WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 5 ] --

Н - Значение критерия Краскела-Уоллеса р - Уровень статистической значимости 3.3.4 Заключение Вакцинные штаммы на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), содержавшие отдельные аминокислотные замены в НА, обладали разной иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа в эксперименте на морских свинках. Наиболее высокие показатели гуморального иммунного ответа были достигнуты после иммунизации штаммами, подготовленными в развивающихся куриных эмбрионах. Штаммы, подготовленные в культуре клеток, приобрели уникальные аминокислотные замены в гемагглютинине и вызывали гуморальный иммунный ответ меньшей степени выраженности.

3.4 Влияние оптимизации кодонного состава гемагглютинина на свойства вирусов гриппа и показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo Метод оптимизации кодонного состава является перспективным для повышения иммуногенности вакцин, что было неоднократно показано в экспериментах с ДНК–вакцинами [96, 171, 200, 237, 353-354]. В свою очередь, деоптимизация кодонного состава живого вируса полиомиелита привела к ожидаемому результату – получению устойчиво аттенуированного штамма вируса [90, 232]. Это позволило предположить, что данный подход может быть эффективным и при подготовке живых гриппозных пандемических и предпандемических вакцин.

В данном разделе исследовались свойства искусственно сконструированных вирусов гриппа с гемагглютинином, кодонный состав которого был оптимизирован в целях увеличения экспрессии белка, и оценивались перспективы использования данного подхода для повышения иммуногенности живой гриппозной вакцины.

3.4.1 Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе.

В качестве источников антигенных детерминант для получения реассортантных вакцинных штаммов экспериментальной «кодон–оптимизированной» ЖГВ планировалось использовать искусственно сконструированные реассортанты на основе вируса A/PR/8/34, содержащие от пандемически актуального вируса нейраминидазу и гемагглютинин с оптимизированным составом кодонов. Данная часть работы была выполнена в сотрудничестве с Махидолcким университетом (Бангкок, Тайланд). Были сконструированы два реассортанта:

(1) H1N1–PR8–кодон–оптимизированный реассортант на основе пандемического вируса (H1N1) (далее: H1-опт) и (2) и H5N1–PR8–кодон–оптимизированный A/California/07/2009 реассортант на основе вируса гриппа птиц A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) (далее – H5-опт).

Разработка и синтез кодон–оптимизированных генов были выполнены компанией GenScript (США). Для выполнения проектов по оптимизации последовательностей эта компания использует запатентованный алгоритм Optimum Gene TM, направленный на комплексное воздействие на процессы транскрипции и трансляции [249]. При внесении изменений в последовательность гена контролируется ряд параметров, влияющих на эффективность экспрессии, в том числе содержание GC, сайты сплайсинга, регуляторные участки последовательностей и элементы вторичной структуры мРНК.

В качестве основы использовали последовательности генов гемагглютинина вирусов A/California/07/09 (№ последовательности в Genbank: GQ906804.1) и A/turkey/Turkey/1/2005 (№ DQ407519.1). Полиосновный сайт расщепления в гемагглютинине H5 был заменен на моноосновный. В гемагглютинин вируса H1N1 было внесено 410 замен, в гемагглютинин H5 – 408 замен. Далее гены были клонированы в плазмиды pHW2000, после чего по методике [155] были сконструированы два реассортантных штамма, каждый из которых содержал нативную нейраминидазу соответствующего «дикого» вируса, кодон–оптимизированный гемагглютинин, а остальные 6 генов принадлежали вирусу A/PR/8/34.

Внесенные изменения затрагивают только структуру РНК, структура белка осталась неизменной, что является основой методики кодонной оптимизации. Модель вторичной структуры мРНК нативных и кодон-оптимизированных вирусов представлена на рис. 19, 20. Из рисунка видно, что после оптимизации кодонного состава структура РНК полностью изменяется. Наблюдается сдвиг по использованию пар кодонов (табл. 23) и снижаются показатели свободной энергии (табл. 24). Теоретически данные изменения должны приводить к увеличению стабильности РНК и большей эффективности процессов транскрипции и трансляции в клетках млекопитающих.

В экспериментах вирусы с кодон-оптимизированным гемагглютинином сравнивали с не оптимизированными реассортантами для инактивированной вакцины. Были использованы следующие вирусы:





1. Реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу от вируса A/California/07/2009(H1N1), и 6 генов, кодирующих внутренние белки – от вируса A/PR/8/34 (H1N1) (далее обозначен как H1)

2. Реассортант, содержащий кодон-оптимизированный гемагглютинин и нейраминидазу от вируса A/California/07/2009(H1N1), и 6 генов, кодирующих внутренние белки – от вируса A/PR/8/34 (H1N1) (далее обозначен как H1-опт)

3. Реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу от вируса A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1), и 6 генов, кодирующих внутренние белки – от вируса A/PR/8/34 – NIBRG-23 (далее: H5)

4. Реассортант, содержащий кодон-оптимизированный гемагглютинин и нейраминидазу от вируса A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1), и 6 генов, кодирующих внутренние белки – от вируса A/PR/8/34 – NIBRG-23 (далее: H5-опт) Таблица 23. Использование триплетов азотистых оснований в последовательности гена гемагглютинина кодон-оптимизированных и исходных штаммов.

–  –  –

Рисунок 19. Моделирование вторичной укладки молекул мРНК нативного и кодон-оптимизированного гемагглютинина H1. Слева: нативная структура, справа: структура, полученная на основе последовательности мРНК кодоноптимизированного штамма. Иллюстрации получены с использованием сервиса CentroidFold [143] Рисунок 20. Моделирование вторичной укладки молекул мРНК нативного и кодон-оптимизированного гемагглютинина H5. Слева: нативная структура, справа: структура, полученная на основе последовательности мРНК кодоноптимизированного штамма. Иллюстрации получены с использованием сервиса CentroidFold [143] Таблица 24. Расчетные показатели свободной энергии мРНК с нативной и оптимизированной последовательностью нуклеотидов

–  –  –

3.4.2 Фенотипические свойства вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине Поскольку в литературе на настоящий момент не опубликовано материалов, посвященных исследованиям живых вирусов гриппа с кодон-оптимизированными фрагментами генома в опытах in vivo, нами были определены лабораторные характеристики этих штаммов и изучена их безвредность для лабораторных животных (морских свинок).

Способность к репликации в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK у кодон-оптимизированных реассортантов оказалась снижена по сравнению с аналогичными реассортантами с не оптимизированным гемагглютинином, но по фенотипическим свойствам (способности / не способности к репродукции за пределами температурного оптимума) «оптимизированные» и «не оптимизированные» вирусы не отличались между собой (табл. 25).

Таблица 25. Титры кодон–оптимизированных штаммов в сравнении с их неоптимизированными аналогами при разных температурах инкубации в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

–  –  –

Более низкие титры вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином наблюдались также при оценке динамики размножения в культуре клеток MDCK (рис. 21).

Рисунок 21. Динамика титров вирусов с оптимизированным и нативным гемагглютинином в клетках MDCK на разных сроках после заражения Оценка эффективности экспрессии. Эта часть работы была выполнена с участием сотрудников отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ». Чтобы подтвердить эффективность экспрессии кодон-оптимизированных конструкций в клетках млекопитающих, был проведен сравнительный анализ экспрессии оптимизированных и нативных вариантов гемагглютинина в клетках линии Vero, трансфецированных плазмидами, содержащими кодон-оптимизированные гены, методом иммуноблоттинга. Уровень экспрессии как Н1, так и Н5 оптимизированного вариантов гемагглютинина был выше по сравнению с нативными генами (рис. 22 А, Б). Также уровень экспрессии анализировали методом иммуноблоттинга в клетках MDCK, зараженных вирусами с кодон-оптимизированным либо нативным гемагглютинином. Внутриклеточный уровень гемагглютинина в клетках, зараженных вирусами с кодон-оптимизированным гемагглютинином через 12 часов после заражения был выше, чем в клетках, зараженных вирусами с нативным гемагглютинином.

Через 24 часа после заражения, напротив, уровни внутриклеточного гемагглютинина в клетках, зараженных вирусами с оптимизированным составом кодонов, были незначительно ниже, чем в клетках, зараженных вирусами с нативным HA (рис. 22 В,Г). Это может быть следствием дефектной репликации вирусов с кодоноптимизированным гемагглютинином, либо изменений, возникших в инфицированных клетках, препятствующих эффективной трансляции кодон-оптимизированного гемагглютинина.

Рисунок 22. Результаты анализа экспрессии гемагглютинина в клетках методом иммуноблоттинга. А. Анализ экспрессии генов H1 и H1-опт в трансфецированных клетках Vero. Б. Анализ экспрессии генов H5 и H5-опт в трансфецированных клетках Vero. В. Анализ уровня гемагглютинина в клетках MDCK, зараженных H1 и H1-опт вирусами через 12 и 24 часа после заражения.

Г. Анализ уровня гемагглютинина в клетках MDCK, зараженных H5 и H5-опт вирусами через 12 и 24 часа после заражения.

Для того, чтобы объяснить механизмы снижения уровней экспрессии, были изучены уровни РНК в зараженных клетках методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Клетки MDCK заражали вирусом с кодон-оптимизированным или нативным гемагглютинином и инкубировали 24 или 48 часов. Далее измеряли количество копий смысловых и антисмысловых цепей РНК после лизирования клеток методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Уровни РНК гемагглютинина выравнивали по уровням РНК генетического сегмента, кодирующего М-ген, одинакового у исследованных штаммов, и, соответственно, не затронутого кодонной оптимизацией. Достоверных отличий между уровнями как смысловой, так и антисмысловой цепей РНК вирусов с нативным и оптимизированным составом кодонов в гемагглютинине, обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии дефектов на уровне репликации и транскрипции гена с оптимизированным составом кодонов (рис. 23).

Рисунок 23. Количество копий смысловых и антисмысловых цепей РНК гемагглютинина в клетках MDCK через 24 и 48 ч после заражения вирусами по результатам оценки методом ОТ-ПЦР в реальном времени. А. Данные для вирусов H1 и Н1-опт. Б. Данные для вирусов Н5 и Н5-опт.

Изучение острой токсичности. Штаммы с кодон–оптимизированным гемагглютинином не были токсичными для морских свинок при интраназальном введении, также, как и не оптимизированные варианты.

Изучение острой токсичности препарата при однократном введении осуществлялось в эксперименте на морских свинках. Вирус вводили в дозе 4,5 lg ЭИД50 на каждое животное в объеме 0,2 мл раствора. Контрольным животным вводили эквивалентное количество препарата плацебо (стерильный физиологический раствор). Каждая экспериментальная группа состояла из 5 морских свинок.

В течение 7 суток после введения проводили визуальное обследование животных, оценивая их внешний вид, поведенческие характеристики, потребление корма и воды, измеряли массу тела.

Однократное введение указанной дозы вируса не вызывало гибели экспериментальных животных, изменения внешнего вида, подвижности, поведенческих реакций, потребления пищи и воды. Динамика изменения массы тела животных опытных групп в разные сроки после введения препаратов, в основном, соответствовала контрольной, снижения величины показателя или торможения его прироста не обнаружено (табл. 26).

Таблица 26. Суммарные данные определения острой токсичности вирусов с кодоноптимизированным и нативным гемагглютинином при интраназальном введении морским свинкам

–  –  –

333,2+27,8 335,6+34,1 331,0+26,3 333,8+33,6 332,8+30,1 337,4+35,6 340,5+38,9 335,4+39,4 335,9+32,1 338,4+27,6 335,5+29,9 342,4+32,4 334,5+28,5 338,7+34,0 338,2+26,5 340,2+35,1 341,8+27,3 337,6+33,4 340,1+33,8 340,4+27,1 341,3+43,4 341,9+31,8 339,8+25,6 341,9+29,9 342,7+32,0 343,9+35,7 343,5+32,4 342,1+28,9 343,8+31,0 343,4+29,9

–  –  –

Показатели репродукции в ВДП.

Для исследования показателей репродукции вирусов в ВДП животных морских свинок заражали интраназально в дозе 0,1 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости в каждый носовой ход (4,5 lg ЭИД50 на одно животное). На протяжении 7 суток, начиная с момента спустя 24 часа после заражения, у животных брали назальные смывы и определяли титр вируса в смыве путем титрования в РКЭ при температуре 32С в течение 48 часов. Вирусы с кодон-оптимизированным гемагглютинином выделялись в течение меньшего срока и в меньших титрах, чем не оптимизированные вирусы (рис. 24).

Рисунок 24. Динамика выделения кодон–оптимизированных штаммов в сравнении с их не оптимизированными аналогами из назальных смывов морских свинок после интраназального заражения. Данные представлены в виде: титр lgЭИД50+ошибка среднего значения. Слева:

динамика выделения вирусов оптимизированного и не оптимизированного H1. Справа: динамика выделения вирусов оптимизированного и не оптимизированного H5.

3.4.3 Показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине в экспериментах in vivo Иммуногенность кодон-оптимизированных вирусов в сравнении с не оптимизированными аналогами исследовалась в серии экспериментов на морских свинках.

Животных заражали интраназально вирусами в дозе 4,5 lg ЭИД50, по 0,2 мл в каждый носовой ход и осуществляли забор крови и назальных смывов через 2, 4 и 8 недель после заражения.

Сыворотки исследовали методами РТГА, микронейтрализации и определяли специфические IgG антитела методом ИФА. В назальных смывах определяли титр IgA-антител методом ИФА.

В эксперименте с изучением H1N1 вирусов были использованы следующие штаммы:

H1-опт: A/California/07/09 – PR8 с кодон-оптимизированным гемагглютинином H1: A/California/07/09 – PR8 с не оптимизированным гемагглютинином H1-pdm: «дикий» вариант A/California/07/09pdm H1-вакц: A/17/Калифорния/09/38 – вакцинный штамм ЖГВ на основе A/California/07/09 [28].

Значения показателей гуморального иммунного ответа в группах животных, вакцинированных разными штаммами, статистически достоверно отличались (табл. 27).

–  –  –

В эксперименте с изучением группы штаммов H5N1 были использованы следующие вирусы:

H5-опт: реассортант A/turkey/Turkey/1/2005-PR8 с кодон-оптимизированным НА;

H5: реассортант A/turkey/Turkey/1/2005-PR8 (NIBRG-23) с не оптимизированным НА;

H5-вакц: A/17/turkey/Turkey/05/133 – реассорантный вакцинный штамм ЖГВ на основе A/turkey/Turkey/1/2005, содержащий гемагглютинин от вируса NIBRG-23, а все остальные гены

– от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [192] Различия показателей гуморального иммунного ответа между разными штаммами были статистически достоверны при исследовании сывороток методами РМН, ИФА, а также в РТГА на сроке 8 недель (табл. 28). Кодон-оптимизированный вариант обладал наиболее высокой иммуногенностью из использованных в эксперименте штаммов (табл. 28). Титры антител после заражения штаммом с кодон-оптимизированным НА были в среднем в 2 раза выше, чем после заражения вирусом NIBRG-23, предназначенным для производства ИГВ, для которой самый важный показатель эффективности – это гуморальный иммунный ответ. Различия в СГТ антител через 8 недель после вакцинации в группе животных, зараженных кодоноптимизированным и не оптимизированным вирусами отличались статистически достоверно при уровне значимости p0,05 при оценке с использованием критерия Манна-Уитни по результатам всех исследований.

–  –  –

3.4.4 Отработка методики получения вакцинных штаммов ЖГВ на основе штаммов для инактивированной вакцины (PR8 реассортантов).

Из работ отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ», а также данных литературы было известно, что ряд реассортантных штаммов для инактивированной гриппозной вакцины обладает жесткой констелляцией генов, в результате чего их сложно использовать в качестве источника поверхностных антигенов при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, хотя такое направление работы представляется весьма перспективным при конструировании живых вакцин против пандемически опасных вирусов [124, 191, 295]. Поскольку в качестве источника антигенных детерминант для получения кодон-оптимизированных штаммов ЖГВ планировалось использовать реассортантные вирусы, несущие внутренние гены высокоурожайного штамма вируса гриппа PR8, была поставлена задача отработать методику скрещивания в РКЭ донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 с PR8–реассортантными вирусами, несущими гемагглютинин и нейраминидазу от вирусов гриппа птиц H5N1 или от пандемического вируса H1N1.

Классическая методика подготовки штаммов отечественной живой гриппозной вакцины разработана Г.И. Александровой Реассортация эпидемических вирусов с [1-2].

аттенуированными вирусами - донорами аттенуации проводится в РКЭ. Получение вакцинного штамма включает в себя скрещивание при 32°C родительских вирусов (донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25°C температуре инкубации и клонирование реассортантов предельными разведениями.

Уже в 1950-х годах рядом исследователей было показано, что ключевым моментом, обеспечивающим успешность получения реассортантов в нужной формулой генома, является этап скрещивания [75, 89, 135, 154]. Так, описано повышение частоты получения рекомбинантных вирусов при использовании разных способов инактивации и при варьировании соотношения вирусных частиц разных штаммов [75, 89]. Положительные результаты были получены при изменении времени инкубации, разведении вируссодержащей жидкости и не одновременном внесении вирусов-родителей в куриный эмбрион [135, 154]. Был проведен анализ литературных данных и выбраны наиболее перспективные с нашей точки зрения подходы, позволяющие увеличить эффективность реассортации: облучение суспензии вируса ультрафиолетовым облучением (УФО), тепловая инактивация вируса перед скрещиванием, сокращение времени инкубации, изменение температуры инкубации, последовательное внесение вирусов-родителей в куриный эмбрион [135].

Для экспериментов по оптимизации метода реассортации были отобраны два вакцинных штамма инактивированной гриппозной вакцины против вирусов гриппа птиц H5N1: штамм VN1203 на основе вируса A/VietNam/1203/2004 и штамм NIBRG–23 на основе вируса A/turkey/Turkey/1/2005), а также вакцинный штамм ИГВ против пандемического гриппа H1N1 (A/California/07/2009–PR8).

Были апробированы различные модификации этапа скрещивания, теоретически способствующие реассортации, в том числе инактивация одного из вирусов [75, 135, 154]. В табл. 29 представлены 32 модификации, примененные нами в разных сериях экспериментов (опубликовано: [57]).

Использовалась инактивация «дикого» вируса, предварительно разведенного физиологическим раствором 1:10, с помощью повышенной температуры и в УФО. Длительная инактивация при температуре 40С не привела к желаемому результату (эксперимент № 2, табл.

29). В результате прогревания при 60С также не удалось добиться реассортации (эксперименты № 3 и 5, табл. 29). Наиболее эффективным способом воздействия оказалось УФО в течение 15– 50 секунд. Оптимальное время облучения определялось индивидуально в каждом опыте и зависело от конкретных свойств вируса и его инфекционного титра.

Также были апробированы сокращение времени инкубации при скрещивании до 14, 18 часов, разное соотношение инфекционных титров родительских вирусов, последовательное внесение родительских вирусов в эмбрион и скрещивание в течение 6 суток при пониженной температуре.

Необычным оказалось то, что родительские вирусы, попадая в один и тот же развивающийся куриный эмбрион, не вступали в реассортацию не только при использовании классического, широко охарактеризованного метода [1-2, 336], когда эмбрион заражается смесью двух вирусов–родителей в равных пропорциях (эксперимент № 1, табл. 29). Они не скрещивались, даже будучи искусственно поставлены в условия, способствующие реассортации (частичная инактивация одного из вирусов, использование сочетания селектирующих факторов и пр.) (эксперименты № 1–9, 14–20, 22, 23, 25–32, табл. 29).

Добиться получения ограниченного числа реассортантов удалось подбором сложного комплекса условий, которые были разными для каждой пары вирусов. Как уже отмечалось выше, обязательным условием успешной реассортации оказалась инактивация «диких»

родительских вирусов УФО. Наиболее легко при условии инактивации в реассортацию вступал вирус VN1203 (H5N1) (эксперименты № 10, 11, 13), при этом подавляющее большинство полученных реассортантов наследовало гемагглютинин птичьего происхождения, а остальные гены – от холодоадаптированного донора аттенуации (формула генома 7:1).

Вирус NIBRG–23 (H5N1) вступил в реассортацию только при сочетании следующего комплекса условий: УФО–инактивации, тщательного подбора соотношения инфекционных доз родительских вирусов и их последовательного внесения в куриный эмбрион (сначала УФО– инактивированный вирус H5N1, и через 4 часа – живой донор аттенуации), а также сокращения времени инкубации эмбрионов при 32С до 14–18 часов (эксперименты № 21 и 24, табл. 29).

При этом в группе № 21 было получено несколько 7:1 «двойных» реассортантов, а в группе № 24 – «тройной» реассортант, унаследовавший гемагглютинин птичьего происхождения, РА и М гены – от вируса PR8, а остальные гены – от донора А/Ленинград/134/17/57. Эксперименты № 9, 12, 14, 22 и 23 с другим соотношением количества вирусных частиц скрещиваемых штаммов, пролонгацией времени инкубации и одновременным внесением вирусов не привели к получению реассортантов (табл. 29).

Отдельно следует сказать об эксперименте с попыткой реассортации при пониженной температуре инкубации. Успешное использование такого варианта скрещивания описано в статье австралийской научной группы [336]. Авторам удалось получить холодоадаптированные вакцинные штаммы с антигенными детерминантами «дикого» вируса. Мы использовали, наряду с пониженной до 26С температурой инкубации, инфицирующие дозы «диких» вирусов, в 10 и 100 раз превышающие дозу донора аттенуации, для того, чтобы исключить возможность их подавления холодоадаптированных вирусов на самых ранних этапах репродукции при пониженной температуре (эксперименты № 7 и 8, табл. 29). Однако, в такой постановке опыта ни один из использованных вирусов в реассортацию с донором аттенуации не вступил.

А/California/07/2009–PR8 (H1N1) реассортантный вирус, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу от пандемического штамма A/California/07/2009 (H1N1), не вступил в реассортацию ни в одном из экспериментов, несмотря на то, что применялись самые разнообразные сочетания параметров скрещивания.

Таким образом, несмотря на многочисленные попытки, получить «тройные» реассортанты при скрещивании холодоадаптированного донора аттенуации с PR8–реассортантными вакцинными штаммами ИГВ удалось только в одном варианте скрещивания из 32–х использованных и только для одного из трех «диких» родительских вирусов, NIBRG–23. В подавляющем большинстве экспериментов родительские вирусы вообще не реассортировали между собой.

–  –  –

WT – вирусы NIBRG-23, VN1203 и А/Калифорния/07/2009–PR8 Получен аттенуированный «тройной» реассортант.

3 Л17 – холодоадаптированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 4 Родительские вирусы не вступили в реассортацию.

3.4.5 Реассортация вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57.

3.4.5.1 Реассортация в системе in ovo Отработка методических условий скрещивания показала, что для повышения вероятности реассортации имеет смысл применять определенные модификации этапа скрещивания, в частности инактивацию вируса УФ облучением, варьирование соотношения количества частиц скрещиваемых вирусов, последовательное внесение вирусов в РКЭ, сокращение времени инкубации.

Всего было проведено 12 экспериментов по скрещиванию H1N1-PR8-кодоноптимизированного штамма и 20 вариантов скрещивания H5N1-PR8-кодон-оптимизированного штамма (табл. 30). Использовались различные варианты модифицированной методики, показавшие ранее свою эффективность, а также классическая методика реассортации. В таблице представлены варианты, использованные нами в попытках получить реассортантный штамм с кодон-оптимизированным гемагглютинином.

В экспериментах с кодон-оптимизированным вирусом на основе A/California/07/09-PR8 репликация вируса подавлялась на начальных этапах подготовки штамма. После первого пассажа под антисывороткой к донору аттенуации рост вируса не детектировался, в том числе после ряда «слепых» пассажей – без сыворотки, при оптимальной температуре. Такая ситуация наблюдалась как в экспериментах с инактивацией вируса (эксперименты № 3, 4, 7-12 табл. 30), так и при использовании для скрещивания не инактивированного вирусного материала (эксперименты № 1, 2, 5, 6 табл. 30), а также при значительном превышении концентрации кодон-оптимизированного вируса по сравнению с донором аттенуации.

Была сделана попытка скрещивания кодон-оптимизированного H1N1 штамма с вакцинным штаммом ЖГВ A/17/turkey/Turkey/05/133. Вирусы были взяты в равных дозах, а также в варианте, когда доза кодон-оптимизированного H1N1 в 10 раз превышала дозу A/17/turkey/Turkey/05/133 (эксперименты № 11,12 табл. 30). В данном эксперименте реассортантов также получить не удалось, кодон-оптимизированный H1N1 был полностью вытеснен штаммом A/17/turkey/Turkey/05/133.

При скрещивании в РКЭ кодон-оптимизированный штамм H5N1 также не вступил в реассортацию ни в одном из 20 вариантов экспериментов (табл. 30). Все клоны, полученные в результате скрещиваний, были полностью идентичны исходному H5N1-PR8-кодоноптимизированному вирусу по составу генома.

–  –  –

1 Скрещивание кодон-оптимизированного H1N1 с вакцинным штаммом ЖГВ A/17/turkey/Turkey/ /05/133 2 Классическое скрещивание [1, 336].

3 WT – реассортанты с кодон-оптимизированным гемагглютинином 4 Л17 – холодоадаптированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57

3.4.5.2 Реассортация в культуре клеток MDCK

Поскольку путем скрещивания донора аттенуации с вирусами с кодон-оптимизированным гемагглютинином в куриных эмбрионах реассортантов получить не удалось, была сделана попытка получения реассортантов в альтернативной системе: клеточной линии MDCK.

Получение реассортантов в первичных [212-213] и перевиваемых [296, 336] клеточных культурах является общепринятой методикой.

Для осуществления скрещивания вирусы с кодон-оптимизированным гемагглютинином накапливали в культуре клеток MDCK и определяли TCID50/мл титрованием в 96-луночных полистирольных планшетах на монослое MDCK. Вирусы скрещивали с холодоадаптированным донором аттенуации в разных соотношениях, как с использованием УФ-инактивации, так и без нее (табл. 31). Было получено 34 клона, из которых 5 представляли собой родительский вирус H5-опт, а 29 – холодоадаптированный донор аттенуации. Анализ генома показал, что вирусы в реассортацию не вступили.

Таблица 31. Результаты скрещивания вируса H5-опт с холодоадаптированным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 в клетках линии MDCK.

–  –  –

3.4.5.3 Реассортация в системе in vivo Третьей возможностью получения реассортантов кодон-оптимизированных вирусов с донором аттенуации было скрещивание в эксперименте in vivo. Морских свинок заражали интраназально смесью, содержащей в равном соотношении кодон-оптимизированный вирус и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Через 24, 48 и 72 часа после заражения производился забор назальных смывов в стерильный физиологический раствор. Часть полученного смыва выдерживали с антисывороткой к донору аттенуации в течение 2 часов, затем клонировали в РКЭ при 32С в течение 48 часов, а также в течение 6 суток при 25С.

другую часть смыва титровали без специфической антисыворотки, при 32С в течение 48 часов. Было получено 4 клона в эксперименте с H1-опт вирусом и 1 клон на основе штамма H5-опт (табл. 32). Анализ генома клонов показал, что оба они представляли собой исходные вирусы с кодоноптимизированным гемагглютинином. Таким образом, реассортанты в морских свинках получить не удалось.

Таблица 32. Количество клонов, полученных при скрещивании кодон-оптимизированных вирусов с холодоадаптированным донором аттенуации в экспериментах in vivo.

–  –  –

3.4.6 Заключение Искусственно сконструированные вирусы, содержащие гемагглютинин с измененным кодонным составом, продемонстрировали сниженную способность к репликации в различных системах (развивающиеся куриные эмбрионы, культура клеток MDCK, морские свинки), однако обладали более высокой иммуногенностью, чем не модифицированные варианты. Это подтверждает, что метод оптимизации кодонного состава гемагглютинина, направленной на повышение экспрессии, является многообещающим способом повышения иммуногенности в составе живого вируса. Тем не менее, поскольку вирусы, наряду с более высокой иммуногенностью, обладали сниженной способностью к репликации, а также не вступали в скрещивание с холодоадаптированным донором аттенуации, возможность использования кодонной оптимизации при подготовке холодоадаптированных штаммов требует дальнейшего изучения. Представляется перспективным продолжать разработку данного направления с использованием методов обратной генетики.

3.5 Cвязь фенотипических признаков «диких» родительских вирусов с иммуногенностью вакцинных штаммов, подготовленных на их основе:

ретроспективный анализ данных клинических испытаний живой гриппозной вакцины Для подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины важно правильно подбирать «дикие» родительские вирусы, обладающие определенными свойствами. Наиболее доступными для оценки являются такие свойства вирусов, как, например, их способность к размножению за верхними и нижними пределами температурного оптимума и чувствительность к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови. Понимание того, какие фенотипические свойства «дикого» вируса могут служить маркерами иммуногенности вакцинного штамма, подготовленного на его основе, должно облегчить отбор вариантов родительских вирусов и способствовать получению высокоиммуногенных вакцинных штаммов.

В данном разделе приведены результаты ретроспективного анализа иммуногенности вакцинных штаммов ЖГВ в зависимости от фенотипических свойств «диких» вирусов, на основе которых подготовлены данные штаммы. Результаты, представленные в этой главе, опубликованы в виде обзорной статьи [62].

3.5.1 Влияние ts–фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины Связь между способностью «дикого» родительского вируса размножаться при температуре, повышенной до 38–40°С, и иммуногенностью полученного на его основе вакцинного штамма была описана в работе [20]. Для более детального исследования данного факта нами был проведен расширенный анализ данных архивов клинических испытаний отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ». В исследование вошло 33 вакцинных штамма, подготовленных на основе 28 «диких» вирусов гриппа А и В в период с 1972 по 2008 год.

Для выявления зависимости иммуногенности от степени температурочувствительности штамма использовалась та же схема, что и в исследовании [20] – в зависимости от интенсивности формирования гуморального иммунного ответа у людей вакцинные штаммы были разделены на три группы – высоко-, средне- и низкоиммуногенные (табл. 33).

Иммуногенность вакцинных штаммов оценивали в соответствии с нормативными документами [32, 63]: рассчитывалась частота 4-кратных приростов титров сывороточных антител в РТГА после вакцинации. Температурочувствительность «диких» вирусов–родителей оценивали в зависимости от их способности к репродукции в куриных эмбрионах при температуре 40С по стандартной методике.

Таблица 33. Оценка уровня иммуногенности вакцинных штаммов для взрослых и для детей (по частоте сероконверсий) [20]

–  –  –

Как показал анализ, высокоиммуногенные вакцинные штаммы чаще получались на основе устойчивых к температуре «диких» родительских вирусов (рис. 25), что полностью подтверждает данные, полученные ранее [20].

Рисунок 25. Распределение количества вакцинных штаммов ЖГВ, вызывающих различную частоту сероконверсий, на основе «диких» вирусов–родителей с различной способностью к росту при повышенной температуре инкубации. Серые столбцы: вакцинные штаммы, подготовленные на основе «диких» температурочувствительных родительских вирусов. Пунктирная линия – тенденция к убыванию количества штаммов в группах с более высокой иммуногенностью («дикие» родительские вирусы обладают температурочувствительностью репродукции). Черные столбцы: штаммы, подготовленные на основе «диких» температуроустойчивых родительских вирусов. Сплошная линия – тенденция к увеличению количества штаммов в группах с более высокой иммуногенностью («дикие» родительские вирусы обладают температуроустойчивостью репродукции). Иммуногенность оценивалась по частоте сероконверсий.

Для выявления более тонких связей между температурочувствительностью и иммуногенностью, оценивалась также способность «диких» вирусов к эффективной репликации при 38°С. Вирусы были разделены на три группы, каждой из которых был присвоен ранг, отражающий степень температурочувствительности:

(1) температуроустойчивые: разница между титрами при указанных температурах – не более 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл;

(2) чувствительные к температуре: разница в репродукции при температуре 33 С и 40 С – не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл;

(3) высоко чувствительные к температуре: разница в репродукции при температуре 33 С и 38 С – не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл.

Известно, что вирусы гриппа В более чувствительны к повышенной температуре инкубации, чем вирусы гриппа А и в ряде работ вирусы гриппа В, способные размножаться при температуре 38°С, охарактеризованы как температуроустойчивые, а не реплицирующиеся при этой температуре – как температурочувствительные В нашем исследовании [27].

чувствительность к температуре рассматривалась в качестве абсолютного показателя, поэтому среди вирусов гриппа А встречались все три представленных выше фенотипа, а вирусы гриппа В были только температурочувствительными и высокотемпературочувствительными.

Была обнаружена обратная зависимость между степенью температурочувствительности «дикого» родительского вируса и иммуногенностью вакцинного штамма, подготовленного на его основе. Значения коэффициента корреляции Спирмена для показателей иммуногенности вакцинного штамма и температурочувствительности вируса–родителя, оцененных в баллах, составляли для вирусов гриппа А и В r = -0,508 (достоверно при p=0,003, n=33) (табл. 34).

Вакцинные штаммы, полученные на основе более устойчивых к температуре вариантов вируса гриппа, были более иммуногенны.

Таблица 34. Распределение вакцинных штаммов по градациям иммуногенности в зависимости от фенотипа вируса-родителя.

–  –  –

3.5.2 Влияние ингибиторочувствительности «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ Был проведен анализ связи ингибиторочувствительности «диких» вирусов–родителей и иммуногенности вакцинных штаммов, подготовленных на их основе, по материалам архивов клинических испытаний вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины ФГБНУ «ИЭМ». В анализ были включены 28 эпидемических вирусов 1972–2008 годов выделения и 33 соответствующих им вакцинных штамма.

Ингибиторочувствительность вируса оценивалась по стандартному протоколу [27] в реакции торможения гемагглютинации с нативной сывороткой лошади, прогретой при 56С в течение 30 минут. Вирус считали устойчивым к ингибиторам, если титр в РТГА с прогретой лошадиной сывороткой не превышал 1:40. При более высоком титре вирус считали ингибиторочувствительным.

Степень иммуногенности рассчитывалась в соответствии с нормативными документами иммуногенными считались штаммы, вызвавшие более 50% сероконверсий у [63]:

серонегативных пациентов после однократной иммунизации и более 70% – после двукратной.

Остальные штаммы считались низкоиммуногенными.

С использованием критерия хи–квадрат Фишера (2) было показано, что иммуногенные варианты вакцинных штаммов, подготовленные на основе ингибитороустойчивых (ИУ) штаммов, получались статистически достоверно чаще (табл. 35).

Таблица 35. Связь иммуногенности вакцинного штамма ЖГВ с ингибитороустойчивостью «дикого» родительского вируса

–  –  –

3.5.3 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ Анализ иммуногенности штаммов, обладающих различными комбинациями двух фенотипических признаков «диких» вирусов-родителей показал, что влияние сочетания признаков статистически достоверно (критерий Краскела-Уоллеса H=14,1, p=0,015, N=33).

Наиболее высокий процент сероконверсий наблюдался в группе 1, в которой «дикий»

родительский вирус одновременно являлся ингибиторо- и температуроустойчивым (78,3%, табл. 36). Чувствительные к ингибиторам и повышенной температуре штаммы были менее иммуногенны (группы 5,6) (табл. 36).

Кроме того, анализ свойств 38 эпидемических штаммов вируса гриппа А и В показал, что существует корреляция между признаками чувствительности вируса к повышенной температуре и его чувствительности к ингибиторам лошадиной сыворотки. Вирусы, способные к эффективной репликации при повышенной температуре, чаще оказывались устойчивыми к ингибиторам, содержащимся в лошадиной сыворотке (коэффициент корреляции Спирмена rrank=0,410, p=0,003, N=38).

Таким образом, совокупное влияние данных свойств на иммуногенность штамма может быть связано с тем, что они коррелируют между собой.

–  –  –

3.5.4 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на выраженность клинических реакций при введении ЖГВ Поскольку в литературе встречается ряд упоминаний о более высокой реактогенности ингибитороустойчивых штаммов вирусов [14, 256, 298], был проведен анализ реактогенности вакцинных штаммов, подготовленных в отделе вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» (по архивным материалам клинических испытаний). В анализ были включены вакцинные штаммы, входившие в состав живой гриппозной вакцины в период с 1972 по 2008 год, по которым удалось сопоставить протоколы исследований реактогенности и иммуногенности с данными о фенотипических свойствах вирусов–родителей (табл. 7 приложения).

В соответствии с нормативными документами [32] наличие у привитого температуры до 37,5°С включительно расценивают как слабую реакцию, от 37,6 до 38,5°С - как среднюю, от 38,6°С и выше - как сильную. Серию вакцины считают реактогенной, если средние или сильные местные реакции или катаральные явления длительностью более 3 суток регистрируют более чем у одного из 50 привитых.

Все штаммы ЖГВ были ареактогенны для людей и полностью удовлетворяли требованиям безопасности, предъявляемым к вакцинным штаммам [32].

Мы сравнили показатели реактогенности, рассчитывающиеся по данным о количестве температурных реакций, в разных группах вирусов (на основе температуроустойчивых и температурочувствительных вирусов, на основе ингибитороустойчивых и ингибиторочувствительных вирусов) и не обнаружили отличий по данному параметру.

Однако, поскольку «дикие» родительские вирусы фенотипически значительно различались между собой, был проведен более детальный анализ для поиска возможных минорных отличий в реакциях на введение штамма.

Была проанализирована частота слабых температурных реакций и частота катаральных явлений, которые в соответствии с нормативными документами не учитывают при расчете показателей реактогенности, после вакцинации штаммами на основе разных вирусов (табл. 37,38). Статистически значимой связи со свойствами температурочувствительности и ингибиторочувствительности родительского штамма обнаружено не было, как для каждого признака в отдельности, так и для их сочетаний.

Таблица 37. Средний процент слабых температурных реакций в группах штаммов на основе ИЧ и ИУ вирусов

–  –  –

Таким образом, свойства «дикого» родительского вируса не влияли на частоту слабых реакций и выраженность катаральных явлений у добровольцев после вакцинации. Это свидетельствует о высоком уровне безопасности реассортантных вакцинных штаммов на основе холодоадаптированных доноров аттенуации: независимо от свойств вируса–родителя холодоадаптированные реассортантные вакцинные штаммы всегда остаются ареактогенными для людей. Это дает возможность выбирать исходный штамм для подготовки живой гриппозной вакцины, руководствуясь данными о свойствах, влияющих на иммуногенность, не опасаясь возможного влияния свойств «дикого» вируса на реактогенность будущей вакцины, что особенно важно при подготовке пандемических и предпандемических вакцин на основе высокопатогенных вирусов.

3.5.5 Заключение Фенотипические свойства «дикого» родительского вируса, выбранного в качестве источника поверхностных антигенов при подготовке реассортантных штаммов живой гриппозной вакцины, оказывают влияние на ее иммуногенность. Обнаружена корреляция данных свойств вирусов–родителей с иммуногенностью живых гриппозных вакцин, подготовленных на их основе. Грамотный выбор штамма–источника антигенных детерминант при подготовке гриппозной вакцины, основанный на оценке его фенотипических свойств, позволит получать вакцинные штаммы с более высокой иммуногенностью.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вакцинопрофилактика является наиболее эффективным, безопасным и экономически обоснованным средством борьбы с гриппом. Высокая восприимчивость населения, короткий инкубационный период, острое начало болезни способствуют быстрому распространению вируса в человеческом коллективе, что резко снижает перспективность других средств защиты.

Живая гриппозная вакцина, представляющая собой аттенуированные штаммы вируса гриппа, рекомендована ВОЗ в качестве приоритетного средства профилактики гриппа, поскольку иммунитет, развивающийся после вакцинации живой гриппозной вакциной, включает все те же звенья, что и после естественной инфекции [314].

Несмотря на то, что роль местного иммунного ответа и клеточного звена иммунитета в случае живых вакцин неоднократно подчеркивалась [70, 149, 258, 310, 319, 341], формальным требованием к вакцине по прежнему являются показатели прироста сывороточных антител, определяемые в РТГА [344]. Ряд вакцин последних лет обладал сниженной иммуногенностью по данному показателю. Методы оценки гуморального иммунного ответа являются рутинными, наиболее отработанными и требуют минимум затрат, поэтому включение любых других способов оценки иммунного ответа в схему оценки поствакцинального иммунитета является сложным и требует обоснования. В связи с этим, вопрос о факторах, влияющих на гуморальный иммунный ответ и о возможностях повышения его показателей после вакцинации живыми гриппозными вакцинами по-прежнему остается актуальным.

Для изучения вирусов гриппа используются модельные животные, наиболее часто применяемыми из которых являются мыши и хорьки [271]. Изучение показателей иммунного ответа производится на мышах, что накладывает ограничения на дизайн экспериментов (мыши невосприимчивы к ряду вирусов гриппа человека без предварительной адаптации, не трансмиссивны), методы забора и исследования биоматериала [271].

Хорьки – дорогие и сложные в содержании животные. Альтернативной моделью является морская свинка. Мы ставили задачу выяснить, могут ли морские свинки использоваться в качестве модельных животных для оценки показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа, в том числе холодоадаптированные вакцинные штаммы, а также отработать схему оценки показателей иммунного ответа. Данные, полученные на модели морской свинки, сравнивали результатами исследования других модельных животных – хорьков и мышей. Полученные данные суммированы в таблице 39.

–  –  –

WT – «дикий» вирус; ХА – холодоадаптированный вакцинный штамм, подготовленный на основе 2 данного вируса;

н.д. - нет данных в доступной литературе 3 1 – штамм, содержащий дополнительные аттенуирующие мутации во внутренних генах;

4 2 – штамм, содержащий стандартное количество аттенуирующих мутаций во внутренних генах Восприимчивость морских свинок к штаммам вируса гриппа человека позволяет работать с данными животными, не прибегая к дополнительной адаптации штаммов [209].

Гриппозная инфекция не летальна для морских свинок, в том числе при заражении высокопатогенными вирусами гриппа [323]. Показатели патогенеза гриппозной инфекции у морских свинок сходны с таковыми у хорьков – основной модели, использующейся для изучения патогенеза гриппа (табл. 39, [17, 214, 323]). Изучение выделения «диких» и холодоадаптированных вирусов из ВДП морских свинок показало, что ХА вирусы выделяются в более низком титре, что соответствует результатам, получаемым на хорьках [17]. Изучение показателей гуморального иммунного ответа выявило совпадение с закономерностями, полученными в экспериментах на мышах и на хорьках: (1) титры сывороточных антител после иммунизации холодоадаптированными вирусами ниже, чем после инфекции, вызванной аналогичным «диким» вирусом; (2) внесение дополнительных аттенуирующих мутаций в геном вакцинного штамма приводит к снижению титров сывороточных антител как у мышей и хорьков, так и морских свинок (табл. 39); (3) данные по различию титров сывороточных антител после заражения вакцинными штаммами, полученные на хорьковой модели, повторяются на модели морской свинки ([253], табл. 39). По результатам выполненных экспериментов и в результате анализа литературных данных можно заключить, что морская свинка является перспективной моделью для изучения гриппозной инфекции, в том числе показателей гуморального иммунного ответа.

Вакцинный штамм современной живой гриппозной вакцины представляет собой реассортант «дикого» эпидемического вируса с холодоадаптированным донором аттенуации.

От эпидемического вируса вакцинный штамм наследует антигенные детерминанты гемагглютинин и нейраминидазу, от холодоадаптированного донора аттенуации переходят остальные шесть генов, кодирующие белки полимеразного комплекса, кор, нуклеопротеин, протонную помпу и неструктурные белки вируса. Состав внутренних генов вакцинных штаммов постоянный, поэтому основное влияние на иммуногенность вакцинного штамма оказывают свойства гемагглютинина и нейраминидазы эпидемического вируса.

Гемагглютинин является наиболее многочисленным поверхностным белком вируса гриппа и основной антигенной детерминантой вируса [111, 265]. Вируснейтрализующие антитела, образующиеся после инфекции и вакцинации, в основном связывают эпитопы, расположенные в глобулярной части гемагглютинина Поэтому изменения в [297].

гемагглютинине могут привести к изменению иммуногенных свойств вакцинного штамма.

Основными функциями гемагглютинина в жизненном цикле вируса гриппа является специфическое связывание с рецептором на поверхности клетки-хозяина в процессе прикрепления вируса к клетке [297], а также обеспечение слияния мембраны эндосомы с оболочкой вируса при выходе вируса в цитоплазму клетки [297]. Участки молекулы гемагглютинина, отвечающие за данные свойства, подробно описаны в литературе [216].

Мутации в данных областях могут серьезно изменять свойства вируса, что сказывается на его иммуногенности [351].

Одной из проблем, с которыми сталкиваются разработчики гриппозных вакцин, являются мутации, появляющиеся в гемагглютинине в процессе адаптации к субстрату, в котором происходит подготовка штамма. Существует два основных субстрата, в которых производится культивирование вируса гриппа и получение вакцинных штаммов:

развивающиеся куриные эмбрионы и перевиваемые клеточные линии [226]. Субстрат, в котором происходит выделение вируса и подготовка штамма, может оказать влияние на то, какой компонент в результате войдет в вакцину, поскольку состав рецепторов вируса гриппа в куриных эмбрионах и перевиваемых клеточных линиях отличается [169, 313]. Современные гриппозные вакцины в подавляющем большинстве случаев производятся с использованием развивающихся куриных эмбрионов. Для живых гриппозных вакцин это единственный разрешенный субстрат: по международным и отечественным стандартам работа с вирусами из культуры клеток в процессе подготовки вакцинного штамма запрещена, штамм ЖГВ должен быть получен только на развивающихся куриных эмбрионах [1].



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |
 


Похожие работы:

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.