WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 2 ] --

Местный гуморальный иммунный ответ является важнейшим фактором защиты от гриппозной инфекции. Развитие местного иммунного ответа происходит в мукозоассоциированной лимфоидной ткани (лимфоглоточное кольцо Пирогова-Вальдейера) [36]. При первичной инфекции в назальных смывах детектируются антитела к гемагглютинину вируса гриппа, относящиеся ко всем трем основным классам (IgG, IgA и IgM), при этом IgA и IgM – значительно чаще, чем IgG [38]. IgA и IgM синтезируются локально, IgG поступают из сыворотки [223]. Местный IgA-ответ после гриппозной инфекции обычно остается на протяжении 3-5 месяцев, обнаруживаются клетки иммунологической памяти [349]. Особенную роль местный иммунный ответ играет в случае вакцинации лиц пожилого возраста: если системный гуморальный иммунный ответ к вируса гриппа с возрастом становится менее интенсивным, то количественные показатели местного иммунного ответа не отличаются у разных возрастных групп [3, 34].

После вторичной инфекции в секретах слизистых IgA является основным изотипом детектируемых специфических антител, также IgA обнаруживаются в сыворотках. Присутствие местно синтезируемых нейтрализующих антител после вакцинации живой гриппозной вакциной коррелирует с защитой от инфекции и заболеваемостью при контакте с «диким»

вирусом, такая же закономерность прослеживается для титров как секретируемых, так и сывороточных антител к гемагглютинину и нейраминидазе [35, 51, 71].

Сывороточные антитела к гемагглютинину являются наиболее часто определяемым показателем защищенности от гриппозной инфекции, входящим в различные фармакологические стандарты [109]. В-клетки, продуцирующие антитела трех основных классов, выявляются в периферической крови в процессе инфекции и после нее [93, 110, 355]. У человека антитела играют роль как в подавлении инфекции, так и в защите от реинфицирования. Уровень сывороточных антител к гемагглютинину и нейраминидазе коррелирует с устойчивостью к инфекции в условиях эксперимента, а также по данным эпидемиологических исследований [108, 235]. При первичной инфекции, иммуноглобулины трех основных классов детектируются через 10-14 дней. Максимальные титры IgA и IgM наблюдаются через 2 недели после инфицирования, после чего начинают снижаться, IgG достигают максимальных концентраций через 4-6 недель. При первичном иммунном ответе преобладают IgG и IgM антитела, при вторичном – IgG и IgA [37, 85, 236].

В отличии от Т-клеток, распознающих линейные эпитопы, презентированные через молекулы MHC, В-клетки способны распознавать антиген в нативной конформации [300].

Специфические антитела могут нейтрализовать инфекцию несколькими путями. Антитела, взаимодействующие с глобулярной частью гемагглютинина, могут напрямую блокировать процесс прикрепления вируса к клеткам, предотвращая попадание остатка сиаловой кислоты в рецепторный карман гемагглютинина вируса [297]. Однако, области, окружающие рецепторный карман вируса гриппа, обладают высокой вариабельностью, поэтому нейтрализующая активность данных антител направлена только против конкретного штамма вируса гриппа и антигенно-родственных вариантов [300]. Антитела, связывающиеся с другими областями гемагглютинина и не влияющие напрямую на взаимодействие гемагглютинина с рецептором, могут изменять способность гемагглютинина к изменению конформации, необходимой для осуществления слияния мембраны эндосомы с оболочкой вируса [163, 250]. Секреторные антитела класса IgA, выделяющиеся на слизистой респираторного тракта, обладают более широкой кросс-протективной активностью, чем сывороточные иммуноглобулины G, защищая от более широкого спектра штаммов [162, 314]. Предполагается, что большая кросспротективность антител класса А по сравнению с иммуноглобулинами класса G объясняется их димерной структурой, что повышает их авидность по сравнению с мономерными IgG [314] После синтеза в антитела-секретирующей клетке, димерный комплекс IgA присоединяется к полимерному иммуноглобулиновому рецептору на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток и проходит трансцитозом через апикальную поверхность, где IgA отщепляется от рецептора и предотвращает инфекцию путем блокирования прикрепления к эпителиальным клеткам. Более того, димерный IgA могут связывать внутри клетки синтезированные вирусные белки, предотвращая сборку вириона [223].

Опсонизация антител на поверхности вирусной частицы обеспечивает фагоцитирование вируса через FcR-опосредованный фагоцитоз, такой же механизм может обеспечивать фагоцитоз зараженных клеток [160].

При присоединении антител к вирусным антигенам на клеточной поверхности, запускается механизм элиминации зараженных вирусом клеток с помощью антитело-зависимой клеточной цитотоксичности [170]. Также, Fc-фрагменты антител, присоединенных к поверхности пораженной клетки, могут активировать запуск каскада комплемента [330]. Взаимодействие опсонинов, являющихся компонентами системы комплемента, с рецепторами макрофагов, обеспечивает фагоцитоз вирусных частиц или зараженных клеток [121]. Перечисленные механизмы не предотвращают гриппозную инфекцию, но обеспечивают ее протекание в более мягкой форме и ускорение элиминации вируса из организма. В реализации данных путей участвуют антитела к ножке гемагглютинина (НА2), М2 белку и некоторым другим консервативным антигенам гриппа [132-133, 266, 301].

Особенностями гуморального иммунного ответа на живую гриппозную вакцину является эффективная стимуляция иммунитета во входных воротах инфекции, не уступающая естественной гриппозной инфекции. При этом сывороточные IgG антитела синтезируются в меньшем титре, чем при естественной инфекции [9]. Изучение гуморального иммунного ответа на ЖГВ производится как в процессе клинических и эпидемиологических исследований [11, 281, 283], так и с использованием экспериментальной модели (мыши) [47, 49]. Разработанные в отделе вирусологии им А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» методики, в числе которых иммуноферментная тест-система [38], позволяющая с высокой степенью специфичности оценивать местный иммунный ответ к вирусу гриппа у человека, методики определения авидности антител [7], позволяют проводить масштабные исследования противогриппозного иммунитета и выявлять корреляцию между функциональной активностью антител и степенью защиты организма [10, 33-34]. Описаны особенности формирования поствакцинального гуморального иммунного ответа у детей и лиц старше 65 лет [3, 5, 8]. На экспериментальной модели описаны механизмы формирования местного [36] и системного иммунного ответа на введение штаммов живой гриппозной вакцины [45-46, 188]. Ряд исследований посвящен формированию иммунологической памяти, как у экспериментальных животных, так и у людей [40, 42].

1.3.2 Клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа и ЖГВ Клеточное звено иммунного ответа играет значительную роль в процессе выздоровления от гриппозной инфекции и предотвращении осложнений [300]. В инициации развития иммунного ответа важнейшую роль играют антиген-презентирующие клетки:

дендритные клетки и макрофаги. Вирусный материал экзогенного происхождения (частицы живого вируса, либо инактивированные вирионы или вакцинный материал, содержащий отдельные фрагменты вирусной частицы), захватываются антиген-презентирующими клетками путем фагоцитоза или эндоцитоза. В результате дальнейшего процессинга антигена в клетке формируется пул пептидных фрагментов, которые презентируются через молекулы MHC I или MHC II CD8+ или CD4+ Тх0-клеткам, соответственно. Тх0 клетки подразделяются на Тх1 и Тх2, в зависимости от спектра продуцируемых цитокинов. После инфицирования вирусом гриппа, антиген-презентирующие клетки секретируют ИЛ-12, приводящий к дифференциации Тх0 в Тх1, секретирующие IFN- и участвующие в процессе стимуляции синтеза IgG2a антител.

Тх1 также секретируют ИЛ-2, необходимый для пролиферации вирус-специфических цитотоксических CD8+ лимфоцитов. В том же случае, если на ранних стадиях иммунного ответа присутствует ИЛ-10, Тх0 дифференцируются в Тх2, секретирующие ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, которые стимулируют выработку антител классов IgG1, IgA и IgE плазматическими клетками.

Т-клетки после распознавания коротких пептидов вирусного происхождения, CD8+ презентируемых через MHC I зараженными вирусом эпителиальными клетками, продуцируют антивирусные цитокины (IFN-) и разрушают зараженные вирусом клетки, экзоцитируя гранулы с перфоринами и гранзимами. Перфорины создают поры в мембране инфицированных клеток. Гранзимы относятся к семейству сериновых протеаз. С помощью перфорина гранзимы проникают в цитоплазму инфицированной клетки и инициируют протеолизис, запуская таким образом разрушение клетки. Возможен также перфорин-независимый путь разрушения клеток цитотоксическими лимфоцитами: он включает присоединение к Fas-рецептору на мембране инфицированной клетки лигандом, продуцируемым активированным цитотоксическим лимфоцитом. Взаимодействие лиганда с рецептором приводит к активации каспаз, запускающих процесс апоптоза инфицированной клетки [300].

Исследования клеточного звена иммунного ответа на холодоадаптированные штаммы ЖГВ выявили, что, как и в случае гуморального иммунного ответа, локальный ответ после вакцинации не уступает показателям, достигаемым после естественной перенесенной инфекции [33, 258]. Это является значительным преимуществом ЖГВ перед ИГВ, вводимой парентерально: после вакцинации ИГВ показатели локального иммунного ответа, в том числе клеточного, значительно ниже. Эффективная стимуляция клеточного пролиферативного иммунного ответа отмечена в том числе после вакцинации пожилых людей [3, 33].

1.3.3 Методы оценки гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию Наиболее общепринятым показателем иммунного ответа на вирус гриппа у людей является титр антигемагглютинирующих антител в сыворотке крови, определяемый в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) [344]. Тем не менее, антитела к нейраминидазе и к другим белкам вируса гриппа также играют роль в защите от инфекции. Показатели специфического иммунитета, оцениваемые в клинических испытаниях (фазы I–III), определяются видом вакцины (инактивированная, живая), но в любом случае в первую очередь определяются показатели антигемагглютинирующей и нейтрализующей активности сывороток.

Оценка дополнительных параметров иммунного ответа (неспецифический иммунитет, местный и клеточный ответ) используется в исследовательских целях, а также может быть информативна в случае живых вакцин с интраназальным путем введения для обоснования их защитной функции [344].

1.3.3.1 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) РТГА является основным методом, использующимся для массовой оценки противогриппозного иммунитета [344]. РТГА основана на способности вируса гриппа агглютинировать эритроциты и подавлению данной способности при связывании с гемагглютинином вируса гриппа специфических антител. Эффективность гемагглютинации зависит от рецепторной специфичности вируса гриппа и состава сиалосодержащих гликопротеинов на поверхности мембраны эритроцитов использованного вида животных [130].

Вирусы гриппа, имеющие -2,3 рецепторную специфичность, агглютинируют эритроциты как птиц, так и млекопитающих [168]. Вирусы гриппа человека, распознающие рецепторы, вообще не агглютинируют эритроциты лошадей, быков и овец, имеющие на поверхности преимущественно -2,3-связанные сиаловые остатки [168, 225]. Эритроциты курицы, человека, морских свинок содержат оба типа оба типа сиаловых рецепторов, при этом на поверхности эритроцитов морских свинок и человека -2,3 рецепторов меньше, чем на куриных эритроцитах, и преобладают сиалогликоконьюгаты с -2,6 связью [225].

В 1990х годах был выделен ряд вирусов гриппа человека подтипов H1N1 и H3N2, не агглютинирующих куриные эритроциты в связи с появлением ряда аминокислотных замен вблизи рецептор-связывающей области молекулы гемагглютинина [225, 244].

Особенную чувствительность к типу эритроцитов штаммы вирусов проявляют в реакции торможения гемагглютинации в присутствии сыворотки. Правильный подбор эритроцитов и предварительная обработка сыворотки улучшают детекцию методом РТГА [255]. Так, при детекции антител к птичьим вирусам в человеческой сыворотке использование эритроцитов с низким содержанием -2,3-связанных сиаловых остатков не позволяет увидеть титры специфических антител, несмотря на их наличие [302]. В эксперименте, с детекцией титра антител к вирусам гриппа птиц (имеющих -2,3-специфичность к рецептору) методом РТГА с использованием эритроцитов курицы (с содержанием как -2,3, так и -2,6 связей) и лошади (содержащих только -2,3 связи) титры антител с лошадиными эритроцитами значительно превышали титры в куриными эритроцитами (до тысячи раз).

При использовании эритроцитов человека на результаты реакции гемагглютинации влияет также группа крови [103]. Для получения воспроизводимых результатов необходимо использовать кровь одной и той же группы, оптимально использовать группу крови O.

РТГА позволяет оценить уровни антител, связывающихся с гемагглютинином и предотвращающих его связывание с рецептором. Основными недостатками РТГА являются невысокая чувствительность, возможность неспецифического ингибирования вируса компонентами сыворотки и сложность стандартизации метода. В зависимости от подтипа вируса и вида животных, сыворотка которых исследуется, необходимо подбирать условия обработки сыворотки, выбирать вид используемых эритроцитов. Отдельные сыворотки вследствие физиологических особенностей организма могут давать сложно интерпретируемую картину гемагглютинации. Метод учитывается визуально, что создает дополнительные сложности при стандартизации.

Тем не менее, данный метод является общепринятым и рекомендованным при эпидемиологических исследованиях [344] и, по действующим нормативным документам, используется для оценки поствакцинального иммунитета у людей [32, 63].

1.3.3.2 Реакция нейтрализации Реакция нейтрализации позволяет оценить уровни антител, нейтрализующих вирус и подавляющих развитие инфекции. Принцип метода заключается в специфическом подавлении инфекционности вируса антителами, содержащимися в сыворотке. Детекцию инфекционности проводят в восприимчивой к вирусу живой системе – в развивающихся куриных эмбрионах, в культурах клеток.

На настоящий момент общепринятым протоколом является постановка реакции микронейтрализации (РМН) в 96-луночных микропланшетах с детекцией роста вируса в культуре клеток [56, 248]. Клеточная культура (наиболее часто используется MDCK) обладает преимуществами перед куриными эмбрионами, поскольку клетки изолированы из организма млекопитающего и более восприимчивы к ряду подтипов вирусов гриппа.

Детекция роста вируса возможна в любой форме, в том числе с помощью постановки реакции агглютинации эритроцитов, но данный способ не рекомендуется из-за ряда ограничений и вышеперечисленных сложностей со стандартизацией. Высоко чувствительным и специфичным способом детекции размножения вируса в клетках является постановка ИФА с антителами к NP-белку вируса гриппа [114], позволяющая использовать единый коньюгат моноклональных антител для детекции размножения вирусов разных штаммов [56].

Стандартизация метода облегчается благодаря аппаратной регистрации результатов реакции.

Метод является более трудоемким и требует большего количества времени для получения результатов, чем РТГА, но из-за высокой чувствительности и специфичности [248] включен в ряд протоколов учета иммунного ответа на вирусы гриппа, в том числе вирусы птичьего гриппа подтипа Н5 [56].

1.3.3.3 Определение антител различных классов методом иммуноферментного анализа (ИФА) Метод иммуноферментного анализа позволяет оценить титр специфических антител определенного класса в образце. Метод очень широко используется, поскольку обладает высокой чувствительностью, специфичностью, позволяет дифференцировать антитела разных классов. Действие метода основано на реакции антиген-антитело. На дно полистирольного 96луночного планшета наносят антиген, против которого детектируют антитела в образцах. В зависимости от выбранного антигена, использующегося для постановки реакции, можно определять титры антител к цельному вириону, отдельным белкам или к пептидным фрагментам [148, 326]. После того, как произошло связывание антител с антигеном, можно детектировать количество антител того или иного класса, связавшихся с антигеном.

В сыворотках крови на ранних сроках определяют иммуноглобулины класса М, начиная со срока 10-14 дней – специфические иммуноглобулины класса G, обладающие наибольшей специфичностью [109]. В назальных секретах наиболее часто определяют титры антител класса IgA [39]. Абсолютные значения титров антител, определенные методом ИФА, обычно выше, чем титры антител по данным РТГА и микронейтрализации. Учет методом иммуноферментного анализа не дает ответа на вопрос о том, обладают ли антитела способностью нейтрализовать вирус: детектируются все антитела, которые могут связаться с использованным антигеном.

Автоматизированный учет результатов ИФА позволяет стандартизировать методику и стабильно получать воспроизводимые результаты.

Особенно интересно использование метода ИФА для учета секреторных противогриппозных антител. В ФГБНУ «ИЭМ» была разработана моноклональная ИФА-тестсистема, позволяющая детектировать секреторные антитела к вирусам гриппа А и В в назальных смывах у людей [38-39]. Проведенные исследования позволили выявить связь между определенным в ИФА уровнем секреторных антител в назальных смывах и защитой от естественной гриппозной инфекции.

1.3.4 Морская свинка как модель для изучения противогриппозного иммунитета.

Самыми распространенными модельными животными для изучения гриппа являются мыши и хорьки [80, 317, 322]. Известно, что мыши, как лабораторная модель для изучения гриппозной инфекции, имеют ряд недостатков: они мало восприимчивы к ряду человеческих вирусов (в частности, подтипа H3N2), не позволяют изучать такое важное свойство вируса гриппа, как его трансмиссивность. Более восприимчивыми к человеческим штаммам вируса гриппа являются хорьки и макаки – очень дорогие и сложные в содержании животные. Ряд исследований, посвященных изучению иммунного ответа у хорьков, содержит указания на то, что данная модель с иммунологической точки зрения является не совсем адекватной при изучении иммуногенности вакцинных штаммов, предназначенных для введения человеку [140, 233].

Альтернативной моделью, позволяющей производить изучение гриппозной инфекции, являются морские свинки [209, 317, 322]. Морские свинки – более мелкие и простые в содержании животные, чем хорьки и макаки, при этом они восприимчивы к первичным человеческим изолятам гриппа без дополнительной адаптации. Поскольку морские свинки значительно крупнее мышей, забор биоматериала у морских свинок возможен в больших объемах без умерщвления животных, что позволяет при необходимости проводить длительные исследования [209].

С 1970-х годов ведутся исследования различных линий морских свинок [67, 99]. Ряд работ посвящен молекулам главного комплекса гистосовместимости [99, 153, 290, 292], проводятся сравнительные исследования, позволяющие установить пригодность морских свинок в качестве модели для изучения разных параметров иммунного ответа [150, 153, 218, Разработан комплекс реагентов, позволяющих изучать широкий спектр 289].

иммунологических показателей на модели морской свинки [238, 251].

В качестве модели для изучения гриппозной инфекции морские свинки используются с 1930-х гг [306, 348]. Опубликованы исследования по патогенезу гриппозной инфекции у морских свинок [73], внутриутробной инфекции [311] формированию иммунного ответа и защите от реинфицирования [259], клеточному звену иммунитета [174, 238]. В последнее десятилетие продолжается активное изучение морских свинок в качестве модели, позволяющей изучать патогенез, трансмиссивность гриппа и иммунный ответ на различные штаммы [91, 207, 209, 238, 322-323].

Развитие гриппозной инфекции у морских свинок локализовано преимущественно в верхних дыхательных путях, животные выделяют вирус в окружающую среду и могут осуществлять его аэрозольную передачу [13, 24, 208].

Для оценки адекватности морских свинок в качестве модельных животных для изучения противогриппозного иммунитета и оценки эффективности вакцин Bushnell c соавт. было проведено исследование иммунных ответов морских свинок на введение вируса A/Wyoming/03/2003 (H3N2), а также на введение очищенного гемагглютинина данного вируса Морских свинок в возрасте 6-9 недель интраназально заражали вирусом [91].

A/Wyoming/03/2003 (H3N2), либо подкожно иммунизировали очищенным гемагглютинином данного вируса, после чего проводили ревакцинацию в 3, 5 и 10 недель. На протяжении 6 месяцев после заражения исследователи изучали иммунный ответ в сыворотках животных в динамике. Иммунный ответ оценивали по титру антигемагглютинирующих антител, оцениваемому в РТГА, а также титрам антител по данным ИФА и иммуноблоттинга. Титры (ИФА, РТГА), полученные после последней иммунизации в 10 недель держались на высоком уровне, незначительно снижение наблюдалось после 26 недель. Оценивали также распознавание отдельных линейных эпитопов в молекуле гемагглютинина методом пептидного сканирования (PepScan). Была получена библиотека пептидных фрагментов гемагглютинина вируса A/Wyoming/03/2003, взаимодействие которых с сыворотками оценивалось методом ИФА. Были обнаружены линейные эпитопы в области основных эпитопов молекулы гемагглютинина (А-Е), а также реакции на пептидные фрагменты, аналогичные описанным другими исследователями, работавшими с использованием метода PepScan [230].

Результаты исследований Bushnell с соавт. позволяют предположить, что морские свинки в качестве модельных животных для изучения иммунологических показателей являются адекватной и удобной моделью [91].

1.4 Свойства вируса гриппа, которые могут повлиять на иммуногенность гриппозных вакцин Формирование иммунного ответа на любой антигенный раздражитель – многофакторный процесс, зависящий от целого ряда признаков и свойств как антигена, так и индивидуального организма. Изучение свойств антигенов, влияющих на развитие иммунного ответа – один из основных вопросов, находящихся в области интересов исследователей, занимающихся вопросами иммунопрофилактики. Правильный подбор антигена для введения в организм определяет эффективность иммунизации и защитные свойства препарата.

Вирус гриппа отличается высокой изменчивостью, с чем связана необходимость ежегодной подготовки новых штаммов гриппозной вакцины. Вакцины на основе разных штаммов гриппа отличаются по иммуногенности, определяемой по состоянию гуморального иммунного ответа.

В связи с высокой скоростью распространения гриппозной инфекции, время на подготовку вакцинных штаммов крайне ограничено и залогом успешных противоэпидемических мероприятий является подготовка максимально эффективной вакцины против циркулирующих вариантов вируса. Для получения высокоиммуногенных штаммов важно правильно подбирать варианты «диких» родительских вирусов, на основе которых будет создаваться вакцина на текущий эпидемический сезон.

Наиболее доступными для оценки являются фенотипические свойства вируса гриппа, такие, как способность к размножению за пределами температурного оптимума, чувствительность к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови и некоторые другие.

Понимание того, какие фенотипические свойства «дикого» вируса могут служить маркерами иммуногенности вакцинного штамма, подготовленного на его основе, должно облегчить отбор вариантов родительских вирусов и получение высокоиммуногенных вакцинных штаммов.

Данный раздел обзора литературы опубликован в виде обзорной статьи: [62].

1.4.1 Температурочувствительность «диких» вирусов, ее возможные механизмы Различная способность штаммов гриппа к размножению при температурах за границами температурного оптимума давно известна, данный показатель широко используется в качестве лабораторного маркера свойств вирусов гриппа. Киселева с соавт. [25] провели подробный анализ большого массива литературных и экспериментальных данных о способности к репродукции при повышенной температуре (37–40С) вирусов гриппа А и В разных лет выделения (с 1933 по 2001 г.) и обосновали, что температурочувствительность штаммов гриппа разных подтипов волнообразно изменяется в ходе их циркуляции. По данным авторов, температурочувствительные штаммы встречались среди всех исследованных сероподтипов вируса гриппа: А (H1N1, H3N2, H2N2) и В.

Появление таких штаммов было датировано годом–двумя после появления в циркуляции антигенно нового варианта. По всей видимости, данные штаммы представляли собой отражение адаптации циркулирующего варианта вируса к популяции хозяина. Это подтверждается исследованиями клинической картины заболевания природными температурочувствительными штаммами: картина заболевания при заражении природными температурочувствительными (далее – ts, от «temperature sensitive») вирусами была смягченная [100].

Известно, что вирусы гриппа, выделенные из популяций разных видов животных, обладают различной способностью к репликации при повышенной температуре. У птичьих и свиных вирусов как правило наблюдается способность к репликации при более высоких температурах, чем у вирусов, выделенных от человека [234]. По данным [25] практически все антигенно новые варианты вирусов гриппа человека обладали высокой способностью к репродукции при температуре 40С. Видимо, новые антигенные варианты вирусов некоторое время сохраняли способность к репликации при высоких температурах, но постепенно преимущество получали формы, менее разрушительно воздействующие на организм хозяина при размножении.

Исследования молекулярных основ аттенуации холодоадаптированных штаммов гриппа, а также анализ температурочувствительных вариантов «диких» вирусов в качестве причин сужения границ температурного оптимума однозначно указывают на ведущую роль внутренних генов вируса гриппа, прежде всего генов полимеразного комплекса [157, 166, 181-182, 307].

Есть данные о возможной роли нейраминидазы в формировании температурочувствительного фенотипа [252]. Известно также, что в различных системах границы температурного диапазона репликации вирусов гриппа отличаются, однако точные причины этого явления неизвестны [16, 101].

1.4.2 Влияние ts–фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины Первые живые гриппозные вакцины готовили путем серийного пассирования эпидемических штаммов в куриных эмбрионах при оптимальной температуре [2]. Таким способом удавалось получать аттенуированные варианты с измененным кругом хозяев.

Пассажные вакцины обладали непредсказуемым набором свойств и нестабильными характеристиками безопасности. Позднее начал применяться метод холодовой адаптации, позволявший получать аттенуированные штаммы с улучшенными показателями безопасности.

Современные штаммы ЖГВ получают путем реассортации эпидемических штаммов с холодоадаптированными безвредными для человека донорами аттенуации. В геном вакцинного штамма переходят гемагглютинин и нейраминидаза эпидемического штамма, а остальные 6 генов принадлежат донору аттенуации. В этих генах содержится набор аттенуирующих мутаций, определяющих стабильность характеристик безопасности штамма [157, 181].

Активное изучение холодовой адаптации как метода аттенуации вируса гриппа показало, что при пассировании при пониженной температуре, использующемся для снижения реактогенных свойств штаммов гриппа, важно контролировать иммуногенные свойства пассажного варианта. Как было показано рядом авторов, аттенуация путем адаптации к пониженной температуре инкубации одновременно приводила к снижению иммуногенных свойств вакцинных штаммов вируса гриппа [79, 321].

Медведевой Т.Е. с соавт. был проведен ряд исследований зависимости [31] иммуногенности от холодовой адаптации штаммов вируса гриппа. Изучалась зависимость между количеством пассажей при пониженной температуре и иммуногенностью. Авторы анализировали реактогенные и иммуногенные свойства пассажных вариантов штамма А/Ленинград/538/74 (H3N2), полученных на разных этапах пассирования этого штамма при пониженной до 28°С температуре в развивающихся куриных эмбрионах. Было показано, что параллельно с постепенным снижением степени чувствительности вируса к воздействию пониженной температуры происходило не только снижение его реактогенности для людей, но и иммуногенности по показателям гуморального иммунного ответа. При этом на определенном этапе пассирования произошло резкое изменение свойств вируса – потеря способности к эффективной репликации при температуре 40°С, резкое снижение реактогенных свойств и снижение иммуногенности.

Тот же коллектив авторов несколькими годами ранее проводил исследование способности вирусов с различными показателями температурочувствительности к индукции синтеза интерферона в развивающихся куриных эмбрионах [30]. Титры интерферона при различных температурах коррелировали с титром вируса при данных температурах. То есть, холодолюбивые штаммы индуцировали выработку большего количества инферферона при субоптимальной температуре инкубации, чем холодочувствительные, у теплолюбивых наиболее высокие показатели количества интерферона достигались при повышенной температуре инкубации.

Киселевой И.В. с соавт. [23, 181-182] был проведен подробный анализ генетических основ аттенуации вирусов гриппа А и В и фенотипических свойств, коррелирующих с аттенуированным фенотипом вирусов. Было показано, что ts–маркер является безусловным показателем аттенуированного фенотипа штамма, в то время как холодоадаптированные (далее

– ca, от «cold–adapted») варианты встречались как среди аттенуированных, так и среди не аттенуированных вирусов. Полное секвенирование генома «диких» родительских вирусов и подготовленных на их основе аттенуированных холодоадаптированных пассажных вариантов дало информацию о роли отдельных генов и мутаций в аттенуации вируса и проявлении са– и ts–фенотипов. Было показано, что основную роль играют мутации в белках полимеразного комплекса (PB1, PB2); что подтверждается данными других авторов, полученными на вирусах подтипов H1N1, H7N7, H3N2 [50, 175]. Была показана также важность наличия мутаций в остальных генах вируса гриппа для стабильности аттенуированного фенотипа.

Аналогичный анализ был проведен для доноров аттенуации американской ЖГВ FluMist [157, 172]. Как и в холодоадаптированных штаммах отечественной ЖГВ, необходимые для проявления аттенуированного фенотипа американской вакцины мутации располагались в генах полимеразного комплекса, но также содержались замены и в других генах.

Влияние адаптации к пониженной температуре на клеточное звено иммунного ответа описано в исследовании [49]. Было показано, что холодовая адаптация приводила к снижению способности индуцировать образование антителосекретирующих В-клеток (АСК) при первичном антигенном раздражении, вплоть до полной утраты. Авторы связывают снижение способности вирусов к первичной стимуляции АСК со сниженной способностью к репликации в нижних отделах дыхательных путей. При этом наличие мутантных генов от холодоадаптированного штамма не оказывало значительного влияния на функциональную активность цитотоксических лимфоцитов памяти. Показано, что количество АСК обусловливалось гемагглютинином и нейраминидазой штамма, а цитотоксический лимфоцитарный ответ определялся составом внутренних генов вируса. При введении мышам вакцинного штамма, содержащего 6 внутренних генов от донора аттенуации, а гемагглютинин и нейраминидазу – от «дикого» вируса, цитотоксический лимфоцитарный ответ был значительно ниже, чем при введении «дикого» вируса.

Было замечено, что существует зависимость между способностью «дикого» родительского вируса размножаться при температуре, повышенной до 38–40°С и иммуногенностью полученного на его основе вакцинного штамма [20]. Авторы провели анализ данных клинических испытаний вакцинных штаммов ЖГВ, полученных на основе «диких» вирусов гриппа, отличавшихся по способности к репликации при повышенной температуре и отметили, что вакцинные реассортанты с более высокой иммуногенностью были получены на основе штаммов, способных к эффективной репликации при температуре 40°С. Штаммы, «дикий»

родитель которых был температурочувствителен уже при 38°С, преимущественно обладали низкой иммуногенностью. Данный анализ был проведен на 19 вакцинных штаммах вируса гриппа А.

Хотя температурочувствительность вируса, как было упомянуто, зависит прежде всего от свойств внутренних белков вируса, по всей видимости, свойства гемагглютинина и нейраминидазы природных вирусов, обладающих разной температурочувствительностью, отличаются по способности индуцировать эффективное развитие иммунного ответа. Возможно, ts–варианты вирусов являются дрейфовыми вариантами, обладающими общими эпитопами в антигенных детерминантах с циркулировавшими на протяжении последнего времени вирусами, в связи с чем в результате реассортации с донором аттенуации и получаются штаммы с более низкой иммуногенностью.

1.4.3 Ингибиторочувствительность «диких» вирусов, ее природа и возможные механизмы Ингибиторочувствительность – еще одно свойство вирусов гриппа, поддающееся быстрой оценке и при этом определяющее поведение вируса в процессе инфекции и при подготовке реассортантных вакцинных штаммов. Наиболее информативны данные, полученные в последние 20 лет, после открытия природы ингибиторов и проведения детальных исследований в этой области.

При оценке чувствительности вируса к ингибиторам необходимо четко понимать, что состав ингибиторов сывороток различных животных отличается, и на результаты оказывает влияние протокол обработки сыворотки и способ учета результатов реакции [130, 168, 219, 273, 279].

Тем не менее, это свойство безусловно стоит принимать во внимание, поскольку чувствительность к ингибиторам как лабораторный маркер изучается достаточно давно и накоплен большой массив данных клинических испытаний вакцин, подготовленных на основе вирусов с разными показателями чувствительности к ингибиторам.

В 1969 году была предложена классификация ингибиторов нормальной сыворотки и секретов животных с разделением на три класса: –, – и –, в зависимости от термостабильности и чувствительности к нейраминидазе [186].

1 класс: –ингибиторы – термостабильные гликопротеины, содержащие остатки сиаловых кислот и связывающиеся с рецептор–связывающими областями головки гемагглютинина вируса гриппа. –ингибиторы чувствительны к обработке нейраминидазой, трипсином, периодатом и содержатся в сыворотках и секретах большинства животных.

2 класс: –ингибиторы представляют собой лектины, взаимодействующие с компонентами вирусных оболочек. Нейтрализация вируса происходит путем связывания гемагглютинина и активации каскада комплемента по лектин–зависимому пути. По классификации Krizanova и Rathova (1969) –ингибиторы отнесены к термолабильным, но в статье Matrosovich с соавт. (1998) показано, что по крайней мере часть из них устойчива к температуре. Ингибиторы этого класса не чувствительны к обработке нейраминидазой и периодатом, могут быть удалены обработкой цитратом или трипсином. Они были обнаружены в сыворотках коров, мышей, кроликов, хорьков и морских свинок.

3 класс: –ингибиторы являются температуроустойчивыми гликопротеинами, содержащими остатки сиаловых кислот и устойчивыми к нейраминидазной активности. По данным Krizanova, Rathova, (1969) при воздействии высокой температуры количество этих ингибиторов может увеличиваться. В качестве способа удаления этих ингибиторов описана только обработка перйодатом калия. Эти ингибиторы присутствуют у лошадей, морских свинок, кроликов, хорьков, свиней и человека.

Позднее эту классификацию расширяли другие исследователи в соответствии с новыми данными.

По современным представлениям, ингибиторы вируса гриппа можно разделить на две основные группы, содержание которых в сыворотках крови разных животных сильно различается - ингибиторы, мимикрирующие под рецептор вируса гриппа на клеточной поверхности, и ингибиторы, не содержащие сиаловых остатков.

1.4.3.1 Ингибиторы, мимикрирующие под рецептор вируса гриппа на клеточной поверхности и блокирующие рецептор–связывающий карман гемагглютинина Гемагглютинин вируса гриппа при проникновении в клетку хозяина взаимодействует с поверхностными олигосахаридами клеточной поверхности. Вирусы гриппа человека прикрепляются к олигосахаридам, содержащим 5–N–ацетилнейраминовую (сиаловую) кислоту, связанную с галактозой или глюкозамином –2,6 связью. Вирусы гриппа птиц и лошадей предпочитают рецепторы с –2,3 связью [279].

Чувствительность к ингибиторам, мимикрирующим под рецептор, определяется рецепторной специфичностью гемагглютинина вируса и субстратной специфичностью его нейраминидазы. В эту группу попадают ингибиторы, по классификации [186] относившиеся к

– и – классам.

В статье Matrosovich с соавт. (1998) подробно разобран молекулярный механизм взаимодействия ингибиторов с гемагглютинином [219]. В ряде экспериментов авторы выясняли, чем обусловлена ингибитороустойчивость штамма вируса A/Los Angeles/2/87 (H3N2) к сывороткам кролика, свиньи и лошади. Было показано, что в каждом случае устойчивость приобреталась с появлением уникальных замен в рецептор–связывающей области гемагглютинина.

В частности, было показано, что устойчивость вируса H3N2 к –ингибиторам лошадиной сыворотки связана с рецепторной специфичностью вируса, в частности, с аминокислотой, стоящей в позиции 226 гемагглютинина. При смене рецепторной специфичности с –2,6 на – 2,3 вирус приобретал устойчивость к –ингибиторам лошадиной сыворотки. Аналогичные результаты были получены [279]. При формировании устойчивости к свиной сыворотке, также содержащей NA–чувствительные сиалогликоконьюгаты с –2,6 связью (2–макроглобулин), был задействован похожий механизм, подробно описанный в [219].

Замены в рецептор–связывающем кармане гемагглютинина в позициях, отвечающих за переключение рецепторной специфичности, в гемагглютинине вируса подтипа H2 также определяют чувствительность к ингибиторам, содержащимся в лошадиной сыворотке [58, 188].

В литературе не встречается упоминаний о вирусах подтипа H1N1, чувствительных к ингибиторам, тот же факт подтверждается нашими собственными исследованиями. Вероятно, это связано с тем, что вирусы гриппа человека данного подтипа взаимодействуют как с –2,6, так и с –2,3 рецепторами [127].

Те же закономерности выявлены при анализе показателя ингибиторочувствительности к лошадиной сыворотке вирусов гриппа В [27]. Показано, что вирусы линии Ямагата, чувствительные к ингибиторам, имеют рецепторную специфичность –2,6, а штаммы викторианской линии проявляли сродство как к –2,3, так и к –2,6 гликанам [335].

Как было отмечено выше, к –ингибиторам относили молекулы, чувствительные к вирусной нейраминидазе, а к –ингибиторам – устойчивые [186]. [130] было показано, что большую роль играет субстратная специфичность нейраминидазы. Нейраминидазы вирусов, чувствительных к ингибиторам лошадиной сыворотки, не расщепляли –2,6 связь между сиаловой кислотой и галактозой, предпочитая –2,3.

В исследовании [219] описан еще один вариант устойчивости ингибиторов к нейраминидазной активности – 4–О–ацетилирование остатка сиаловой кислоты.

1.4.3.2 Ингибиторы, не содержащие сиаловых остатков: коллектины, пентраксины Во вторую группу относят молекулы сывороток и секретов слизистых, не содержащие остатков сиаловой кислоты и ингибирующие вирус гриппа вне зависимости от его рецепторной специфичности. По классификации Krizanova и Rathova [186] это –ингибиторы, и в эту группу были отнесены только термолабильные молекулы. Matrosovich с соавт. [219] расширили группу, включив термостабильные компоненты, и описали механизм ингибирования вируса гриппа компонентами бычьей сыворотки: связывание лектина с маннозой и активация каскада комплемента по лектин–зависимому пути.

По современным представлениям, к –ингибиторам относятся молекулы семейства коллектинов, а также другие не содержащие сиаловых остатков компоненты врожденной неспецифической защиты против вирусов гриппа, механизм действия которых изучается [273].

Ca2+–зависимые Коллектины – лектины, содержащие коллагеноподобный домен, и консервативный домен, связывающийся с олигосахаридами. Коллектины связываются с остатками сахаров на поверхности гемагглютинина и блокируют его, а также вызывают активацию системы комплемента [219, 273]. Чувствительность к молекулам данного класса четко связана с характером гликозилирования гемагглютинина [145, 219, 273]. К этой группе относятся белок сурфактанта D, манноза–связывающий лектин, CL–43, конглютинин [219, 273].

Reading с соавт. [273] описана возможная роль пентраксинов (SAP, CRP, PTX3) в качестве –ингибиторов вируса гриппа.

1.4.4 Связь ингибиторочувствительности с иммуногенностью В рамках прогнозирования влияния ингибиторочувствительности вируса на его иммуногенность интересно рассмотреть несколько аспектов.

Во–первых, чувствительность к ингибиторам является важным свойством вакцинного штамма, и для живой гриппозной вакцины способность вируса попадать в клетки ВДП, размножаться в них и стимулировать развитие иммунного ответа является отдельной характеристикой, напрямую влияющей на иммуногенность вакцинного штамма.

Во–вторых, чувствительность вируса к ингибиторам, содержащимся в прогретой лошадиной сыворотке, определенная по стандартному протоколу, является стабильным маркером свойств вируса, позволяющим прогнозировать его специфичность к типу рецептора и оценивать корреляцию данного свойства вирусов–родителей с иммуногенностью вакцин на основе этих вирусов.

Проводился ряд исследований, посвященных оценке действия на разные штаммы in vivo ингибиторов вируса гриппа, содержащихся в сыворотке и секретах млекопитающих.

Пассированием под сывороткой получали штаммы, устойчивые к сыворотке определенного вида животных, после чего проводилось заражение животных полученными вариантами вирусов. Hartley с соавторами [145] на мышах показали, что ингибитороустойчивый вариант «дикого» вируса обладал повышенной вирулентностью по сравнению с чувствительным вариантом.

Изучение in vivo роли некоторых –ингибиторов проводили на модели мышей с нокаутированными генами соответствующих белков (белки сурфактанта легких, коллектины).

Было показано, что потеря белков сурфактанта A и D приводит к увеличению восприимчивости к гриппозной инфекции и увеличению ее проявлений [198-199], а заражение вирусом гриппа повышает выработку этих белков [274].

В исследовании, проведенном на пассажных вакцинных штаммах [14] содержится указание на более высокую иммуногенность ингибиторочувствительных вариантов. Работа проводилась на штаммах A2/Гонконг/1/68/21 и А2/Истра/69/10 (по современной классификации это вирусы, принадлежащие к сероподтипу H3N2). Из исходной гетерогенной популяции выделяли линии, отличавшиеся по ингибиторочувствительности, после чего проводили ряд последовательных пассажей при пониженной температуре. Изучали иммуногенность холодоадаптированных пассажных вариантов для добровольцев, а также потенциальную антигенную активность данных штаммов в условиях циркуляции гомологичных штаммов вируса в течение трех лет. Ингибиторочувствительные варианты были более иммуногенны по показателям гуморального иммунитета, причем ингибиторочувствительный штамм A2/Гонконг/1/68/21 обладал стабильно высокой иммуногенной активностью на протяжении трех лет. Вакцинный вирус А2/Истра/69/10, полученный на основе специально полученного ингибитороустойчивого варианта, вызывал значительные приросты сывороточных антител только в первый год циркуляции гомологичных штаммов, в дальнейшем его иммуногенность сильно снизилась. У добровольцев с исходным титром антител 1:16 и более приростов антител обнаружено не было. Сходные результаты получили иностранные авторы, работавшие с гомологичными вирусами тех же лет выделения [78].

В исследовании Жиловой с соавт. [14] более иммуногенные ингибиторочувствительные (ИЧ) варианты показали более высокую реактогенность при испытании на ограниченных группах добровольцев. Данные о более высокой реактогенности ИЧ–вирусов были опубликованы и ранее [298], а также подтверждались иностранными исследователями [78].

Стоит отметить, что в данном случае идет о пассажных вакцинах с непредсказуемым набором мутаций во внутренних генах вакцинных штаммов, поэтому говорить о прямом влиянии ингибиторочувствительности на реактогенность не совсем корректно. В литературе также существуют данные о более высокой вирулентности ингибитороустойчивых (ИУ) вирусов. В частности, было показано, что ИУ–варианты проникают в нижние отделы дыхательных путей мышей [145].

По всей видимости, в случае с вакцинными штаммами, не способными реплицироваться при температуре, характерной для нижних дыхательных путей, основную роль играет способность эффективно размножаться в верхних отделах дыхательных путей. ИЧ–вирусы гриппа, обладающие сродством к -2,6–рецепторам, преобладающим в верхних отделах дыхательных путей [293, 351], способны более эффективно реплицироваться в верхних дыхательных путях и вызывать большее количество реакций, регистрируемых при испытаниях вакцинного штамма.

Еще в одном отечественном исследовании [26] подтверждаются данные о более высокой иммуногенности ингибиторочувствительных (ИЧ) вирусов. Вывод был сделан автором на основе косвенных данных: при анализе комплекса свойств различных вирусов и полученных на их основе вакцинных штаммов была обнаружена зависимость между степенью гидрофобности и иммуногенностью вирусов, при этом анализ сочетания свойств приводит к заключению о том, что ингибиторочувствительные вирусы обладают большей иммуногенностью.

1.4.5 Связь рецепторной специфичности с иммуногенностью Поскольку устойчивость вирусов гриппа к ингибиторам, содержащимся в прогретой лошадиной сыворотке, определенная по стандартному протоколу, является отражением –2,6–

–2,3 рецепторной специфичности вируса гриппа, ряд работ последних лет, посвященных зависимости иммуногенности от рецепторной специфичности вируса, может быть рассмотрен в рамках возможной связи ингибиторочувствительности с иммуногенностью.

Рецептор–связывающие участки молекулы гемагглютинина перекрываются с его антигенными участками [343], поэтому аминокислотные замены в этой области могут существенно повлиять на иммуногенность полученного в результате изменения рецепторной специфичности варианта вируса.

Исследования, посвященные этому вопросу, подтверждают наличие связи между иммуногенностью и рецепторной специфичностью.

В детальном исследовании на животной модели (хорьки) Xu с соавторами [351] показали влияние одиночных мутаций в рецептор–связывающей области гемагглютинина на специфичность взаимодействия с рецептором и на иммуногенность. Авторы работали с гриппом подтипа H1N1, для которого известно, что вирусы гриппа человека данного подтипа взаимодействуют как с –2,6, так и с –2,3 рецепторами, при этом обладая большей аффинностью к –2,6 [72, 127]. В респираторном тракте хорьков, как и у человека, преобладают

–2,6 рецепторы. Для сравнения авторы использовали 4 варианта вируса A/Solomon Island/3/06 (H1N1), содержащие разные сочетания аминокислотных остатков в позициях 190 и 226 гемагглютинина. Авторы подтвердили, что 226 аминокислотный остаток, известный как детерминанта рецепторной специфичности у вирусов подтипа H3 [278], играет ту же роль у выбранного штамма подтипа Оценка иммуногенности производилась методами H1.

определения сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации. Авторы показали, что вариант с –2,6–специфичностью был более иммуногенен, чем вариант, адаптированный к «птичьему» рецептору, и холодоадаптированный вакцинный штамм на основе варианта с –2,3–специфичностью реплицировался в верхних отделах дыхательных путей значительно хуже.

Изменение только одного аминокислотного остатка повлияло на антигенные свойства вируса и способность взаимодействовать с эритроцитами с разным составом поверхностных сиалогликанов. Именно это послужило причиной того, что при подготовке вакцинного штамма в качестве итогового варианта вакцины был выбран вариант с –2,3–специфичностью, как было позже показано, менее иммуногенный. При определении происхождения гемагглютинина клонов, полученных в процессе подготовки вакцинного штамма, в качестве референс–вируса использовался –2,3–специфичный вариант, прошедший несколько пассажей в куриных эмбрионах. Варианты с –2,6–специфичным гемагглютинином были признаны антигенно отличающимися и исключены из процесса подготовки [351].

В более раннем исследовании, проведенном с использованием вариантов вируса A/Memphis/102/72 (H3N2) с различной рецепторной специфичностью на той же животной модели также производилось сравнение иммунного ответа [197]. Вирусы пассировались на клеточной линии MDCK с использованием лошадиной сыворотки в качестве селектирующего фактора для получения варианта с измененной рецепторной специфичностью. Была обнаружена связь рецепторной специфичности только с изменением патогенных свойств вируса, иммуногенность же по показателю титров сывороточных антител в реакции РТГА была одинаковой. В статье Xu с соавт. [351] показано, что аминокислота, стоящая в позиции 226 гемагглютинина, определяла рецепторную специфичность, при этом аминокислота, стоящая в позиции 190, также влияла на способность к связыванию с рецептором, в том числе одно из исследованных сочетаний аминокислот в позициях 190 и 226 определяло двойную рецепторную специфичность. Разные варианты сочетаний незначительно отличались антигенно и по кросс– нейтрализующей активности сывороток после иммунизации.

Возможно, подобное явление является причиной результатов, полученных Leigh с соавт.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |
 

Похожие работы:

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Шестакова Вера Владимировна МОРФО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS MILL. К КОККОМИКОЗУ Специальность: 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.