WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 3 ] --

[197]. Поскольку клеточная линия MDCK содержит оба типа рецепторов, а механизм действия сыворотки не определен однозначно, нельзя исключать, что вариант с измененной аффинностью к рецепторам отличался по свойствам от варианта, который был бы получен путем пассирования в системе с рецепторами только с –2,3–связью. Вероятно, более детальное изучение антигенных свойств и понимание молекулярного механизма переключения специфичности у данных штаммов, а также определение кросс–нейтрализующей активности сывороток могло бы объяснить полученные результаты.

Исследования влияния отдельных аминокислотных остатков на связывание с рецептором и иммуногенность проводились также на вирусах гриппа сероподтипа H5.

Wang с соавт. [333] исследовали влияние замен и характера гликозилирования в молекуле гемагглютинина вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) на способность к связыванию с разными типами рецепторов и иммуногенность реассортантнпых холодоадаптированных штаммов при интраназальном заражении хорьков. Вакцина на основе штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) оказалась низкоиммуногенной и авторы искали пути повышения иммуногенности путем внесения в последовательность гемагглютинина одиночных замен, основываясь на последовательности близкородственного штамма A/Hong Kong/213/2003 (H5N1), вызывавшего развитие активного иммунного ответа у животных. Гемагглютинин штамма A/Vietnam/1203/2004 специфичен к «птичьему» варианту рецептора, штамм A/Hong Kong/213/2003 имеет двойную специфичность и способен связывать оба типа рецепторов.

Способность к связыванию с –2,6 рецептором штамм A/Vietnam/1203/2004 приобретал при внесении ряда одиночных замен, но ни одна из этих замен не приводила к увеличению иммунного ответа. Увеличения способности к репликации в верхних дыхательных путях хорьков и повышения иммуногенности удалось добиться только путем внесения замены в позиции 227 (S227N), а также удаления гликозилирования в позиции 158. При отборе вариантов с мутациями в ключевых позициях, определяющих рецепторную специфичность (Q226L, G228S), добиться повышения иммуногенности удавалось также только в случае потери гликозилирования в позиции 158. Вероятно, гликозилирование в позиции 158 играет важнейшую роль, маскируя антигенные эпитопы в головке гемагглютинина вируса A/Vietnam/1203/2004, обеспечивая снижение иммунного ответа.

Влияние гликозилирования на различные свойства вируса, в том числе эффективность вакцин, подробно рассмотрено в обзоре Schulze [288]. На момент написания указанного обзора данные литературы, касающиеся вопроса иммуногенности вирусов, выращенных в разных субстратах, были противоречивы. В одном из случаев, описанных в обзоре, иммунитет у модельных животных был одинаковым к обоим вариантам вирусов из различных субстратов. В оригинальном исследовании [173] указано, что вирусы отличались мутацией в гемагглютинине в позиции 156 (H3N2). В другой статье, на которую ссылается автор обзора, варианты вирусов H1 и H3 из куриных эмбрионов обладали меньшей иммуногенностью при иммунизации инактивированным вирусом, чем варианты, подготовленные в МDCК. Отмечена также важность выбора варианта вируса, используемого в качестве антигена при оценке иммуногенности различными методами: аффиность связывания вируса с рецептором влияет на оценку титра антител. В частности, при оценке нейтрализующей активности сывороток, полученных против человеческих H1 вирусов, использование вариантов, накопленных в MDCK, выявляет более высокие титры антител, чем использование вариантов из куриных эмбрионов с дополнительными сайтами гликозилирования в головке гемагглютинина.

Коллектив авторов компании MedImmune (США) исследовал влияние одиночных мутаций на иммуногенность холодоадаптированных штаммов для животных. Штаммы H3, содержавшие аминокислотные замены в отдельных позициях (V186G, L194P), были способны к активному размножению в куриных эмбрионах, но обладали низкой иммуногенностью. Замены в данных позициях позволяли достичь более высоких показателей иммуногенности, но значительно снижали репликацию вируса в куриных эмбрионах. Анализ большого количества штаммов показал, что введение в гемагглютинин дополнительных аминокислотных замен (195, 226), позволяло получить штаммы, обладавшие способностью как к эффективной репликации, так и к индукции иммунного ответа [97].

Позднее были опубликованы данные, полученные на вирусах других подтипов [98].

Авторы искали компромиссный вариант, позволяющий получить с использованием куриных эмбрионов наиболее иммуногенный вариант вакцины.

Изучалась роль пары мутаций в позициях 226 и 228 у H2 и H6 вирусов. Как и в других исследованиях, большей иммуногенностью для хорьков обладали варианты с –2,6 рецепторной специфичностью (Leu226 и Gly228), наименьшей – с –2,3 специфичностью (Gln226 и Gly228). Удалось получить вариант с двойной рецепторной специфичностью (Leu226 и Ser228), который, несмотря на большую аффинность к –2,6 рецептору, тем не менее достаточно эффективно взаимодействовал с рецептором птичьего типа и эффективно реплицировался в развивающихся куриных эмбрионах. Репликация в верхних дыхательных путях хорьков также была эффективной и этот вариант вируса обладал высокими показателями иммуногенности, являясь наиболее перспективным вариантом в качестве вакцинного компонента.

Интересные данные приводятся в исследовании [152]. Анализ пула одиночных мутантов вируса A/PR/8/34, полученных путем пассирования в популяциях вакцинированных данным штаммов и иммунологически наивных мышей показал, что при пассировании вируса в вакцинированных мышах вирус приобретает ряд мутаций в рецептор–связывающей области, обеспечивающих увеличение эффективности взаимодействия вируса с клеткой, и при этом снижающих взаимодействие с поликлональными антителами. В процессе ухода от иммунного ответа получали преимущество те субпопуляции вируса, мутации в антигенных сайтах которых повышали аффинность связывания с клеткой хозяина.

Анализ литературных данных приводит к заключению о том, что переключение рецепторной специфичности гемагглютинина определяется аминокислотными остатками, стоящими в определенных позициях, но не ограничивается только этими заменами [219, 221, 295]. Часты случаи, когда гемагглютинин способен к связыванию с рецепторами разных типов, при этом тонкая подстройка к какому–либо типу рецепторов происходит за счет дополнительных аминокислотных замен в области рецепторного кармана [98, 152]. Огромную роль играет характер гликозилирования молекулы гемагглютинина [125, 333].

Важно, что в работах, посвященных влиянию одиночных мутаций в рецептор– связывающей области на иммуногенность вирусов гриппа, есть подтверждение того, что варианты, отличающиеся по составу одиночных замен и по рецепторной специфичности, могут значительно отличаться по антигенным свойствам [97, 152, 156, 197].

1.5 Кодонная оптимизация как способ повышения иммуногенности Кроме стандартных способов оптимизации иммуногенности вакцины, таких, как подбор оптимальной вакцинирующей дозы, сочетание с иммуностимулирующими препаратами, использование адьювантов, постоянно разрабатываются и совершенствуются новые подходы к повышению иммуногенной активности вакцинных препаратов. Один из таких подходов – оптимизация кодонного состава генов, кодирующих антигенные детерминанты, успешно применяющийся в разработке ДНК–вакцин (данный раздел обзора литературы опубликован в виде обзорной статьи: [60]).

1.5.1 Теоретические основы оптимизации кодонного состава С момента, когда стал известен феномен вырожденности генетического кода, велись исследования частоты встречаемости разных кодонов в генах различных организмов. Доказано влияние кодонного состава на регуляцию генов, эффективность трансляции, вторичную структуру ДНК и РНК [315]. Показано предпочтение использования определенных кодонов разными организмами, и связь кодонного состава генов многоклеточных организмов с эволюционным возрастом этих генов. Также была замечена связь между уровнем экспрессии генов и их кодонным составом, наиболее сильно проявляющаяся у примитивных организмов, но существующая также и у высших многоклеточных [267].

Феномен предпочтения определенных кодонов при кодировании генетической информации различными организмами используется при разработке генетических конструкций для изменения их свойств. С созданием методик, позволяющих синтезировать крупные фрагменты ДНК, появилась возможность эффективной модификации генетического материала простейших живых систем, что получило широкое применение в таких специальных областях, как создание противовирусных вакцин.

Метод оптимизации/деоптимизации кодонного состава заключается в создании генетической конструкции на основе какого–либо гена, с измененным составом кодонов, при этом в аминокислотную последовательность кодируемого белка и, соответственно, его структуру, изменения не вносятся, но за счет изменений в РНК изменяется эффективность экспрессии гена. При оптимизации кодонного состава триплеты нуклеотидов, кодирующие определенную аминокислоту, заменяют на синонимичные, кодирующие эту же аминокислоту, но более часто использующиеся в генах с высоким уровнем экспрессии в данном виде клеток. За счет этого достигается повышение эффективности этапа трансляции. Это связывают с отсутствием конкуренции за тРНК клетки за счет использования более обильных в данной клетке молекул транспортных РНК [158], а также с изменением последовательности мРНК и, соответственно, ее вторичной структуры [81], и характеристик стабильности [320], что также может повлиять на скорость и эффективность процесса трансляции.

При простой замене кодонов по всей последовательности существует высокий риск появления в итоговой молекуле нежелательных регуляторных участков, сайтов рестрикции, повторов и других. С другой стороны, некоторые изменения могут стабилизировать структуру.

Таким образом, целью кодонной оптимизации является создание последовательности, в которой будет найдено оптимальное сочетание внесенных изменений, удовлетворяющее конкретным целям исследования.

Разработан ряд компьютерных программ, предназначенных для оптимизации последовательностей путем замены кодонов. Алгоритмы, по которым работали программы первого поколения, включали в себя только анализ кодонного состава введенной последовательности и последовательную подмену кодонов на более частые в системе, которую планировалось использовать для экспрессии [123]. Современные алгоритмы включают анализ итоговой последовательности ДНК и мРНК по ряду показателей. Так, в программе происходит последовательная оптимизации небольших участков GeneOptimizer [269] последовательности, при этом исследователь самостоятельно задает длину участка и параметры, по которым будет проводиться оценка эффективности оптимизации. Среди них рассматриваются индекс использования кодонов (в соответствии с базами данных частоты встречаемости кодонов в различных клетках [240]), анализ последовательности ДНК на наличие сайтов рестрикции, CpG островков, участков спаривания, гомологии с другими последовательностями, содержания GС, наличия прямых и инвертированных повторов.

Доступная для использования в Интернете программа JCat учитывает так называемый «кодонный контекст» - определенные сочетания кодонов, располагающиеся рядом [138].

Важность этого параметра связана с взаимодействием определенных тРНК в процессе элонгации [102]. Алгоритм Hot RodTM (CODA Genomics, Inc.), разработанный для оптимизации экспрессии белков в E.coli, включает оптимизацию кодонного состава, учет встречаемости пар кодонов и анализ вторичной структуры мРНК, что позволяет проводить компьютерный дизайн оптимизированных генов с высокой степенью эффективности [146].

В эволюции вирусов адаптация к хозяину включает и использование определенных кодонов и их пар в вирусном геноме, которое соответствует предпочтению кодонов организмом–хозяином [74]. Это дает возможность регулировать взаимодействие вируса с макроорганизмом за счет изменения кодонного состава генома вируса, основываясь на информации о кодонном составе генов хозяина. На настоящий момент это направление исследований динамично развивается, поскольку представляется крайне перспективным.

Ведутся работы с изучением кодонного состава и возможностей его изменения у полиовирусов [105, 232], гепатита А [112], парвовирусов [362], вирусов гриппа [215, 231, 316], ВИЧ [270, 353], респираторно–синцитиального вируса [179], герпесвирусов [122, 280], ротавирусов [134], папилломавирусов [178] и др.

1.5.2 Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин Одной из наиболее изученных на настоящий момент моделей, на примере которой исследуются возможности метода изменения кодонного состава в разработке противовирусных вакцин, является полиовирус [90, 193, 232]. Разные группы исследователей проводили эксперименты по аттенуации полиовирусов путем изменения соотношения кодонов в гене белка капсида полиовируса, заменяя более используемые кодоны на менее используемые [90, 232]. Burns с соавт.[90] заменяли кодоны для 9 аминокислот полиовируса штамма живой оральной вакцины Сэбина 2 типа на более редкие синонимичные кодоны. У полученного вируса способность к репликации в клетках HeLa была снижена, причем снижение было пропорционально количеству замененных кодонов [90]. Mueller с соавт. в 2006 году получили аналогичные результаты при работе с полиовирусом 1 типа Mahoney, а также показали, что этапом, обеспечивающим аттенуированный фенотип вируса, является этап трансляции.

Полученный штамм был протестирован ими на мышах и показано снижение нейровирулентности [232]. Позднее той же группой исследователей было предпринято исследование в направлении деоптимизации состава пар кодонов. Как было замечено, пары кодонов, кодирующие определенные пары последовательно расположенных аминокислот, также как и кодоны, имеют определенную частоту встречаемости в генах организма, и такие пары достаточно стабильны.

Coleman с соавт. в 2008 году разработали компьютерную программу, позволяющую моделировать генетическую конструкцию с измененным кодонным составом на основе заданной аминокислотной последовательности, и в первом приближении предсказывать последствия изменения кодонного состава [105]. Программа анализирует состав РНК и на его основе такие характеристики как взаимодействия между участками цепи, возможную вторичную укладку. Изменения кодонного состава выбираются таким образом, чтобы получившаяся после внесения изменений структура была наиболее энергетически выгодна и при этом было внесено максимальное количество изменений в заданном направлении. Авторы программы получали аттенуированные штаммы полиовируса путем разбиения оптимальных кодонных пар: один из компонентов пары заменяли таким образом, чтобы получилась более редкая, не оптимальная пара. Мутации вносились в ген белка капсида P1, всего в ген была внесена 631 мутация. Также исследовались последствия оптимизации пар кодонов, что потребовало внесения 566 мутаций. Вирус с деоптимизированным составом пар кодонов имел устойчивый аттенуированый фенотип для животных, сохранявшийся в ходе пассирования за счет большого количества мутаций. При этом аттенуированный таким путем вирус сохранил способность к формированию протективного иммунитета. Вирус с оптимизированным составом пар кодонов имел свойства на уровне вируса «дикого» типа, использованного в качестве контроля, и не обладал повышенной патогенностью или летальностью для мышей [105].

С использованием того же алгоритма был создан аттенуированный штамм гриппа на основе вируса A/PR/8/34 (H1N1) (PR8). Генетической модификации подверглись значительные участки последовательности генов HA, NP и PB1. Модифицированные вирусы получали с использованием стандартной 8–плазмидной системы, и анализировались как одногенные мутанты, так и вариант, содержащий все 3 модифицированных гена. Модифицированные вирусы проявляли такой же, как и вирус «дикого» типа, фенотип по отношению к температурным условиям, уровни репликации мутантов на клетках MDCK были незначительно, в среднем на порядок ниже, чем у «дикого» вируса. Анализ экспрессии генов методом вестерн– блот показал высокий уровень снижения экспрессии только тех генов, которые были модифицированы у соответствующих вариантов мутантных вирусов. При заражении мышей одногенные мутанты показали сниженную до 500 раз патогенность, вирус, содержащий все 3 модифицированных гена, имел показатели патогенности, сниженные по сравнению с вирусом «дикого» типа в 13000 раз. При этом доза, необходимая для формирования протективного иммунитета, у аттенуированного варианта была выше, чем у вируса «дикого» типа, всего в 10 раз [232].

1.5.3 Повышение иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава У млекопитающих использование кодонов в одних и тех же тканях практически идентично [231], поэтому для исследования иммуногенности кодон–оптимизированных препаратов, предназначенных для вакцинации человека, могут быть использованы стандартные модельные животные.

Кроме работ по аттенуации вирусов методом деоптимизации кодонного состава, проводились также работы по оценке возможности увеличения иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава. Большая часть исследований в данном направлении посвящена разработке ДНК–вакцин против различных инфекционных агентов (бактерии, вирусы, простейшие) [165, 364]. Предполагаемый механизм повышения иммуногенности связан с увеличением эффективности трансляции, а, следовательно, наработки антигена в клетках. Рядом исследователей показано, что наработка антигена после оптимизации кодонного состава последовательности происходит значительно эффективнее, чем при использовании нативной последовательности [96, 200]. Возможно также использование консенсусной последовательности разных вариантов антигена в качестве основы для оптимизации в целях формирования кросс–протекции. Так, в исследовании [96] при разработке ДНК–вакцины для профилактики гриппа, вызванного штаммами H5N1, была рассчитана консенсусная последовательность гена гемагглютинина на основе последовательности 467 разных штаммов H5, в том числе относящихся к разным подгруппам птичьего гриппа H5.

Однако, созданная генетическая конструкция в нативном виде не позволяла добиться эффективной экспрессии гемагглютинина. После оптимизации кодонного состава данной последовательности была получена новая генетическая конструкция, которая приводила к значительно более эффективной экспрессии гемагглютинина и вызывала формирование протективного иммунитета у лабораторных животных. В экспериментах на мышах исследователи обнаружили, что использование консенсусной последовательности в качестве исходной действительно позволяет добиться защиты от более широкого круга вирусов [96].

Аналогичное исследование проводилось в рамках разработки вакцины против вируса иммунодефицита человека. Вакцинный материал – ген белка env вируса – был оптимизирован в несколько этапов, включая выбор консенсусной последовательности, оптимизацию кодонного состава, оптимизацию структуры мРНК и добавление специфических последовательностей.

Иммуногенность этой потенциальной ДНК–вакцины оценивалась на трансгенных мышах разных линий, и было показано усиление клеточного иммунного ответа, что особенно важно в случае ВИЧ–инфекции [354]. Годом позже было опубликовано исследование, в котором тем же способом была получена потенциальная ДНК–вакцина против вируса чикунгунья (р. Alphavirus, сем. Togaviridae), содержащая несколько белков оболочки вируса и формирующая как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ [237]. На примере ВИЧ было проведено исследование также увеличения иммуногенности препаратов на основе белков Tat–1 и Tat–2, в норме вызывающих слабый иммунный ответ. Нативная последовательность белков tat по кодонному составу значительно отличается от оптимальной для млекопитающих. С помощью оптимизации кодонного состава препарата авторам удалось значительно увеличить эффективность экспрессии белков в клетках, а также удалось добиться повышенного уровня активации клеточного звена иммунитета при введении препаратов мышам, в том числе повышенную эффективность активации цитотоксических лимфоцитов. Также авторы отметили, что при применении препарата с оптимизированным кодонным составом иммунный ответ развивается преимущественно с активацией Тх1. Изменение кодонного состава позволило увеличить активацию более важного для предотвращения ВИЧ–инфекции клеточного звена иммунитета, однако не позволило добиться значительного увеличения показателей гуморального иммунного ответа [270].

Оптимизация нуклеотидной последовательности также положительно сказывается на развитии местного иммунного ответа. Проводилось исследование мукозальной ДНК–вакцины против респираторно–синцитиального вируса на основе аденовирусного вектора [179]. У лабораторных животных были зафиксированы высокие титры специфических иммуноглобулинов после интраназальной иммунизации ДНК–вакциной с IgA оптимизированным соотношением кодонов.

[331] в 2006 году было проведено исследование, посвященное оптимизации кодонного состава участков гемагглютинина вирусов гриппа сероподтипов H1N1 (A/New Caledonia/20/99) и H3N2 (A/Panama/2007/99), которые являлись компонентами гриппозной ДНК–вакцины. Было показано, что оптимизация кодонного состава гена гемагглютинина приводила к увеличению иммуногенности вакцины по сравнению с вакциной, подготовленной на основе оригинальной последовательности. Введение конструкции с оптимизированным кодонным составом приводило к более активной экспрессии антигена, а формирование протективного иммунитета у лабораторных животных (кролики, мыши) происходило уже после двух иммунизаций, против которые требовались в случае использования конструкции с нативной 3–4, последовательностью кодонов [331].

ДНК–вакцина, приготовленная на основе гемагглютинина свиного гриппа H1N1 2009 года (штамм A/Texas/05/2009), при использовании в конструкции нативной последовательности, обладала слабой иммуногенностью из–за крайне низкой экспрессии антигена. После оптимизации кодонного состава последовательности стимуляция CD8+ Т–лимфоцитов и титры антител значительно увеличились. Что интересно, уровень CD4+–ответа, оценивавшийся по уровню продукции цитокинов TNF, IFN, IL–2 в спленоцитах как при введении плазмид с нативной последовательностью, так и оптимизированных, оставался постоянным и при этом относительно высоким. Авторы связывают это с тем, что использованный ими путь введения – электропорация – стимулирует иммунный ответ по CD4+ пути даже при низком уровне экспрессии антигена в клетке [316].

О том, что оптимизация кодонного состава необходима для активации цитотоксических лимфоцитов у человека и приматов пишут также разработчики ДНК–вакцины против ВИЧ [353]. В том же источнике говорится о повышении уровня клеточного иммунного ответа при использовании метода электропорации для введения вакцины.

При разработке ДНК–вакцины для профилактики гриппа птиц также был использован подход оптимизации нуклеотидной последовательности гемагглютинина. Соотношение кодонов в созданной генетической конструкции было искусственно смещено в сторону кодонов, более часто встречающихся в организме птиц. В качестве исходного штамма Н5 был использован штамм высоко патогенного гриппа птиц A/goose/Guangdong/1/96. Иммуногенность вакцины оценивалась на цыплятах и по результатам экспериментов авторы сделали вывод о том, что оптимизация последовательности позволяет существенно повысить иммуногенность, при одновременном снижении дозы антигена, вводимого в организм [171].

Таким образом, в литературе описано множество вариантов модификаций кодонного состава патогенов в составе различных вакцин. Данные, полученные при работе с разными патогенами, свидетельствуют о перспективности данного подхода. Системы, сконструированныя в итоге изменения кодонного состава, отвечали требованиям исследователей (аттенуированный фенотип при деоптимизации, повышенная иммуногенность – при оптимизации кодонного состава) и отличались исключительной стабильностью за счет множественности внесенных изменений.

Тем не менее, на настоящий момент данный подход можно рассматривать только в качестве теоретической разработки, применение которой на практике требует проведения значительного количества исследований для подтверждения безопасности применения данного метода и стандартизации методик работы.

По данным экспериментов на модельных животных, негативных последствий, связанных с введением в организм материала, содержащего кодон-оптимизированные последовательности белков, не наблюдалось [96, 105, 270, 354].

Это свидетельствует в пользу безопасности метода оптимизации кодонного состава Уже на сегодняшний день созданы компьютерные программы, позволяющие произвести изменение кодонного состава с учетом как частоты встречаемости отдельных кодонов, так и характеристик полученной в итоге ДНК и мРНК [102, 146]. В процессе расчета модифицированной конструкции необходимо контролировать отдельные участки генов и даже отдельные пары кодонов, влияющие на процессы транскрипции и трансляции данного гена. В перспективе сведения о новых описанных регуляторных участках должны вноситься в программу или храниться в единой базе данных об элементах вторичной структуры и факторах, позволяющих контролировать транскрипцию и трансляцию.

1.6 Заключение к обзору литературы Интенсивность гуморального иммунного ответа по действующим стандартам является основным формальным показателем эффективности противогриппозных вакцин. В связи с этим, особое внимание привлекают исследования, посвященные изучению факторов, влияющих на формирование гуморального иммунного ответа. В случае живой гриппозной вакцины, вакцинный штамм наследует от эпидемического вируса только антигенные детерминанты – гемагглютинин и нейраминидазу, внутренние гены принадлежат холодоадаптированному донору аттенуации. Опубликовано значительное количество работ, посвященных антигенным свойствам гемагглютинина и нейраминидазы. Тем не менее, в условиях ограниченного времени на подготовку штамма живой гриппозной вакцины, необходимо выработать подходы, позволяющие оперативно оценить, как свойства эпидемического вируса-родителя будут влиять на иммуногенность полученного вакцинного штамма и как можно ее повысить. Анализ литературных данных не дает однозначного ответа на вопрос о влиянии ряда свойств вируса как на его иммуногенность, так и на иммуногенность полученных на его основе вакцинных штаммов. В связи с этим, представляется перспективным изучить в экспериментах на животной модели показатели иммунного ответа после заражения модельными парами вирусов, отличающимися каким-либо свойством, влияние которого на иммуногенность можно предполагать после анализа литературных данных. В качестве таких пар можно использовать температуроустойчивые и температурочувствительные, ингибитороустойчивые и ингибиторочувствительные, а также варианты, отличающиеся между собой по наличию мутаций.

Оптимизация кодонного состава гемагглютинина представляется одним из перспективных путей повышения иммуногенности вакцинного препарата, но, поскольку все опубликованные на настоящий момент исследования касаются иммуногенности ДНК-вакцин, открытым остается вопрос о том, как оптимизация кодонного состава гемагглютинина повлияет на свойства живого вируса гриппа, его способность к взаимодействию с живыми системами и иммуногенность in vivo.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Вирусологические методы Вирусы. В работе были использованы эпидемические штаммы гриппа типа подтипов А и В, вакцинные штаммы, полученные путем классической реассортации и методом обратной генетики. Также использовались штаммы с искусственно синтезированным кодоноптимизированным гемагглютинином (табл. 1).

–  –  –

СDC – Центр по контролю за заболеваемостью, Атланта, Джорджия, США 1 ИЭМ – ФГБНУ «ИЭМ», музей вирусов отдела вирусологии им А.А.Смородинцева 2 Реассортантные штаммы для инактивированных вакцин подготовлены на основе эпидемических 3 вирусов в качестве доноров антигенных детерминант и донора высокой урожайности A/Puerto Rico/8/34 в качестве источника внутренних генов.

У штаммов для инактивированной гриппозной вакцины на основе вирусов H5N1 модифицирован 4 высокоосновный cleavage-сайт гемагглютинина, что делает вирусы апатогенными, при полном сохранении антигенного профиля данных вирусов [115, 337].

Холодоадаптированные реассортантные штаммы ЖГВ подготовлены с использованием в качестве 5 источника внутренних генов донора аттенуации (для вирусов А - А/Ленинград/134/17/57, Для вирусов В

- В/СССР/60/69), а в качестве источников поверхностных антигенов – актуальных циркулирующих вирусов гриппа в соответствии с рекомендациями ВОЗ. ХА доноры аттенуации отечественной живой гриппозной вакцины, а также реассортантные вакцинные штаммы, полученные на их основе, являются собственностью ФГБНУ «ИЭМ» (Санкт–Петербург).

Штамм с формулой генома 7:1, подготовлен и любезно предоставлен сотрудницей отд. вирусологии 6

Баженовой Е.А.

Накопление вирусов проводили на 10–11–дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (ООО "Племрепродуктор Назия" Ленинградская область, пос. Приладожский) либо в культуре клеток MDCK.

Зараженные куриные эмбрионы инкубировали в термостате при оптимальной (32С) температуре в течение 48 часов для вирусов гриппа А и 72 часов для вирусов гриппа В. Затем, предварительно охладив эмбрионы в течение 20 минут при –20С или в течение 24 часов при +4С, вируссодержащую аллантоисную жидкость собирали.

Накопление вируса в клеточной культуре MDCK проводили по общепринятой методике.

Вируссодержащую жидкость наносили на предварительно подготовленный суточный монослой клеток. Для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду DMEM с Lглутамином (Биолот, Санкт-Петербург), содержащую 1 мкг/мл трипсина TPCK. Клетки инкубировали в атмосфере 5% СО2 в СО2-инкубаторах в течение 72 часов в при температуре 37°С (для «диких» вирусов и реассортантов для ИГВ) или 33°С (для холодоадаптированных штаммов вируса гриппа). После окончания времени инкубации оценивали состояние клеточного монослоя (визуально), наличие вируса в лунках определяли в РГА с эритроцитами кур (0,5%) и/или человека группы 0 (I), Rh+ (1,0%) и/или морской свинки (1,0%).

Культуральную жидкость, содержащую вирусные частицы, осветляли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут и хранили при -70С.

Клонирование методом бляшек осуществляли в 6-луночных полистироловых планшетах («SARSTEDT», Германия), при этом после процедуры заражения клеточный монослой покрывался 0,8%-ным раствором агарозы. После застывания агарозы планшеты помещались в СО2-инкубатор и инкубировались трое суток при температуре 33°С. Накопление вирусов из бляшек проводили под жидкой средой в 12-луночных полистироловых планшетах.

Оценку инфекционной активности вирусов проводили по методу Рида и Менча [275].

Для определения инфекционного титра вируса гриппа использовали развивающиеся 10–11– дневные куриные эмбрионы (РКЭ) или культуру клеток MDCK. Десятикратные разведения вируса готовили в буферно–солевом растворе pH от 7,0 до 7,4.

При оценке инфекционной активности в РКЭ вводили в аллантоисную полость каждого эмбриона по 0,2 мл вируссодержащей жидкости. Каждым разведением вируса заражали по 5–6 РКЭ. Зараженные эмбрионы инкубировали при температуре, определенной задачами исследования, затем определяли наличие вируса в аллантоисной жидкости в стандартной реакции гемагглютинации (РГА) с 1%–ными куриными эритроцитами [32]. При температуре 32°С и выше зараженные эмбрионы инкубировали в течение 48 часов, при температуре 25°С в течение 7 суток. Титр вируса выражали в lg ЭИД50/мл.

Титрование вируса в культуре клеток MDCK проводилось в 96-луночных полистироловых планшетах («SARSTEDT», Германия). Разведения вируса вносили на предварительно подготовленный монослой клеток, по 6-7 лунок на 1 разведение, в 1 лунку помещали по 25 мкл.

вируссодержащей жидкости с добавлением TPCK-трипсина (Sigma). Планшет инкубировали 30 мин. при 37 °С в СО2-инкубаторе, затем отбирали остатки вируссодержащей жидкости и добавляли по 150 мкл питательной среды DMEM с L-глутамином (Биолот, Санкт-Петербург) в каждую лунку. В каждом планшете 1 ряд лунок оставляли для контроля за состоянием клеточной культуры. Планшеты инкубировали в течение 72 часов в СО2-инкубаторе при температуре 37°С или 33°С. Титр вируса оценивали путем постановки реакции гемагглютинации аликвоты культуральной жидкости с 1% куриными эритроцитами в круглодонном планшете. Титр вируса выражали в lg TCID50/мл.

Для постановки реакции микронейтрализации титр вируса в клетках MDCK оценивали через 48 часов инкубации при 37°С методом иммуноферментного анализа по рекомендованной методике [56]. Культуральную жидкость из лунок удаляли, клетки фиксировали 80% холодным ацетоном, блокировку свободных мест на планшете производили раствором 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере в течение часа при 37°С. Для постановки ИФА использовали пероксидазный коньюгат моноклональных антител в NP вируса гриппа А производства ГУ НИИ Гриппа РАМН. В качестве субстрата использовался 3,3’,5,5’тетраметилбензидин (Sigma, США, кат. № Т2885). Учет реакции проводился спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Расчет титра вируса производился по формулам, приведенным в руководстве по постановке реакции микронейтрализации [56].

Фенотип вируса по отношению к температуре инкубации определялся по результатам титрования в РКЭ одновременно на нескольких температурах.

Для определения фенотипа вируса рассчитывали разницу между титром вируса в РКЭ при оптимальной (32°С) и не оптимальной температурах.

По степени температурочувствительности вирусы делили на:

(1) температуроустойчивые: разница между титрами при температурах 32°С, 38°С, 40°С температурах – не более 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл (2) чувствительные к температуре: разница в репродукции при температуре 32 С и 40 С – не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл (3) высоко чувствительные к температуре: разница в репродукции при температуре 32 С и 38 С – не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл.

Холодоустойчивыми считались вирусы, разница между титрами при температурах 32°С и 25°С составляла не более 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл [22].

Фенотип вируса по отношению к неспецифическим сывороточным ингибиторам определялся по результатам реакции торможения агглютинации с сывороткой неиммунных животных (лошадей и морских свинок). Вирус считали устойчивым к ингибиторам, если титр в РТГА не превышал 1:40. При более высоком титре вирус считали ингибиторочувствительным [27].

Подготовка реассортантных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины проводилась по стандартной методике [1, 336], а также с применением ряда модификаций, подробно описанных в главе «Результаты». Вирусы, использовавшиеся в качестве источника антигенных детерминант, скрещивали в РКЭ с холодоадаптированным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57. Для отбора вариантов с нужными характеристиками применяли селективные пассажи при пониженной до 26°С температуре в присутствии кроличьей или крысиной антисыворотки к донору аттенуации, как дополнительного селектирующего фактора, после чего производили четыре последовательных клонирования методом предельных разведений.

Получение холодоадаптированных реассортантов в культуре клеток MDCK проводили по методике, описанной в [15]. Вирусы, использовавшиеся в качестве источника антигенных детерминант, вносили на предварительно подготовленный суточный монослой клеток MDCK в смеси с холодоадаптированным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57. Для отбора вариантов с нужными характеристиками вирусный материал, полученный после скрещивания, выдерживали в течение 2 часов в присутствии антисыворотки к донору аттенуации и применяли клонирование методом бляшек при температуре 33С.

2.2 Методы работы с лабораторными животными Животные. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» [48] и была одобрена Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ». В работе использовались морские свинки (самки–альбиносы) весом 300–350 г. полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Ленобласть, Всеволожский район, Рапполово). Животные содержались в стандартных крысиных клетках при температуре 22С и относительной влажности 25%, имели свободный доступ к пище и воде. Регистрацию температуры и влажности в помещении вивария осуществляли с помощью беспроводной погодной станции Oregon Scientific, модель BAR388HG (Китай). Всего в работе было использовано 150 морских свинок.

Схема оценки показателей гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo.

Для исследования иммуногенности разных штаммов вируса гриппа животных заражали интраназально вируссодержащим материалом автоматической микропипеткой по 100 мкл в каждый носовой ход без анестезии (не меньше 3–х особей на группу). Животные получали вирус в дозе 5 lg ЭИД50 на одну особь. Группа «плацебо» получала в том же объеме стерильный физиологический раствор. На 14, 28 и 56 сутки от начала эксперимента у морских свинок (как зараженных, так и получивших плацебо) собирали носовые смывы (в 1,0 мл стерильного физиологического раствора) и по 1 мл крови для получения сыворотки. Материалы хранили при -20°С до окончания эксперимента и использовали для оценки иммуногенности различными методами.

2.3 Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа Обработка сывороток. Перед постановкой реакций гемагглютинации, микронейтрализации для удаления неспецифических ингибиторов вируса гриппа сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor–destroying enzyme производства Denka–Seiken, Tokyo, Japan) согласно протоколу производителя.

Неиммунные сыворотки морских свинок и лошадей, использовавшиеся для оценки ингибиторочувствительности вирусов гриппа, не подвергали обработке. В отдельно указанных случаях прогревали при температуре 56°С в течение 30 минут, либо в течение 80°С в течение 10 минут. Перед прогреванием сыворотки разводили в 10 раз стерильным физиологическим раствором.

Сыворотку морских свинок собирали у не иммунизированных животных-доноров.

Лошадиную сыворотку использовали производства ООО «Биолот» (Санкт-Петербург).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) использовалась для оценки уровня гуморального иммунного ответа в сыворотках крови, а также при определении чувствительности вирусов к неспецифическим ингибиторам гемагглютинации, содержащимся в сыворотках морских свинок. Реакцию РТГА проводили в соответствии с методическими указаниями по определению показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа [32]. Для детекции результатов реакции использовалась 1% взвесь эритроцитов курицы, человека (0 (I) Rh+ группы) или морской свинки (в зависимости от задач конкретного опыта).

Реакция микронейтрализации использовалась для оценки уровней гуморального иммунного ответа в сыворотках крови морских свинок. Постановка реакции проводилась по протоколу, разработанному в ГУ НИИ Гриппа РАМН [56]. По описанной в протоколе схеме готовили рабочий раствор вируса гриппа, необходимый для проведения реакции. Перед постановкой реакции сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor–destroying enzyme производства Denka-Seiken, Tokyo, Japan) и добавляли питательной среды DMEM с Lглутамином, доводя разведение до 1:10. В круглодонных планшетах готовили последовательные двукратные разведения сыворотки (от 1/20 до 1/1280). Рабочее разведение вируса (концентрация вирусных частиц 100 TCID50/50 мкл) на среде DMEM с L-глутамином с содержанием TPCK-трипсина в концентрации 2 мкг/мл добавляли в равном объеме к сыворотке и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Далее вносили данную смесь в подготовленные планшеты с монослоем клеток MDCK с добавлением 50 мкл питательной среды DMEM с Lглутамином и инкубировали в течение 48 часов при 37°С в CO2-инкубаторе. В каждом планшете ставились контрольные пробы: контроль подбора дозы вируса, контроль состояния клеточной культуры, контроль сывороток. По окончании времени инкубации среду полностью удаляли, клетки фиксировали 80% холодным ацетоном и проводили ИФА. Для блокировки использовался раствор 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере. Постановка ИФА проводилась с применением пероксидазного коньюгата моноклональных антител к NPбелку вируса гриппа А производства ФГБУ НИИ гриппа МЗРФ. В качестве субстрата использовался 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (Sigma, США). Учет реакции проводился спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Расчет титра вируса производился по формулам, приведенным в руководстве по постановке реакции микронейтрализации [56].

Иммуноферментный анализ с использованием антител к IgG и IgA морских свинок использовался для определения содержания вирусспецифических антител указанных классов в сыворотках и назальных смывах животных. Очистка вирусов, использовавшихся в качестве антигенов, производилась центрифугированием в градиенте сахарозы. Вирусы наносили на планшеты в концентрации 16 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) в 50 мкл карбонатбикарбонатного буфера в лунке (для детекции антител в сыворотках крови) или 32 ГАЕ в 100 мкл буфера в лунке для определения антител в назальных смывах.

Для блокировки использовался раствор 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере. Для детекции антител класса IgG использовали антитела козы к IgG морских свинок, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). Для определения антител класса IgA использовались овечьи антитела к IgA морских свинок, коньюгированные с пероксидазой хрена (Immunology Consultants Laboratory Inc., США). В качестве субстрата использовался 3,3’,5,5’тетраметилбензидин (Sigma, США).

2.4 Молекулярно–биологические методы Выделение РНК производили из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, вируссодержащей культуральной жидкости, суспензий клеток. Выделение осуществляли с помощью набора «РИБО–сорб» (АмплиСенс, Россия) или QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с инструкциями производителей наборов.

Получение кДНК осуществляли с помощью набора "Реверта–L" (Амплисенс, Россия) или QuantiTest Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с инструкциями производителей наборов. На данном этапе использовали универсальные праймеры, позволяющие в одной реакции синтезировать кДНК для разных фрагментов генома вирусов гриппа. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью метода микс–ПЦР [18]. Авторами метода разработаны пары праймеров, позволяющие в одной реакции определить происхождение гена от одного из родительских вирусов – эпидемического родителя или донора аттенуации. Праймеры, использованные при генотипировании реассортантных вирусов, представлены в табл. 1-3 приложения). Амплификацию проводили в ДНК–амплификаторе Eppendorf MasterCycler® gradient с использованием программ, представленных в таблице 2.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле с добавлением этидиум бромида в концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты полимеразной цепной реакции визуализировали на трансиллюминаторе ЕСХ (Vilber Lourmat) при длине волны УФ 330 нм.

Использовались реагенты производства «СибЭнзим» (Россия, Новосибирск).

Секвенирование последовательности сегментов генома осуществляли при использовании автоматического капиллярного секвенатора 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. Последующая обработка данных производилась с использованием пакета программ Lasergene 7.1 (DNAstar).

Для проведения реакции секвенирования на основе выделенной РНК получали кДНК и амплифицировали отдельные фрагменты генома с использованием OneStep RT-PCR Kit (Qiagen GmbH, Германия) или SuperScript III One-Step RT-PCR System (Invitrogen, США) с добавлением специфических праймеров, позволяющих амплифицировать нужные фрагменты генома (табл.

4-5 приложения). Программы для амплификации представлены в таблице 3. Результаты реакции амплификации разделяли путем электрофореза в 0,9% агарозном геле и визуализировали на трансиллюминаторе ЕСХ (Vilber Lourmat) при длине волны УФ 330 нм.

Полученные фрагменты выделяли из геля и очищали с использованием набора реагентов для очистки ДНК KR-011 («Омникс», Санкт-Петербург, Россия). На основе амплифицированных последовательностей получали пул меченых фрагментов с использованием набора реактивов BigDye® Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя. Программа амплификации, рекомендованная производителем набора, представлена в таблице 3, последовательность специфических праймеров представлена в таблице 6 приложения. Очистка от не включившихся в последовательность меченых нуклеотидов проводилась с использованием сорбента Sephadex G-100 (Sigma, США).

Предварительно подготовленный раствор сорбента помещали в колонки, центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин, дважды промывали дистиллированной водой (200 мкл) с последующим центрифугированием при тех же условиях. Для очистки результатов реакции амплификации раствор пропускали через колонку, содержащую сорбент, с предварительной инкубацией в течение 5 минут и последующим центрифугированием 3 мин при 3000 об/мин. Очищенные пробы (15 мкл) помещали в планшеты для секвенирования, добавляли раствор формамида для предотвращения ренатурации ДНК, проводили денатурацию при 95°С в течение 5 мин и помещали в капиллярый анализатор 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Таблица 2. Программы амплификации ДНК, использованные при проведении анализа генома реассортантов вирусов гриппа методом микс-ПЦР

–  –  –

Анализ уровней экспрессии гемагглютинина. Оценивались уровни экспрессии гемагглютинина в клетках после заражения штаммами с кодон-оптимизированным либо нативным гемагглютинином. Использовался метод ОТ-ПЦР в реальном времени и иммуноблоттинг.

ОТ-ПЦР в реальном времени. Вирусы вносили в культуру клеток MDCK (3 х 105 клеток/лунку) при множественности заражения 0.01. Через 24 и 48 часов после заражения инфицированные клетки лизировали в TRIZOL (Invitrogen, США). Уровни РНК М-гена определяли в реакции ПЦР в реальном времени с использованием набора реактивов SuperScriptTM III Platnum® One-step Quantitative kit (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. Для постановки реакции использовали праймеры, последовательности которых приведены в таблице, а также зонд, меченый на 5’-конце 6карбоксифлуоресцеином (табл. 4).Программа амплификации представлена в таблице 5.

Количество копий М-гена рассчитывали с использованием стандартной кривой.

Таблица 4. Праймеры, использованные в реакции ПЦР в реальном времени для детекции уровней экспрессии М-гена

–  –  –

Таблица 5. Программа амплификации ДНК, использованная при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием SuperScriptTM III Platnum® One-step Quantitative kit (Invitrogen, США)

–  –  –

Уровни смысловой и антисмысловой цепей РНК гемагглютинина из лизированных образцов зараженных культур клеток определяли с использованием методики ПЦР в реальном времени с использованием SuperScriptTM III First strand synthesis (Invitrogen, США) и ThermoOneTM Real-time Premix (SYBR Green) (RBCBioscience)(табл. 6,7).

Таблица 6. Программа амплификации ДНК, использованная при проведении детекции уровней смысловой и антисмысловой цепей РНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием SuperScriptTM III First strand synthesis (Invitrogen, США)

–  –  –

Анализ кривой плавления проводился в диапазоне от 70 oC до 99 oC. Количество копий гена гемагглютинина рассчитывалось с использованием стандартной кривой плазмидной ДНК (pHw2000-HA). Исследования производились с использованием амплификатора LightCycler® 480 (Roche).

Таблица 7. Праймеры, использованные в реакции ПЦР в реальном времени для детекции уровней смысловой и антисмысловой цепей РНК кодон-оптимизированных и нативных вариантов гемагглютинина H1 и H5

–  –  –

Иммуноблоттинг.

Сравнивали уровни экспрессии гемагглютинина в клетках MDCK, Vero после заражения вирусом с кодон-оптимизированным или нативным гемагглютинином. Вирус вносили в дозе 2400 TCID50. Через 12, 18, 24 или 48 часов инкубации клетки лизировали в буфере RIPA. 300 мкг общего белка помещали 13% полиакриламидный гель и проводили электрофорез 150 В в течение 1,5 ч. Далее гель помещали на нитроцеллюлозную мембрану. Для детекции уровня белка HA вируса гриппа на мембрану наносили специфические антитела (овечьи анти-H1, либо овечьи анти-H5 в разведении 1:100 (NIBSC)). На втором этапе на мембрану наносили антитела козы против овечьих, коньюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 (Invitrogen). В качестве субстрата использовали диаминобензидин.

2.5. Методы компьютерного моделирования Моделирование пространственной структуры молекул белков с одиночными мутациями проводилось по алгоритму моделирования по гомологии с использованием сервиса SWISS-MODEL [69, 177, 257] и компьютерной программы Swiss-PdbViewer 4.1.0. В качестве основы использовались структуры вирусов из базы данных Protein Data Bank (www.rcsb.org) с минимальными отличиями в аминокислотной последовательности.

Для сборки олигомеров из мономеров, смоделированных по гомологии, использовался алгоритм сборки симметричных олигомеров, доступный онлайн на сервере ZDOCK [260].



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 8 |
 

Похожие работы:

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.