WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 6 ] --

Исследования рецепторного состава в амниотической и аллантоисной полости куриных эмбрионов показали, что концевые сиаловые кислоты на рецепторах вируса гриппа в основном присоединены -2,3-связью, при этом в аллантоисной полости -2,6-связанных сиаловых остатков нет, они присутствуют только на поверхности клеток, выстилающих амниотическую полость куриного эмбриона [169]. В процессе подготовки штамма проходит ряд пассажей в эмбрионах, в результате которого происходит отбор вариантов, содержащих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютинина, которые позволяют с более высокой эффективностью связывать рецепторы с -2,3-связью [126, 221, 277]. Клеточная линия MDCK, одна из основных линий, на которой производится работа с вирусами гриппа, содержит как так и -2,3-связанные остатки сиаловых кислот [313].

Выбор субстрата для выделения вируса из природного материала уже определяет, какой компонент популяции получает преимущество [363]. Так, Mochalova с соавт. был проведен анализ последовательности гемагглютинина вирусов, выделенных из клинического материала в клеточных линиях Vero, MDCK и в развивающихся куриных эмбрионах [227]. Вирусы, выделенные в клеточных линиях, сохраняли рецепторную специфичность, характерную для вируса из клинического материала, и в большинстве не приобретали мутаций в гемагглютинине на этапе выделения. Среди вариантов, выделенных в МDCK, встречались вирусы с одиночными заменами в гемагглютинине. Выделение вирусов в развивающихся куриных эмбрионах приводило к отбору вариантов, содержащих аминокислотные отличия вблизи рецепторсвязывающего кармана: замену глутамина на аргинин в позиции 226, либо аспарагиновой кислоты на глицин в позиции 225 у вирусов подтипа H1N1, а также лейцина на изолейцин в позиции 194 и аргинина на серин в позиции 220 у вирусов подтипа H3N2.

В нашей работе описаны два варианта вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) – выделенный в РКЭ и выделенный в клеточной культуре MDCK. Эти варианты отличались по аминокислотной позиции 190: у культурального в данной позиции располагается остаток аспарагина, у «яичного» штамма– аспарагиновая кислота. Аминокислотная замена в данной позиции описана в литературе как адаптационная к куриным эмбрионам [126]. В условиях эксперимента вирусы, адаптировавшиеся к куриным эмбрионам, приобретали повышенную способность к связыванию с клетками хорио-аллантоисной мембраны, несущими рецепторы с

-2,3 связью, и приобретали ряд замен в гемагглютинине [126]. У штаммов подтипа H1N1 происходили аминокислотные замены в позициях 190 и 225. Было показано, что на взаимодействие с рецептором влияли замены, связанные с изменением распределения заряда в головке гемагглютинина, это были замены 187, 189, 190 [126]. Роль замены в 190 позиции подтверждается также исследованием Nobusava с соавторами [244].

В случае штаммов на основе A/New Caledonia/20/99 замена аспарагина на аспарагиновую кислоту, по всей видимости, изменяет распределение заряда и увеличивает способность к взаимодействию с рецептором с -2,3 связью.

Вакцинные штаммы, подготовленные на основе вирусов, выделенных в разных субстратах, сохраняли аминокислотный остаток в данной позиции, унаследованный от родительского вируса: штамм 25М/1 содержал аспарагин, штаммы 39Е/2 и NC145 – аспарагиновую кислоту. Из популяции «яичного» вируса нам удалось выделить минорный компонент NCE/2, содержавший в данной позиции аспарагин. Вакцинные штаммы NC81 и NC84, подготовленные на его основе, также содержали аспарагин в данной позиции. В данном случае для подготовки вакцинного штамма был использован чистый клон, и аминокислота в позиции 190 сохранилась после 6 пассажей в куриных эмбрионах. Это говорит о том, что влияние субстрата не однозначно определяет появление аминокислотной замены, но значительно повышает вероятность отбора субстрат-адаптированных вариантов. Возможно, роль также сыграли аминокислотные замены в гетерогенной позиции 225, которые могли оказать влияние на конформацию рецептор-связывающего кармана [126].

Адаптационные замены могут не происходить в том случае, если исходная популяция вируса не гетерогенна по данной позиции и не содержит вариантов с большей аффинностью к рецепторам. В случае же предсуществования в популяции компонентов с повышенной способностью к связыванию, они получают преимущество в новой системе, и штамм, полученный на их основе, содержит аминокислотные позиции, дающие преимущество в выбранной биологической системе. Данную возможность можно использовать при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины – предварительное клонирование популяции и отбор подходящего клона может сделать процесс подготовки штамма более предсказуемым.

Отдельно стоит отметить аминокислотные замены, приводящие к изменению характера гликозилирования молекулы. Так, штамм 39Е/2 потерял сайт гликозилирования за счет замены треонина на изолейцин в позиции 131 НА1. Возможно, именно это стало причиной сниженной иммуногенности данного реассортанта, поскольку по остальным позициям 39E/2 не отличается от более иммуногенных штаммов на основе A/New Caledonia/20/99. Подобная замена в данной позиции описана в исследовании Gambaryan с соавт. [125]. Исследование двух вариантов вируса A/USSR/90/77 (H1N1), отличавшихся остатком аминокислоты в позиции 131, один из которых за счет этого приобретал сайт гликозилирования, показало, что из-за разницы в пространственной структуре рецепторов наличие углеводного остатка в данной позиции влияло на связывание с рецептором. Наличие углеводородной цепи влияло на связывание вируса с рецептором с -2,6 связью, и не оказывало влияния на связывание с -2,3. Вирусы, выращенные в MDCK, связывали в растворе рецепторы птичьего происхождения (-2,3) значительно более слабо, чем вирусы, выращенные в РКЭ [125]. Вероятно, изменение характера гликозилирования из-за замены в позиции 131, для вируса 39Е/2 являющейся адаптационной к типу субстрата, влияет на доступность антигенных сайтов вируса, и, следовательно, на иммуногенность по показателям гуморального иммунного ответа.

Кроме адаптации к субстрату, рецепторная специфичность вируса может варьировать в процессе циркуляции. Так, среди изолятов, выделенных в пандемию «Азиатского гриппа» 1957 года, встречались варианты как с -2,3, так и с -2,6 рецепторной специфичностью [204].

Вирусы, вызвавшие пандемию, были результатом реассортации вирусов птичьего гриппа с человеческими штаммами [287]. От птичьих вирусов в состав генома пандемического штамма вошли сегменты, кодирующие HA, NA и PB1 [176]. Исходно, гемагглютинин птичьего штамма обладал повышенным сродством к -2,3-связанным сиаловым кислотам, но в процессе циркуляции происходила адаптация вируса к человеческому типу рецептора. При адаптации к

-2,6 типу рецептора, гемагглютинин приобрел две аминокислотные замены: замена глутамина на лейцин в позиции 226 HA1, а также замена глицина на серин в позиции 228 [204, 254]. В нашей работе штаммы также отличались по рецепторной A/Singapore/1/57 (H2N2) специфичности и в вышеуказанных позициях содержали соответствующие аминокислотные остатки. Кроме того, они отличались также аминокислотным остатком в позиции 156 НА2, что, по литературным данным, также является заменой, усиливающей взаимодействие с рецептором. Замена глутаминовой кислоты на лизин в данной позиции, увеличивает положительный заряд в глобулярной части молекулы гемагглютинина, что позволяет гемагглютинину ингибиторочувствительного вируса взаимодействовать с рецептором эффективнее [220]. Мутанты, содержавшие данную замену, были изолированы авторами при пассировании в клеточной линии MDCK. [152] продемонстрировали, что данная мутация возникает также в процессе пассирования в мышах и снижает способность гемагглютинина реагировать с антителами, направленными против широкого спектра штаммов вирусов гриппа.

Уход от иммунного ответа подтверждается также в работе [358].

Вокруг рецепторного кармана гемагглютинина расположены высоко вариабельные области – антигенные сайты. Эти области находятся под постоянным прессингом иммунной системы и гетерогенность в них прослеживается при анализе последовательностей гемагглютинина вирусов одного сезона. Мутации в антигенных сайтах могут сильно повлиять на характер иммунного ответа к вакцинному штамму, в зависимости от того, как аминокислотная замена влияет на пространственную структуру и заряд [300], а также в зависимости от распределения вариабельных позиций в циркулирующих вариантах эпидемических штаммов. Необходимо также внимательно относиться к выбору антигена для постановки результатов реакции – наличие даже одиночной мутации может решительным образом повлиять на результаты детекции гуморального иммунного ответа [156].

Aминокислотная замена в позиции 78 НА1 штамма NC84 располагалась в области, относящейся к антигенному сайту Cb [164]. Эта замена была обнаружена при клонировании «дикой» популяции NCE и сохранилась у штамма NC84, подготовленного на основе клона, содержавшего данную замену. Судя по всему, замена глутаминовой кислоты на лизин в данной позиции не оказывает значительного влияния на иммуногенные свойства штамма, несмотря на изменение заряда аминокислотного остатка. Штамм NC84 по показателям гуморального иммунного ответа не имел достоверных отличий от штамма NC145, содержащего в данной позиции глутаминовую кислоту.

Аминокислотный остаток 225 HA1 в популяции вируса A/New Caledonia/20/99 обладал высокой вариабельностью: в нем было обнаружено три разных варианта аминокислот. По данным литературы, вариабельность в данной позиции является свойством вирусов подтипа H1 [113]. Несмотря на то, что данный аминокислотный остаток является компонентом петли 220 рецептор-связывающего кармана гемагглютинина, влияния на иммуногенность по результатам наших экспериментов выявить не удалось.

Отдельно необходимо сказать про замены в субъединице НА2, являющейся основной частью ножки гемагглютинина [167]. Трансмембранный домен гемагглютинина достаточно консервативен и не является мишенью вируснейтрализующих антител. Тем не менее, в этом домене расположен консервативный пептид слияния, играющий важнейшую роль в жизненном цикле вируса [84, 286], а также области, отвечающие за взаимодействие субъединиц тримера гемагглютинина между собой [163, 167, 250].

Среди исследованных нами штаммов, были два варианта, содержавшие уникальные замены в НА2 – NC145 и 25M/1. Штамм NC145, обладавший наиболее высокой иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа, содержал в позиции 106 субъединицы НА2 лизин, обнаруженный в составе исходной популяции «дикого» вируса при клонировании, притом что у остальных исследованных штаммов на основе A/New в данной позиции располагается остаток аргинина. Гетерогенность Caledonia/20/99 аргинин/лизин в данной позиции характерна для H1-вирусов [318]. Данный основный остаток располагается на длинном -спиральном участке (B-цепь HA2), аминокислотные остатки, входящие в состав разных мономеров, контактируют между собой в области оси симметрии тримера гемагглютинина, в непосредственной близости от пептида слияния, в точке, где длинный -спиральный участок подвергается анфолдингу при низких pH [86]. Остаток лизина в позиции 106 формирует водородные связи с глутаминовой кислотой в позиции 103. В области расположения аминокислотного остатка Lys106 обнаруживаетсяя пик электронной плотности, Lys106 вероятнее всего, обусловленный ионными взаимодействиями с анионами (предположительно фосфаты), что стабилизирует структуру в области оси тримера. Arg106 формирует солевые мостики с Glu105, но ионные взаимодействия в области оси тримера гемагглютинина, в отличие от предыдущего случая, значительно слабее [141]. Возможно, данный аминокислотный остаток стабилизировал структуру гемагглютинина штамма NC145, что и привело к его наибольшей иммуногенности среди исследованных штаммов.

Замена аспарагиновой кислоты на аспарагин в позиции 112 HA2 была обнаружена у штамма 25М/1, обладавшего самой низкой иммуногенностью среди исследованных штаммов, а также сниженными показателями репродукции в развивающихся куриных эмбрионах. По данным литературы, замена в данной позиции отражается на свойствах пептида слияния Asp112 гемагглютинина из-за пространственного взаимодействия участков молекулы.

формирует 4 водородных связи, стабилизирующих пептид слияния, и мутации в этой позиции приводят к изменению конформации при менее кислых pH [167]. Вероятно, данная мутация снизила способность штамма 25М/1 к эффективной инфекции, что привело к более низкой иммуногенности данного штамма.

Отбор вирусов текущего эпидемического сезона, на основе которых рекомендуется подготовка вакцинных штаммов, ежегодно производится Всемирной организацией здравоохранения. Выбор вируса-родителя для вакцинного штамма можно производить на основе свойств эпидемических вирусов, в том числе доступных для оценки фенотипических маркеров. В нашем исследовании рассматривалось влияние двух распространенных маркеров:

температурочувствительности и чувствительности к неспецифическим сывороточным ингибиторам.

При использовании ингибиторочувствительности вирусов в качестве лабораторного маркера свойств нужно понимать, что данная характеристика является отражением целого комплекса свойств вирусов: рецепторной специфичности гемагглютинина [219, 279], субстратной специфичности нейраминидазы [130]. При этом при сравнении данных о ингибиторочувствительности вирусов необходимо принимать в внимание ряд параметров:

сыворотка животного, использованная для детекции ингибиторочувствительности, состав сиалосодержащих рецепторов на поверхности использованных эритроцитов [29, 130, 168, 219, 228]. Смена фенотипа вируса по отношению к сывороточным ингибиторам сопровождается мутациями в консервативной области рецепторного кармана, отвечающей за взаимодействие с рецептором [58, 188, 219, 279].

Состав неспецифических ингибиторов вирусов гриппа, являющихся компонентами сывороток и секретов слизистых, зависит от вида организма-хозяина [29, 219, 273, 279] и устойчивость вируса к данным ингибиторам, а также распределение рецепторов вируса гриппа у хозяина, с которыми может взаимодействовать данным вирус, влияют на эффективность развития инфекции [198-199].

В верхних дыхательных путях человека на клетках мерцательного эпителия расположены -2,6 рецепторы, рецепторы со связью -2,3 выявлены в нижних отделах дыхательных путей: в бронхиолах и альвеолах [293]. -2,6 рецепторы в альвеолах также присутствуют, но в меньшем количестве, чем в верхних дыхательных путях [351].

Исследование прикрепления вирусов гриппа разных подтипов к рецепторам в воздухоносных путях модельных животных показало, что наиболее близкими моделями являются хорьки и свиньи [324]. Как и у людей, поверхность ресничного эпителия верхних дыхательных путей у хорьков покрыта рецепторами с -2,6 специфичностью, -2,3 рецепторы встречаются в клетках альвеол [351]. У морских свинок клетки альвеол и трахеи покрыты рецепторами с -2,3-связью, в меньшей степени присутствуют -2,6 рецепторы [128]. На поверхности слизистой носовых путей обнаружены клетки, экспрессирующие -2,6 и в меньшей степени -2,3 гликаны.

Сыворотки и секреты слизистых морских свинок содержат неспецифические ингибиторы вируса гриппа в высокой концентрации [29, 186]. Основным отличием состава ингибиторов в сыворотке морской свинки от человеческой сыворотки является высокое содержание 4-О-ацетилированных сиаловых остатков [144, 268], из-за чего ингибиторы становятся устойчивыми к воздействию нейраминидазы [219]. Эту особенность необходимо учитывать при использовании морских свинок в качестве модельных животных для изучения показателей гуморального иммунного ответа на ИЧ вирусы.

При детекции показателей гуморального иммунного ответа на ингибиторочувствительные вирусы у морских свинок мы столкнулись с рядом сложностей методического характера. Использование ингибиторочувствительного антигена оказывало влияние на результаты РТГА и РМН. Эта закономерность прослеживалась как в случае ИЧ и ИУ вариантов штамма A/Singapore/1/57, так и в случае пар штаммов, отличавшихся происхождением нейраминидазы. В случае вариантов A/Singapore/1/57 после обработки сывороток RDE в контрольных группах наблюдались фоновые реакции, в случае штаммов с разной нейраминидазой реакций в контрольных группах не наблюдалось, но, вероятно, ингибирование все-таки оказывало влияние, поскольку отличия между результатами реакции с использованием разных антигенов были статистически достоверны.

Рецепторная специфичность гемагглютинина и субстратная специфичность нейраминидазы вируса для эффективного обеспечения реализации жизненного цикла вируса должны соответствовать друг другу [327] и составу рецепторов в ткани, в которой происходит реализация жизненного цикла вируса [77, 309, 352]. Вакцинный штамм на основе ИЧ-вируса, наследующий нейраминидазу от ИУ-донора аттенуации, оказывался более устойчивым к неспецифическим ингибиторам сыворотки. У вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 в процессе пассирования в эмбрионах в гемагглютинине появилась замена метионина на валин в позиции 251 (соответствует позиции 252 у штамма B/Victoria/2/87), которая может рассматриваться как адаптационная в сторону викторианской линии, а также замена 202, также, вероятно, связанная с адаптацией к рецептору, поскольку расположена в петле 190 рецепторсвязывающего кармана.

Сравнительный анализ показателей гуморального иммунного ответа у животных после введения ИЧ- и ИУ- штаммов A/Singapore/1/57, а также пар штаммов с разной нейраминидазой, показал, что при использовании одного и того же антигена, статистически достоверных различий не выявлялось, то есть значительного влияния на показатели иммуногенности чувствительность к ингибиторам не оказывала. При использовании гомологичного антигена титры были выше.

По данным литературы, посвященным исследованию данного вопроса, можно сделать вывод, что ингибиторочувствительные вирусы (с -2,6 специфичностью к рецепторам) должны быть более иммуногенны. Данные о более высокой иммуногенности ингибиторочувствительных вариантов представлены в исследовании, проведенном на пассажных вакцинных штаммах [14]. Еще одно подтверждение содержится в работе [26].

Исследования сравнительной иммуногенности вирусов с разной рецепторной специфичностью, проведенные на животных, содержат разные данные о влиянии этого признака на иммуногенность. В исследовании Xu с соавт. [351] более высокой иммуногенностью обладали

-2,6-специфичные варианты. В этом исследовании также содержатся данные о разной антигенности -2,6 и -2,3 – специфичных вариантов, что хорошо согласуется с полученными нами данными о более высоких показателях гуморального иммунного ответа при использовании гомологичного антигена. Еще одним подтверждением положительного влияния специфичности к -2,6 на показатели иммунного ответа являются данные, полученные Wang с соавт. [333] – в работе исследовалось влияние гликозилирования и отдельных аминокислотных замен в рецептор-связывающей области на иммуногенность. Показатели иммунного ответа положительно коррелировали с интенсивностью размножения вирусов в верхних дыхательных путях хорьков, что было напрямую связано с их аффинностью к рецепторам. Leigh с соавт.

[197] не удалось обнаружить отличий в иммуногенности между вариантами вирусов с разной рецепторной специфичностью.

Что интересно, исследование ретроспективных данных по иммуногенности вакцин на основе штаммов, различающихся по показателю чувствительности к неспецифическим ингибиторам, выявило большую иммуногенность вакцин, подготовленных на основе ингибитороустойчивых вирусов-родителей. Полученные результаты можно объяснить тем, что в исследованиях, представленных в литературе, использовались модельные системы «диких»

вирусов с охарактеризованными одиночными заменами в антигенных детерминантах.

Преимущество в размножении в дыхательных путях получали вирусы с –2,6 специфичностью гемагглютинина к рецептору, содержащие все остальные гены от того же «дикого» вируса. В случае вакцинных штаммов ЖГВ, полученных путем классической реассортации в системе in ovo, специфичность к «птичьему» типу рецепторов является преимуществом на стадии подготовки штамма и позволяет получать вакцинные штаммы за значительно меньшее количество пассажей, чем при работе с вирусами, предпочитающими рецептор с –2,6–связью, чувствительными к ингибиторам, содержащимся в лошадиной сыворотке.

Кроме того, традиционно, для подготовки гриппозных диагностикумов используются ингибитороустойчивые антигены, природные или получаемые серийным пассированием ингибиторочувствительного вируса в присутствии богатой ингибиторами нормальной сыворотки животных поскольку результаты, полученные с использованием [55], ингибиторочувствительных антигенов, сложно поддаются трактовке Однако, [58].

неоднократно было показано, что результаты реакции торможения гемагглютинации могут достоверно отличаться при наличии одиночных мутаций в гемагглютинине, располагающихся вблизи от активного центра молекулы, и для получения более высокого титра необходимо использовать тот антиген, которым проводилась иммунизация [58, 152, 156, 197]. Также нельзя исключать, что использование чувствительного к ингибиторам антигена при детекции результатов реакции методом РТГА дает более высокие титры за счет неспецифического ингибирования, что влияет на результат оценки иммуногенности [58, 156].

Отдельно стоит говорить о функциональной роли ингибиторов в развитии гриппозной инфекции. В масштабном исследовании, посвященном влиянию содержания ингибиторов в сыворотках крови на заболеваемость гриппом и ОРЗ, приведены данные о сезонной и географически обусловленной динамике содержания термолабильных ингибиторов в сыворотках волонтеров, а также данные о связи тяжести течения заболевания от содержания ингибиторов в сыворотках [64]. По данным, полученным авторами исследования, концентрация сывороточных термолабильных ингибиторов не влияла на интенсивность гуморального иммунного ответа, но оказывала влияние на тяжесть клинической картины заболевания. В данном случае лабораторные характеристики самих штаммов, которые вызывали заболевание, а также использованных в качестве антигена, не учитывались. Это может быть еще одним фактом, объясняющим статистически более высокую иммуногенность ингибитороустойчивых штаммов – возможно, чувствительные к ингибиторам вирусы значительно менее эффективно проникают через неспецифический барьер организма.

Вторым маркером, влияние которого на иммуногенность рассматривалось в нашей работе, является температурочувствительность. Влияние температурочувствительности на иммуногенность пассажных вариантов вируса гриппа описано в исследованиях [31, 79, 321].

Даже единичные аттенуирующие мутации от холодоадаптированных вариантов, как было показано в главе 3.1, снижают иммуногенность штаммов.

Тем не менее, поскольку за чувствительность вируса гриппа к температуре инкубации в основном отвечают внутренние гены [157, 181], а в геном вакцинного штамма попадают только поверхностные антигены вируса гриппа – гемагглютинин и нейраминидаза, мы исследовали зависимость между температурочувствительностью «дикого» вируса и иммуногенностью вакцинного штамма на его основе. Было показано, что данная зависимость выявляется с высокой степенью статистической значимости – более иммуногенные штаммы получались на основе температуроустойчивых вирусов. По всей видимости, свойства гемагглютинина и нейраминидазы природных вирусов, обладающих разной температурочувствительностью, отличаются по способности индуцировать эффективное развитие иммунного ответа. Возможно, ts–варианты вирусов являются дрейфовыми вариантами, обладающими общими эпитопами в антигенных детерминантах с циркулировавшими на протяжении последнего времени вирусами, в связи с чем в результате реассортации с донором аттенуации и получаются штаммы с более низкой иммуногенностью.

Известно, что температура в кишечнике птиц достигает 42С и птичьи вирусы гриппа в среднем имеют более высокий температурный оптимум репликации, чем человеческие штаммы, размножающиеся в основном в верхних дыхательных путях человека при температуре, близкой к 33–37С [190].

Анализ сочетания свойств температуро- и ингибиторочувствительности «диких» вирусов показал, что существует корреляция между признаками чувствительности вируса к повышенной температуре и его чувствительности к ингибиторам лошадиной сыворотки.

Температуроустойчивые вирусы, чаще оказывались устойчивы и к ингибиторам нормальной сыворотки. Как уже упоминалось в обзоре литературы, в процессе циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции, судя по всему, идет постепенная адаптация к размножению при более низких температурах и накопление природных ts–вариантов [25]. Также есть исследование, подтверждающее, что в процессе антигенного дрейфа вирус постепенно подстраивается к рецептору хозяина [152]. Вероятно, свойства температуроустойчивости и ингибитороустойчивости являются связанными друг с другом из–за особенностей эпидемиологии штаммов гриппа. Новые варианты вирусов, являющиеся результатом реассортации сегментами генома между вирусами гриппа птиц и млекопитающих, часто наследуют от «птичьих» вирусов температуро– и ингибитороустойчивый фенотип. А поскольку именно такие вирусы являются антигенно шифтовыми вариантами, вакцинные штаммы на их основе могут быть более иммуногенны, чем вакцинные штаммы на основе дрейфовых вариантов, чувствительных к температуре и адаптированных к «человеческому» типу рецептора.

В научной литературе описана методика, позволяющая без внесения замен в аминокислотную последовательность белка, влиять на эффективность его экспрессии – изменение кодонного состава, или так называемая кодонная оптимизация/деоптимизация [158, 320]. Данный способ применяется для получения аттенуированных вирусов [90, 232], а также для повышения иммуногенности ДНК-вакцин [136, 171, 270, 353], поскольку аминокислотный состав, и, соответственно, структура белка, остаются неизменными.

В экспериментальных исследованиях, выполненных на ДНК-вакцинах для профилактики гриппа, оптимизации подвергали последовательность гемагглютинина. Опубликован ряд работ, посвященных влиянию кодонной оптимизации на иммуногенность ДНК-вакцин на основе гемагглютининов подтипов H1 [316], H3 [331], H5 [96, 171, 200]. Исследовались как показатели гуморального иммунного ответа, так и влияние оптимизации на клеточное звено иммунитета [316].

Повышение иммуногенности препарата с оптимизированным кодонным составом ожидается за счет увеличения экспрессии белка в клетках хозяина. Увеличение экспрессии после кодонной оптимизации подтверждается в ряду исследований, посвященных оптимизации последовательности ДНК-вакцин [316, 331]. В случае живого вируса, проводились исследования, посвященные аттенуации вируса и было показано снижение уровней репликации после деоптимизации кодонного состава [232]. В наших экспериментах последовательность гемагглютинина была изменена таким образом, чтобы оптимизировать экспрессию гемагглютинина в клетках млекопитающих. Уровни экспрессии оптимизированных вариантов гемагглютинина, как H1, так и H5, превышали уровни экспрессии нативных белков. При этом инфекционные титры живых вирусов с измененным гемагглютинином были ниже, чем у не модифицированных вариантов, то есть для живого вируса оптимизация кодонного состава, направленная на увеличение экспрессии, приводила к снижению эффективности репродукции.

Тем не менее, несмотря на сниженный уровень репликации, вирусы с оптимизированным кодонным составом гемагглютинина вызывали у животных более интенсивный гуморальный иммунный ответ, чем варианты с не оптимизированным гемагглютинином. Превышение титров после иммунизации оптимизированными вариантами было сравнимо с данными, полученными после иммунизации ДНК-вакцинами. В среднем, разница в титрах по данным реакции торможения гемагглютинации, между оптимизированными и не оптимизированными вариантами, по данным исследований, выполненных на ДНК-вакцинах, составляла 3-4 раза [171, 316, 331].

Реассортанты с донором аттенуации на основе вирусов с модифицированным составом кодонов получить не удалось. Было известно, что возможны сложности при получении реассортантов на основе вирусов, содержащих внутренние гены от A/PR/8/34 [124, 191, 295].

Вероятно, существуют особенности констелляции генов подобных реассортантов, возможно, связанные с особенностями взаимодействия сегментов генома при упаковке в вирион [161, 245].

Как известно, ключевым моментом, определяющим эффективность реассортации, является этап скрещивания [75, 89, 135, 154]. Поэтому был проведен анализ данных о модификациях методики скрещивания, которые могут привести к увеличению числа реассортантных штаммов. Неоднократно упоминалось о эффективности такого приема как инактивация инфекционной активности вируса [75, 89]. Gotlieb и Hirst был опробован ряд модификаций методики скрещивания, позволявших существенно увеличить выход реассортантных штаммов по сравнению с классической методикой реассортации [135, 154].

Авторы использовали инактивацию одного из вирусов, вносили инактивированный вирус до живого, а также использовали разные соотношения количества вирусных частиц. По результатам исследования наиболее перспективным вариантом оказалось последовательное внесение вирусов в эмбрион, причем первым вносится инактивированный штамм, через 3-4 часа – живой штамм. Сокращение времени скрещивания до 14-18 часов также приводило авторов к положительному результату. Инактивация вируса в неразведенной хориоаллантоисной жидкости была малоэффективна, и при скрещивании инактивированного таким способом вируса частота получения рекомбинантов была низкой. Более успешной инактивация была при разведении вирусной суспензии в соотношении 1:10. Наибольший успех скрещивания наблюдался в случае, если исходный вирус был инактивирован до остаточного титра 1-2 lg. Исследование оптимального соотношения количества вносимых вирусов показало, что при внесении слишком больших и слишком малых количеств инактивированного вируса частота реактивации снижается. Для живого вируса как большие, так и малые количества давали одинаково положительный результат. В среднем, оптимальным соотношением для реассортации авторы указали 30 единиц активного вируса к 5000 инактивированного [135].

На основе анализа был выбран ряд модификаций методики скрещивания, часть из которых привела к положительному результату при скрещивании реассортантов на основе A/PR/8/34 с холодоадаптированным донором аттенуации. Тем не менее, реассортанты вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином получить не удалось. Возможно, это связано со сниженными показателями репликации оптимизированных штаммов, либо с еще более значительной констелляцией генов, чем у исходных вариантов вирусов.

Раздел 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ полученных результатов позволяет сделать ряд практических выводов, которые могут быть использованы при подготовке штаммов ЖГВ и оценке их иммуногенности.

Предварительное клонирование популяции «дикого» вируса гриппа и выбор клона на основе анализа последовательности HA и NA может обеспечить получение реассортантов с заданными свойствами. При этом внимание необходимо обращать на мутации, локализованные не только в антигенных областях HA и NA, но также и в других функционально важных участках, таких как сайт, обеспечивающий взаимодействие с остатком сиаловой кислоты, участки, ответственные за взаимодействия внутри олигомерного комплекса, пептид слияния HA.

При выборе «дикого» вируса гриппа, на основе которого будет получен вакцинный реассортант, следует руководствоваться его фенотипическими свойствами. На основе более температуроустойчивого вируса может быть получен более иммуногенный вариант вакцины.

Чувствительность вируса-родителя к неспецифическим сывороточным ингибиторам оказывает неоднозначное влияние на иммуногенность вакцинного штамма: с одной стороны, по нашим и литературным данным в условиях эксперимента ингибиторочувствительность не влияет на иммуногенность, либо, в отдельных случаях, ИЧ-штаммы, имеющие сродство к -2,6 рецепторам, преобладающим в верхних дыхательных путях человека, вызывают более интенсивный гуморальный иммунный ответ, чем аналогичные ИУ-варианты, предпочтительно прикрепляющиеся к -2,3 – рецепторам. С другой стороны, анализ данных клинических испытаний показал, что на основе ИУ-вирусов в среднем получались более иммуногенные вакцинные штаммы, что, возможно, связано с эволюционной историей данных вирусов.

Для детекции показателей гуморального иммунного ответа на ИЧ штамм стоит использовать ИЧ антиген, поскольку использование ИУ антигена занижает показатели иммунного ответа. При этом особое внимание необходимо обращать на способы обработки сыворотки и при необходимости проводить дополнительные серологические исследования (в частности, методом ИФА).

Кодонная оптимизация HA в составе живого вируса позволяет повысить интенсивность гуморального иммунного ответа, что делает эту методику перспективным способом повышения иммуногенности ЖГВ.

ВЫВОДЫ:

Морская свинка является адекватной моделью для оценки постинфекционного и 1.

поствакцинального гуморального иммунного ответа, индуцированного вирусами гриппа и штаммами живой гриппозной вакцины.

Неспецифические ингибиторы, содержащиеся в сыворотке крови, приводят к искажению 2.

оценки значений показателей гуморального иммунного ответа при использовании ингбиторочувствительных штаммов вируса гриппа в реакциях торможения гемагглютинации и микронейтрализации. Метод иммуноферментного анализа позволяет получать воспроизводимые результаты вне зависимости от уровня ингибиторочувствительности антигенов. При использовании адекватного метода определения антител показано, что чувствительность к неспецифическим ингибиторам не оказывает влияния на иммуногенность штаммов вируса гриппа.

Выявлены одиночные аминокислотные замены (T131I в HA1 и D112N в HA2 3.

гемагглютинина), приводящие к снижению гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок штаммами живой гриппозной вакцины, подготовленными на основе вируса гриппа А/NewCaledonia/20/99 (H1N1).

Впервые сконструированы штаммы вирусов гриппа с измененным кодонным составом 4.

гемагглютинина и изучены их биологические свойства. Показано, что штаммы с измененным кодонным составом реплицировались в системе in vitro и in vivo хуже, чем их не модифицированные аналоги, однако вызывали более интенсивный гуморальный иммунный ответ.

На основе ретроспективного анализа клинических испытаний вакцинных штаммов за 30летний период выявлена прямая зависимость между температуро- и ингибитороустойчивостью «диких» родительских вирусов гриппа А и В и уровнем гуморального иммунного ответа привитых лиц на живые гриппозные вакцины, подготовленные на основе данных вирусов.

Благодарность

Автору работы хотелось бы выразить благодарность за помощь, оказанную на различных этапах выполнения диссертационной работы, всем сотрудникам отдела вирусологии им А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ», в особенности к.б.н. Дубровиной И.А., Баженовой Е.А., Ивановой Е.В., Кузнецовой В.А. за помощь при выполнении экспериментов и работе с животными, к.б.н. Кузнецовой С.А. за обучение иммунологическом методикам работы, к.б.н.

Исаковой-Сивак И.Н. за обучение методикам молекулярно-генетического анализа, к.м.н.

Григорьевой Е.П. за помощь в сборе и систематизации архивной информации о результатах клинических испытаний, к.б.н. Ларионовой Н.В. за рекомендации, касающиеся разных разделов работы, а также сотруднику НИИ Гриппа д.б.н. Кривицкой В.З. за обучение методу постановки реакции микронейтрализации, рецензентам, к.б.н. Писаревой М.М. и профессору, д.м.н.

Найхину А.Н. за ценные замечания и советы, касающиеся содержания и оформления диссертации, а также моему научному руководителю, д.б.н. Ирине Васильевне Киселевой и руководителю отдела вирусологии им А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ», д.м.н., з.д.н.

профессору Ларисе Георгиевне Руденко, которые сделали возможным выполнение данной работы и оказывали неоценимую помощь на всех этапах исследования.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПК – антиген-презентирующие клетки ВДП - верхние дыхательные пути ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения ЖГВ - живая гриппозная вакцина ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина ИЛ - интерлейкин ИЧ - ингибиторочувствительный ИУ – ингибитороустойчивый ИФА – иммуноферментный анализ Л17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с предварительной обратной транскрипцией ПЦР - полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction) РМН – реакция микронейтрализации РНП - рибонуклеопротеин РГА - реакция гемагглютинации РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы РТГА - реакция торможения гемагглютинации ХА – холодоадаптированный ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты ЭИД50 - 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза вируса att - аттенуация, аттенуирующий фенотип (attenuation) ca - холодоадаптированность (cold–adaptation, са фенотип) HA - гемагглютинин Ig – иммуноглобулин IFN - интерферон NA - нейраминидаза non-ts - cпособность к репродукции при температуре выше оптимальной RCT40(38) - репродуктивная способность при различных температурах (reproductive capacity at different temperatures) RDE - receptor–destroying enzyme ts температурочувствительность (temperature sensitivity) NIBRG–23 (H5N1) - реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса А/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вируса гриппа птиц A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) VN1203 (H5N1) - реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса А/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вируса гриппа птиц A/VietNam/1203/2004 (H5N1)

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунки:

Рисунок 1. Схематическое изображение рецептор-связывающего сайта гемагглютинина, взаимодействующего с аналогом рецептора вируса гриппа с указанием ключевых позиций, участвующих во взаимодействии с рецептором и водородных связей между отдельными аминокислотными остатками и аналогом рецептора.

Рисунок 2. Схема расположения антигенных сайтов Sa, Sb, Ca и Cb в молекуле гемагглютинина подтипа Н1.

Рисунок 3. Выделение «диких» и вакцинных штаммов вируса гриппа из назальных смывов морских свинок

Рисунок 4. Ректальная температура морских свинок, зараженных интраназально «дикими» и вакцинными штаммами вируса гриппа.

Рисунок 5. Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm у морских свинок

Рисунок 6. Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm у морских свинок

Рисунок 7. Титры антител к вирусу А/New Caledonia/20/99 (H1N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок.

Рисунок 8. Строение глобулярной части мономера гемагглютинина A/Singapore/1/57 со стороны рецепторного кармана.

Рисунок 9. Расположение позиции 183 в НА вируса гриппа A (H3N2).

Рисунок 10. Расположение аминокислотных позиций 202 и 251 в НА вируса гриппа B............. 79 Рисунок 11. Титры сывороточных антител против 6:2 и 7:1 вакцинных штаммов на основе вируса A/California/7/2004 (H3N2)

Рисунок 12. Титры антител к вирусу A/California/7/2004 (H3N2) в сыворотках и назальных смывах морских свинок.

Рисунок 13. Титры антител к 6:2 и 7:1 вакцинным штаммам на основе вируса B/Wisconsin/1/2010 в РТГА с разными антигенами.

Рисунок 14. Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа B/Wisconsin/1/2010 у морских свинок

Рисунок 15. Расположение аминокислотных остатков, по которым обнаружена гетерогенность среди изученных реассортантов на основе А/New Caledonia/20/99 (H1N1).

Рисунок 16. Рецептор-связывающий карман штамма А/New Caledonia/20/99 (H1N1)................. 92 Рисунок 17. Расположение аминокислотного остатка 106 субъединицы HA2 в месте контакта мономеров гемагглютинина вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1).

Рисунок 18. Среднегеометрические титры антител к вирусу А/New Caledonia/20/99 (H1N1) у морских свинок

Рисунок 19. Моделирование вторичной укладки молекул мРНК нативного и кодоноптимизированного гемагглютинина H1.

Рисунок 20. Моделирование вторичной укладки молекул мРНК нативного и кодоноптимизированного гемагглютинина H5.

Рисунок 21. Динамика титров вирусов с оптимизированным и нативным гемагглютинином в клетках MDCK на разных сроках после заражения

Рисунок 22. Результаты анализа экспрессии гемагглютинина в клетках методом иммуноблоттинга. А.

Рисунок 23. Количество копий смысловых и антисмысловых цепей РНК гемагглютинина в клетках MDCK через 24 и 48 ч после заражения вирусами по результатам оценки методом ОТПЦР в реальном времени.

Рисунок 24. Динамика выделения кодон–оптимизированных штаммов в сравнении с их не оптимизированными аналогами из назальных смывов морских свинок после интраназального заражения...

Рисунок 25. Распределение количества вакцинных штаммов ЖГВ, вызывающих различную частоту сероконверсий, на основе «диких» вирусов–родителей с различной способностью к росту при повышенной температуре инкубации..

Таблицы:

Таблица 1. Вирусы, использованные в экспериментах.

Таблица 2. Программы амплификации ДНК, использованные при проведении анализа генома реассортантов вирусов гриппа методом микс-ПЦР

Таблица 3. Программы амплификации ДНК, использованные при проведении секвенирования участков генома вирусов гриппа

Таблица 4. Праймеры, использованные в реакции ПЦР в реальном времени для детекции уровней экспрессии М-гена

Таблица 5. Программа амплификации ДНК, использованная при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием SuperScriptTM III Platnum® One-step Quantitative kit (Invitrogen, США)

Таблица 6. Программа амплификации ДНК, использованная при проведении детекции уровней смысловой и антисмысловой цепей РНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием SuperScriptTM III First strand synthesis (Invitrogen, США)

Таблица 7. Праймеры, использованные в реакции ПЦР в реальном времени для детекции уровней смысловой и антисмысловой цепей РНК кодон-оптимизированных и нативных вариантов гемагглютинина H1 и H5

Таблица 8. Значения инфекционных титров реассортантов на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), определенные в РКЭ и культуре клеток MDCK

Таблица 9. Среднегеометрические титры антител против вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок и хорьков в разные сроки после вакцинации штаммами 25М/1, 39Е/2 и NC145

Таблица 10. Аминокислотные различия в гемагглютинине ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 (по материалам [188])

Таблица 11. Чувствительность ИУ и ИЧ вариантов вируса A/Singapore/1/57 к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови: титры неспецифических сывороточных ингибиторов при исследовании нативных сывороток в РТГА с ИУ и ИЧ антигенами.

Таблица 12. Репликация ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 при различной температуре в РКЭ и культуре клеток MDCK

Таблица 13. Динамика выделения ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 из назальных смывов морских свинок после интраназального заражения

Таблица 14. Среднегеометрические титры антител против ИУ и ИЧ вариантов вируса гриппа А/Singapore/1/57 в сыворотках морских свинок в разные сроки после вакцинации.

Таблица 15. Реассортантные штаммы, использованные в исследовании влияния нейраминидазы, унаследованной от ИЧ или ИУ штамма, на показатели гуморального иммунного ответа, в опытах in vivo.

Таблица 16. Аминокислотные отличия в гемагглютинине и нейраминидазе штаммов на основе A/California/7/2004 и B/Wisconsin/1/2010, использованных в исследовании.

Таблица 17. Показатели ингибиторочувствительности реассортантных и «диких» штаммов в РТГА с нормальной сывороткой морской свинки.

Таблица 18. Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина клонов, выделенных из гетерогенной популяции «дикого» вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1)

Таблица 19. Перечень использованных в экспериментах вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и донора аттенуации ЖГВ А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2)

Таблица 20. Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина вакцинных штаммов на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1)

Таблица 21. Репродукция вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Таблица 22. Оценка достоверности различий средних значений титров антител в сыворотках и смывах животных на разных сроках после иммунизации штаммом 25М/1 и остальными штаммами, использованными в исследовании

Таблица 23. Использование триплетов азотистых оснований в последовательности гена гемагглютинина кодон-оптимизированных и исходных штаммов.

Таблица 24. Расчетные показатели свободной энергии мРНК с нативной и оптимизированной последовательностью нуклеотидов

Таблица 25. Титры кодон–оптимизированных штаммов в сравнении с их неоптимизированными аналогами при разных температурах инкубации в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Таблица 26. Суммарные данные определения острой токсичности вирусов с кодоноптимизированным и нативным гемагглютинином при интраназальном введении морским свинкам

Таблица 27. Среднегеометрические титры антител против штаммов гриппа на основе A/California/07/2009 (H1N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок в разные сроки после вакцинации

Таблица 28. Среднегеометрические титры антител против штаммов гриппа на основе A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок в разные сроки после вакцинации

Таблица 29. Использованные в работе варианты скрещиваний родительских вирусов с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57

Таблица 30. Варианты скрещиваний кодон-оптимизированных вирусов с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57, примененные для получения реассортантов

Таблица 31. Результаты скрещивания вируса H5-опт с холодоадаптированным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 в клетках линии MDCK.

Таблица 32. Количество клонов, полученных при скрещивании кодон-оптимизированных вирусов с холодоадаптированным донором аттенуации в экспериментах in vivo.

Таблица 33. Оценка уровня иммуногенности вакцинных штаммов для взрослых и для детей (по частоте сероконверсий) [20]

Таблица 34. Распределение вакцинных штаммов по градациям иммуногенности в зависимости от фенотипа вируса-родителя.

Таблица 35. Связь иммуногенности вакцинного штамма ЖГВ с ингибитороустойчивостью «дикого» родительского вируса

Таблица 36. Распределение вакцинных штаммов с разной иммуногенностью в зависимости от сочетания фенотипических характеристик «дикого» родительского штамма

Таблица 37. Средний процент слабых температурных реакций в группах штаммов на основе ИЧ и ИУ вирусов

Таблица 38. Средний процент слабых температурных реакций в зависимости от ts-фенотипа вируса-родителя вакцинного штамма

Таблица 39. Характеристики гриппозной инфекции у модельных животных, использующихся для изучения гриппа

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения 1.

вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопросы вирусологии. – 1977.– № 4. – с. 387-395.

Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. 1994, СПб: Наука.

2.

– 151 с.

Баранцева И.Б., Найхин А.Н., Донина С.А., Степанова Л.А., Рекстин А.Р., Григорьева 3.

Е.П., Дешева Ю.А., Руденко Л.Г. Гуморальный и местный иммунный ответ на гриппозные вакцины у лиц пожилого и молодого возраста // Вопросы вирусологии. – 2003. – № 2. – с. 32-36.

Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. 1998, М.: Практика. – 459 с.

4.

Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Донина С.А., Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Баранцева И.Б., 5.

Завиткова Е.А., Москвичева Т.М., Жаворонков В.Г., Руденко Л.Г. Сравнительная оценка безвредности, иммуногенной активности и профилактической эффективности взрослого и детского вариантов живой гриппозной вакцины у школьников 7-14 лет // Вопросы вирусологии. – 2002. – № 4. – с. 24-27.

Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/ 6.

Калифорния/04/71 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2307162 от 27.09.2007.

Донина С.А., Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Петухова Г.Д., Найхин А.Н., Руденко Л.Г.

7.

Авидность секреторных IgA-антител у людей после иммунизации живой гриппозной вакциной // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2. – № 2-3. – с. 336.

Донина С.А., Найхин А.Н., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Баранцева И.Б., Рекстин А.Р., 8.

Руденко Л.Г. Местный иммунный ответ на живую холодоадаптированную гриппозную вакцину у детей, взрослых и престарелых лиц // Вопросы вирусологии. – 2003. – № 2. – с. 29-31.

Донина С.А., Найхин А.Н., Петухова Г.Д., Баранцева И.Б., Чиркова Т.В., Григорьева 9.

Е.П., Рекстин А.Р., Руденко Л.Г. Системный гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации // Медицинская иммунология. – 2006. – Т. 8. – № 1. – с. 31-36.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |
 

Похожие работы:

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Шестакова Вера Владимировна МОРФО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS MILL. К КОККОМИКОЗУ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.