensis в среде, не увеличивали синтез ИЛ-17 под влиянием антигенов.

Таким образом, под влиянием тулярина и КНК F. tularensis в культуре, спленоцитов, полученных от иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ мышей детектировалось специфическое усиление синтеза ИФН- и ИЛ-17. Синтез ФНОпод влиянием антигенов F. tularensis увеличивался в культуре спленоцитов, полученных от иммунных и интактных мышей.

3.4. Изменение активности синтеза ИФН- и ФНО- лимфоцитами под влиянием антигенов F. tularensis Задача исследования – сравнить влияние антигенов тулярина и КНК F. tularensis на изменение уровня синтеза цитокинов ИФН- и ФНОлимфоцитами в культуре спленоцитов, полученных от иммунизированных против туляремии мышей и интактных животных.

Проведенные нами предварительные эксперименты показали, что для выявления достоверных различий между изменениями цитокиновой активности в ответ на антигены F. tularensis у лимфоцитов, полученных от контрольных и иммунных мышей, время инкубирования клеток должно составлять 48 ч.

Количество ИФН- и ФНО- синтезирующих лимфоцитов CD4+ субпопуляции, выделенных от интактных мышей и животных, иммунизированных живой туляремийной вакциной представлено на рисунок 8.

Через 48 ч активации клеток тулярином или КНК происходило достоверное увеличение синтеза ИФН- ((6,67±1,23) и (8,26±1,65) %, соответственно) и ФНОи (10,1±2,45) Т хелперами, полученными от иммунных мышей. У интактных мышей усиления синтеза данных цитокинов в ответ на активацию F. tularensis лимфоцитов антигенами (0,99±0,45) по отношению к не активированным клеткам in vitro не выявили.

–  –  –

В Г Рисунок 8 – Цитофлюорограммы, отражающие содержание цитокин-синтезирующих лимфоцитов, стимулированных антигенами F. Tularensis Изменение процентного содержания CD4+ субпопуляции лимфоцитов, синтезирующих ИФН- (А, Б) и ФНО- (В, Г), в ответ на активацию в течение 48 ч in vitro тулярином (А, В) или КНК (Б, Г). Кривые отображают долю CD4+лимфоцитов (по оси ординат) и интенсивность флюоресценции клеток, меченных моноклональными антителами против ИФН- (по оси абсцисс). Зона М1 выделяет клетки, синтезирующие цитокины. Кривая, нарисованная тонкой линией, отображает распределение лимфоцитов интактных мышей, а кривая, нарисованная жирной линией – распределение лимфоцитов мышей, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ.

3.5. Оценка специфичности тулярина Задачи исследования – оценить способность тулярина специфически активировать в системе in vitro CD4+ и CD8+ субпопуляции Т лимфоцитов мышей, иммунизированных вакцинным штаммом F. tularensis 15 линии НИИЭГ.

Мышей линии BALb/c иммунизировали однократно подкожно клетками F. tularensis 15 линии НИИЭГ и Salmonella entheriditis 92 по 20 КОЕ (14 и 7 мышей в группах, соответственно), Y. pestis EV НИИЭГ в дозе 1 105 КОЕ (7 мышей в группе). На 28 сутки после иммунизации у семи мышей из каждой группы, включая интактных в качестве отрицательного контроля, отбирали кровь для получения сывороток и селезенки для выделения спленоцитов. На 28 сутки после иммунизации по 7 мышей заражали подкожно штаммом F. tularensis 503 (LD50 меньше 10 КОЕ): интактных – в дозе 10 КОЕ/мышь; иммунизированных штаммом F. Tularensis 15 линии НИИЭГ – в дозе 500 КОЕ/мышь (50 LD50).

Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суток.

Селезенки павших животных гомогенизировали и высевали на FT агар для подтверждения диагноза заражения туляремией.

Формирование протективного противотуляремийного поствакцинального иммунитета у экспериментальных животных было подтверждено результатами экспериментальной инфекции после заражения штаммом F. tularensis 503: все зараженные мыши, иммунизированные F. tularensis 15 линии НИИЭГ, оставались живыми до конца срока наблюдения, остальные группы мышей погибли на 4-6 день после инфицирования.

Оценка гуморального иммунитета методом ИФА показала, что у мышей, иммунизированных F. tularensis 15 линии НИИЭГ, титр антител составил в среднем 1:200 (таблица 3).

Несмотря на 100 % выживаемость иммунных мышей, у одного животного из пяти проверенных титр антитела к тулярину был 1:20.

–  –  –

У мышей, вакцинированных гетерологичными вакцинами S. Entheriditis 92 и Y. pestis EV НИИЭГ, антитела к тулярину в ИФА не обнаруживались, что свидетельствует о специфичности реакции с тулярином.

Возможность использования тулярина в качестве активатора Т лимфоцитов оценивали по изменению экспрессии поверхностного рецептора CD69 – маркера ранней активации клеток. В таблице 3 приведены данные процентного содержания Т хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+), экспрессирующих маркер CD69, после стимуляции их in vitro тулярином в популяции лимфоцитов, полученных от интактных и иммунизированных мышей.

Без активации тулярином in vitro количество CD69-позитивных CD4+ Т лимфоцитов, выделенных из селезенки мышей на 28 день после иммунизации животных вакцинными штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ, Y. pestis EV НИИЭГ или S. entheriditis 92, составило 1,07, 1,39 и 2,64 %, соответственно. Содержание CD69-позитивных CD4+ Т лимфоцитов у интактных мышей составило 0,46 %.

Некоторое увеличение содержание CD69+ Т хелперов (1,07-2,64 %) у иммунных животных по сравнению с лимфоцитами, полученных от интактных мышей, свидетельствует о спонтанной поствакцинальной функциональной активности лимфоцитов.

Активация спленоцитов in vitro тулярином приводила к увеличению CD69-позитивных Т хелперов только в группе мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной. Процент лимфоцитов с маркерами CD3+CD4+CD69+ в этой группе животных после стимуляции тулярином увеличился до 8,94 % и коэффициент стимуляции (КС) составил 8,36. В остальных группах мышей КС не превышал 1,92. Полученные данные свидетельствуют о специфичной активации тулярином Т хелперов (CD3+CD4+CD69+) мышей, имеющих иммунитет к туляремии.

В субпопуляции цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+) под влиянием тулярина in vitro тенденция к увеличению клеток, экспрессирующих маркер CD69, отмечалась только в группе мышей, иммунизированных против туляремии (КС = 2, таблица 3).

Достоверное по отношению к не активированным тулярином лимфоцитам увеличение Т хелперов, синтезирующих ИФН- и ФНО-, в ответ на стимуляцию антигенами туляремийного микроба in vitro обнаружено только у лимфоцитов, выделенных от мышей, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ (рисунок 9).

–  –  –

В Г Рисунок 9 – Процентное содержание Т хелперов, синтезирующих ИФН- и ФНО- без стимуляции и после стимуляции их in vitro тулярином, у мышей, иммунизированных F. tularensis 15 НИИЭГ Процентное содержание CD3+CD4+ клеток, синтезирующих ИФН- (А) и ФНО- (В) без стимуляции in vitro тулярином; процентное содержание CD3+CD4+ клеток, синтезирующих соответственно ИФН- (Б) и ФНО- (Г) после стимуляции in vitro тулярином.

Процентное содержание CD3+CD4+CD69+ лимфоцитов, синтезирующих ИФН- и ФНО-, после активации их in vitro тулярином составляло 9,01 и 11,37 %, а без стимуляции – 1,95 и 1,45 %, соответственно.

–  –  –

Мы выявляли количество активированных лимфоцитов и Т хелперов, продуцирующих ИФН- и ФНО- в ответ на стимуляцию клеток in vitro КНК F. tularensis. Как видно из рисунка 10, статистически достоверная разница в количестве CD4+-T лимфоцитов, синтезирующих ИФН- и ФНО-, отмечалась между клетками, не активированными и активированными in vitro КНК F. tularensis, выделенными от мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ.

–  –  –

Спленоциты разных групп мышей инкубировали в среде без и в присутствии КНК в течение 24ч при температуре 37 °С. Сравнивали процентное содержание экспрессии CD4+ Т лимфоцитов, синтезирующих ИФН- и ФНО-, без стимуляции и стимулированных КНК.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |
 

Похожие работы:

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.