WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 4 ] --

Визуализация полученной структуры и картирование расположения мутаций производилась с использованием компьютерных программ RasMol 2.7.5, PyMol 1.3.

Моделирование вторичной структуры РНК производилось с помощью онлайн-сервиса CentroidFold [143].

2.6 Методы статистической обработки Статистическая обработка производилась по стандартным методикам [4, 43-44].

Разведочный анализ данных и определение параметров распределения производились в компьютерной программе PASW Statistics 18.

0.0. Значения титров вирусов и сывороточных антител для статистической обработки переводили логарифмировали по основаниям 10 (для титров вирусов) и 2 (для титров антител). Проверка на нормальность проводилась с использованием критерия Шапиро-Уилка, оценка равенства дисперсий производилась с помощью критерия Левена. В случаях, если распределение данных в выборках являлось нормальным, применялись параметрические методы статистического анализа: для сравнения средних значений в двух группах чисел использовался t-критерий Стьюдента, при большем количестве групп достоверность влияния группирующих факторов определялась с использованием дисперсионного анализ Фишера. Для определения зависимости между переменными вычислялся коэффициент корреляции Пирсона. При небольших объемах выборок, а также в случае, когда параметры распределения не позволяли применять параметрические методы статистического анализа, применялись непараметрические методы.

Сравнение средних значений в группах производилось с использованием критерия МаннаУитни (в случае независимых выборок), либо коэффициента Вилкоксона (в случае зависимых измерений). Определение значимости влияния группирующего фактора в случае, если количество выборок превышало две, проводилось с использованием теста Крускала-Уоллеса.

Таблицы сопряженности анализировали с использованием критерия хи-квадрат.

Отличия считались достоверными при уровне статистической значимости p0,05.

Расчеты производились с помощью программ Microsoft Office Excel 2007, PASW Statistics 18.0.0, Statistica for Windows 6.0.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Отработка модели для постановки опытов по исследованию показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа В качестве модели противогриппозного иммунитета чаще всего используются мыши или хорьки [80, 317, 322]. По литературным данным известно, что мыши являются не самой удачной моделью для изучения гриппозной инфекции – они невосприимчивы к ряду штаммов вируса гриппа человека, не выделяют вирус из дыхательных путей [91, 209] и, ввиду малых размеров, вызывают сложности при необходимости повторных заборов биоматериала. Хорьки являются дорогой и сложной в содержании моделью, условия для работы с которой имеются не в любой лаборатории. Кроме того, исследования иммунного ответа к вирусу гриппа у хорьков показали, что данная модель с иммунологической точки зрения является не совсем адекватной [140, 233].

Морские свинки являются одними из широко распространенных лабораторных животных, исследования на которых проводятся с начала 20 века [159]. На настоящий момент данная модель всесторонне изучается, в том числе исследователями, работающими с вирусом гриппа. На данной модели выполнялись исследования по патогенезу гриппозной инфекции [73, 311, 323], трансмиссивности [13, 180, 208-209], адаптации вируса к хозяину [207], иммунному ответу к вирусам гриппа [174, 238, 259]. В исследовании [91] обосновано использование морских свинок в качестве модельного объекта для изучения гуморального иммунного ответа к вирусу гриппа.

В связи с перечисленными достоинствами данного модельного объекта, нами была поставлена задача изучить возможность использования морских свинок для оценки гуморального иммунного ответа на штаммы живой гриппозной вакцины и отработать схему оценки показателей гуморального иммунного ответа.

3.1.1 Сравнительный анализ патогенетических особенностей гриппозной и вакцинальной инфекций у морских свинок.

Морских свинок заражали «дикими» вирусами гриппа и ХА штаммами живой гриппозной вакцины, подготовленными на их основе:

(1) Вирус A/California/07/09 (H1N1)pdm и вакцинный штамм ЖГВ, подготовленный на его основе А/17/Калифорния/09/38 (H1N1) (2) Штамм для получения ИГВ NIBRG-23 (H5N1) (A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1) x PR8) и вакцинный штамм ЖГВ, подготовленный на его основе, А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N2).

Животных заражали интраназально в дозе 5,0 lg ЭИД50. В день заражения и в течение 4 суток после него измеряли ректальную температуру тела животных, а также собирали назальные смывы в 1,0 мл физиологического раствора и исследовали выделение вируса путем титрования в РКЭ. Через 2, 4 и 8 недель исследовали показатели гуморального иммунного ответа.

Выделение вируса из ВДП. Как Н1, так и Н5 холодоадаптированные вакцинные штаммы выделялись из верхних дыхательных путей животных в более низких титрах, чем «дикие»

вирусы, на основе которых они были подготовлены (рис. 3) Рисунок 3. Выделение «диких» и вакцинных штаммов вируса гриппа из назальных смывов морских свинок.

Показаны средние титры вирусов (+ошибка среднего значения), определенные методом титрования в РКЭ при температуре 32С в течение 48 часов.

Слева. Пунктирной линией показаны титры вируса A/California/07/09 (H1N1)pdm, сплошной линией – титры холодоадаптированного вакцинного штамма А/17/Калифорния/09/38 (H1N1).

Справа. Пунктирной линией показаны титры вируса NIBRG-23 (A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1) x PR8), сплошной линией – титры холодоадаптированного вакцинного штамма А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N1).

Показатели ректальной температуры. Значения температуры тела животных, измеренной в прямой кишке, располагались в интервале от 38,9оС до 39,9оС. Показатели ректальной температуры животных, зараженных разными вирусами, отличались через 24 часа после заражения (рис. 4). В контрольной группе, получившей стерильный физиологический раствор, средние значения температуры перед заражением, а также на протяжении 4 суток после, не отличались и колебались в пределах от 39,1 до 39,4.

В группе животных, зараженных вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm, значение показателя ректальной температуры через сутки после заражения статистически достоверно отличалось от показателей до заражения, а также от показателей на вторые, третьи и четвертые сутки после заражения (значение критерия Вилкоксона Z=2,02, p0,05) (рис. 4). В группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом А/17/Калифорния/09/38 (H1N1), подъема температуры не наблюдалось, как и в группе, получившей плацебо.

В группе животных, зараженных вирусом NIBRG-23, также наблюдался подъем температуры через 1 сутки после заражения (значение критерия Вилкоксона Z=2,02, p0,05). В группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N1), подъема температуры не зафиксировано (рис. 4).

Рисунок 4. Ректальная температура морских свинок, зараженных интраназально «дикими» и вакцинными штаммами вируса гриппа.

Слева. Пунктирной линией показаны средние показатели ректальной температуры животных (+ошибка среднего значения), зараженных вирусом A/California/07/09 (H1N1)pdm, сплошной линией – иммунизированных холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/09/38 (H1N1).

Тонкой пунктирной линией с треугольными маркерами – показатели температуры в группе плацебо (животным введен стерильный физиологический раствор) Справа. Пунктирной линией показаны средние показатели ректальной температуры животных (+ошибка среднего значения), зараженных вирусом NIBRG-23 (A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1) x PR8), сплошной линией – иммунизированных холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N1). Тонкой пунктирной линией с треугольными маркерами – показатели температуры в группе плацебо.

Интенсивность гуморального иммунного ответа. Показатели гуморального иммунного ответа определяли в сыворотках крови и назальных смывах через 2, 4 и 8 недель после заражения в реакциях торможения гемагглютинации, микронейтрализации и ИФА. В назальных смывах определяли содержание иммуноглобулинов класса А методом ИФА.

Показатели гуморального иммунного ответа морских свинок, зараженных штаммом A/California/07/09 (H1N1)pdm, на всех сроках и по результатам исследований всеми методами были выше, чем показатели в группе, иммунизированной холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/09/38 (H1N1) (рис. 5).

Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа Рисунок 5.

A/California/07/09 (H1N1)pdm у морских свинок.

Заштрихованные столбцы: группа свинок, иммунизированная холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/09/38 (H1N1).

Серые столбцы: группа свинок, зараженная штаммом A/California/07/09 (H1N1)pdm.

Данные представлены в виде: среднегеометрический титр +ошибка среднего значения.

В паре вирусов Н5 разница между показателями гуморального иммунного ответа в группах животных, зараженных холодоадаптированным и исходным штаммами, была не такой сильной, тем не менее, холодоадаптированный штамм вызывал менее интенсивный гуморальный иммунный ответ (рис. 6).

Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа Рисунок 6.

A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1) у морских свинок.

Заштрихованные столбцы: группа свинок, иммунизированная холодоадаптированным вакцинным штаммом А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N1).

Серые столбцы: группа свинок, иммунизированная штаммом NIBRG-23 (A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1) x PR8).

Данные представлены в виде: среднегеометрический титр +ошибка среднего значения.

3.1.2 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах Для исследования была отобрана пара холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов, подготовленных на основе A/New Caledonia/20/99 (H1N1).

Вирусы были получены из музея штаммов отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ». Штаммы были подготовлены на основе вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) с использованием в качестве источника внутренних генов разных холодоадаптированных доноров аттенуации: штамм NC145 получен на основе клонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 [19], а штамм NC77 - на основе донора А/Ленинград/134/17/А33/57 (Лен/17/33), который отличается от А/Ленинград/134/17/К7/57 наличием двух дополнительных аттенуирующих мутаций во внутренних генах: PB1975, NP1066 [22]. Последовательность гемагглютинина и нейраминидазы штаммов не отличалась.

Сравнение показателей репродукции вакцинных штаммов в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK показало, что в РКЭ инфекционные титры штаммов были недостоверно выше, чем в культуре клеток MDCK (табл. 8). Способность к репликации при различных температурах, определенная в РКЭ, не отличалась [22].

Таблица 8. Значения инфекционных титров реассортантов на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), определенные в РКЭ и культуре клеток MDCK

–  –  –

В работе использовали 3 группы морских свинок: 2 группы были интраназально иммунизированы штаммами NC145 и NC77, контрольная группа получала стерильный физиологический раствор в том же объеме. В опытных группах животных наблюдались детектируемые титры антигемагглютинирующих, нейтрализующих антител, в том числе специфических антител класса IgG, определяемых в ИФА. Прирост титров антител в сыворотках продолжался вплоть до 8 недель после заражения, в назальных смывах на данном сроке у части животных наблюдались детектируемые титры специфических IgA антител.

Значения показателей гуморального иммунного ответа после иммунизации штаммом NC77 были ниже, чем после иммунизации штаммом NC145. Различия были статистически достоверны при исследовании методом РТГА на сроке в 2 недели, при исследовании методом микронейтрализации на сроках 4 и 8 недель, а также на сроке 4 недели при исследовании титров специфических IgG антител в сыворотках и IgA антител в назальных смывах методом ИФА (рис. 7).

Рисунок 7. Титры антител к вирусу А/New Caledonia/20/99 (H1N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок.

Заштрихованные столбцы: группа свинок, иммунизированная стандартным вакцинным штаммом NC145.

Серые столбцы: группа свинок, иммунизированная штаммом NC77, содержащим дополнительные аттенуирующие мутации.

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами.

Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня (1:10 для РТГА, РМН, ИФА в сыворотках, 1:2 в назальных смывах).

U - Значение критерия Манна-Уитни 1 р - Уровень статистической значимости 2 Таким образом, включение в состав генома реассортантного вируса двух дополнительных мутаций в генах NP и РВ1, присущих более аттенуированному донору А/Ленинград/134/47/57, снижало показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов морским свинкам.

3.1.3 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с одиночными кодирующими мутациями в гемагглютинине Поскольку стандартной моделью для изучения иммуногенности вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины являются хорьки, был поставлен эксперимент, позволяющий сравнить иммунный ответ на вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины у хорьков и у морских свинок [59]. На модели морской свинки проводили исследование иммуногенности вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), для которых были известны показатели их иммуногенности для хорьков [253].

Морских свинок заражали штаммами 25М/1, 39Е/2 и NC145 [253]. Спустя 2, 4 и 8 недель в РТГА исследовали титр сывороточных антител против вируса А/New Caledonia/20/99.

Данные, полученные в результате эксперимента на морских свинках, полностью согласуются с данными, полученными на хорьках [253]: штамм 25М/1 обладал наиболее низкой иммуногенностью, штамм NC145 – наиболее высокой, показатели после вакцинации штаммом 39Е/2 были выше, чем после вакцинации 25М/1, но значительно ниже, чем в группе животных, вакцинированных штаммом NC145 (табл. 9).

Таблица 9. Среднегеометрические титры антител против вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1) в сыворотках и назальных смывах морских свинок и хорьков в разные сроки после вакцинации штаммами 25М/1, 39Е/2 и NC145.

–  –  –

В связи с тем, что полученные в предварительном эксперименте данные представляют собой интересный материал для дальнейшего изучения, результаты более подробного исследования иммуногенности данных штаммов для морских свинок представлены в разделе 3.3.

3.1.4 Заключение Представленные результаты свидетельствуют о том, что морские свинки могут использоваться в качестве модельных дивотных для изучения гриппа, в том числе оценки показателей гуморального иммунного ответа. В экспериментах вирусы гриппа эффективно реплицировались в респираторном тракте морских свинок. При этом отмечено, что холодоадаптированные вакцинные штаммы выделялись из ВДП морских свинок в более низких титрах, чем соответствующие им «дикие» вирусы. Гуморальный иммунный ответ к вирусам гриппа после интраназального введения удавалось детектировать уже через 14 дней после заражения.

Возможность использования модели для оценки показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным вирусам гриппа подтверждена в экспериментах с заражением морских свинок холодоадаптированными штаммами к вирусам разных подтипов, а также отличающимися по набору аттенуирующих мутаций и одиночных аминокислотных замен в гемагглютинине.

Отработана схема оценки показателей гуморального иммунного ответа, позволяющая получать воспроизводимые результаты на модели морской свинки, согласующиеся с результатами, полученными с использованием других модельных животных (мыши, хорьки).

3.2 Влияние ингибиторочувствительности штамма вируса гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок Сыворотки крови разных видов млекопитающих (в том числе человека) содержат неспецифические ингибиторы вирусов гриппа, отличные от иммуноглобулинов [29, 130, 186, 273]. Ранее данное свойство рассматривалось как фенотипический признак вируса, и у ряда вирусов в эксперименте удавалось изменить показатель чувствительности к ингибиторам [256].

При этом возможное влияние на антигенные свойства вирусов не учитывалось. На настоящий момент ингибиторочувствительность рассматривается как фенотипическое отражение рецепторной специфичности и характера гликозилирования гемагглютинина вируса гриппа, а также субстратной специфичности нейраминидазы [130, 219, 288].

В данном разделе представлены результаты изучения влияния ингибиторочувствительности вирусов гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок.

3.2.1 Сравнение ингибитороустойчивого и ингибиторочувствительного вариантов вируса А/Singapore/1/57 (H2N2), имеющих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютинина, в экспериментах in vitro и in vivo.

В работе использовались ингибитороустойчивый (ИУ) и ингибиторочувствительный (ИЧ) варианты вируса гриппа А/Singapore/1/57 (H2N2).

Сотрудниками отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» И.Н.Исаковой-Сивак и В.А.Кузнецовой было произведено секвенирование последовательности гемагглютинина данных штаммов и обнаружены три аминокислотных отличия (табл. 10).

Таблица 10. Аминокислотные различия в гемагглютинине ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 (по материалам [188])

–  –  –

По данным литературы, аминокислотные остатки 226 и 228 являются детерминантами рецепторной специфичности вирусов H2 [254]. Как было показано [188], ИУ вариант вируса A/Singapore/1/57 имеет -2,3 рецепторную специфичность, а ИЧ вариант - -2,6.

156 аминокислотная позиция входит в состав петли 150 рецептор-связывающего кармана [242]. Замена глутаминовой кислоты на лизин в этой позиции увеличивает положительный заряд в данной области.

На рис. 8 представлено изображение глобулярной части мономера гемагглютинина A/Singapore/1/57 со стороны рецепторного кармана. Видно, что аминокислоты, стоящие в позициях 156, 226 и 228 располагаются в петлях рецептор-связывающего кармана.

Рисунок 8. Строение глобулярной части мономера гемагглютинина A/Singapore/1/57 со стороны рецепторного кармана.

Слева: расположение синтетического аналога -2,3 рецептора в рецепторном кармане. Цветом выделены аминокислотные позиции 156, 226 и 228. Иллюстрация получена на основе структуры PDB ID: 2WRB [204]. Справа: расположение синтетического аналога -2,6 рецептора в рецепторном кармане. Цветом выделены аминокислотные позиции 156, 226 и 228. Иллюстрация подготовлена на основе структуры PDB ID: 2WR7 [204] с использованием программы RasMol 2.7.5.2 Ингибиторочувствительный вариант значительно отличался от ингибитороустойчивого по способности к подавлению неспецифическими ингибиторами сыворотки животных. При использовании в качестве антигена в РТГА ИЧ-варианта, вирус подавлялся сывороткой неиммунной морской свинки до титра 1:10240, в то время как ИУ-вариант был устойчив к действию данной сыворотки (табл. 11). После прогревания сыворотки при высокой температуре (80С в течение 10 минут) титр ингибирующей ИЧ-вирус активности сыворотки становился еще выше. Ингибиторы в титре 1:2560 оставались в сыворотке морской свинки в том числе после обработки RDE. ИУ-вирус не подавлялся ни одним из вариантов сыворотки, использованной в эксперименте.

Таблица 11. Чувствительность ИУ и ИЧ вариантов вируса A/Singapore/1/57 к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови: титры неспецифических сывороточных ингибиторов при исследовании нативных сывороток в РТГА с ИУ и ИЧ антигенами.

–  –  –

Оба вируса обладали способностью к эффективной репликации при температуре 40С в РКЭ, и слабо реплицировались при 25С (табл. 12), то есть обладали типичным для «дикого»

вируса тех лет выделения non-ts/non-ca фенотипом. Однако, при всех температурах инкубации инфекционный титр ИЧ-варианта при титровании в РКЭ в среднем был ниже, чем ИУ-варианта.

При титровании же в культуре клеток MDCK титры обоих вирусов были практически одинаковыми (табл. 12).

Таблица 12. Репликация ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 при различной температуре в РКЭ и культуре клеток MDCK

–  –  –

Для определения динамики выделения вирусов из носовой полости млекопитающих две группы морских свинок были заражены ИУ и ИЧ вариантами вируса A/Singapore/1/57 в равных дозах (5 lg ЭИД50 на одно животное). У животных брали назальные смывы спустя 1, 2, 3, 4 и 5 суток после заражения и определяли в них титр вируса путем титрования в РКЭ при температуре 32С в течение 48 часов. ИЧ-вирус выделялся в более высоком титре, чем ИУ.

Выделение ИУ-варианта удалось зафиксировать в 1 и 2 сутки после заражения, ИЧ-вариант выделялся до третьих суток (табл. 13).

Таблица 13. Динамика выделения ИУ и ИЧ вариантов A/Singapore/1/57 из назальных смывов морских свинок после интраназального заражения

–  –  –

3.2.2 Показатели гуморального иммунного ответа после заражения морских свинок вариантами вируса А/Singapore/1/57 (H2N2) в экспериментах in vivo Иммуногенность ИУ и ИЧ вариантов вируса A/Singapore/1/57 исследовалась в серии экспериментов на морских свинках. Животных заражали интраназально и оценивали показатели гуморального иммунного ответа. Сыворотки исследовали методами РТГА, микронейтрализации и ИФА, в смывах методом ИФА определяли содержание иммуноглобулинов класса А.

Поскольку было показано, что ИУ и ИЧ вирусы имеют разную способность к неспецифическому ингибированию сыворотками животных, а также известно, что вирусы имеют аминокислотные отличия в гемагглютинине, при учете интенсивности гуморального иммунного ответа разными методами в качестве антигена использовались оба варианта вирусов.

При исследовании сывороток методом РТГА, выбор антигена для детекции результатов реакции оказывал решающее влияние на результат реакции. Независимо от того, каким вирусом были заражены морские свинки, титры при использовании в качестве антигена ИЧ вируса были значительно (в среднем на два порядка) выше, чем при использовании ИУ варианта, причем в контрольной группе в реакции с ИЧ-антигеном титры достигали значения 1:5120, чего никогда не наблюдалось в реакции с ИУ-антигеном (титры менее 1:10). Более высокие титры выявлялись при использовании гомологичного антигена, но данные различия не были статистически значимы (табл. 14, значение критерия Манна-Уитни U). При учете с использованием одного и того же антигена, статистически значимых различий между титрами антилел в группах, иммунизированных ИЧ и ИУ вариантами вируса, не наблюдалось.

Титры вируснейтрализующих антител, оцененные с помощью реакции микронейтрализации, по динамике повторяли результат, полученный с использованием РТГА (табл. 14), использование гомологичного антигена также давало более высокие титры. По абсолютным значениям титры при использовании ИУ антигена были в 4-8 раз выше, чем титры ангтигемагглютинирующих антител, оцененные в РТГА, а при использовании ИЧ антигена были примерно в 100 раз ниже полученных в РТГА значений. Подавление репродукции ИЧантигена неиммунными сыворотками животных из контрольной группы также наблюдалось в титре в среднем в 100 раз ниже, чем в РТГА. Влияние антигена на результаты реакции также было статистически значимым (табл. 14).

Влияние антигена, выбранного для учета, на результаты реакции, было статистически значимым при оценке антигемагглютинирующих антител в сыворотках методом РТГА и вируснейтрализующей активности сывороток методом микронейтрализации (табл. 14, значение критерия Вилкоксона Z). Роль неспецифического ингибирования можно оценить по результатам подавления гемагглютинации и репликации вируса сыворотками животных из группы, получившей плацебо (табл. 14) Титры иммуноглобулинов класса G, оцененные методом ИФА, были наиболее высокими (до 1:40960). В сыворотках контрольной группы животных титры составляли в среднем 1:20 при использовании любого из антигенов. Титры сывороточных антител при использовании гомологичного антигена были выше для обеих групп животных, что свидетельствует о возможных антигенных отличиях ИУ и ИЧ вариантов вируса (табл. 14).

Титры иммуноглобулинов класса А в назальных смывах были более высокими в группе, зараженной ИУ-вариантом, различия были статистически значимы на сроке 4 недели.

Значения титров IgA внутри групп животных имели большой разброс, что затрудняет однозначную трактовку результатов исследования интенсивности местного гуморального иммунного ответа (табл. 14).

–  –  –

3.2.3 Характеристика 7:1 и 6:2 реассортантов, унаследовавших нейраминидазу от ИЧ или ИУ вируса-родителя Известно, что нейраминидаза вносит определенный вклад в ингибиторочувствительность вируса [130, 186]. Данное свойство зависит от субстратной специфичности нейраминидазы и особенностей ее строения [130, 219]. Поскольку нейраминидаза также вносит свой вклад в формирование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [312], мы провели исследование влияния присутствия в геноме вакцинного штамма нейраминидазы от ИЧ или ИУ вируса на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными реассортантами, сравнивая иммуногенность пар штаммов, отличавшихся происхождением гена, кодирующего нейраминидазу.

Для исследования было выбрано 2 пары вирусов: пара реассортантов на основе вируса A/California/7/2004 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), и другая пара на основе вируса B/Wisconsin/1/2010 и донора аттенуации В/СССР/60/69 (табл. 15).

Таблица 15. Реассортантные штаммы, использованные в исследовании влияния нейраминидазы, унаследованной от ИЧ или ИУ штамма, на показатели гуморального иммунного ответа, в опытах in vivo.

–  –  –

Прежде всего была определена последовательность гемагглютинина и нейраминидазы всех четырех использованных в исследовании штаммов.

В гемагглютинине штамма A/17/Калифорния/04/6 была обнаружена кодирующая замена в позиции 547, приводящая к замене аспарагина на тирозин в позиции 183 (табл. 16).

Аминокислотный остаток 183 входит в состав петли 190 рецептор-связывающего кармана гемагглютинина [242] (рис. 9).

Рисунок 9. Расположение позиции 183 в НА вируса гриппа A (H3N2).

На рисунке показана глобулярная часть гемагглютинина вируса гриппа A (H3N2), иллюстрация получена на основе PDB структуры 4O5N [196]. Красным цветом выделено расположение аминокислоты 183.

В гемагглютинине 6:2 штамма В/60/Висконсин/2010/125 были обнаружены некодирующие замены в нуклеотидных позициях 139, 303, 504, 840 и 1266, и кодирующие замены в позициях 650 и 796, приводящие к замене серина на аспарагин в позиции 202 и метионина на валин в позиции 251 соответственно (табл. 16). Позиция 202 входит в состав петли 190 рецепторсвязывающего кармана (рис. 10).

Рисунок 10. Расположение аминокислотных позиций 202 и 251 в НА вируса гриппа B.

Расположение показано на структуре гемагглютинина вируса гриппа B в комплексе с синтетическим аналогом рецептора вируса гриппа. Слева: глобулярная часть гемагглютинина вируса гриппа B в комплексе с синтетическим аналогом птичьего рецептора LSTa, иллюстрация получена на основе PDB структуры 2RFT [329] Справа: глобулярная часть гемагглютинина вируса гриппа B в комплексе с синтетическим аналогом птичьего рецептора LSTc, иллюстрация получена на основе PDB структуры 2RFU [329]. Зеленым цветом показано расположение аминокислоты 251.

NA исследованных штаммов не содержали мутаций, их последовательности полностью соответствовали последовательности вирусов-«родителей».

–  –  –

Влияние нейраминидазы на чувствительность штаммов к ингибиторам нормальной сыворотки было определено в РТГА: титр, до которого подавлялся вирус, в геноме которого присутствовала нейраминидаза, унаследованная от ИУ-вируса (штаммы с формулой генома 7:1), отличался от титра исходного вируса в 8-16 раз, при этом штаммы с формулой генома 6:2 подавлялись до того же титра, что и исходный «дикий» ингибиторочувствительный вирус (табл. 17).

–  –  –

Чувствительность реассортантного вируса к температуростабильным неспецифическим ингибиторам сыворотки в сравнении с «диким» родительским вирусом Донор аттенуации B/СССР/60/69.

3.2.4 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа A/California/7/2004 (H3N2) Первая пара штаммов была подготовлена на основе ингибиторочувствительного вируса и ингибитороустойчивого донора аттенуации A/California/7/2004 (H3N2) А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Оценивались показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок штаммами на основе данных двух вирусов, отличавшихся происхождением нейраминидазы: штамм 6:2 (А/17/Калифорния/04/71) унаследовал нейраминидазу от «дикого» ИЧ родителя, штамм 7:1 (A/17/Калифорния/04/6) унаследовал нейраминидазу от ИУ донора аттенуации. Для изучения показателей гуморального иммунного ответа две группы морских свинок заражали интраназально штаммами А/17/Калифорния/04/71 (6:2) и A/17/Калифорния/04/6 (7:1).

Результаты реакции торможения гемагглютинации с антигенами, содержащими разную нейраминидазу. Поскольку известно, что свойства нейраминидазы могут повлиять на результаты РТГА [130], реакции ставились с использованием двух разных антигенов: штамма с формулой генома 7:1 (A/17/Калифорния/04/6) и штамма 6:2 (А/17/Калифорния/04/71). При использовании более чувствительного (см. разд. 3.3.3) к ингибиторам нормальной сыворотки антигена (А/17/Калифорния/04/71) детектировались более высокие титры сывороточных антител в обеих группах животных, отличия были достоверны при уровне статистической значимости p0,05 (рис. 11). Более высокие титры при использовании каждого антигена выявлялись и в группе животных, зараженных гомологичным антигеном, но статистически значимых отличий обнаружено не было (рис. 11). При учете с использованием одного и того же антигена, статистически значимых различий между титрами антилел в группах, иммунизированных 6:2 и 7:1 штаммами, не наблюдалось.

Рисунок 11. Титры сывороточных антител против 6:2 и 7:1 вакцинных штаммов на основе вируса A/California/7/2004 (H3N2) Название столбца – вирус, которым заражали группу животных, в скобках указан вирус, использованный в качестве антигена для постановки реакции.

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами.

Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня (1:10).

Z - значение критерия Вилкоксона (сравнение результатов РТГА отдельно по каждому животному) p - уровень статистической значимости Показатели гуморального иммунного ответа по результатам исследований методами РТГА, микронейтрализации, ИФА.

При анализе показателей гуморального иммунного ответа разными методами в качестве антигена использовался «дикий» вирус A/California/7/2004 (H3N2). Показатели иммунного ответа в группе животных, зараженных 6:2 штаммом, были выше, чем в группе, зараженной 7:1 штаммом, на всех сроках наблюдения при исследовании разными методами, но статистически значимых отличий обнаружено не было (рис. 12).

Рисунок 12. Титры антител к вирусу A/California/7/2004 (H3N2) в сыворотках и назальных смывах морских свинок.

Заштрихованные столбцы: группа свинок, иммунизированная вакцинным штаммом A/17/Калифорния/04/71 с нейраминидазой от ИЧ-вируса (6:2).

Серые столбцы: группа свинок, иммунизированная штаммом A/17/Калифорния/04/6 с нейраминидазой от ИУ-вируса (7:1).

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами.

Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня (1:10 для РТГА, РМН, ИФА в сыворотках, 1:2 в назальных смывах).

U - Значение критерия Манна-Уитни 1 р - Уровень статистической значимости 2 3.2.5 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа B/Wisconsin/1/2010 7:1 и 6:2 реассортанты были подготовлены на основе ингибиторочувствительного вируса B/Wisconsin/1/2010 и ингибитороустойчивого донора аттенуации B/СССР/60/69. По аналогии с разделом 3.3.4. исследовали показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок указанными реассортантами, отличавшимися происхождением нейраминидазы:

штамм 6:2 (В/60/Висконсин/2010/125) унаследовал нейраминидазу от «дикого» ИЧ родителя, штамм 7:1 (В/60/Висконсин/2010/7392) унаследовал нейраминидазу от ИУ донора аттенуации.

Две группы морских свинок заражали интраназально штаммами В/60/Висконсин/2010/125 (6:2) и В/60/Висконсин/2010/7392 (7:1).

Результаты реакции торможения гемагглютинации с антигенами, содержащими разную нейраминидазу.

Результаты реакции торможения гемагглютинации учитывались с двумя антигенами:

В/60/Висконсин/2010/125 (6:2) и В/60/Висконсин/2010/7392 (7:1). Более высокие титры детектировались при использовании гомологичного антигена, при этом таких значительных различий, как в опыте со штаммами на основе A/California/7/2004, не наблюдалось (рис. 13).

Статистически значимых различий обнаружено не было.

Рисунок 13. Титры антител к 6:2 и 7:1 вакцинным штаммам на основе вируса B/Wisconsin/1/2010 в РТГА с разными антигенами.

Название столбца – вирус, которым заражали группу животных, в скобках указан вирус, использованный в качестве антигена для постановки реакции.

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами.

Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня ( 1:10).

Z - значение критерия Вилкоксона (сравнение результатов РТГА отдельно по каждому животному) p - уровень статистической значимости Показатели гуморального иммунного ответа по результатам исследований методами РТГА, микронейтрализации, ИФА.

При исследовании показателей гуморального иммунного ответа разными методами в качестве антигена при постановке реакций использовался «дикий» вирус B/Wisconsin/1/2010.

Статистически значимых различий между показателями в группах животных, иммунизированных 6:2 и 7:1 штаммами, обнаружено не было (рис. 14).

Рисунок 14. Среднегеометрические титры антител к вирусу гриппа B/Wisconsin/1/2010 у морских свинок.

Заштрихованные столбцы: группа свинок, иммунизированная вакцинным штаммом В/60/Висконсин/2010/125 с нейраминидазой от ИЧ-вируса (6:2).

Серые столбцы: группа свинок, иммунизированная штаммом В/60/Висконсин/2010/7392 с нейраминидазой от ИУ-вируса (7:1).

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами.

Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня ( 1:10 для РТГА, РМН, ИФА в сыворотках, 1:2 в назальных смывах).

U - Значение критерия Манна-Уитни 1 р - Уровень статистической значимости 2 3.2.6 Заключение Степень чувствительности к ингибиторам связана как со свойствами гемагглютинина, так и со свойствами нейраминидазы вируса. Показатели иммунного ответа у морских свинок после иммунизации штаммами, отличавшимися по степени чувствительности к ингибиторам, не имели статистически достоверных отличий, при условии учета с использованием одного и того же антигена. При этом степень ингибиторочувствительности антигена, использованного при учете титров антител в РТГА и РМН, статистически достоверно влияла на результат.

Использование ингибитороустойчивого антигена при детекции иммунного ответа на ингибиторочувствительный антиген приводило к занижению значений показателей иммунного ответа. При использовании ингибиторочувствительного антигена значение играл фактор неспецифического подавления вируса компонентами сыворотки. При детекции специфических антител методом ИФА неспецифического подавления не происходило, поэтому данный метод может быть рекомендован для работы с ингибиторочувствительными антигенами.

3.3 Отдельные аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина и их влияние на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами Гемагглютинин – поверхностный белок вируса гриппа, мутации в котором могут критическим образом повлиять на антигенные свойства и иммуногенность штамма.

Исследованию одиночных мутаций, влияющих на иммуногенность, посвящен ряд работ [156, 211, 332] и др.). Кроме того, иммуногенность определяется комплексом фенотипических признаков, определяющих характер и эффективность взаимодействия вируса с организмомхозяином.

Что касается антигенных свойств гемагглютинина, наибольшее влияние оказывают мутации в областях, расположенных на поверхности глобулярной части молекулы [272]. Любая одиночная мутация в гемагглютинине теоретически может повлиять на антигенные свойства вируса гриппа и/или иммуногенность штамма [83], следовательно, сведения о влиянии мутаций в гемагглютинине на иммуногенность и свойства вируса могут помочь в выборе вакцинного кандидата.

В данном разделе представлены результаты изучения влияния одиночных аминокислотных замен в молекуле гемагглютинина на иммуногенность вакцинных штаммов

ЖГВ по показателям гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo (опубликовано:

[61]).

3.3.1 Гетерогенность в аминокислотном составе гемагглютинина популяции дикого вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и клетках MDCK В работе был использован эпидемический вирус А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинные реассортанты на его основе. Выбор вируса для исследования был обусловлен тем, что при его первичной изоляции из клинического материала пациента выделение производилось с использованием двух различных биологических систем: развивающихся куриных эмбрионов (далее изоляты обозначены как NCE) и культуры клеток MDCK (NCM) [253]. Варианты, выделенные на разных субстратах, отличались по некоторым аминокислотным позициям в гемагглютинине (табл. 18).

–  –  –

Для того, чтобы более детально изучить состав популяции «дикого» вируса, было произведено клонирование популяции NCE. Получено четыре клона (NCE/1-4), гемагглютинин которых был отсеквенирован. Была выявлена гетерогенность гемагглютинина по четырем аминокислотным позициям (табл. 18). Клоны NCE/1-3 представляли собой чистые линии, а вариант NCE/4 - гетерогенную смесь. Поскольку все чистые клоны были идентичны по последовательности аминокислот в гемагглютинине и нейраминидазе, в качестве источника антигенных детерминант для получения вакцинного штамма был выбран один из них (NCE/2).

Влияние одиночных аминокислотных отличий в гемагглютинине на показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo исследовали с использованием ряда реассортантных вакцинных штаммов, полученных на основе разных вариантов вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и донора аттенуации ЖГВ А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Были использованы следующие штаммы, представленные в таблице 19.

–  –  –

Было произведено секвенирование гемагглютинина реассортантов, перечисленных в табл. 19. Реассортанты, подготовленные в разных субстратах, отличались по ряду аминокислотных позиций в гемагглютинине. Штаммы NC145 и NC84 унаследовали от родительской популяции вируса отдельные варианты аминокислот, обнаруженные в гетерогенных позициях. Штаммы 25М/1 и 39Е/2 приобрели по одной уникальной замене в гемагглютинине, не обнаруженной при клонировании смешанной популяции изолированного в эмбрионах «дикого» вируса (табл. 20).

Таблица 20. Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина вакцинных штаммов на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1)

–  –  –

Изучение репродукции вакцинных штаммов в культуре клеток MDCK показало, что значения инфекционных титров изученных штаммов совпадали, при этом при титровании в РКЭ наблюдались определенные отличия. Штамм 25М/1 значительно активнее размножался в культуре клеток (табл. 21), в титрах штаммов 39Е/2 и NC145 также наблюдались отличия.

Таблица 21. Репродукция вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

–  –  –

3.3.2 Картирование аминокислотных отличий в гемагглютинине клонов дикой популяции А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинных реассортантов, подготовленных на их основе Чтобы лучше понять расположение вариабельных аминокислот в молекуле гемагглютинина изученных вирусов на основе А/New Caledonia/20/99 (H1N1), а также их возможное влияние на функции и иммуногенные свойства гемагглютинина, аминокислотные позиции, по которым была выявлена гетерогенность в молекулах гемагглютинина исследованных штаммов, были визуализированы с использованием компьютерного моделирования.

Как было показано выше, в глобулярной части молекулы гемагглютинина (HA1) вариабельность была обнаружена в четырех аминокислотных позициях – 78, 131, 190 и 225.

Еще две вариабельные позиции располагались в ножке гемагглютинина (аминокислотные остатки 106 и 112) (табл. 20).

Вариабельность в субъединице HA1.

Позиция 78. В позиции 78 (нумерация остатков по H3 [272]) при клонировании популяции вируса NCE у клона NCE/4 стоял остаток глутаминовой кислоты, как и в последовательностях NCE (AJ344014.1) и NCM (ISDNAU0001) (табл. 18). Клоны NCE/1-3 содержали остаток лизина. Данный аминокислотный остаток расположен на поверхности глобулярной части молекулы гемагглютинина (рис. 15) и входит в антигенный сайт Cb [164].

Штамм NC84, подготовленный на основе клона дикой популяции NCE/2, в данной позиции содержал лизин, остальные исследованные штаммы – глутаминовую кислоту (табл.

20).

Позиция 131. 131 аминокислотный остаток во всех штаммах представлен треонином, кроме штамма 39Е/2, у которого в данной позиции стоит изолейцин (табл. 20). У всех изученных штаммов, кроме 39Е/2, в позициях 129-131 расположен потенциальный сайт гликозилирования Asn-His-Thr, у штамма 39Е/2 в связи с заменой треонина на изолейцин гликозилирование в данной позиции произойти не может. По данным [242], этот аминокислотный остаток является частью петли 120 рецептор-связывающего кармана (рис. 16).

Позиция 190. Варианты «дикого» вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1), выделенные в разных субстратах (РКЭ и культуре клеток MDCK (NCE и NCM,)), отличались по аминокислотному остатку в позиции 190: вирус, выделенный в MDCK (NCM) содержал в этой позиции аспарагин, а вариант NCE – аспарагиновую кислоту (табл. 18). Вакцинные реассортанты, подготовленные на их основе, унаследовали аминокислоту от родительского варианта вируса: 25М/1 содержит аспарагин, 39E/2 и NC145 – аспарагиновую кислоту.

Аминокислотный остаток 190 входит в состав спирали 190, формирующей часть рецепторного кармана гемагглютинина (рис. 15, 16) и по данным литературы известен как детерминанта рецепторной специфичности вирусов H1 [126, 351].

Рисунок 15. Расположение аминокислотных остатков, по которым обнаружена гетерогенность среди изученных реассортантов на основе А/New Caledonia/20/99 (H1N1). На рисунке показан тример гемагглютинина вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1). На одном из мономеров показано расположение аминокислотных остатков, по которым была выявлена гетерогенность среди изученных штаммов. Разными цветами показано расположение антигенных сайтов Ca, Cb, Sb, Sa ([164]). На рисунке слева – вид со стороны одного из мономеров, на рисунке справа один из мономеров показан в виде схемы основных элементов структуры и видно аминокислотные позиции 106 и 112 в субъединице HA2, расположенные в центре тримера.

Иллюстрация получена с использованием программы RasMol 2.7.5.

Рисунок 16. Рецептор-связывающий карман штамма А/New Caledonia/20/99 (H1N1).

Расположение аминокислот, варьирующих у изученных реассортантов, в области рецепторого кармана. Петли 120, 130, 150, 220, спираль 190 [242] выделены желтым цветом. Вариабельные аминокислоты выделены и подписаны на рисунке (в качестве примера показан гемагглютинин штамма NCE). Видно расположение аминокислоты 131 в основании петли 120, 190 остатка в составе спирали 190, 225 остатка в составе петли 220. Иллюстрация получена с использованием программы RasMol 2.7.5.

Позиция 225. В исследованных нами реассортантах в 225 позиции были обнаружены аспарагин, глицин или аспарагиновая кислота. 225 аминокислотный остаток входит в состав петли 220 рецептор-связывающего кармана гемагглютинина (рис. 16). По литературным данным в этой позиции в популяциях разных вирусов подтипа H1 также отмечена высокая вариабельность [113].

Вариабельность в субъединице HA2.

Позиция 106. Вакцинный штамм NC145 унаследовал от «яичной» популяции дикого вируса минорный компонент лизин в позиции 106 ножки гемагглютинина (HA2) (рис. 15). На рис. 17 представлен вид на участок соединения мономеров гемагглютинина, в котором и расположен данный аминокислотный остаток.

Рисунок 17. Расположение аминокислотного остатка 106 субъединицы HA2 в месте контакта мономеров гемагглютинина вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1). Вид на молекулу со стороны ножки. Слева – вариант, содержащий лизин (штамм NC145), cправа – вариант, содержащий аргинин (остальные штаммы, на рисунке в качестве примера изображена модель гемагглютинина штамма NCE).

Иллюстрация получена с использованием программы RasMol 2.7.5.

Позиция 112. Реассортант 25М/1, подготовленный в клетках MDCK на основе М-варианта вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1), приобрел мутацию в ножке гемагглютинина: в позиции 112 субъединицы HA2 произошла замена аспарагиновой кислоты на аспарагин (рис. 15).

3.3.3 Показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок, вакцинированных штаммами, подготовленными на основе вариантов вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1), имеющих одиночные аминокислотные отличия в гемагглютинине Иммуногенность вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса А/New отличающихся по отдельным аминокислотным позициям в Caledonia/20/99 (H1N1), гемагглютинине, исследовали на модели морской свинки. Для изучения показателей гуморального иммунного ответа четыре группы морских свинок заражали интраназально вакцинными штаммами на основе А/New Caledonia/20/99 (H1N1) (табл. 19). Показатели гуморального иммунитета определяли методами РТГА, ИФА и микронейтрализации по схеме, описанной в разделе «Материалы и методы».

Было показано, что показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок после интраназального введения исследованных штаммов значительно отличались.

Значения титров антител были наиболее низкими у штамма 25M/1, подготовленного в культуре клеток на основе изолированного в культуре родительского вируса NCМ. Средние значения титров сывороточных антител животных, вакцинированных штаммом 25М/1, статистически достоверно отличались от значений титров сывороточных антител животных, вакцинированных штаммами NC145 и NC84, на всех сроках, по результатам всех исследований (табл. 22, рис. 18).

–  –  –

Штамм 39Е/2 был более иммуногенен, значения титров антител в данной группе статистически достоверно превышали титры, полученные в результате вакцинации 25М/1, на сроке 8 недель по результатам исследований сывороток тремя методами (табл. 22, рис. 18).

Штаммы NC145 и NC84 вызывали значительно более высокие приросты титров антигемагглютинирующих, нейтрализующих антител, а также специфических иммуноглобулинов класса G, оценивавшихся в ИФА. Титры в данных группах животных были статистически достоверно выше титров в группах, вакцинированных 25M/1 и 39Е/2 (рис. 18), при этом между группами NC145 и NC84 статистически значимых различий обнаружено не было.

Значения титров антител класса IgA также были более низкими у «клеточных» штаммов и более высокими у «яичных», но статистически значимых отличий обнаружено не было. Более высокие значения титров IgA наблюдались на сроке 2-4 недели, а к 8 неделям значения данного показателя снижались (рис. 18).

Рисунок 18. Среднегеометрические титры антител к вирусу А/New Caledonia/20/99 (H1N1) у морских свинок.

Морские свинки были иммунизированы штаммами 25M/1, 39Е/2, NC145 и NC84.

Данные представлены в виде среднегеометрический титр в log2+ ошибка среднего значения. Среднегеометрические значения титров антител в группах подписаны над столбцами. Значения титров антител до иммунизации, а также в группе плацебо – менее детектируемого уровня ( 1:10 для РТГА, РМН, ИФА в сыворотках, 1:2 в назальных смывах).



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |
 

Похожие работы:

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«ПОЕДИНОК НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА УДК 602.3:582.282/284:57.086.83]:[681.7.069.24+577.34 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СЪЕДОБНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ МАКРОМИЦЕТОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук Научный консультант Дудка Ирина...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.