WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

«ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...»

-- [ Страница 5 ] --

В штамме [PSI+][PIN+], но не в его изогенном деривате [psi-][pin-], были идентифицированы белки Sup35 и Rnq1 - детерминанты прионных факторов [PSI+] и [PIN+], соответственнo, а также белки Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1. Известно, что шапероны Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1 взаимодействуют с прионными агрегатами белка Sup35 и играют роль в поддержании этого приона [Newnam et al., 1999;

Chernoff et al., 1999; Sondheimer et al., 2001; Higurashi et al., 2008]. Исходя из этих данных, выявление перечисленных шаперонов методом PSIA объясняется их физическим взаимодействием с прионом [PSI+].

Разработанный нами метод впервые позволил оценить возможность присутствия в клетках прионов, не имеющих фенотипического проявления. По всей вероятности, прионизация является редким событием – в штаммах [PSI+][PIN+] идентифицированы белки Sup35 и Rnq1, но, помимо шаперонов, не выявлено других белков, по которым различаются фракции SDS-устойчивых агрегатов тестируемых штаммов.

Модификация метода PSIA HPLC-MALDI впервые позволила на основании данных протеомного анализа составить список перспективных кандидатов на роль функциональных дрожжевых амилоидов. В этот список входят белки Gas1, Tif1, Ecm33, Rim1, Toh1, Plb1, Gas5, Gas3, Ape1, Ilv2, Ira1, Utp20, YBL100W-B и Mlp1. Белки Gas3, Gas5, Ecm33 и Toh1, также как и Gas1, являются белками клеточной стенки [Nuoffer et al., 1991; Rolli et al., 2010; Terashima et al., 2003;

Hamada et al., 1998]. Особый интерес представляет белок Toh1. Продукция этого белка резко усиливается при повреждениях клеточной стенки, а также при остановке клеточных делений [Garca et al., 2004; Tkach et al., 2012]. Можно предположить, что формирование амилоидных фибрилл белка Toh1 в клеточной стенке помогает клетке пережить стресс.

Для оценки агрегации одного из выявленных кандидатов на роль функциональных амилоидов проведены дополнительные эксперименты. Мы сконструировали плазмиду PGPD1-GAS1-YFP, содержащую химерный ген GAS1YFP, под контролем промотора GPD1. При трансформации штамма BY47-42 плазмидой белок образует цитологически PGPD1-GAS1-YFP Gas1-YFP детектируемые агрегаты (рис. 20А). Более того, в штамме ATCC 201388 GAS1YFP, содержащем химерный ген GAS1-YFP под контролем промотора GAS1, также детектируются агрегаты, которые локализуются в основном по периферии клеток и, возможно, входят в состав клеточной стенки (рис. 20А). Агрегаты Gas1YFP демонстрируют устойчивость к обработке 1% SDS (рис.20 Б).

Рисунок 20. Агрегация белка Gas1-YFP в клетках штамма BY4742. А – Выявление с помощью флуоресцентной микроскопии агрегатов белка Gas1-YFP, продуцирующегося под контролем промоторов GPD1 и GAS1. Б – Выявление SDS-устойчивых полимеров белка Gas1-YFP методом полуденатурирующего электрофореза и Вестерн-блот гибридизации с использованием антител 11E5, специфичных к YFP, GFP и CFP. Цифрами обозначены номера дорожек. 1 – денатурированный белок Gas1-YFP; 2- неденатурированный белок YFP; 3- SDSустойчивые полимеры неденатурированного белка Gas1-YFP, продуцирующегося под контролем промотора GPD1.

Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой белок Gas1 образует конститутивные амилоидные агрегаты in vivo. Для окончательного заключения в перспективе необходимо в экспериментах in vitro оценить способность белка Gas1 формировать фибриллы, которые окрашиваются амилоид-специфическими красителями. В представленной работе мы выявляем кандидатов на роль функциональных дрожжевых амилоидов, но не ставим задачу доказать амилоидные свойства выявленных кандидатов.

В целом, полученные результаты позволяют заключить, что разработанный метод может быть успешно использован для протеомного скрининга и идентификации белков, формирующих прионные агрегаты. Минорный белок Rnq1 (не более 1140 молекул на клетку) [Ghaemmaghami et al., 2003; Chong et al., уверенно идентифицируется даже при использовании наименее 2015], чувствительного варианта методики, включающей двумерный электрофорез.

Модификация методики включающая наиболее PSIA, HPLC-MALDI, информативна и может дать преимущества при идентификации неизвестных прионных детерминантов, таких как [NSI+]. Большое количество ложнопозитивных сигналов, соответствующих, например, белкам рибосомы, легко отсекается за счт сравнения списка белков, выявленных в прионном штамме и его деривате, полученном в результате пассирования клеток на среде с GuHCl.

3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме [NSI+] 3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты в штамме [NSI+] Мы использовали метод PSIA HPLC-MALDI для выявления белков, которые могут являться детерминантами прионного фактора [NSI+]. Фракция белков, формирующих агрегаты, устойчивые к инкубации с 1% SDS, была получена из культур штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-], как описано в разделе «Материалы и методы». Белковые агрегаты растворяли в муравьиной кислоте, высушивали, денатурировали кипячением и очищали от детергентов.

После трипсинолиза пептиды разделяли методом HPLC и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии. Эксперимент проведн в двух независимых повторностях. В таблице 18 представлены в алфавитном порядке белки, идентифицированные в штамме [NSI+] со счтом, превышающим 50 условных единиц в обеих повторностях. Единственное исключение составляет Swi1, который идентифицирован лишь в одном эксперименте. Это исключение сделано, исходя из того, что Swi1 - один из самых минорных белков в дрожжевом протеоме (примерно 120 молекул на клетку) [Chong et al., 2015], но в то же время этот белок является детерминантом приона [SWI+] [Du et al., 2008; Crow et al., Можно предположить, что детектируется на пределе 2008]. Swi1 чувствительности метода PSIA HPLC-MALDI. Из таблицы исключены все рибосомные белки, которые выявляются во фракции детергент-устойчивых агрегатов, как в штамме [NSI+], так и [nsi-].

Ряд белков, выявленных нами ранее в качестве кандидатов на роль функциональных дрожжевых амилоидов (см. таблицу 17), был идентифицирован также в штаммах [NSI+] и [nsi-]. К этому списку относятся белки Gas1, Gas5, Rim1, Toh1 и Ape1. Отметим, что здесь указаны лишь те белки, которые с высоким счтом выявлялись в штаммах [NSI+] и [nsi-] в двух независимых повторностях.

Полученные данные свидетельствуют о том, что присутствие этих белков во фракции детергент-устойчивых амилоидов не является штаммоспецифичной особенностью. Во фракции SDS-устойчивых агрегатов в штаммах [NSI+] и [nsi-] также выявлен белок Bgl2, который, как было показано ранее, образует амилоидные полимеры в клеточной стенке дрожжей [Kalebina et al., 2008]. В качестве потенциального амилоида интересно рассмотреть белок клеточной стенки Ygp1, который идентифицирован методом PSIA HPLC-MALDI в штаммах [NSI+] и [nsi-]. Продукция Ygp1 активируется при остановке клеточных делений, вызванной недостатком питательных веществ, и этот белок секретируется во внешнюю среду, способствуя формированию биоплнки [Destruelle et al., 1994].

Учитывая функции Ygp1 и его способность формировать SDS-устойчивые агрегаты, можно полагать, что этот белок образует функциональные амилоидные агрегаты в стессовых условиях. Как было сказано в главе «Обзор литературы», в формировании биоплнки бактерий важную роль играют амилоиды. Вполне возможно, это справедливо и для S. cerevisiae.

Таблица 18. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты, в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDI

–  –  –

*Белок выявляется и идентифицируется только в штамме 1-1-D931 [NSI+].

Белки Rnq1, Swi1, Mit1 и Sis1 были идентифицированы только в штамме [NSI+], но не в контрольном штамме [nsi-] (табл. 18). Белки Rnq1 и Swi1 являются детерминантами прионов [PIN+] и [SWI+], соответственно [Derkatch et al., 2001;

Due et al., 2008]. Mit1 входит в список потенциально прионогенных белков, поскольку содержит Q/N-обогащнную последовательность [Harrison and Gerstein 2003]. Шаперон Sis1 связывает неправильно уложенные белки и транспортирует их в ядро для деградации. Показано, что данный шаперон взаимодействует с различными дрожжевыми прионами [по: Higurashi et al., 2008]. В частности, мы показали, что шаперон Sis1 выявляется методом PSIA HPLC-MALDI в штамме [PIN+][PSI+] (таблица 17). Основываясь на этих данных, можно исключить белок Sis1 из списка кандидатов на роль детерминанта фактора [NSI+]. Таким образом, белки Rnq1, Swi1 и Mit1 являются кандидатами на роль детерминанта фактора [NSI+].

3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+]

С помощью метода PSIA были выявлены белки Rnq1, Swi1 и Mit1, которые присутствуют во фракции детергент-устойчивых агрегатов в образцах из штамма [NSI+], но отсутствуют в образцах [nsi-] (табл. 18). Мы провели сравнительный анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP и Mit1-GFP в штаммах [NSI+] и [nsi-] с помощью Вестерн-блот гибридизации.

Методом полуденатурирующего электрофореза мы показали, что SDSустойчивые агрегаты Rnq1-CFP выявляются в штамме [NSI+], но не [nsi-] (рисунок 21А). Агрегация Swi1-YFP в штамме [NSI+] и отсутствие агрегатов этого белка в [nsi-] штамме было показано с помощью метода дифференциального центрифугирования (рисунок 21Б). На основании этих данных можно заключить, что штаммы [NSI+] содержат белки Rnq1 и Swi1 в принной изоформе [PIN+] и [SWI+], соответственно. Анализ агрегации белка Mit1-GFP был проведн как с помощью метода дифференциального центрифугирования, так и методом полуденатурирующего электрофореза. Результаты, представленные на рисунке 21Г, свидетельствуют о том, что белок Mit1-GFP агрегирует как в штамме [NSI+], так и [nsi-]. Отметим, что в эксперименте была использована центромерная плазмида PMIT1-MIT1-GFP и можно полагать, что агрегация химерного белка Mit1отражает уровень агрегации нативного белка С помощью GFP Mit1.

полуденатурирующего электрофореза мы показали, что лишь небольшая доля белка Mit1-GFP оказывается устойчива к обработке SDS (рисунок 22В). По всей вероятности, уровень агрегации белка Mit1 в штаммах [NSI+] и [nsi-] не различается. Сам по себе факт агрегации Mit1 интересен, поскольку этот белок является ключевым транскрипционным фактором, регулирующим псевдогифальный рост дрожжей (Cain et al, 2012). Возможно, при выращивании штаммов на полной среде именно агрегация Mit1 приводит к его инактивации и ингибированию псевдогифального роста. Вместе с тем, полученные результаты свидетельствуют, что белок Mit1 не является детерминантом [NSI+].

Рисунок 21. Сравнительный анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP и Mit1-GFP в штаммах [NSI+] и [nsi-]. А – Белок Rnq1-CFP формирует SDSустойчивые полимеры в штамме [NSI+], но не в штамме [nsi-]. Б - в штамме [NSI+] белок Swi1-YFP представлен в осадочной фракции («О» - осадочная фракция), содержащей высокомолекулярные белковые агрегаты, а в штамме [nsi-] представлен в надосадочной растворимой фракции («Н» - надосадочная фракция).

В – лишь небольшая доля белка Mit1-GFP выявляется во фракции SDSустойчивых полимеров. Г – Методом дифференциального центрифугирования установлено, что белок Mit1-GFP представлен в осадочной фракции как в штамме [NSI+], так и [nsi-].

На основании полученных данных можно предположить, что признаки, наблюдаемые в штаммах [NSI+], опосредованы прионами [PIN+] и (или) [SWI+].

Для проверки возможного влияния приона [PIN+] на проявление фактора [NSI+] был получен штамм 7-1-1-D931 с делецией гена RNQ1. Делеция гена RNQ1 вызвала резкое снижение уровня нонсенс-супрессии (рис. 22). Рост на среде без аденина детектируется лишь на пятый день. Последующая трансформация данного штамма плазмидой, содержащей ген не приводит к RNQ1, восстановлению темпов роста на среде без аденина. Таким образом, как делеция гена RNQ1, так и потеря фактора [PIN+], приводят к резкому ослаблению супрессорного фенотипа. Слабый супрессорный фенотип стабильно наследуется и элиминируется при пассировании на среде с GuHCl (рис. 22). Делеция гена RNQ1, как и потеря фактора [PIN+], не оказывает влияния на рост дрожжей на средах с неферментатируемыми источниками углерода (не представлено). На основании полученных результатов можно заключить, что проявление фактора [NSI+] определяется как минимум двумя компонентами - прионом [PIN+] и ещ одним прионом, который элиминируется GuHCl.

Рисунок 22. Влияние приона [PIN+] на проявление фактора [NSI+]. Анализ роста на среде без аденина до и после пассирования на среде с GuHCl штаммов: 4-1-1D931 [NSI+]; 7-1-1-D931 (дериват штамма [NSI+], с делецией гена RNQ1); 7-1-1D931, трансформированный плазмидой pID130, содержащей ген RNQ1 под контролем собственного промотора.

Наиболее вероятным кандидатом на роль второго детерминанта фактора [NSI+] является белок Swi1. Данные, представленные в разделе 3.1. «Выявление и характеристика прионного фактора [NSI+]» предполагают, что детерминант фактора [NSI+], как и Swi1, имеет ядерную локализацию и регулирует транскрипцию других генов. Более того, мутации в гене SWI1, как и фактор [NSI+], вызывают нарушения споруляции и дефекты роста на средах с неферментируемыми источниками углерода [Nasmyth, 1987; Lohr et al., 1995].

Для проверки влияния приона [SWI+] на поддержание и проявление фактора [NSI+] необходимо делетировать ген SWI1, а затем вновь ввести этот ген в исследуемый штамм. Такой подход приводит к элиминации исследуемого приона и позволяет оценить его возможные эффекты. Мы получили дериват штамма 4-1D931 [NSI+], с делецией гена SWI1. Делеция гена SWI1 в штамме 7-4-1-1-D931 приводит к усилению супрессорного фенотипа и вызывает задержку роста на средах с галактозой и глицерином (рис. 23). Фенотипические изменения, опосредованные делецией гена не элиминируются в результате SWI1, пассирования клеток на среде с GuHCl (не представлено). Последующее введение плазмиды p426GPD–SWI1YFP вызывает полную элиминацию всех проявлений фактора [NSI+] – трансформанты, так же как клетки штамма [nsi-] не растут на средах без аденина и триптофана и не демонстрируют дефектов роста на средах с галактозой (рис. 23). Таким образом, временная инактивация гена SWI1 вызывает элиминацию всех проявлений прионного фактора [NSI+]. Вместе с тем, супрессорный фенотип, характерный для штаммов [NSI+], наблюдается лишь при наличии двух прионов [SWI+] и [PIN+] (см. рисунки 22 и 23).

Рисунок 23. Влияние приона [SWI+] на проявление фактора [NSI+]. Делеция гена SWI1 и последующая трансформация исследуемого штамма плазмидой p426GPDSWI1YFP приводят к элиминации всех проявлений фактора [NSI+].

На основании полученных данных можно заключить, что наблюдаемые наследуемые изменения признаков определяются не неизвестным прионным фактором [NSI+], а зависят от взаимодействия двух прионов [SWI+] и [PIN+]. Мы впервые показали, что взаимодействие прионов, подобно взаимодействию классических генов, вызывает наследуемые изменения признаков.

Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+]3.3.

Для исследования взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] мы решили оценить вклад каждого приона в регуляцию супрессорного фенотипа. Штаммы [swi-][PIN+] и [SWI+][pin-] были получены из исходного штамма [SWI+][PIN+] за счт делеции хромосомных копий генов SWI1 и RNQ1, соответственно, и последующей трансформации штаммов плазмидами, кодирующими данные гены.

Напомним, что временная потеря гена-детерминанта вызывает элиминацию соответствующего приона [Wickner et al., 1999]. Был проведн сравнительный анализ проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG) в клетках штаммов [SWI+][PIN+], [swi-][PIN+], [SWI+][pin-], [swi-][pin-] а также swi1[PIN+].

Полученные результаты представлены на рисунке 24.

В случае анализа супрессии trp1-289 (UAG) какого-либо взаимодействия прионов отмечено не было – рост на среде без триптофана зависит исключительно от приона [SWI+] (рисунок 24). Интересно отметить, что в случае прионизации Swi1 уровень супрессии trp1-289 (UAG) заметно выше, чем в штамме с делецией гена SWI1 (рисунок 24).

При анализа роста исследуемых штаммов на среде без аденина отмечается взаимодействие прионных детерминантов. Слабая супрессия проявления нонсенсмутации ade1-14 (UGA) отмечается в штамме [pin-] [SWI+] (рисунок 24). Сильный супрессорный фенотип характерен для штамма [SWI+][PIN+]. Делеция гена SWI1 вызывает ещ большее усиление супресии мутации ade1-14, чем наличие в штамме прионов [SWI+] и [PIN+]. С точки зрения формальной генетической логики прослеживается следующая схема:

Прионная инактивация белка Swi1 в штаммах [SWI+][pin-] вызывает слабую 1.

супрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA);

На фоне прионизации белка Rnq1 в штаммах [SWI+][PIN+] инактивация Swi1 2.

усиливается, что закономерно приводит к усилению супрессорного фенотипа;

3. Отсутствие белка Swi1 в штаммах swi1 приводит к ещ большей супресии проявления исследуемой нонсенс-мутации.

Описанная схема полностью соответствует классическому типу комплементарных взаимодействий – один наследственный детерминант дополняет влияние другого на проявление признака. Есть только одно отличие

– в нашем случае имеет место не взаимодействие классических генов, а взаимодействие прионов. Такой феномен описан впервые. Как мы показали ранее, снижение эффективности терминации трансляции в исследуемых штаммах определяется прион-зависимым подавлением уровня экспрессии гена SUP45 (рисунок 17). Очевидно, тонкий эффект приона [PIN+] на терминацию трансляции, который детектируется при анализе роста на среде без аденина, не имеет фенотипического проявления при анализе супрессии нонсенс-мутации trp1-289 (UAG).

Рисунок 24. Анализ влияния взаимодействий прионов [SWI+] и [PIN+] на супресиию проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG).

Для проверки гипотезы о влиянии приона [PIN+] на прионные агрегаты белка Swi1 был проведн сравнительный анализ агрегации белка Swi1-YFP в штаммах 1-1-D931 [SWI+][PIN+]), 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931 [swiPIN+] и 1-4-1-1 [swi-][ [pin-] (рис. 25 и таблица 19). Наибольший процент клеток с агрегатами Swi1-YFP отмечен в штамме 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-] (примерно 8%). Примерно такой же процент клеток с агрегатами Swi1-YFP характерен для штаммов [SWI+], описанных ранее [Crow et al., 2011].

Рисунок 25. Агрегация белка Swi1-YFP в штаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+]; 6-1D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931[swi-][ [pin-] <

–  –  –

Этот результат, как и данные делеционного анализа и дифференциального центрифугирования, подтверждает наше заключение о наличии приона [SWI+] в исследуемых штаммах. Важно отметить, что в штамме 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+], который в отличие от штамма 6-1-4-1-1-D931 содержит прион [PIN+], процент клеток с агрегатами Swi1-YFP примерно в два раза ниже (3,5%). С помощью критерия Манна-Уитни мы показали, что наблюдаемые различия статистически значимы (p=0,01). Исходя из полученных результатов, можно заключить, что присутствие приона [PIN+] влияет на прионные агрегаты [SWI+]. Наличие редких агрегатов Swi1-YFP в штаммах 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931 [swipin-] связано с тем, что данный белок на фоне сверхпродукции спонтанно агрегирует в небольшой доле клеток в штаммах [swi-] [Cow et al., 2011]. Различия в уровне нонсенс-супрессии и в частотах агрегации белка Swi1-YFP, которые демонстрируют штаммы [PIN+][SWI+] и [pin-][SWI+], свидетельствуют о том, что прион [PIN+] прямо или опосредованно влияет на прионные агрегаты белка Swi1.

Полученные результаты показывают также, что прионизация Rnq1 и Swi1 приводит к появлению новой функциональной активности этих белков.

Прионизация белка Rnq1 влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект прионных агрегатов [SWI+] на супрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA).

Прионизация Swi1 вызывает супрессию проявления нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), тогда как инактивация этого белка в результате делеции гена SWI1 такого эффекта не вызывает.

Для проверки гипотезы, согласно которой имеет место физическое [PIN+] [SWI+], [PIN+][SWI+] взаимодействие прионов и штамм D955 трансформировали плазмидами pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) и p426GPD–SWI1YFP, кодирующими гибридные белки Swi1-YFP и Rnq1-CFP. Клетки, в которых одновременно присутствовали сигналы, соответствующие белкам Rnq1-CFP и Swi1-YFP, выявлялись с очень низкой частотой. Известно, что сверхпродукция Rnq1 токсична и, по всей вероятности, одновременная сверхпродукция Rnq1-CFP и Swi1-YFP усиливает токсический эффект. Ни в одной из нескольких тысяч проанализированных клеток колокализации агрегатов Rnq1-CFP и Swi1-YFP отмечено не было(рисунок 27).

Ранее в работе других исследователей также было показано, что прионные агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют в штаммах [PIN+][SWI+] [Du and Li, 2014]. Из наших и литературных данных следует, что [PIN+] оказывает не прямое, а опосредованное влияние на прионные агрегаты белка Swi1.

–  –  –

Как мы показали (см. рис. 14), супрессия, наблюдаемая в штаммах [SWI+][PIN+] [NSI+]), обозначенных как приводит к снижению (ранее эффективности терминации трансляции. Снижение эффективности терминации трансляции опосредовано уменьшением уровня экспрессии гена SUP45 (рисунок 17). Поскольку белок Swi1 является транскрипционным регулятором более чем 6% дрожжевых генов [Peterson and Herskowitz, 1992; Burns and Peterson, 1997], эффект его прионной инактивации на уровень экспрессии гена SUP45 и терминацию трансляции вполне объясним, однако остатся загадкой, каким образом на этот процесс влияет прион [PIN+]. Наши и литературные данные свидетельствуют о том, что прионные агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют. Исходя из этого, следует, что белок Rnq1 в прионной конформации приобретает новую функцию и опосредовано влияет на свойства прионных агрегатов [SWI+]. Недавно было показано, что Rnq1 только в прионной изоформе вызывает гиперфосфорилирование белка Pin4 [Yang et al., 2014].

Вполне вероятно, что прионные агрегаты Rnq1 секвестрируют репрессор киназы, которая ответственна за гиперфосфорилирование не только Pin4, но и некоторых других белков, и в частности Swi1. В связи с этим, интересно отметить, что у белка Swi1 выявлено необычно много (двенадцать) потенциальных сайтов фосфорилирования (http://www.yeastgenome.org).

Полученные данные позволяют сформулировать концепцию, согласно которой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другими компонентами протеомной сети, могут вызывать наследуемые изменения признаков. По аналогии с признаками, наследование которых контролируется одним или несколькими генами, можно утверждать, что существуют признаки, проявление которых контролируется прионизацией одного белка, или взаимодействием различных прионов.

Несмотря на то, что взаимодействия прионов можно описать в рамках традиционной классификации взаимодействий генов, мы не можем согласиться с авторами, которые предлагают рассматривать прионы в качестве генов или «белковых генов» [Chernoff, 2001; Wickner et al., 2004]. Ген представляет собой единицу наследственного материала, кодирующую одну макромолекулу. Прион, несомненно, является матрицей, кодирующей наследственную информацию о конформации белка [Инге-Вечтомов, 2013], но он не кодирует молекулу белка, а лишь изменяет е конформацию и функциональную активность. Как было показано ранее, прионизация приводит к тем же последствиям, что и мутации [Chernoff, 2001]. Разница заключается в том, что мутация приводит к изменению самого гена, а прионизация вызывает наследуемое изменение генного продукта.

На основании приведнных рассуждений мы приходим к заключению, что прион не является геном, поскольку не кодирет макромолекулу, а вызывает изменение е свойств.

Когда мы говорим о взаимодействии генов, то на самом деле речь идт о взаимодействии генных продуктов (в нашем случае белков). Исходя из этого, становится понятным, почему взаимодействие прионов приводит к таким же последствиям, как взаимодействие классических генов. Мы показали, что прионы [SWI+] и [PIN+] демонстрируют комплементарное взаимодействие по отношению к признаку «супрессия нонсенс-мутации ade1-14(UGA)». Теоретически можно предсказать, что прионы могут взаимодействовать также по типу эпистаза и различных вариантов полимерии.

Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных 3.4.

агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей Наш метод протеомного скрининга был успешно использован для идентификации глутамин-аспарагин обогащнных дрожжевых белков, формирующих прионные агрегаты. Мы предположили, что данный метод может служить универсальным инструментом для выявления различных амилоидов у любых организмов. Для проверки этой гипотезы мы оценили возможность выявления агрегатов PrP и A млекопитающих с помощью метода PSIA при продукции этих белков в дрожжах S. cerevisiae. Ранее было показано, что белки PrP и A агрегируют в дрожжах, и агрегаты PrP, подобно полимерам PrPSc в мозге млекопитающих, демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработке протеиназой К [Ma and Lindquist, 1999].

Штамм BY4742 [PIN+] трансформировали плазмидами PGPD-PrP90-231GFP(URA3) и PGPD-A-GFP(URA3), продуцирующими гибридные белки PrP(90GFP и A40-GFP под контролем промотора GPD. Поскольку прион [PIN+] уверенно идентифицируется методом PSIA (см. раздел «Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»), сигнал, соответствующий белку Rnq1, может служить положительным контролем. В качестве отрицательного контроля использовали [pin-] дериват штамма BY4742, трансформированный плазмидой pRS316CG, продуцирующей белок GFP под контролем промотора CUP1. Фракции, содержащие белковые агрегаты, устойчивые к обработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, были выделены и очищены из опытных и контрольных образцов как описано в разделе «Материалы и методы». Для удобства демонстрации полученных результатов, была использована модификация метода PSIA, включающая двумерный электрофорез белков, окрашенных флуорохромами. Белки из «опытных» образцов, содержащих белки A-GFP или PrP(90-231)-GFP, окрашивали флуорохромом Cy5 (красный), а белки из контрольного образца зелным флуорохромом Cy3. Белки A-GFP и PrP(90GFP были выявлены во фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке 3% саркозинатом натрия (рис. 28; таблица 20), но не обнаружены при обработке белковых лизатов 1% SDS (не представлено).

Рисунок 28. Изображения двумерных гель-электрофорезов белков, выделенных методом из штамма трансформированного плазмидами, PSIA BY4742, продуцирующими белки A-GFP (А) и PrP(90-231)-GFP (Б) и из его деривата [pin-]. Белки, выделенные из штамма BY4742 [PIN+] и его деривата [pin-], метили флуорохромами Cy5 и Cy3, соответственно.

Эти результаты соответствуют ранее полученным данным, согласно которым амилоидные конформеры пептида A устойчивы к обработке саркозинатом, но растворимы в SDS [Coalier et al., 2013]. На основании представленных результатов можно заключить, что разработанный метод достаточно универсален и может быть использован для идентификации различных белков, формирующих амилоидные полимеры.

Таблица Идентификация методом масс-спектрометрии белков, 20.

формирующих агрегаты устойчивые к обработке саркоазинатом натрия, в штаммах BY4742 / PGPD-A-GFP(URA3) и BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFP

–  –  –

Независимо от нас был разработан сходный подход для идентификации прионов и амилоидов [Kryndushkin et al., 2013]. Так же как и мы, авторы обрабатывали белковый лизат додецилсульфатом натрия при комнатной температуре, но затем не отделяли детергент устойчивые агрегаты от прочих амилоидов ультрацентрифугированием, а разделяли белковую смесь в агарозном геле. На заключительном этапе белковые полимеры выделяли из геля и идентифицировали при помощи HPLC-MALDI [Kryndushkin et al., 2013]. Данный подход, как и разработанный нами метод, позволил выявлять SDS-устойчивые агрегаты дрожжевых прионов [PSI+] и [PIN+], однако прионные агрегаты Sup35 и Rnq1 выявлялись не во всех исследованных штаммах [PSI+] и [PIN+]. Метод, описанный в этой статье, также не позволяет выявлять SDS-чувствительные амилоиды, подобные тем, которые образуют химерные белки A-YFP и PrP-CFP.

Мы считаем, что наш метод значительно превосходит описанный аналог по ряду параметров.

Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo 3.5.

амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом A в дрожжах S. cerevisiae Как было отмечено в разделе «Обзор литературы», белок PrP и пептид A взаимодействуют друг с другом лишь в том случае, когда один из партнров представлен в амилоидной конформации [Morales et al., 2010]. Взаимодействие олигомеров A с мономерами PrPC, по всей видимости, способствует гибели нейронов в случае болезни Альцгеймера [Lauren et al., 2009; Kudo et al., 2013].

Это взаимодействие хорошо изучено и выявлены короткие последовательности PrP23–30аа и PrP95–110аа, ответственные за связывание патологических олигомеров A с мономерами PrP [Lauren et al., 2009; Chen et al., 2010].

Поскольку взаимодействие PrP с A зависит от конформационных изменений этих белков, следует ожидать, что за физическое взаимодействие агрегатов PrPSc с A отвечают иные последовательности. Мы исследовали взаимодействие агрегатов PrP с пептидом A в дрожжевой модельной системе.

Для анализа агрегации амилоидогенных белков млекопитающих в дрожжах штамм BY4742 трансформировали плазмидой pGPD-A-YFP(URA3), содержащей гибридный ген A-YFP, а также плазмидами pGPD-PrP23-231-CFP(LEU2), pGPDи PrP28-231-CFP(LEU2) pGPD-PrP90-231-CFP(LEU2) pGPD-PrP110-231-CFP(LEU2), содержащими различные фрагменты PrP, слитые с последовательностью, кодирующей CFP. С помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии мы показали, что A-YFP образует цитологически детектируемые агрегаты в дрожжевых клетках (рис. 29). Все гибридные белки, содержащие полноразмерный PrP (PrP23-231-CFP) и его различные делетированные производные (PrP28–231CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP), также агрегировали в дрожжах (рис.29).

Рисунок 29. Агрегация гибридных белков A-YFP, PrP23-231-CFP, PrP28–231CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP в клетках штамма BY4742. Все исследуемые белки образуют цитологически детектируемые агрегаты в клетках дрожжей. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду, продуцирующую белок CFP, который равномерно распределн в цитоплазме.

Мы показали, что агрегаты PrP23–231-GFP и A-GFP локализованы в цитоплазме дрожжевых клеток и не колокализуются с ядром, вакуолями, эндосомами и липидными включениями (рис. 30). Ранее были опубликованы данные, согласно которым A–GFP колокализуется с липидными включениями в клетках дрожжей [Caine et al., 2007]. В этой работе авторы использовали флуоресцентный краситель «Нильский красный». Мы использовали краситель «Судан чрный», поскольку, как мы показали, флуоресценция «Нильского красного» детектируется как при использовании фильтра RFP, так и GFP, даже в клетках, которые не содержат химерный белок A–GFP. Таким образом, можно заключить, что A-GFP не колокализуется с липидными включениями в клетках дрожжей, по крайней мере в штамме BY4742.

Рисунок 30. Сравнительный анализ локализации агрегатов PrP23–231-GFP и AGFP с различными клеточными компартментами и липидными включениями.

Вакуолярная мембрана (красный цвет) окрашена красителем FM4–64, эндосома (синий) красителем Liso-tracker Blue, ядро и митохондрии (синий цвет) выявляли за счт использования ДНК-специфичного красителя DAPI. Липидные включения окрашивали красителем Судан чрный (чрный цвет).

Методом дифференциального центрифугирования и иммуноблотинга с использованием антител, распознающих последовательности GFP, YFP и CFP, мы подтвердили, что белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110– 231-CFP и A-YFP формируют в дрожжевой клетке высокомолекулярные нерастворимые агрегаты, которые детектируются в основном в осадочной фракции “Pellet”, тогда как белок CFP выявляется исключительно в растворимой фракции (рис. 31А).

Для оценки амилоидных свойств исследуемых белков мы охарактеризовали устойчивость агрегатов к обработке ионными детергентами и протеиназой К. С помощью метода полуденатурирующего электрофореза с использованием антител Ab502604, специфичных к PrP, мы показали, что все исследуемые белки формируют агрегаты, устойчивые к 3% саркозинату натрия (рис. 31Б), но не к 1% SDS (результат не представлен). Более того, после обработки гибридных белков PrP-CFP протеиназой К, в концентрации 50 µg/ml интактным остатся фрагмент размером 19-20 KDa (рис. 31В). Такой же фрагмент, размером 19-20 KDa, соответствующий последовательности PrP(90-231), был выявлен раньше при продукции белка PrP(23-231) в мозге больных млекопитающих и в клетках S.

cerevisiae [Ma and Lindquist, 1999]. Белок A-YFP также демонстрирует высокий уровень устойчивости к обработке протеиназой К, но, в отличие от вариантов PrPCFP, не фрагментируется, а сохраняется полноразмерным (рис. 31В).

На основании полученных результатов можно заключить, что исследуемые белки (PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и AYFP) при продукции в дрожжах демонстрируют амилоидные характеристики.

Рисунок 31. Белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231CFP и A-YFP демонстрируют амилоидные характеристики при продукции в клетках дрожжей. А – анализ агрегации исследуемых белков методом дифференциального центрифугирования. Белковые лизаты были разделены центрифугированием (12,000 g) на растворимую (S – soluble) и нерастворимую (P

– pellet) фракции, после электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали с использованием антител Ab-13970, специфичных к YFP (CFP). Б – Выявление детергент устойчивых полимеров исследуемых белков методом полуденатурирующего электрофореза. Белковый лизат инкубировали 10 мин при RT с 3% саркозинатом натрия, белки детектировали с использованием антител Ab-13970. В - Анализ устойчивости исследуемых белков к обработке протеиназой К в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля показано, что белок CFP деградирует при использовании низкой концентрации протеиназы К.

Для анализа взаимодействия агрегатов PrP с пептидом A штамм BY4742 был котрансформирован попарно плазмидой pGPD-A-YFP(URA3) и одной из плазмид, продуцирующих химерные белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP. Частоты колокализации оценивали с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. При подсчте частот колокализации учитывали клетки, которые одновременно содержали агрегаты PrP-CFP, и сигналы, соответствующие A-YFP. Агрегаты PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP и PrP90–231-CFP колокализовались с гибридным белком A-YFP с высокой частотой (от 75 до 85% агрегатов, содержащих фрагменты PrP, имели общую локализацию с A-YFP) (рис. 32). Частота колокализации агрегатов PrP110–231CFP с белком A-YFP примерно в пять раз ниже (около 17%) (рис. 32).

Рисунок 32. Анализ колокализации агрегатов белков PrP23–231-CFP, PrP28–231и с белком методом CFP, PrP90–231-CFP PrP110–231-CFP A-YFP флуоресцентной конфокальной микроскопии. А- фотографии клеток, копродуцирующих исследуемые белки. Б – Диаграмма, отражающая частоты колокализации исследуемых белков. Указаны достоверные различия (p 0,05) и ошибка среднего.

Физическое взаимодействие агрегатов гибридных белков PrP-CFP с A-YFP исследовали с помощью метода AB FRET (Acceptor Photobleaching Fluorescence Resonance Energy Transfer). Метод AB FRET основан на том, что при облучении донора (CFP) перенос энергии к реципиентной молекуле (YFP) происходит лишь в том случае, когда расстояние между этими молекулами составляет менее 10нм.

Детекция переноса энергии методом AB FRET свидетельствует о физическом взаимодействии исследуемых белков. Клетки, копродуцирующие PrP23–231-CFP с PrP23–231-YFP, а также PrP23–231-CFP с YFP, были использованы в качестве позитивного и негативного контроля, соответственно. Наибольший показатель AB FRET (11.5%) отмечен в клетках, используемых в качестве положительного контроля и копродуцирующих белки PrP23–231-CFP и PrP23–231-YFP (рис. 33).

Рисунок 33. Сравнительный анализ физического взаимодействия агрегатов белков PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP с белком A-YFP методом AB-FRET. Указаны достоверные различия (p 0,05) и ошибка среднего.

Эффективность AB FRET в клетках, ко-продуцирующих белки PrP23–231CFP и A-YFP, а также PrP28–231-CFP и A-YFP, составляет примерно 6%, тогда как этот показатель в клетках содержащих белки PrP90–231-CFP и A-YFP или PrP110–231-CFP и A-YFP был значительно ниже и не отличался от негативного контроля (рис. 33). Таким образом, фрагмент PrP28-89 необходим для физического взаимодействия агрегатов PrP с пептидом A.

В результате работы был выявлен интересный парадокс – агрегаты PrP90– 231-CFP с высокой частотой колокализуются с белком A-YFP (рис. 32), тогда как физическое взаимодействие не детектируется (показатели AB FRET не отличаются от негативного контроля) (рис. 33). Для объяснения этого парадокса мы предложили гипотезу, согласно которой агрегаты PrP90–231-CFP не связывают мономеры A, а взаимодействуют лишь с агрегатами этого пептида (смотри схему на рис. 34 и описание схемы).

Поскольку колокализация отмечается в клетках, продуцирующих белки PrP90–231-CFP и A-YFP, но не PrP110–231-CFP и A-YFP, следует полагать, что короткая последовательность PrP90-109 играет важную роль в связывании амилоидными конформерами PrP агрегатов A, но не мономеров этого пептида.

Метод AB FRET позволяет детектировать перенос энергии при взаимодействии агрегатов PrP с мономерами A, но при связывании предсуществующих агрегатов A-YFP среднее растояние между молекулами PrP и A оказывается больше 10нм и перенос энергии не детектируется.

Рисунок 34. Схема, объясняющая противоречие между высокими частотами колокализации и низкими показателями FRET при анализе взаимодействия агрегатов PrP(90-231) с пептидом A. Агрегаты PrP(23-231) способны связывать как агрегаты, так и мономеры A. В случае делеции последовательности PrP(23агрегаты PrP(90-231) могут связывать лишь агрегаты, но не мономеры A. В этом случае среднее расстояние между молекулами PrP(90-231) и A оказывается больше 10нм, в результате чего показатели FRET не отличаются от отрицательного контроля.

На основании результатов, представленных в этом разделе, можно сделать вывод, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной и адекватной моделью для исследования агрегации и физического взаимодействия гетерологичных амилоидных белков in vivo.

166

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе данные дополняют теорию белковой наследственности. Согласно этой теории, изменение конформации белка может поддерживаться автокаталитически и вызывать наследуемые изменения признаков у микроорганизмов. Иными словами, наследуемые изменения могут возникать без каких-либо мутаций в последовательности нуклеиновых кислот.

Наши результаты позволяют предложить концепцию, согласно которой не только прионизация одного белка, но и функциональное взаимодействие различных прионов вызывает наследуемые изменения признаков. Более того, мы показали, что взаимодействия прионов могут быть описаны в рамках традиционной классификации генных взаимодействий. В отношении признака «супрессия нонсенс-мутации ade1-14 (UGA)» прионы [PIN+] и [SWI+] демонстрируют комплементарное взаимодействие – прион [PIN+] усиливает (дополняет) действие приона [SWI+] на исследуемый признак. Согласно нашим результатам, взаимодействия прионов, как и взаимодействия генов, не обязательно предполагают физическое связывание генных продуктов, а может быть опосредовано дополнительными компонентами протеомных сетей. Более того, с учтом наших и литературных данных об отсутствии физического связывания различных прионов одновременно представленных в клетках дрожжевых штаммов, можно предсказать, что будущие исследования приведут к выявлению не физического, а функционального взаимодействия прионов.

Суммируя полученные данные можно заключить, что сквозное прочтение преждевременного стоп-кодона ade1-14 (UGA) определяется снижением уровня продукции белка Sup45 (рисунок 17) на фоне прионизации белков Swi1 и Rnq1.

Гипотетическая схема, отражающая эффекты прионов [SWI+] и [PIN+] на супрессорный фенотип, представлена на рисунке 35.

Вероятно, Swi1, являясь глобальным транскрипционным регулятором, позитивно регулирует уровень транскрипции гена SUP45. Прионная инактивация Swi1 в штаммах [SWI+][pin-] вызывает слабый супрессорный фенотип (рисунок 24). [PIN+] опосредованно (возможно, за счт активации фосфорилирования) усиливает инактивацию белка Swi1 в штаммах [PIN+][SWI+], что способствует снижению уровня продукции Sup45. Уменьшение уровня продукции белка Sup45 приводит к снижению эффективности терминации трансляции (рисунок 14) и вызывает усиление супрессорного фенотипа.

Рисунок 35. Влияние прионов [SWI+] и [PIN+] на супрессию нонсенс-мутации ade1-14 (UGA). Красная стрелка отражает позитивный эффект белка Swi1 на экспрессию гена SUP45. Этот эффект снижается в результате прионизации белка Swi1 (синяя стрелка), и ещ менее выражен в присутствии приона [PIN+] (чрная штрихованная стрелка). «Х» - компонент (или компоненты) протеомной сети, определяющие [PIN+]-зависимую модификацию прионной формы белка Swi1.

- Swi1-зависимая позитивная регуляция транскрипции гена SUP45 (число стрелок отражает уровень эффективности регуляции транскрипции).

Отметим, что описанное в нашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] принципиально отличается от ранее охарактеризованных белковых [GAR+]. [GAR+] взаимодействий, вызывающих возникновение приона представляет собой единственный известный прион, который детерминируется двумя или несколькими белками [Brown and Lindquist, 2009]. Однако, важно отметить принципиальные различия между прионным фактором [GAR+] и феноменом, описанным в нашей работе – наблюдаемая нами супрессия нонсенсGAR+] мутации детерминируется двумя прионами, тогда как прион предположительно определяется взаимодействием белков Pma1 и Std1, [Brown and Lindquist, 2009]. В отличие от Swi1 и Rnq1, белки Pma1 и Std1не формируют независимых прионов.

В ходе работы мы охарактеризовали не только новое проявление прионов [PIN+] и [SWI+] (их совместное влияние на нонсенс-супрессию), но и показали, что прионная конверсия белков Rnq1 и Swi1 приводит к появлению новой функциональной активности этих белков. Белок Rnq1 только в прионной форме влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект приона [SWI+] на супрессию нонсенс-мутации ade1-14 (UGA). Прионизация Swi1, в свою очередь, вызывает супрессию нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), и эта функция не зависит от инактивации Swi1.

Мы разработали и успешно апробировали метод PSIA, позволивший идентифицировать прионные белки, взаимодействие которых определяет изменения признака, а также выявить ряд белков, являющихся кандидатами на роль конститутивных дрожжевых амилоидов. Амилоидные свойства агрегатов одного из выявленных кандидатов, а именно белка клеточной стенки Gas1, подтверждены с помощью других методов (рис. 20). Метод PSIA достаточно универсален, поскольку позволил выявить агрегаты ранее охарактеризованных прионов [PSI+], [PIN+] и [SWI+], амилоидные полимеры белка клеточной стенки дрожжей Bgl2, а также агрегаты белков млекопитающих PrP и A. Поскольку генетические подходы применимы лишь для выявления прионов, обладающих фенотипическим проявлением, разработанный нами метод впервые позволяет оценить масштабность прионного феномена у исследуемых организмов.

Теоретически можно было ожидать, что помимо уже охарактеризованных прионов в дрожжевых клетках могут присутствовать прионные конформеры других белков, агрегация которых не вызывает видимых эффектов. Из полученных результатов по исследованию протеома различных штаммов дрожжей можно сделать вывод, что прионизация является редким событием.

Выявление списка кандидатов на роль дрожжевых функциональных амилоидов открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.

Важно отметить, что возможность применения метода PSIA не ограничивается единственным объектом. В настоящее время этот метод уже используется для поиска функциональных и патологических амилоидов в клетках дрожжей и бактерий, а также в мозге млекопитающих.

Более того, как показали наши коллеги из лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна, метод PSIA перспективен и для исследования взаимодействия прионов и амилоидов. Используя этот метод, удалось выявить шесть белков, агрегация которых индуцируется в результате сверхпродукции в клетках дрожжей мутантной последовательности белка Htt человека. Важно отметить, что пять из этих шести белков содержат глутаминаспарагин обогащнные последовательности, т.е. сходны по аминокислотной последовательности с Htt и являются потенциально амилоидогенными. Эти данные представлены в нашей совместной статье [Nizhnikov et al., 2014].

Поскольку амилоидогенез является автокаталитическим процессом, на который влияет небольшое количество дополнительных факторов, многие вопросы, возникающие при исследовании агрегации и взаимодействия амилоидов, могут быть решены за счт использования адекватных модельных систем. Мы показали, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной моделью, предоставляющей уникальные преимущества для исследования взаимодействий гетерологичных амилоидов in vivo. Белки PrP и A при продукции в дрожжах формируют агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами в

–  –  –

Подводя итоги, отметим наиболее значимые результаты работы. Показано, что взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков.

Установлено, что функциональное взаимодействие прионов, может быть описано в рамках традиционной классификации генных взаимодействий.

Охарактеризовано новое проявление и новая функциональная активность прионов [PIN+] и [SWI+]. Разработан метод PSIA, позволяющий выявлять прионы и амилоиды в масштабах протеома. Этот метод может быть использован для выявления функциональных и патологических амилоидов различных организмов.

Использование данного метода впервые позволило на основании экспериментальных данных составить список белков-кандидатов на роль функциональных амилоидов в дрожжах S. cerevisiae. Показано, что использование дрожжей в качестве модельной системы предоставляет уникальные преимущества для анализа взаимодействий гетерологичных амилоидов in vivo.

171

ВЫВОДЫ:

1. Взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков:

взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] приводит к изменению эффективности терминации трансляции.

2. Прионизация Rnq1 и Swi1 вызывает появление новой функциональной активности этих белков: [PIN+] изменяет свойства прионных агрегатов [SWI+], а прионизация Swi1 вызывает супрессию нонсенс-мутации trp1UAG).

3. Разаботан и апробирован метод протеомного скрининга амилоидов, позволяющий выявлять и идентифицировать прионы и амилоиды различных организмов.

4. Выявлены белки, которые формируют детергент-устойчивые агрегаты в клетках дрожжей и являются кандидатами на роль функциональных амилоидов.

5. Дрожжи S. cerevisiae являются адекватной моделью, предоставляющей уникальные преимущества для исследования взаимодействия гетерологичных амилоидогенных белков - в дрожжевой модельной системе выявлены короткие последовательности прионного белка млекопитающих, определяющие специфичность взаимодействия агрегатов PrP с пептидом A.

172

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |
 

Похожие работы:

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.