WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...»

-- [ Страница 4 ] --

9. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок тщательно суспендировали в 1 мл буфера ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT), доводили объм до 5.4 мл. и добавляли 0.6мл 10% раствора SDS (конечная концентрация 1% SDS). Альтернативно, в других экспериментах вместо 1% SDS использовали саркозинат натрия в конечной концентрации 3%. Аккуратно перемешивали, не допуская образования пены.

10. Пробы наслаивали на 2 мл подушки (25% сахароза в буфере TBS). Пробирки устанавливали в ротор Ti75 ультацентрифуги и включали режим «отложенный старт». Таким образом, пробы инкубировались 4-6 часов при температуре 18оС.

11. Центрифугировали пробы 8ч., 223 600g при 4oC в пробирках для ротора Ti75.

12. Полученный осадок детергент-устойчивых белковых агрегатов суспендировали в 8мл воды и вновь центрифугировали при тех же условиях.

13. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC (при необходимости дольше).

14. В случае разделения белков с помощью двумерного электрофореза осадок растворяли в хаотропных агентах (смотри раздел «Двумерный разностный электрофорез белков»). В случае использования методики “HPLC – MALDI” осадок растворяли в 100 мкл 96%муравьиной кислоты. Если осадок не растворялся, увеличивали объем муравьиной кислоты. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре.

15. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC.

16. Осадок суспендировали в 90 мкл воды, добавляли 30 мкл буфера (100mM TrisHCL-6.8, 20% меркаптоэтанол, 10% SDS, 0.2% бромфеноловый синий, 40% глицерин) и кипятили белки 10мин при 100оС.

2.8.2. Разделение и идентификация белков 2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE) Белки растворяли в регидратирующем буфере (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат (ХАМПс), 25 мМ Трис, рН 8,5) и коньюгировали с флурохромами Cy5 (опытный образец) или Cy3 (контрольный образец) (Luminoprobe, BioDye) в соотношении 400 пмоль флуорохрома на 50 мкг белка. Концентрацию белка оценивали по величине поглощения при длине волны 280 нм. Образцы инкубировали с флуорохромами на льду в течение 30 мин. в темноте. Реакцию останавливали добавлением 10 мкмоль L-лизина с последующей инкубацией в течение 10 мин.

при тех же условиях, затем белки центрифугировали 2500g, 10 мин. Растворнные белки, меченные разными флуорохромами, объединяли и загружали в стрип с градиентом рН 3-10 (7 см, BioRad, США). Процесс загрузки был сопряжен с пассивной регидратацией стрипа (16-18 ч. при комнатной температуре в темноте).

Разделение первого направления проводили в ячейке для изоэлектрического фокусирования (Protean IEF Cell, BioRad), следуя рекомендациям производителя (10000 Вольт-часов, финальное напряжение 4000 В, 20°C, ток не более 25 мА/стрип).

Перед разделением второго направления стрипы с фокусированными образцами последовательно инкубировали по 15 мин. в эквилибрирующих буферах: первом (6 M мочевина, 2% додецил-сульфат натрия, 20% глицерин, 2% дитиотреитол, 0,375 M Трис, pH 8,8) и втором, где дитиотреитол заменен на 2,5% иодоацетамид. Электрофорез второго направления проводили в ячейке MiniProtean TetraCell (BioRad) в 15% полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (tris/glycine/SDS buffer, BioRad) при напряжении 200 В. Для визуализации электрофоретической картины использовали лазерный сканнер GE Typhoon FLA 9500. Наложение электрофореграмм проводили в программном обеспечении ImageJ версии 1.48v (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA, http://imagej.nih.gov.ij). Гель окрашивали кумасси G250 (Coomassie Brilliant Blue R250, BioRad). Пятна окрашенные кумасси G250 и соответствующие сигналам, выявленным при лазерном сканирования вырезали из геля.

2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE

Идентификацию белков, вырезанных из SDS-PAGE геля, проводили при помощи матрично-ассоциированной лазерной дисорбционно-ионной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI) на приборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Кусочки геля отмывали деионизованной водой и 40% ацетонитрилом в 50 мМ бикарбонате аммония. Далее проводили дегидратацию в 100% ацетонитриле с дополнительным высушиванием на вакуумном концентраторе (Labconco). К высушенным фрагментам геля добавляли 10 мМ раствор дитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали смесь (45 мин., 56°С). Смесь охлаждали, удаляли жидкость и добавляли раствор 55 мМ йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 30 мин. при комнатной температуре в темноте, далее добавляли 1 мкл раствора дитиотрейтола для инактивации йодацетамида и высушивали пробы на вакуумном концентраторе (Labconco). К высушенным кусочкам геля добавляли 5 мкл раствора трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Трипсин инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты, затем экстрагировали пептиды из геля 2%, 25% и 50% раствором йодацетамида с 50 мМ бикарбонатом аммония, проводя три последовательные инкубации в ультразвуковой бане по 10 минут. Далее пробы осаждали в течение 30 мин. (20000 g, 4°С) и высушивали на вакуумном концентраторе (Labconco).

Далее к высушенным образцам добавляли 5 мкл 0,1% раствора трифторуксусной кислоты и наносили их на 384-луночную подложку MTP AnchorChip™ 800/384 В качестве матрицы была использована -циано-4Bruker Daltonics).

гидроксикоричная кислота. При анализе пиков было использовано программное обеспечение flexAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Белки идентифицировали при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2 (Matrix Science, с использованием базы данных http://www.matrixscience.com) NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве допустимых модификаций были установлены карбоксиметилирование цистеина и частичное окисление метионина. Также в качестве допустимого было указано два пропущенных сайта трипсинолиза.

Показатель «счт масс-спектрометрии», отражающий достоверность идентификации белка, прибор автоматически определяет по адаптированному алгоритму «MOWSE», представленному в базе данных “Mascot database” (http://www.matrixscience.com/help/interpretation_help.html#SCORING). Показатель «счт масс-спектрометрии» отражает:

количество пептидов в последовательности идентифицированного белка, 1.

масса которых совпадает с массой пептидов, выявленных в анализе;

точность совпадения массы выявленных пептидов с теоретически 2.

ожидаемым показателем.

Счт масс-спектрометрии существенно повышает выявление уникальных пептидов, характерных только для одного белка в исследуемом протеоме. Счт превышающий 50 условных единиц как правило свидетельствует о достоверной идентификации белка на 5% уровне значимости (p0.05).

2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI) Удаление детергентов и обессоливание проб проводили при помощи колонок HiPPR Detergent Removal column (Thermo Scientific) и Zeba Desalting column (Thermo Scientific), соответственно, согласно протоколу производителя. К полученным пробам (50 мкл, концентрация тотального белка 0,2 мг/мл) добавляли 1 мкл свежеприготовленного раствора 50 мМ дитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 15 минут при 50°С, после чего добавляли 1 мкл 100 мМ раствора йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали пробу в течение 15 мин., 20°С в темноте. Далее к пробам добавляли 1 мкл дитиотрейтола для инактивации йодацетамида, 5 мкл трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и проводили инкубацию при 37°С в течение ночи. Трипсин 102 инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты, после чего проводили центрифугирование в течение 30 мин. (20000 g, 4°С).

Полученные смеси пептидов наносили (1 мкл) на обратнофазовую колонку для HPLC Acclaim™ PepMap 300 (150 мм 75 мкм, размер частиц 5 мкм, Thermo Scientific) и разделяли в градиенте ацетонитрила (2-90%) в течение 45 мин. на высокоэффективном нанопоточном жидкостном хроматографе UltiMate 3000 UHPLC+ RSLCnano (Dionex). Фракции пептидов наносили на 384-луночную подложку 800/384 (Bruker с помощью MTP AnchorChip™ Daltonics) автоматического коллектора фракций «Proteineer fc II» (Bruker Daltonics) через каждые 10 с. В качестве матрицы была использована -циано-4-гидроксикоричная кислота. В качестве стандартов использовали Peptide calibration standard II Идентификацию проводили на 8222570 (Bruker Daltonics).

приборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Для каждой фракции определяли MSспектр. Полученные спектры анализируются при помощи программного обеспечения WARP-LC с учетом того, что они получены в результате жидкостной хроматографии. Программа определяет набор уникальных пептидов, характеризующихся задержкой, зарядом и молекулярной массой. Для этих пептидов проводили MS/MS в тех фракциях, где концентрация (интенсивность пика) этих пептидов максимальна. Соответствие полученных спектров белкам определялось при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2.

Показатель «счт масс-спектрометрии», отражающий достоверность идентификации белка, определялся как описано в разделе 2.8.2.2.

Статистические методы 2.9.

Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили при помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0. (“StatSoft Inc.”, США).

103

–  –  –

Эпигенетичесикй детерминант, вызывающий нонсенс-супрессию, был выявлен при работе с дрожжевым штаммом 1-D931 (таблица 4), маркированным нонсенсмутациями ade1-14 и trp1-289 и содержащем плазмиду pU-A-SUP35MC на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35. Гибридный ген A-SUP35MC содержит последовательность, кодирующую амилоидный пептид бета человека, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей домены М и С белка Sup35. Ген ASUP35MC находится под контролем промотора CUP1, который активируется добавлением ионов меди в питательную среду. Эффективность терминации трансляции оценивали в соответствии с темпами роста штамма на среде без аденина и без триптофана, что отражает частоты ошибочного прочтения стопкодонов ade1-14(UGA) или trp1-289 (UAA), как значащих (рис.10 А и Б).

Как видно из результатов, представленных на рисунке 10А, темпы роста штамма на среде без аденина закономерно снижаются при увеличении концентрации ионов меди в питательной среде, и, соответственно, с увеличением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC. Относительное количество белка A-Sup35MC в клетках штамма 1-D931 при изменении концентрации ионов меди в среде оценивали методом Вестерн-блот гибридизации с использованием моноклональных антител 4G8, специфичных к пептиду А (рис. 10А). При добавлении в среду 150 µМ сульфата меди штамм 1-D931 на среде без аденина и без триптофана не растт (рис.10А и Б).

Рисунок 10. Характеристика нонсенс-супрессорного фенотипа штамма 1-D931 и его деривата 1-1-D931, которые продуцируют гибридный белок A-Sup35MC. АРост штамма 1-D931 на среде без аденина с добавлением сульфата меди в различной концентрации. Результаты Вестерн-блот гибридизации с использованием антител 4G8 отражают изменение уровня продукции белка ASup35MC. Б – Рост штамма 1-1-D931 на средах без аденина и без триптофана с добавлением 150 µМ сульфата меди до и после пассирования клеток на среде с GuHCl. В – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC в клетках штаммов 1-D931 и 1-1-D931 методом Вестерн-блот гибридизации. Выравнивание количества тотального белка в обоих случая (1А и 1В) проводилось с помощью метода Бредфорда [Bradford, 1976].

В результате отбора индивидуальных колоний мы выявили один клон, обозначенный 1-1-D931, демонстрирующий нонсенс-супрессорный фенотип при добавлении в питательную среду даже 150 µМ сульфата меди (рис 10Б).

Супрессия проявления нонсенс-мутаций ade1-14(UGA) и trp1-289 (UAG) не была связана с изменением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC (рис 10В). Нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследовался в митозе и элиминировался в результате пассирования клеток исследуемого штамма на среде с 5mM хлоридом гуанидина (GuHCl) у 124 из 128 клеток (97%) (рис 10Б).

Напомним, что GuHCl инактивирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 и вызывает элиминацию большинства известных дрожжевых прионов [Tuite et al., 1981;. Derkatch et al., 1997; Wickner, 1994]. На основании этих фактов мы заключили, что нонсенс-супрессия в штамме 1-1-D931 детерминируется эпигенетическим фактором, который мы назвали [NSI+] (Nonsense Suppression Iducer). Штаммы, не содержащие этот фактор, были обозначены [nsi-].

Анализ роста штаммов на средах с неферментируемыми источниками углерода показал, что наличие фактора [NSI+] ингибирует рост штаммов на средах, содержащих в качестве источника углерода галактозу или глицерин (рис.

11). Элиминация фактора [NSI+] в результате пассирования штамма на среде с GuHCl приводит к восстановлению нормальных темпов роста дрожжей на средах с неферментируемыми источниками углерода (рис. 11).

Рисунок 11. Фактор [NSI+] вызывает нонсенс-супрессию и подавление роста на средах с неферментируемыми источниками углерода. Рост штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на средах MD без добавления аденина и триптофана, а также на средах с галактозой (MG) и глицерином (MGly) в качестве источника углерода. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC во все используемые среды добавляли 150 М сульфата меди. Фотографии сделаны на третий день инкубации дрожжей на селективных средах при 30oC.

3.1.2. A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]

Пептид А человека как в организме млекопитающих, так и при продукции в дрожжевых клетках, может формировать агрегаты [Bagriantsev and Liebman, 2006; Porzoor and Macreadie, 2013]. Для проверки гипотезы, согласно которой фактор [NSI+] возник в результате прионной конверсии гибридного белка ASup35MC, мы провели сравнительный анализ агрегации этого белка в штаммах [NSI+] и [nsi-], используя метод дифференциального центрифугирования и Вестерн-блот гибридизации. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC здесь и во всех дальнейших экспериментах во все используемые среды добавляли 150 М сульфата меди. Как в штамме [NSI+], так и в штамме [nsi-] большая доля белка A-Sup35MC представлена в растворимой надосадочной фракции (рис.12 А).

Рисунок 12. Гибридный белок A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]. А – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC методом Вестерн-блот гибридизации с использованием антител “Anti-Sup35C”, распознающих последовательность Sup35MC. Для выравнивания количества тотального белка использовался метод Бредфорда. Б – Рост дрожжей на среде без аденина в эксперименте с последовательной заменой плазмид в штамме [NSI+].

Плазмиду pL-Ab-SUP35MC замещали на плазмиду pYCH-U2, а затем проводили обратную замену плазмид.

Распределение белка между надосадочной и осадочной фракциями не различается. Таким образом, полученные результаты не подтверждают гипотезу о том, что возникновение фактора [NSI+] связано с прионной агрегацией ASup35MC.

Как известно, делеция гена, кодирующего прионформирующий белок, неизбежно приводит к элиминации приона [Wickner et al., 1999]. Замена плазмиды pL-A-Sup35MC на центромерную плазмиду pYCH-U2, содержащую ген под контролем собственного промотора, вызвала потерю SUP35 супрессорного фенотипа (рис. 12Б), однако обратная замена плазмиды pYCH-U2 на pL-A-Sup35MC привела к полному восстановлению супрессорного фенотипа (рис. 12Б). Данные, полученные в этом эксперименте доказывают, что потеря гена, кодирующего белок A-Sup35MC лишь маскирует проявление фактора [NSI+], но не вызывает его элиминации. На основании полученных результатов можно заключить, что гибридный белок A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+].

3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции Поскольку нонсенс-супрессию наблюдали в штаммах [NSI+] лишь на фоне продукции A-Sup35MC, мы предположили, что гибридный белок даже при сверхпродукции хуже выполняет функцию фактора терминации трансляции, чем нативный белок Sup35. Для проверки этого предположения мы заменили в штаммах 4-1-1-D931[NSI+] и 1-1-D931[NSI+] плазмиды, кодирующие белок ASup35MC, на следующие конструкции:

1. Плазмида pFL38-SUP35P, кодирующая ген SUP35 P. methanolica;

2. Плазмида pNR-ABF1, содержащая ген SUP35 с мутацией в промоторной области, снижающей уровень экспрессии;

3. Плазмида pASB2, содержащая ген SUP35 под контролем собственного промотора.

На фоне продукции белка Sup35 P. methanolica, для штамма 3-4-1-1-D931 [NSI+] характерна нонсенс-супрессия (рис. 13А), которая элиминируется на среде с GuHCl. По всей вероятности, этот белок, как и A-Sup35MC, недостаточно эффективно выполняет функцию фактора терминации трансляции, а фактор [NSI+] является провокационным фоном, позволяющим выявлять снижение эффективности терминации трансляции на фенотипическом уровне.

Штамм [NSI+], содержащий плазмиду pNR-ABF1, демонстрирует сильный рост на среде без аденина (рис. 13А). После пассирования клеток на среде с GuHCl интенсивность роста на среде без аденина заметно снижается. С помощью ПЦР в реальном времени мы показали, что уровень экспрессии гена SUP35 в штамме, содержащем плазмиду pNR-ABF1 с мутацией в промоторе SUP35, достоверно ниже (p 0.01), чем в штамме, несущем плазмиду pASB2 (рис 13Б).

Рисунок 13. А- Анализ нонсенс-супрессии в дериватах штамма [NSI+], в которых гибридный ген A-SUP35MC замещн на: 1) ген SUP35 P.methanolica (pFL38SUP35P); 2) ген SUP35 S. cerevisiae с делецией локуса ABF в промоторной области; 3) интактный ген SUP35 S. cerevisiae. Б - сравнение количества мРНК SUP35 в штаммах [nsi–], несущих плазмиды pASB2 и pNRABF1. Данные представлены как Сt ± стандартное отклонение.

Значение параметров Сt (см. «Материалы и методы») соответствует 2.12 ± 0.431 для pASB2 и –0.59 ± 0.381 для pNRABF1 (рис. 13Б). Таким образом, уровень экспрессии гена SUP35 в штамме с плазмидой pNRABF1 примерно в шесть раз ниже, чем в штамме, несущем плазмиду pASB2. Полученные данные [NSI+], свидетельствуют о том, что супрессия, опосредованная может наблюдаться как на фоне аминокислотных замен в белке, выполняющем роль фактора eRF3, так и при снижении уровня экспрессии соответствующего гена.

Рисунок 14. Сравнительный анализ частот считывания стоп-кодонов UGA и UAG как значащих в штаммах [NSI+] и [nsi-].

Нонсенс-супрессия, опосредованная фактором [NSI+], может являться следствием снижения эффективности терминации трансляции, или вызываться иными причинами – например, изменением регуляции биохимического пути деградации нонсенс-содержащих мРНК. Для выяснения возможной взаимосвязи проявления [NSI+] с регуляцией терминации трансляции изогенные штаммы 2-1D931 [NSI+] и 1-2-1-1-D931 [nsi-] были трансформированы плазмидами pDB691 или pDB721, в составе которых два гена, кодирующих две различные люциферазы, разделены стоп-кодонами и соответственно.

UGA UAG, Исследуемые штаммы трансформировали также плазмидами pDB690 или pDB720, в которых на месте стоп-кодонов расположены значащие триплеты.

Показатель, отражающий сравнительную активность двух люцифераз в штаммах [NSI+] и [nsi-], вычисляли как указано в разделе «Материалы и методы».

Полученные данные показали, что [NSI+] вызывает статистически достоверное увеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG как значащих (рис.14).

[NSI+] Таким образом, детерминант вызывает снижение эффективности терминации трансляции, и этот эффект может проявляться в виде омнипотентной нонсенс-супрессии на фоне мутаций в гене SUP35, не имеющих собственного проявления.

3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+]

[NSI+], как и большинство дрожжевых прионов, эффективно элиминируется при пассировании клеток на среде с GuHCl. Эти данные позволили предположить, что фактор [NSI+] имеет прионную природу. GuHCl -зависимая элиминация дрожжевых прионов связана с тем, что это вещество ингибирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 [Ferreira et al., 2001], который необходим для расщепления (т.е. размножения) прионных агрегатов. Мы оценили влияние делеции и сверхэкспрессии HSP104 на передачу фактора [NSI+] в ряду клеточных поколений. Все клоны штамма 3-1-1-D931 (дериват 1-1-D931 [NSI+]) с делецией утратили супрессорный фенотип (рис. Известно, что HSP104) 15).

сверхэкспрессия HSP104 вызывает элиминацию [PSI+][Chernoff et al., 1995], но не влияет на поддержание всех остальных дрожжевых прионов. Штамм 1-1-D931 [NSI+] трансформировали многокопийной плазмидой pLH105, содержащей ген HSP104 под контролем собственного промотора. Трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина, трижды переносили методом «отпечатков» на такую же среду и затем перепечатывали на среду без аденина. Как показано на рисунке 15, сверхэкспрессия HSP104 не вызывает элиминацию супрессорного фенотипа в штамме [NSI+] (рис. 15).

Рисунок 15. Влияние делеции и сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание и проявление фактора [NSI+]. Дрожжи фотографировали на третий день роста на среде без аденина.

Поскольку у дрожжей прионизация вызывает наследуемое изменение формы белка, прионные факторы обладают общими характеристиками [по: Wickner et al., 1999] с изменениями:

1. могут возникать de novo после элиминации;

2. наследуются как нехромосомные доминантные факторы;

3. демонстрируют инфекционность (передаются цитодукцией и в результате белковой трансформации);

4. наследование большинства дрожжевых прионов зависит от продукции шаперона Hsp104.

Фактор [NSI+] демонстрирует сходство с дрожжевыми прионами – он элиминируется при пассировании на среде с GuHCl и для его поддержания требуется продукция шаперона Hsp104. Мы проверили соответствие фактора [NSI+] всем остальным характеристикам дрожжевых прионов.

Фактор [NSI+] исходно был выявлен в штамме 1-1-D931, который содержит прион [PIN+] (прионная форма белка Rnq1). Прион [PIN+] является затравкой, необходимой для возникновения другого приона [PSI+], а также для агрегации некоторых амилоидных белков [Derkatch et al., 1997; Vitrenko et al., 2007; Du and Li 2014]. С учтом этих фактов, мы оценивали частоты спонтанного возникновения [NSI+] в изогенных штаммах 1-4-1-1-D931 [pin-] и 2-4-1-1D931 [PIN+]. Штамм 1-4-1-1-D931 был получен за счт пассирования клеток 4-1-1-D931 [NSI+] на среде с GuHCl. Для получения штамма 2-4-1-1D931, содержащего фактор [PIN+], сферопласты штамма 1-4-1-1-D931 [pin-] трансформировали белковым экстрактом из штамма BY4742 [PIN+] и плазмидой pmCUPNMsGFP, продуцирующей белок Sup35NM-GFP. Для дальнейшей работы с помощью флуоресцентной микроскопии отбирали трансформантов, содержащих агрегаты белка Sup35NM-GFP, которые выявляются лишь в клетках, имеющих фактор [PIN+]. Возникновение отдельных клонов, демонстрирующих фенотип [NSI+] (рост на среде без аденина, который элиминируется пассированием клеток на среде с GuHCl), было отмечено с частотой 5 x 10-6 лишь в штамме 2-4-1-1D931 [PIN+], но не в изогенном ему штамме 1-4-1-1-D931 [pin-] (табл. 9).

Таблица 9. Спонтанное возникновение de novo фактора [NSI+]

–  –  –

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+] способен возникать повторно после элиминации. Мы не можем сделать вывод о возможном влиянии приона [PIN+] на спонтанное возникновение фактора [NSI+], поскольку различия не являются статистически достоверными.

Для анализа характера наследования фактора [NSI+] штамм 1-1-D931[NSI+] aтипа спаривания, содержащий плазмиду pU-A-Sup35MC, скрещивали с изогенным ему штаммом 2-1-1-1-D931 [nsi-] -типа спаривания, содержащим плазмиду pL-A-Sup35MC. Диплоидов отбирали на среде –Leu-Ura.

Диплоидный статус отдельных клонов проверяли контрольным скрещиванием с тестерами типа спаривания. Все отобранные диплоиды демонстрировали нонсенс-супрессорный фенотип, изгоняемый при трхкратном пассировании клеток на среде с 5mM GuHCl (рис. 16). Таким образом, [NSI+] демонстрирует доминантное проявление.

Рисунок 16. Рост на среде без аденина диплоидных штаммов, полученных в результате скрещивания гаплоидов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-], до и после пассирования на среде с GuHCl.

При споруляции диплоидных клонов в тетрадах выявлялось лишь от одной до трх жизнеспособных аскоспор. В связи с этим наследование фактора [NSI+] у мейотических сегрегантов анализировали с помощью случайной выборки аскоспор. В потомстве всех проанализированных диплоидных клонов подавляющее большинство гаплоидных сегрегантов (237 клонов) демонстрировали супрессорный фенотип (Ade+) и лишь 9 клонов не росли на среде без аденина (табл. 10).

Таблица 10. Фенотип гаплоидных сегрегантов диплоидных клонов, полученных в результате скрещивания штаммов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-]

–  –  –

Клоны утрачивали способность к росту на среде без аденина после пассирования на среде с GuHCl (результаты не представлены). Расщепление по типу спаривания статистически достоверно не отличалось от 1:1 (2 3,84). В контроле при скрещивании изогенных гаплоидных штаммов [nsi-] были получены диплоидные клоны, фенотипа Ade-. Все гаплоидные сегреганты (150 клонов), полученные от таких диплоидов, также имели фенотип Ade-.

Дефекты споруляции исследуемых штаммов могут быть вызваны как наличием фактора [NSI+], так и тем, что жизненно-важный ген A-SUP35MC не интегрирован в хромосому, а представлен на центромерной плазмиде. Для проведения тетрадного анализа были получены штаммы 1-D934 [NSI+] и 1-2-D934 [nsi-], содержащие интегрированную в хромосому кассету, включающую ген SUP35P.m. и маркерный ген LEU2. В результате скрещивания этих штаммов был [NSI+], получен диплоид демонстрирующий D935 GuHCl-изгоняемый супрессорный фенотип. Тетрады на среде для споруляции выявлялись лишь на десятый день, и большинство аскоспор оказались нежизнеспособными. На основании этих данных можно предположить, что фактор [NSI+] вызывает дефекты споруляции. Во всех двенадцати тетрадах, которые образовали четыре жизнеспособные аскоспоры, наблюдали соотношение 4Ade+:0Ade-.

Супрессорный фенотип элиминировался при пассировании гаплоидных сегрегантов на среде с GuHCl. В качестве контроля использовался диплоидный штамм D936 [nsi-], полученный в результате пассирования штамма D935 на среде с GuHCl и утративший супрессорный фенотип. Во всех тетрадах, полученных в [nsi-], результате споруляции контрольного диплоидного штамма D936 наблюдалось соотношение 0Ade+:4Ade-. Таким образом, фактор [NSI+], подобно дрожжевым прионам, имеет доминантное проявление и характеризуется неменделевским наследованием в мейозе.

Инфекционность фактора [NSI+] оценивали с помощью цитодукции и метода белковой трансформации. Цитодукцией называется процесс слияния цитоплазмы двух клеток разного типа спаривания с последующей абортивной утратой ядра одной из клеток [Zakharov and Yarovoy, 1977]. Цитодукция происходит с высокой частотой, если один из скрещивающихся штаммов маркирован мутацией kar1-1, препятствующей кариогамии. Для оценки инфекционности фактора [NSI+] донорный штамм 1-1-D931 [NSI+] скрещивали с реципиентным штаммом 1-D932, который помимо kar1-1 маркирован мутацией cyhR, вызывающей устойчивость к циклогексимиду, и не содержит митохондрий. Цитодуктанты получают митохондрии донорного штамма, что позволяет селектировать их на среде с неферментируемым источником углерода. Супрессорным фенотипом, который элиминируется при пассировании на среде с GuHCl, обладали 11 и 16% цитодуктантов в двух независимых выборках (таблица 11). Таким образом, [NSI+] демонстрирует цитоплазматическую инфекционность, то есть передатся от донорного штамма реципиентному при слиянии цитоплазмы.

Таблица 11. Передача фактора [NSI+] при цитодукции

–  –  –

Для подтверждения инфекционных свойств [NSI+] мы трансформировали сферопласты штамма 1-D933 [nsi-] вектором pRS315 и белковым экстрактом из штамма 4-1-1-D931 [NSI+]. Вектор pRS315 использовали для повышения эффективности отбора сферопластов, компетентных к трансформации.

Трансформантов отбирали на селективной среде и проверяли тип спаривания. В трх независимых экспериментах клоны, демонстрирующие супрессию, которая элиминируется на среде с GuHCl, выявлялись с частотами от 5 до 7% (таблица 12). В контрольном эксперименте, где белковый экстракт был выделен из штамма [nsi-], трансформанты, демонстрирующие нонсенс-супрессию не выявлялись.

Интересно отметить, что цитоплазматические прионные детерминанты, такие как [PSI+] и [URE3], передаются цитодукцией с частотой близкой к 100%, тогда как частоты передачи фактора [NSI+] значительно ниже. Вместе с тем, при помощи метода белковой трансформации детерминант [NSI+] передатся так же эффективно, как прион [PIN+] [Patel and Liebman, 2007]. Невысокие частоты цитодукции характерны для факторов, белки-детерминанты которых имеют преимущественно ядерную локализацию [Du et al. 2008; Patel et al., 2009]. Эти данные позволяют предположить, что детерминант фактора [NSI+] локализован в ядре.

Таблица 12. Передача фактора [NSI+] методом белковой трансформации

–  –  –

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+] обладает всеми характеристиками дрожжевого приона – возникает de novo после элиминации, демонстрирует доминантное нехромосомное наследование и обладает инфекционностью.

Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 3.1.5.

3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявление [NSI+] Для выявления генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявление [NSI+], мы оценили эффект сверхэкспрессии всех дрожжевых генов в штамме 1-1-D931 [NSI+]. Этот штамм был трансформирован плазмидами библиотеки YSC4613. Библиотека включает 1588 клонов E. coli, несущих челночный многокопийный вектор pGP564 с уникальными фрагментами генома S. cerevisiae, размером от 9 до 13 тысяч пар нуклеотидов и содержащими от 4 до 12 открытых рамок считывания. Каждый клон содержит одну плазмиду с несколькими генами S. cerevisiae с известной индивидуальной нуклеотидной последовательностью. Штамм 1-1-D931 был трансформирован всеми плазмидами библиотеки, трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина и переносили методом отпечатков на среду без лейцина и аденина. Всего на селективной среде без аденина было проанализировано по восемь трансформантов каждой из 1588-ми плазмид. В результате скрининга было установлено, что на рост штамма на селективной среде без аденина влияют шесть плазмид геномной библиотеки: YGPM18l24, YGPM25e16, YGPM27n12, YGPM4g14, YGPM17m07 и YGPM18d16, причем трансформация плазмидами YGPM4g14 и YGPM17m07 приводит к усилению роста, а YGPM18l24, YGPM25e16, YGPM27n12 и YGPM18d16 – к подавлению.

Плазмиды YGPM4g14 и YGPM17m07 содержат ген ADE1, сверхэкспрессия которого закономерно приводит к усилению роста штамма на среде без аденина, однако не влияет на рост штамма на среде без триптофана. Плазмида YGPM18d16 содержит ген SUP35, экспрессия которого, как мы показали ранее, маскирует [NSI+]-зависимую нонсенс-супрессию. Интересно отметить, что штамм 1-1-D931 содержит фактор [PIN+], и сверхэкспрессия гена SUP35 в таких штаммах обычно приводит к прионизации Sup35 и индукции нонсенс-супрессии, но в присутствии фактора [NSI+] этого не происходит.

Оставшиеся три плазмиды (YGPM18l24, YGPM18l24 и YGPM25e16) наряду с другими генами содержали ген SUP45. Этот ген кодирует основной фактор терминации трансляции eRF1 эукариот [Zhouravleva et al., 1995]. Мы предположили, что сверхэкспрессия именно этого гена вызывает повышение эффективности терминации трансляции в штамме 1-1-D931 и маскирует [NSI+]опосредованную нонсенс-супрессию. Для проверки этого предположения мы использовали центромерную плазмиду pRS315-SUP45, любезно предоставленную Г.А. Журавлевой (СПбГУ), несущую ген SUP45 дикого типа под контролем собственного промотора. Трансформация плазмидой pRS315-SUP45 действительно вызвала подавление роста штамма на среде без аденина (Рис.17А).

Элиминация этой плазмиды приводила к восстановлению супрессорного фенотипа.

Мы предположили, что детерминант [NSI+] участвует в регуляции экспрессии SUP45 на уровне мРНК. Если на фоне [NSI+] происходит снижение относительного количества мРНК SUP45, то это может приводить к уменьшению количества данного белка и снижению эффективности терминации трансляции.

Для проверки этого предположения мы сравнили относительные количества мРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] при помощи ПЦРРВ.

Данные, полученные для четырнадцати независимо полученных проб мРНК каждого из штаммов, воспроизведнные в трх повторностях, показали, что в штамме [NSI+] достоверно (p0,01) снижено количество мРНК SUP45 в сравнении со штаммом [nsi-] (значения параметров Сt составляют 2,08±0,521 и 1,00±0,289 для [NSI+] и [nsi-] штаммов, соответственно) (Рисунок 17Б).

Рисунок 17. Фактор [NSI+] снижает уровень экспрессии гена SUP45. А – Трансформация штамма [NSI+] центромерной плазмидой с копией гена SUP45 вызывает маскировку супрессорного фенотипа, но после потери плазмиды фенотип восстанавливается. Б - Относительное количество мРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-]. В – Сравнительный анализ относительного количества белка Sup45 в штаммах [NSI+] и [nsi-], находящихся в экспоненциальной и стационарной фазе роста. Показаны результаты Вестерн-блот гибридизации для одной пары клонов [NSI+] и [nsi-]. Количественные данные денситометрического анализа вычислены для четырх пар независимых клонов и представлены как среднее значение измерений интенсивности сигналов Sup45/Tub1 ± стандартное отклонение.

Наблюдаемая разница соответствует снижению количества мРНК SUP45 в штамме [NSI+] приблизительно в два раза (2-Ct=2,14), что полностью объясняет антисупрессорный эффект введения SUP45 на центромерной плазмиде. С помощью Вестерн-блот гибридизации мы сравнили количество белка Sup45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на экспоненциальной и стационарной стадии роста (дрожжи инкубировали в течение одного и трх дней, соответственно, в жидкой среде при 300С). Количество тотального белка в клетках штаммов [NSI+] и [nsi-] выравнивали по методу Бредфорда [Bradford, 1976] и в соответствии с интенсивностью сигнала тубулина (Tub1) при использовании антител T6074. Результаты количественной оценки данных Вестерн-блот гибридизации показали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах [NSI+] статистически достоверно (p=0,009) снижено в сравнении со штаммами [nsi-] в клетках, находящихся в стационарной, но не в экспоненциальной фазе роста. На рисунке 17В представлены результаты сравнительного анализа количества белка Sup45 в клетках [NSI+] и [nsi-] в одной из четырех пар независимо полученных клонов. Полученные медианы относительного содержания Sup45p в штаммах [NSI+] и [nsi-] равны 0,54±0,088 и 1,00±0,260, что соответствует снижению содержания Sup45p в штаммах [NSI+] в стационарной фазе роста приблизительно в два раза. Таким образом, возникновение детерминанта [NSI+] вызывает снижение содержания мРНК SUP45 в клетке, что закономерно приводит к уменьшению количества белка Sup45 в стационарной фазе роста и к нонсенс-супрессии.

3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] Сверхпродукция прионформирующих белков, зачастую, хотя и не всегда, резко повышает частоту индукции прионной изоформы de novo [Wickner et al., 2002; Du and Li, 2014]. На этом свойстве базируется один из основных методов идентификации дрожжевых прионов. Для поиска белков, сверхпродукция которых вызывает индукцию нонсенс-супрессорного фенотипа в штамме [nsi-], была использована дрожжевая адресная библиотека YSC4613 “Open Biosystems”, плазмиды которой содержат перекрывающиеся фрагменты генома S. cerevisiae (см. главу «Материалы и методы» и предыдущий раздел).

Поскольку спонтанное возникновение фактора [NSI+] было отмечено исключительно в штаммах [PIN+], для трансформации плазмидами библиотеки был использован штамм 1-D933 [nsi-], содержащий прионный детерминант [PIN+].

В результате эксперимента было выявлено 24 плазмиды, трансформация которыми вызывала нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] (таблица 13). Эти плазмиды содержат 178 индивидуальных генов. Следует отметить, что последовательности геномных фрагментов, клонированных в плазмиды библиотеки, перекрываются. С учтом этого, потенциальными кандидатами на роль детерминанта фактора [NSI+] могут быть только те гены, которые представлены в составе выявленных 24 плазмид, однако отсутствуют в плазмидах, трансформация которыми не приводит к супрессии. Таким образом, количество потенциальных кандидатов на роль гена-детерминанта фактора [NSI+] сокращается до 75 генов.

–  –  –

Супрессия нонсенс–мутации trp1-289(UAA), как и ингибирование роста на среде с галактозой, была отмечена при трансформации штамма 1-D933 [nsi-] лишь одной из 24-х плазмид. Эта плазмида содержит 11 генов, влияние которых на супрессию нонсенс-мутаций ранее показано не было. Один из этих генов, а именно VTS1 (плазмида YGPM2f04, таблица 13), контролирует стабильность мРНК [Aviv et al., 2003] и, кроме того, кодирует потенциально прионогенный белок, содержащий глутамин-аспарагин обогащнную последовательность [Harrison and Gerstein, 2003].

Таблица 13. Плазмиды геномной библиотеки YSC4613, трансформация которыми вызывает нонсенс-супрессию в штамме 1-D933 [nsi-] Плазмида Название генов в составе плазмиды CHD1, PAB1, YER165C-A, DNF1* YGPM10p05 плазмиды SAC3**, SSY1, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1** YGPM11n12 CHD1**, PAB1, YER165C-A, DNF1* YGPM11p20 LCD1**, RPL37B, PLM5, SAM2, LPP1, SPG3, PSP1, YDR506C** YGPM14f05 YGPM14k18 YPR150W***, SUE1, YPR152C, YPR153W, PIN3, NCA2, TPO3, YPR157W*

–  –  –

Мы сконструировали плазмиду pU-VTS1, в которой последовательность, кодирующая белок Vts1, находится под контролем индуцибельного промотора CUP1. Сверхэкспрессия VTS1 в штамме 1-4-1-1-D931 [nsi-], как мы и ожидали, вызывает супрессию нонсенс-мутаций ade1-14 и trp1-289, а также вызывает ингибирование роста дрожжей на среде с галактозой, но не на среде с глицерином (рис. 18А). Таким образом, эффекты сверхпродукции гена VTS1 имеют сходное проявление с фактором [NSI+].

Рисунок 18. Влияние изменения уровня экспрессии гена VTS1 на фенотип штаммов, содержащих фактор [NSI+]. А – Сверхэкспрессия гена VTS1 в штамме [nsi-], также как и фактор [NSI+], вызывает рост клеток на средах без аденина и триптофана и ингибирует рост на среде с галактозой, но, в отличие от [NSI+], не влияет на темпы роста на среде с глицерином; Б – Нонсенс-супрессия, возникающая в штамме [nsi-] при трансформации плазмидой pU-VTS1, элиминируется после потери плазмиды; В – Штамм 9-1-1-D931 [NSI+] с делецией гена VTS1 демонстрирует супрессию, которая элиминируется GuHCl.

Вместе с тем, элиминация плазмиды pU-VTS1 приводит к потере супрессорного фенотипа (рис. 18Б). Кроме того, супрессорный фенотип сохраняется в штамме [NSI+] на фоне делеции гена VTS1 (рис. 18 В). Супрессия элиминируется на среде с GuHCl. Эти данные однозначно доказывают, что ген VTS1 не является детерминантом фактора [NSI+].

На основании полученных результатов можно заключить, что генетический скрининг позволил выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияет на проявление фактора [NSI+] или вызывает сходные эффекты, однако гендетерминант [NSI+] этим методом обнаружить не удалось.

Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в 3.2.

дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»

Генетический скрининг не позволил выявить ген-детерминант фактора [NSI+]. Делеционный скрининг не может использоваться для выявления жизненно-важных генов, кодирующих прионные белки, а сверхэкспрессия геновдетерминантов прионов не всегда приводит к заметному повышению частот индукции прионов [Du and Li, 2014]. Таким образом, генетические подходы при идентификации прионов могут быть неэффективны. Для решения поставленных в работе задач мы разработали метод идентификации амилоидов, основанный на знании их универсальных биохимических свойств.

3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»

При разработке метода протеомного скрининга и идентификации амилоидов, названного нами PSIA (Proteomic Screening for Identification of Amyloid proteins) мы основывались на предложенном ранее подходе по выделению и очистке высокомолекулярной фракции детергент-устойчивых белковых агрегатов, обогащнной амилоидами [Kushnirov et al., 2006]. Для выявления и идентификации в этой фракции любых, даже минорных белков, формирующих амилоидные агрегаты, мы разработали схему экспериментов, объединяющую несколько биохимических и протеомных методов, и апробировали е на примере выявления уже известных дрожжевых прионов [PIN+] и [PSI+].

Методика включает три основных этапа:

1) Выделение и очистка при помощи серии ультрацентрифугирований белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами.

2) Разделение фракции белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, при помощи двумерного электрофореза белков, связанных с флуорохромами.

3) Выделение окрашенных белков из геля, трипсинолиз и идентификация с помощью масс-спектрометрии.

Выделение белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, в клетках штамма GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенного деривата GT409 [psi-][pin-] было проведено как описано в главе «Материалы и методы». Детергент-устойчивую фракцию белковых агрегатов растворяли в буфере, содержащем хаотропные агенты, а нерастворимые в буфере белковые агрегаты отделяли центрифугированием. Растворимые в буфере белки из штамма [PSI+][PIN+] окрашивали красным флуорохромом Cy5, а из штамма [psi-][pin-] зелным флуорохромом Cy3. На следующем этапе белки, выделенные из обоих штаммов, смешивали и разделяли методом двумерного гель-электрофореза. На рис 19А и 19Б представлены результаты выделения белковых агрегатов, устойчивых к обработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, соответственно. Необходимость использования саркозината связана с тем, что некоторые амилоиды неустойчивы к обработке SDS, но не растворяются при использовании более мягких детергентов [Urakov et al., 2010; Coalier et al., 2013]. Белкам, представленным в обоих штаммах, соответствуют жлто-зелные сигналы, тогда как белки, образующие агрегаты исключительно в штамме [PSI+][PIN+], окрашены красным цветом. Красные пятна, как в случае обработки SDS, так и при обработке саркозинатом, были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии как белок Rnq1 – детерминант приона [PIN+] (данные спектрометрии представлены в таблицах 14 и 15). В обоих случаях белку Rnq1 соответствовали несколько сигналов, различающихся по изоэлектрической точке, но не по массе. Это может быть связано с посттрансляционными модификациями белка Rnq1. Белкам, формирующим агрегаты, устойчивые к 1% SDS как в штамме [PSI+][PIN+], так и в штамме [psi-][pin-], соответствовали жлтые сигналы, образующиеся в результате наложения флуорохромов Cy3 и Cy5. Этим сигналам соответствовали белки Gas1, Ape1 и Ape4 (рис. 19 А; таблица 14).

Белки Gas1, Ape1 и Ape4 были выявлены также при обработке фракции белковых агрегатов 3% саркозинатом натрия (рис. 19Б; таблица 15). Эти белки либо образуют конститутивные амилоидные полимеры в дрожжах, либо формируют детергент-устойчивые агрегаты неамилоидной природы. В результате обработки белковых агрегатов саркозинатом, который является более мягким детергентом в сравнении с SDS, на геле выявляется гораздо больше жлтых сигналов, которым соответствуют белки, образующие агрегаты в штаммах [PSI+][PIN+] [psi-][pin-].

и Существенная часть этих белков, являются компонентами 20S субъединицы протеасомы (рис. 19Б; таблица 15). К ним относятся все белки семейства Pre, а также белки Pup3 и Scl1 (SGD, http://www.yeastgenome.org). Очевидно, этот белковый комплекс не имеет отношения к амилоидам, но демонстрирует устойчивость к обработке 3% саркозинатом натрия.

Важно отметить, что наличие относительно большого количества белков не мешает выявлению прионов, поскольку использование разноцветных флуорохромов позволяет чтко выявлять белки, формирующие агрегаты исключительно в прионсодержащем штамме. Отметим, что белок Sup35, образующий прионные агрегаты в штамме [PSI+][PIN+], не выявлен с помощью двумерных электрофорезов (рис. 19 А и 19Б). Мы показали, что Sup35 выявляется в штамме [PSI+][PIN+], во фракции белковых агрегатов, нерастворимых в буфере для двумерного электрофореза. Белки из этой фракции, выделенные из опытного и контрольного штаммов, были денатурированы кипячением в 2% SDS, разделены с помощью одномерного гель-электрофореза и визуализированы окрашиванием кумасси R250. Полоска, представленная исключительно в штамме [PSI+][PIN+] (рис.19В), была идентифицирована масс-спектрометрией как белок Sup35 (таблица 16).

Рисунок 19. Белки, формирующие детергент-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-]. А - Изображение двумерного гель электрофореза белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты. Белки из штаммов [PSI+][PIN+] [psi-][pin-] и окрашены флуорохромами GT81-1C GT409 Cy5(красный) и Cy3(зелный), соответственно. Б – Изображение двумерного гель электрофореза белков, образующих саркозинат-устойчивые агрегаты. Белки из штаммов GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] окрашены флуорохромами Cy5(красный) и Cy3(зелный), соответственно. В – Изображение одномерного электрофореза, белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты, нерастворимые в буфере с хаотропными агентами.

Таким образом, мы показали, что прионные агрегаты Sup35 демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработке хаотропными агентами (8 M мочевина, 2 M тиомочевина и 4% CHAPS).

Таблица 14. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19A).

–  –  –

Примечания:

1 Здесь и далее - счт – показатель, отражающий достоверность идентификации белка (см. «Материалы и методы»). Указан счт, с которым были идентифицированы белки в образце из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].

* Белок выявлен и идентифицирован только в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] (Здесь и далее для таблиц 14 -17).

Таблица 15. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих агрегаты, устойчивые к обработке саркозинатом натрия, в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19Б).

–  –  –

Таблица 16. Идентификация белков, выявленных на одномерном электрофорезе в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19В), методом массспектрометрии.

–  –  –

Несмотря на эффективность и удобство для демонстрации результатов, этот метод имеет определнные ограничения:

1) Белки с экстремальной изоэлектрической точкой (ниже 3,5 и выше 9,5) не разделяются с помощью двумерного электрофореза и выпадают из анализа;

2) Белки, которые продуцируются на крайне низком уровне, могут, не детектироваться на геле.

Для того, чтобы повысить разрешающую способность методики, мы отказались от использования двумерного электрофореза. Фракцию белков, образующих агрегаты устойчивые к обработке 1% SDS при комнатной температуре, выделяли так же как описано выше.

Таблица 17. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409[psi-][pin-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDI,

–  –  –

Указаны показания счта масс-спектрометрии для образца из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].

На следующем этапе белки растворяли в концентрированной муравьиной кислоте, высушивали в вакуумном испарителе и денатурировали кипячением в буфере с 2% SDS. Далее пробы обессоливали, расщепляли на пептиды с помощью трипсина, пептиды разделяли на колонке HPLC и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии (см. главу “Материалы и методы»). Такой подход лишн недостатков, которые возникают при использовании двумерного электрофореза.

Кроме того, отсутствие этапа выделения белка из геля повышает чувствительность метода. Необходимость использования муравьиной кислоты связана с тем, что фибриллы некоторых амилоидных белков не растворимы даже при кипячении в буфере с SDS.

В таблице 17 представлены белки, идентифицированные с помощью новой модификации нашего метода в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенном деривате GT409 [psi-][pin-]. Данный подход позволяет идентифицировать белки, представленные в пробах даже в следовых количествах. В таблице 17 представлены лишь первые 30 белков, идентифицированных в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] с самым высоким счтом. Из таблицы исключены данные идентификации белков большой и малой субъединиц рибосомы, которые были выявлены в обоих штаммах (результаты не представлены). Для всех этих рибосомных белков характерна экстремально щелочная изоэлектрическая точка (pI 10), что препятствовало их выявлению при использовании двумерного электрофореза (см. рис. 19А и 19Б). По всей вероятности, субъединицы дрожжевой рибосомы представляют собой прочный РНП-комплекс, который не полностью распадается на отдельные белки в результате обработки РНК-азой А и 1% SDS при комнатной температуре.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.