«ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...»

9. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок тщательно суспендировали в 1 мл буфера ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT), доводили объм до 5.4 мл. и добавляли 0.6мл 10% раствора SDS (конечная концентрация 1% SDS). Альтернативно, в других экспериментах вместо 1% SDS использовали саркозинат натрия в конечной концентрации 3%. Аккуратно перемешивали, не допуская образования пены.

10. Пробы наслаивали на 2 мл подушки (25% сахароза в буфере TBS). Пробирки устанавливали в ротор Ti75 ультацентрифуги и включали режим «отложенный старт». Таким образом, пробы инкубировались 4-6 часов при температуре 18оС.

11. Центрифугировали пробы 8ч., 223 600g при 4oC в пробирках для ротора Ti75.

12. Полученный осадок детергент-устойчивых белковых агрегатов суспендировали в 8мл воды и вновь центрифугировали при тех же условиях.

13. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC (при необходимости дольше).

14. В случае разделения белков с помощью двумерного электрофореза осадок растворяли в хаотропных агентах (смотри раздел «Двумерный разностный электрофорез белков»). В случае использования методики “HPLC – MALDI” осадок растворяли в 100 мкл 96%муравьиной кислоты. Если осадок не растворялся, увеличивали объем муравьиной кислоты. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре.

15. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC.

16. Осадок суспендировали в 90 мкл воды, добавляли 30 мкл буфера (100mM TrisHCL-6.8, 20% меркаптоэтанол, 10% SDS, 0.2% бромфеноловый синий, 40% глицерин) и кипятили белки 10мин при 100оС.

2.8.2. Разделение и идентификация белков 2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE) Белки растворяли в регидратирующем буфере (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат (ХАМПс), 25 мМ Трис, рН 8,5) и коньюгировали с флурохромами Cy5 (опытный образец) или Cy3 (контрольный образец) (Luminoprobe, BioDye) в соотношении 400 пмоль флуорохрома на 50 мкг белка. Концентрацию белка оценивали по величине поглощения при длине волны 280 нм. Образцы инкубировали с флуорохромами на льду в течение 30 мин. в темноте. Реакцию останавливали добавлением 10 мкмоль L-лизина с последующей инкубацией в течение 10 мин.

при тех же условиях, затем белки центрифугировали 2500g, 10 мин. Растворнные белки, меченные разными флуорохромами, объединяли и загружали в стрип с градиентом рН 3-10 (7 см, BioRad, США). Процесс загрузки был сопряжен с пассивной регидратацией стрипа (16-18 ч. при комнатной температуре в темноте).

Разделение первого направления проводили в ячейке для изоэлектрического фокусирования (Protean IEF Cell, BioRad), следуя рекомендациям производителя (10000 Вольт-часов, финальное напряжение 4000 В, 20°C, ток не более 25 мА/стрип).

Перед разделением второго направления стрипы с фокусированными образцами последовательно инкубировали по 15 мин. в эквилибрирующих буферах: первом (6 M мочевина, 2% додецил-сульфат натрия, 20% глицерин, 2% дитиотреитол, 0,375 M Трис, pH 8,8) и втором, где дитиотреитол заменен на 2,5% иодоацетамид. Электрофорез второго направления проводили в ячейке MiniProtean TetraCell (BioRad) в 15% полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (tris/glycine/SDS buffer, BioRad) при напряжении 200 В. Для визуализации электрофоретической картины использовали лазерный сканнер GE Typhoon FLA 9500. Наложение электрофореграмм проводили в программном обеспечении ImageJ версии 1.48v (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA, http://imagej.nih.gov.ij). Гель окрашивали кумасси G250 (Coomassie Brilliant Blue R250, BioRad). Пятна окрашенные кумасси G250 и соответствующие сигналам, выявленным при лазерном сканирования вырезали из геля.

2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE

Идентификацию белков, вырезанных из SDS-PAGE геля, проводили при помощи матрично-ассоциированной лазерной дисорбционно-ионной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI) на приборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Кусочки геля отмывали деионизованной водой и 40% ацетонитрилом в 50 мМ бикарбонате аммония. Далее проводили дегидратацию в 100% ацетонитриле с дополнительным высушиванием на вакуумном концентраторе (Labconco). К высушенным фрагментам геля добавляли 10 мМ раствор дитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали смесь (45 мин., 56°С). Смесь охлаждали, удаляли жидкость и добавляли раствор 55 мМ йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 30 мин. при комнатной температуре в темноте, далее добавляли 1 мкл раствора дитиотрейтола для инактивации йодацетамида и высушивали пробы на вакуумном концентраторе (Labconco). К высушенным кусочкам геля добавляли 5 мкл раствора трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Трипсин инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты, затем экстрагировали пептиды из геля 2%, 25% и 50% раствором йодацетамида с 50 мМ бикарбонатом аммония, проводя три последовательные инкубации в ультразвуковой бане по 10 минут. Далее пробы осаждали в течение 30 мин. (20000 g, 4°С) и высушивали на вакуумном концентраторе (Labconco).

Далее к высушенным образцам добавляли 5 мкл 0,1% раствора трифторуксусной кислоты и наносили их на 384-луночную подложку MTP AnchorChip™ 800/384 В качестве матрицы была использована -циано-4Bruker Daltonics).

гидроксикоричная кислота. При анализе пиков было использовано программное обеспечение flexAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Белки идентифицировали при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2 (Matrix Science, с использованием базы данных http://www.matrixscience.com) NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве допустимых модификаций были установлены карбоксиметилирование цистеина и частичное окисление метионина. Также в качестве допустимого было указано два пропущенных сайта трипсинолиза.

Показатель «счт масс-спектрометрии», отражающий достоверность идентификации белка, прибор автоматически определяет по адаптированному алгоритму «MOWSE», представленному в базе данных “Mascot database” (http://www.matrixscience.com/help/interpretation_help.html#SCORING). Показатель «счт масс-спектрометрии» отражает:

количество пептидов в последовательности идентифицированного белка, 1.

масса которых совпадает с массой пептидов, выявленных в анализе;

точность совпадения массы выявленных пептидов с теоретически 2.

ожидаемым показателем.

Счт масс-спектрометрии существенно повышает выявление уникальных пептидов, характерных только для одного белка в исследуемом протеоме. Счт превышающий 50 условных единиц как правило свидетельствует о достоверной идентификации белка на 5% уровне значимости (p0.05).

2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI) Удаление детергентов и обессоливание проб проводили при помощи колонок HiPPR Detergent Removal column (Thermo Scientific) и Zeba Desalting column (Thermo Scientific), соответственно, согласно протоколу производителя. К полученным пробам (50 мкл, концентрация тотального белка 0,2 мг/мл) добавляли 1 мкл свежеприготовленного раствора 50 мМ дитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 15 минут при 50°С, после чего добавляли 1 мкл 100 мМ раствора йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали пробу в течение 15 мин., 20°С в темноте. Далее к пробам добавляли 1 мкл дитиотрейтола для инактивации йодацетамида, 5 мкл трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и проводили инкубацию при 37°С в течение ночи. Трипсин 102 инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты, после чего проводили центрифугирование в течение 30 мин. (20000 g, 4°С).

Полученные смеси пептидов наносили (1 мкл) на обратнофазовую колонку для HPLC Acclaim™ PepMap 300 (150 мм 75 мкм, размер частиц 5 мкм, Thermo Scientific) и разделяли в градиенте ацетонитрила (2-90%) в течение 45 мин. на высокоэффективном нанопоточном жидкостном хроматографе UltiMate 3000 UHPLC+ RSLCnano (Dionex). Фракции пептидов наносили на 384-луночную подложку 800/384 (Bruker с помощью MTP AnchorChip™ Daltonics) автоматического коллектора фракций «Proteineer fc II» (Bruker Daltonics) через каждые 10 с. В качестве матрицы была использована -циано-4-гидроксикоричная кислота. В качестве стандартов использовали Peptide calibration standard II Идентификацию проводили на 8222570 (Bruker Daltonics).

приборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Для каждой фракции определяли MSспектр. Полученные спектры анализируются при помощи программного обеспечения WARP-LC с учетом того, что они получены в результате жидкостной хроматографии. Программа определяет набор уникальных пептидов, характеризующихся задержкой, зарядом и молекулярной массой. Для этих пептидов проводили MS/MS в тех фракциях, где концентрация (интенсивность пика) этих пептидов максимальна. Соответствие полученных спектров белкам определялось при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2.

Показатель «счт масс-спектрометрии», отражающий достоверность идентификации белка, определялся как описано в разделе 2.8.2.2.

Статистические методы 2.9.

Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили при помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0. (“StatSoft Inc.”, США).

103

–  –  –

Эпигенетичесикй детерминант, вызывающий нонсенс-супрессию, был выявлен при работе с дрожжевым штаммом 1-D931 (таблица 4), маркированным нонсенсмутациями ade1-14 и trp1-289 и содержащем плазмиду pU-A-SUP35MC на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35. Гибридный ген A-SUP35MC содержит последовательность, кодирующую амилоидный пептид бета человека, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей домены М и С белка Sup35. Ген ASUP35MC находится под контролем промотора CUP1, который активируется добавлением ионов меди в питательную среду. Эффективность терминации трансляции оценивали в соответствии с темпами роста штамма на среде без аденина и без триптофана, что отражает частоты ошибочного прочтения стопкодонов ade1-14(UGA) или trp1-289 (UAA), как значащих (рис.10 А и Б).

Как видно из результатов, представленных на рисунке 10А, темпы роста штамма на среде без аденина закономерно снижаются при увеличении концентрации ионов меди в питательной среде, и, соответственно, с увеличением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC. Относительное количество белка A-Sup35MC в клетках штамма 1-D931 при изменении концентрации ионов меди в среде оценивали методом Вестерн-блот гибридизации с использованием моноклональных антител 4G8, специфичных к пептиду А (рис. 10А). При добавлении в среду 150 µМ сульфата меди штамм 1-D931 на среде без аденина и без триптофана не растт (рис.10А и Б).

Рисунок 10. Характеристика нонсенс-супрессорного фенотипа штамма 1-D931 и его деривата 1-1-D931, которые продуцируют гибридный белок A-Sup35MC. АРост штамма 1-D931 на среде без аденина с добавлением сульфата меди в различной концентрации. Результаты Вестерн-блот гибридизации с использованием антител 4G8 отражают изменение уровня продукции белка ASup35MC. Б – Рост штамма 1-1-D931 на средах без аденина и без триптофана с добавлением 150 µМ сульфата меди до и после пассирования клеток на среде с GuHCl. В – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC в клетках штаммов 1-D931 и 1-1-D931 методом Вестерн-блот гибридизации. Выравнивание количества тотального белка в обоих случая (1А и 1В) проводилось с помощью метода Бредфорда [Bradford, 1976].

В результате отбора индивидуальных колоний мы выявили один клон, обозначенный 1-1-D931, демонстрирующий нонсенс-супрессорный фенотип при добавлении в питательную среду даже 150 µМ сульфата меди (рис 10Б).

Супрессия проявления нонсенс-мутаций ade1-14(UGA) и trp1-289 (UAG) не была связана с изменением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC (рис 10В). Нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследовался в митозе и элиминировался в результате пассирования клеток исследуемого штамма на среде с 5mM хлоридом гуанидина (GuHCl) у 124 из 128 клеток (97%) (рис 10Б).

Напомним, что GuHCl инактивирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 и вызывает элиминацию большинства известных дрожжевых прионов [Tuite et al., 1981;. Derkatch et al., 1997; Wickner, 1994]. На основании этих фактов мы заключили, что нонсенс-супрессия в штамме 1-1-D931 детерминируется эпигенетическим фактором, который мы назвали [NSI+] (Nonsense Suppression Iducer). Штаммы, не содержащие этот фактор, были обозначены [nsi-].

Анализ роста штаммов на средах с неферментируемыми источниками углерода показал, что наличие фактора [NSI+] ингибирует рост штаммов на средах, содержащих в качестве источника углерода галактозу или глицерин (рис.

11). Элиминация фактора [NSI+] в результате пассирования штамма на среде с GuHCl приводит к восстановлению нормальных темпов роста дрожжей на средах с неферментируемыми источниками углерода (рис. 11).

Рисунок 11. Фактор [NSI+] вызывает нонсенс-супрессию и подавление роста на средах с неферментируемыми источниками углерода. Рост штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на средах MD без добавления аденина и триптофана, а также на средах с галактозой (MG) и глицерином (MGly) в качестве источника углерода. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC во все используемые среды добавляли 150 М сульфата меди. Фотографии сделаны на третий день инкубации дрожжей на селективных средах при 30oC.

3.1.2. A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]

Пептид А человека как в организме млекопитающих, так и при продукции в дрожжевых клетках, может формировать агрегаты [Bagriantsev and Liebman, 2006; Porzoor and Macreadie, 2013]. Для проверки гипотезы, согласно которой фактор [NSI+] возник в результате прионной конверсии гибридного белка ASup35MC, мы провели сравнительный анализ агрегации этого белка в штаммах [NSI+] и [nsi-], используя метод дифференциального центрифугирования и Вестерн-блот гибридизации. Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC здесь и во всех дальнейших экспериментах во все используемые среды добавляли 150 М сульфата меди. Как в штамме [NSI+], так и в штамме [nsi-] большая доля белка A-Sup35MC представлена в растворимой надосадочной фракции (рис.12 А).

Рисунок 12. Гибридный белок A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]. А – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC методом Вестерн-блот гибридизации с использованием антител “Anti-Sup35C”, распознающих последовательность Sup35MC. Для выравнивания количества тотального белка использовался метод Бредфорда. Б – Рост дрожжей на среде без аденина в эксперименте с последовательной заменой плазмид в штамме [NSI+].

Плазмиду pL-Ab-SUP35MC замещали на плазмиду pYCH-U2, а затем проводили обратную замену плазмид.

Распределение белка между надосадочной и осадочной фракциями не различается. Таким образом, полученные результаты не подтверждают гипотезу о том, что возникновение фактора [NSI+] связано с прионной агрегацией ASup35MC.

Как известно, делеция гена, кодирующего прионформирующий белок, неизбежно приводит к элиминации приона [Wickner et al., 1999]. Замена плазмиды pL-A-Sup35MC на центромерную плазмиду pYCH-U2, содержащую ген под контролем собственного промотора, вызвала потерю SUP35 супрессорного фенотипа (рис. 12Б), однако обратная замена плазмиды pYCH-U2 на pL-A-Sup35MC привела к полному восстановлению супрессорного фенотипа (рис. 12Б). Данные, полученные в этом эксперименте доказывают, что потеря гена, кодирующего белок A-Sup35MC лишь маскирует проявление фактора [NSI+], но не вызывает его элиминации. На основании полученных результатов можно заключить, что гибридный белок A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+].

3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции Поскольку нонсенс-супрессию наблюдали в штаммах [NSI+] лишь на фоне продукции A-Sup35MC, мы предположили, что гибридный белок даже при сверхпродукции хуже выполняет функцию фактора терминации трансляции, чем нативный белок Sup35. Для проверки этого предположения мы заменили в штаммах 4-1-1-D931[NSI+] и 1-1-D931[NSI+] плазмиды, кодирующие белок ASup35MC, на следующие конструкции:

1. Плазмида pFL38-SUP35P, кодирующая ген SUP35 P. methanolica;

2. Плазмида pNR-ABF1, содержащая ген SUP35 с мутацией в промоторной области, снижающей уровень экспрессии;

3. Плазмида pASB2, содержащая ген SUP35 под контролем собственного промотора.

На фоне продукции белка Sup35 P. methanolica, для штамма 3-4-1-1-D931 [NSI+] характерна нонсенс-супрессия (рис. 13А), которая элиминируется на среде с GuHCl. По всей вероятности, этот белок, как и A-Sup35MC, недостаточно эффективно выполняет функцию фактора терминации трансляции, а фактор [NSI+] является провокационным фоном, позволяющим выявлять снижение эффективности терминации трансляции на фенотипическом уровне.

Штамм [NSI+], содержащий плазмиду pNR-ABF1, демонстрирует сильный рост на среде без аденина (рис. 13А). После пассирования клеток на среде с GuHCl интенсивность роста на среде без аденина заметно снижается. С помощью ПЦР в реальном времени мы показали, что уровень экспрессии гена SUP35 в штамме, содержащем плазмиду pNR-ABF1 с мутацией в промоторе SUP35, достоверно ниже (p 0.01), чем в штамме, несущем плазмиду pASB2 (рис 13Б).

Рисунок 13. А- Анализ нонсенс-супрессии в дериватах штамма [NSI+], в которых гибридный ген A-SUP35MC замещн на: 1) ген SUP35 P.methanolica (pFL38SUP35P); 2) ген SUP35 S. cerevisiae с делецией локуса ABF в промоторной области; 3) интактный ген SUP35 S. cerevisiae. Б - сравнение количества мРНК SUP35 в штаммах [nsi–], несущих плазмиды pASB2 и pNRABF1. Данные представлены как Сt ± стандартное отклонение.

Значение параметров Сt (см. «Материалы и методы») соответствует 2.12 ± 0.431 для pASB2 и –0.59 ± 0.381 для pNRABF1 (рис. 13Б). Таким образом, уровень экспрессии гена SUP35 в штамме с плазмидой pNRABF1 примерно в шесть раз ниже, чем в штамме, несущем плазмиду pASB2. Полученные данные [NSI+], свидетельствуют о том, что супрессия, опосредованная может наблюдаться как на фоне аминокислотных замен в белке, выполняющем роль фактора eRF3, так и при снижении уровня экспрессии соответствующего гена.

Рисунок 14. Сравнительный анализ частот считывания стоп-кодонов UGA и UAG как значащих в штаммах [NSI+] и [nsi-].

Нонсенс-супрессия, опосредованная фактором [NSI+], может являться следствием снижения эффективности терминации трансляции, или вызываться иными причинами – например, изменением регуляции биохимического пути деградации нонсенс-содержащих мРНК. Для выяснения возможной взаимосвязи проявления [NSI+] с регуляцией терминации трансляции изогенные штаммы 2-1D931 [NSI+] и 1-2-1-1-D931 [nsi-] были трансформированы плазмидами pDB691 или pDB721, в составе которых два гена, кодирующих две различные люциферазы, разделены стоп-кодонами и соответственно.

UGA UAG, Исследуемые штаммы трансформировали также плазмидами pDB690 или pDB720, в которых на месте стоп-кодонов расположены значащие триплеты.

Показатель, отражающий сравнительную активность двух люцифераз в штаммах [NSI+] и [nsi-], вычисляли как указано в разделе «Материалы и методы».

Полученные данные показали, что [NSI+] вызывает статистически достоверное увеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG как значащих (рис.14).

[NSI+] Таким образом, детерминант вызывает снижение эффективности терминации трансляции, и этот эффект может проявляться в виде омнипотентной нонсенс-супрессии на фоне мутаций в гене SUP35, не имеющих собственного проявления.

3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+]

[NSI+], как и большинство дрожжевых прионов, эффективно элиминируется при пассировании клеток на среде с GuHCl. Эти данные позволили предположить, что фактор [NSI+] имеет прионную природу. GuHCl -зависимая элиминация дрожжевых прионов связана с тем, что это вещество ингибирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 [Ferreira et al., 2001], который необходим для расщепления (т.е. размножения) прионных агрегатов. Мы оценили влияние делеции и сверхэкспрессии HSP104 на передачу фактора [NSI+] в ряду клеточных поколений. Все клоны штамма 3-1-1-D931 (дериват 1-1-D931 [NSI+]) с делецией утратили супрессорный фенотип (рис. Известно, что HSP104) 15).

сверхэкспрессия HSP104 вызывает элиминацию [PSI+][Chernoff et al., 1995], но не влияет на поддержание всех остальных дрожжевых прионов. Штамм 1-1-D931 [NSI+] трансформировали многокопийной плазмидой pLH105, содержащей ген HSP104 под контролем собственного промотора. Трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина, трижды переносили методом «отпечатков» на такую же среду и затем перепечатывали на среду без аденина. Как показано на рисунке 15, сверхэкспрессия HSP104 не вызывает элиминацию супрессорного фенотипа в штамме [NSI+] (рис. 15).

Рисунок 15. Влияние делеции и сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание и проявление фактора [NSI+]. Дрожжи фотографировали на третий день роста на среде без аденина.

Поскольку у дрожжей прионизация вызывает наследуемое изменение формы белка, прионные факторы обладают общими характеристиками [по: Wickner et al., 1999] с изменениями:

1. могут возникать de novo после элиминации;

2. наследуются как нехромосомные доминантные факторы;

3. демонстрируют инфекционность (передаются цитодукцией и в результате белковой трансформации);

4. наследование большинства дрожжевых прионов зависит от продукции шаперона Hsp104.

Фактор [NSI+] демонстрирует сходство с дрожжевыми прионами – он элиминируется при пассировании на среде с GuHCl и для его поддержания требуется продукция шаперона Hsp104. Мы проверили соответствие фактора [NSI+] всем остальным характеристикам дрожжевых прионов.

Фактор [NSI+] исходно был выявлен в штамме 1-1-D931, который содержит прион [PIN+] (прионная форма белка Rnq1). Прион [PIN+] является затравкой, необходимой для возникновения другого приона [PSI+], а также для агрегации некоторых амилоидных белков [Derkatch et al., 1997; Vitrenko et al., 2007; Du and Li 2014]. С учтом этих фактов, мы оценивали частоты спонтанного возникновения [NSI+] в изогенных штаммах 1-4-1-1-D931 [pin-] и 2-4-1-1D931 [PIN+]. Штамм 1-4-1-1-D931 был получен за счт пассирования клеток 4-1-1-D931 [NSI+] на среде с GuHCl. Для получения штамма 2-4-1-1D931, содержащего фактор [PIN+], сферопласты штамма 1-4-1-1-D931 [pin-] трансформировали белковым экстрактом из штамма BY4742 [PIN+] и плазмидой pmCUPNMsGFP, продуцирующей белок Sup35NM-GFP. Для дальнейшей работы с помощью флуоресцентной микроскопии отбирали трансформантов, содержащих агрегаты белка Sup35NM-GFP, которые выявляются лишь в клетках, имеющих фактор [PIN+]. Возникновение отдельных клонов, демонстрирующих фенотип [NSI+] (рост на среде без аденина, который элиминируется пассированием клеток на среде с GuHCl), было отмечено с частотой 5 x 10-6 лишь в штамме 2-4-1-1D931 [PIN+], но не в изогенном ему штамме 1-4-1-1-D931 [pin-] (табл. 9).

Таблица 9. Спонтанное возникновение de novo фактора [NSI+]

–  –  –

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+] способен возникать повторно после элиминации. Мы не можем сделать вывод о возможном влиянии приона [PIN+] на спонтанное возникновение фактора [NSI+], поскольку различия не являются статистически достоверными.

Для анализа характера наследования фактора [NSI+] штамм 1-1-D931[NSI+] aтипа спаривания, содержащий плазмиду pU-A-Sup35MC, скрещивали с изогенным ему штаммом 2-1-1-1-D931 [nsi-] -типа спаривания, содержащим плазмиду pL-A-Sup35MC. Диплоидов отбирали на среде –Leu-Ura.

Диплоидный статус отдельных клонов проверяли контрольным скрещиванием с тестерами типа спаривания. Все отобранные диплоиды демонстрировали нонсенс-супрессорный фенотип, изгоняемый при трхкратном пассировании клеток на среде с 5mM GuHCl (рис. 16). Таким образом, [NSI+] демонстрирует доминантное проявление.

Рисунок 16. Рост на среде без аденина диплоидных штаммов, полученных в результате скрещивания гаплоидов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-], до и после пассирования на среде с GuHCl.

При споруляции диплоидных клонов в тетрадах выявлялось лишь от одной до трх жизнеспособных аскоспор. В связи с этим наследование фактора [NSI+] у мейотических сегрегантов анализировали с помощью случайной выборки аскоспор. В потомстве всех проанализированных диплоидных клонов подавляющее большинство гаплоидных сегрегантов (237 клонов) демонстрировали супрессорный фенотип (Ade+) и лишь 9 клонов не росли на среде без аденина (табл. 10).

Таблица 10. Фенотип гаплоидных сегрегантов диплоидных клонов, полученных в результате скрещивания штаммов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-]

–  –  –

Клоны утрачивали способность к росту на среде без аденина после пассирования на среде с GuHCl (результаты не представлены). Расщепление по типу спаривания статистически достоверно не отличалось от 1:1 (2 3,84). В контроле при скрещивании изогенных гаплоидных штаммов [nsi-] были получены диплоидные клоны, фенотипа Ade-. Все гаплоидные сегреганты (150 клонов), полученные от таких диплоидов, также имели фенотип Ade-.

Дефекты споруляции исследуемых штаммов могут быть вызваны как наличием фактора [NSI+], так и тем, что жизненно-важный ген A-SUP35MC не интегрирован в хромосому, а представлен на центромерной плазмиде. Для проведения тетрадного анализа были получены штаммы 1-D934 [NSI+] и 1-2-D934 [nsi-], содержащие интегрированную в хромосому кассету, включающую ген SUP35P.m. и маркерный ген LEU2. В результате скрещивания этих штаммов был [NSI+], получен диплоид демонстрирующий D935 GuHCl-изгоняемый супрессорный фенотип. Тетрады на среде для споруляции выявлялись лишь на десятый день, и большинство аскоспор оказались нежизнеспособными. На основании этих данных можно предположить, что фактор [NSI+] вызывает дефекты споруляции. Во всех двенадцати тетрадах, которые образовали четыре жизнеспособные аскоспоры, наблюдали соотношение 4Ade+:0Ade-.

Супрессорный фенотип элиминировался при пассировании гаплоидных сегрегантов на среде с GuHCl. В качестве контроля использовался диплоидный штамм D936 [nsi-], полученный в результате пассирования штамма D935 на среде с GuHCl и утративший супрессорный фенотип. Во всех тетрадах, полученных в [nsi-], результате споруляции контрольного диплоидного штамма D936 наблюдалось соотношение 0Ade+:4Ade-. Таким образом, фактор [NSI+], подобно дрожжевым прионам, имеет доминантное проявление и характеризуется неменделевским наследованием в мейозе.

Инфекционность фактора [NSI+] оценивали с помощью цитодукции и метода белковой трансформации. Цитодукцией называется процесс слияния цитоплазмы двух клеток разного типа спаривания с последующей абортивной утратой ядра одной из клеток [Zakharov and Yarovoy, 1977]. Цитодукция происходит с высокой частотой, если один из скрещивающихся штаммов маркирован мутацией kar1-1, препятствующей кариогамии. Для оценки инфекционности фактора [NSI+] донорный штамм 1-1-D931 [NSI+] скрещивали с реципиентным штаммом 1-D932, который помимо kar1-1 маркирован мутацией cyhR, вызывающей устойчивость к циклогексимиду, и не содержит митохондрий. Цитодуктанты получают митохондрии донорного штамма, что позволяет селектировать их на среде с неферментируемым источником углерода. Супрессорным фенотипом, который элиминируется при пассировании на среде с GuHCl, обладали 11 и 16% цитодуктантов в двух независимых выборках (таблица 11). Таким образом, [NSI+] демонстрирует цитоплазматическую инфекционность, то есть передатся от донорного штамма реципиентному при слиянии цитоплазмы.

Таблица 11. Передача фактора [NSI+] при цитодукции

–  –  –

Для подтверждения инфекционных свойств [NSI+] мы трансформировали сферопласты штамма 1-D933 [nsi-] вектором pRS315 и белковым экстрактом из штамма 4-1-1-D931 [NSI+]. Вектор pRS315 использовали для повышения эффективности отбора сферопластов, компетентных к трансформации.

Трансформантов отбирали на селективной среде и проверяли тип спаривания. В трх независимых экспериментах клоны, демонстрирующие супрессию, которая элиминируется на среде с GuHCl, выявлялись с частотами от 5 до 7% (таблица 12). В контрольном эксперименте, где белковый экстракт был выделен из штамма [nsi-], трансформанты, демонстрирующие нонсенс-супрессию не выявлялись.

Интересно отметить, что цитоплазматические прионные детерминанты, такие как [PSI+] и [URE3], передаются цитодукцией с частотой близкой к 100%, тогда как частоты передачи фактора [NSI+] значительно ниже. Вместе с тем, при помощи метода белковой трансформации детерминант [NSI+] передатся так же эффективно, как прион [PIN+] [Patel and Liebman, 2007]. Невысокие частоты цитодукции характерны для факторов, белки-детерминанты которых имеют преимущественно ядерную локализацию [Du et al. 2008; Patel et al., 2009]. Эти данные позволяют предположить, что детерминант фактора [NSI+] локализован в ядре.

Таблица 12. Передача фактора [NSI+] методом белковой трансформации

–  –  –

На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+] обладает всеми характеристиками дрожжевого приона – возникает de novo после элиминации, демонстрирует доминантное нехромосомное наследование и обладает инфекционностью.

Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 3.1.5.

3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявление [NSI+] Для выявления генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявление [NSI+], мы оценили эффект сверхэкспрессии всех дрожжевых генов в штамме 1-1-D931 [NSI+]. Этот штамм был трансформирован плазмидами библиотеки YSC4613. Библиотека включает 1588 клонов E. coli, несущих челночный многокопийный вектор pGP564 с уникальными фрагментами генома S. cerevisiae, размером от 9 до 13 тысяч пар нуклеотидов и содержащими от 4 до 12 открытых рамок считывания. Каждый клон содержит одну плазмиду с несколькими генами S. cerevisiae с известной индивидуальной нуклеотидной последовательностью. Штамм 1-1-D931 был трансформирован всеми плазмидами библиотеки, трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина и переносили методом отпечатков на среду без лейцина и аденина. Всего на селективной среде без аденина было проанализировано по восемь трансформантов каждой из 1588-ми плазмид. В результате скрининга было установлено, что на рост штамма на селективной среде без аденина влияют шесть плазмид геномной библиотеки: YGPM18l24, YGPM25e16, YGPM27n12, YGPM4g14, YGPM17m07 и YGPM18d16, причем трансформация плазмидами YGPM4g14 и YGPM17m07 приводит к усилению роста, а YGPM18l24, YGPM25e16, YGPM27n12 и YGPM18d16 – к подавлению.

Плазмиды YGPM4g14 и YGPM17m07 содержат ген ADE1, сверхэкспрессия которого закономерно приводит к усилению роста штамма на среде без аденина, однако не влияет на рост штамма на среде без триптофана. Плазмида YGPM18d16 содержит ген SUP35, экспрессия которого, как мы показали ранее, маскирует [NSI+]-зависимую нонсенс-супрессию. Интересно отметить, что штамм 1-1-D931 содержит фактор [PIN+], и сверхэкспрессия гена SUP35 в таких штаммах обычно приводит к прионизации Sup35 и индукции нонсенс-супрессии, но в присутствии фактора [NSI+] этого не происходит.

Оставшиеся три плазмиды (YGPM18l24, YGPM18l24 и YGPM25e16) наряду с другими генами содержали ген SUP45. Этот ген кодирует основной фактор терминации трансляции eRF1 эукариот [Zhouravleva et al., 1995]. Мы предположили, что сверхэкспрессия именно этого гена вызывает повышение эффективности терминации трансляции в штамме 1-1-D931 и маскирует [NSI+]опосредованную нонсенс-супрессию. Для проверки этого предположения мы использовали центромерную плазмиду pRS315-SUP45, любезно предоставленную Г.А. Журавлевой (СПбГУ), несущую ген SUP45 дикого типа под контролем собственного промотора. Трансформация плазмидой pRS315-SUP45 действительно вызвала подавление роста штамма на среде без аденина (Рис.17А).

Элиминация этой плазмиды приводила к восстановлению супрессорного фенотипа.

Мы предположили, что детерминант [NSI+] участвует в регуляции экспрессии SUP45 на уровне мРНК. Если на фоне [NSI+] происходит снижение относительного количества мРНК SUP45, то это может приводить к уменьшению количества данного белка и снижению эффективности терминации трансляции.

Для проверки этого предположения мы сравнили относительные количества мРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] при помощи ПЦРРВ.

Данные, полученные для четырнадцати независимо полученных проб мРНК каждого из штаммов, воспроизведнные в трх повторностях, показали, что в штамме [NSI+] достоверно (p0,01) снижено количество мРНК SUP45 в сравнении со штаммом [nsi-] (значения параметров Сt составляют 2,08±0,521 и 1,00±0,289 для [NSI+] и [nsi-] штаммов, соответственно) (Рисунок 17Б).

Рисунок 17. Фактор [NSI+] снижает уровень экспрессии гена SUP45. А – Трансформация штамма [NSI+] центромерной плазмидой с копией гена SUP45 вызывает маскировку супрессорного фенотипа, но после потери плазмиды фенотип восстанавливается. Б - Относительное количество мРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-]. В – Сравнительный анализ относительного количества белка Sup45 в штаммах [NSI+] и [nsi-], находящихся в экспоненциальной и стационарной фазе роста. Показаны результаты Вестерн-блот гибридизации для одной пары клонов [NSI+] и [nsi-]. Количественные данные денситометрического анализа вычислены для четырх пар независимых клонов и представлены как среднее значение измерений интенсивности сигналов Sup45/Tub1 ± стандартное отклонение.

Наблюдаемая разница соответствует снижению количества мРНК SUP45 в штамме [NSI+] приблизительно в два раза (2-Ct=2,14), что полностью объясняет антисупрессорный эффект введения SUP45 на центромерной плазмиде. С помощью Вестерн-блот гибридизации мы сравнили количество белка Sup45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на экспоненциальной и стационарной стадии роста (дрожжи инкубировали в течение одного и трх дней, соответственно, в жидкой среде при 300С). Количество тотального белка в клетках штаммов [NSI+] и [nsi-] выравнивали по методу Бредфорда [Bradford, 1976] и в соответствии с интенсивностью сигнала тубулина (Tub1) при использовании антител T6074. Результаты количественной оценки данных Вестерн-блот гибридизации показали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах [NSI+] статистически достоверно (p=0,009) снижено в сравнении со штаммами [nsi-] в клетках, находящихся в стационарной, но не в экспоненциальной фазе роста. На рисунке 17В представлены результаты сравнительного анализа количества белка Sup45 в клетках [NSI+] и [nsi-] в одной из четырех пар независимо полученных клонов. Полученные медианы относительного содержания Sup45p в штаммах [NSI+] и [nsi-] равны 0,54±0,088 и 1,00±0,260, что соответствует снижению содержания Sup45p в штаммах [NSI+] в стационарной фазе роста приблизительно в два раза. Таким образом, возникновение детерминанта [NSI+] вызывает снижение содержания мРНК SUP45 в клетке, что закономерно приводит к уменьшению количества белка Sup45 в стационарной фазе роста и к нонсенс-супрессии.

3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] Сверхпродукция прионформирующих белков, зачастую, хотя и не всегда, резко повышает частоту индукции прионной изоформы de novo [Wickner et al., 2002; Du and Li, 2014]. На этом свойстве базируется один из основных методов идентификации дрожжевых прионов. Для поиска белков, сверхпродукция которых вызывает индукцию нонсенс-супрессорного фенотипа в штамме [nsi-], была использована дрожжевая адресная библиотека YSC4613 “Open Biosystems”, плазмиды которой содержат перекрывающиеся фрагменты генома S. cerevisiae (см. главу «Материалы и методы» и предыдущий раздел).

Поскольку спонтанное возникновение фактора [NSI+] было отмечено исключительно в штаммах [PIN+], для трансформации плазмидами библиотеки был использован штамм 1-D933 [nsi-], содержащий прионный детерминант [PIN+].

В результате эксперимента было выявлено 24 плазмиды, трансформация которыми вызывала нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] (таблица 13). Эти плазмиды содержат 178 индивидуальных генов. Следует отметить, что последовательности геномных фрагментов, клонированных в плазмиды библиотеки, перекрываются. С учтом этого, потенциальными кандидатами на роль детерминанта фактора [NSI+] могут быть только те гены, которые представлены в составе выявленных 24 плазмид, однако отсутствуют в плазмидах, трансформация которыми не приводит к супрессии. Таким образом, количество потенциальных кандидатов на роль гена-детерминанта фактора [NSI+] сокращается до 75 генов.

–  –  –

Супрессия нонсенс–мутации trp1-289(UAA), как и ингибирование роста на среде с галактозой, была отмечена при трансформации штамма 1-D933 [nsi-] лишь одной из 24-х плазмид. Эта плазмида содержит 11 генов, влияние которых на супрессию нонсенс-мутаций ранее показано не было. Один из этих генов, а именно VTS1 (плазмида YGPM2f04, таблица 13), контролирует стабильность мРНК [Aviv et al., 2003] и, кроме того, кодирует потенциально прионогенный белок, содержащий глутамин-аспарагин обогащнную последовательность [Harrison and Gerstein, 2003].

Таблица 13. Плазмиды геномной библиотеки YSC4613, трансформация которыми вызывает нонсенс-супрессию в штамме 1-D933 [nsi-] Плазмида Название генов в составе плазмиды CHD1, PAB1, YER165C-A, DNF1* YGPM10p05 плазмиды SAC3**, SSY1, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1** YGPM11n12 CHD1**, PAB1, YER165C-A, DNF1* YGPM11p20 LCD1**, RPL37B, PLM5, SAM2, LPP1, SPG3, PSP1, YDR506C** YGPM14f05 YGPM14k18 YPR150W***, SUE1, YPR152C, YPR153W, PIN3, NCA2, TPO3, YPR157W*

–  –  –

Мы сконструировали плазмиду pU-VTS1, в которой последовательность, кодирующая белок Vts1, находится под контролем индуцибельного промотора CUP1. Сверхэкспрессия VTS1 в штамме 1-4-1-1-D931 [nsi-], как мы и ожидали, вызывает супрессию нонсенс-мутаций ade1-14 и trp1-289, а также вызывает ингибирование роста дрожжей на среде с галактозой, но не на среде с глицерином (рис. 18А). Таким образом, эффекты сверхпродукции гена VTS1 имеют сходное проявление с фактором [NSI+].

Рисунок 18. Влияние изменения уровня экспрессии гена VTS1 на фенотип штаммов, содержащих фактор [NSI+]. А – Сверхэкспрессия гена VTS1 в штамме [nsi-], также как и фактор [NSI+], вызывает рост клеток на средах без аденина и триптофана и ингибирует рост на среде с галактозой, но, в отличие от [NSI+], не влияет на темпы роста на среде с глицерином; Б – Нонсенс-супрессия, возникающая в штамме [nsi-] при трансформации плазмидой pU-VTS1, элиминируется после потери плазмиды; В – Штамм 9-1-1-D931 [NSI+] с делецией гена VTS1 демонстрирует супрессию, которая элиминируется GuHCl.

Вместе с тем, элиминация плазмиды pU-VTS1 приводит к потере супрессорного фенотипа (рис. 18Б). Кроме того, супрессорный фенотип сохраняется в штамме [NSI+] на фоне делеции гена VTS1 (рис. 18 В). Супрессия элиминируется на среде с GuHCl. Эти данные однозначно доказывают, что ген VTS1 не является детерминантом фактора [NSI+].

На основании полученных результатов можно заключить, что генетический скрининг позволил выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияет на проявление фактора [NSI+] или вызывает сходные эффекты, однако гендетерминант [NSI+] этим методом обнаружить не удалось.

Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в 3.2.

дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»

Генетический скрининг не позволил выявить ген-детерминант фактора [NSI+]. Делеционный скрининг не может использоваться для выявления жизненно-важных генов, кодирующих прионные белки, а сверхэкспрессия геновдетерминантов прионов не всегда приводит к заметному повышению частот индукции прионов [Du and Li, 2014]. Таким образом, генетические подходы при идентификации прионов могут быть неэффективны. Для решения поставленных в работе задач мы разработали метод идентификации амилоидов, основанный на знании их универсальных биохимических свойств.

3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»

При разработке метода протеомного скрининга и идентификации амилоидов, названного нами PSIA (Proteomic Screening for Identification of Amyloid proteins) мы основывались на предложенном ранее подходе по выделению и очистке высокомолекулярной фракции детергент-устойчивых белковых агрегатов, обогащнной амилоидами [Kushnirov et al., 2006]. Для выявления и идентификации в этой фракции любых, даже минорных белков, формирующих амилоидные агрегаты, мы разработали схему экспериментов, объединяющую несколько биохимических и протеомных методов, и апробировали е на примере выявления уже известных дрожжевых прионов [PIN+] и [PSI+].

Методика включает три основных этапа:

1) Выделение и очистка при помощи серии ультрацентрифугирований белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами.

2) Разделение фракции белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, при помощи двумерного электрофореза белков, связанных с флуорохромами.

3) Выделение окрашенных белков из геля, трипсинолиз и идентификация с помощью масс-спектрометрии.

Выделение белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, в клетках штамма GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенного деривата GT409 [psi-][pin-] было проведено как описано в главе «Материалы и методы». Детергент-устойчивую фракцию белковых агрегатов растворяли в буфере, содержащем хаотропные агенты, а нерастворимые в буфере белковые агрегаты отделяли центрифугированием. Растворимые в буфере белки из штамма [PSI+][PIN+] окрашивали красным флуорохромом Cy5, а из штамма [psi-][pin-] зелным флуорохромом Cy3. На следующем этапе белки, выделенные из обоих штаммов, смешивали и разделяли методом двумерного гель-электрофореза. На рис 19А и 19Б представлены результаты выделения белковых агрегатов, устойчивых к обработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, соответственно. Необходимость использования саркозината связана с тем, что некоторые амилоиды неустойчивы к обработке SDS, но не растворяются при использовании более мягких детергентов [Urakov et al., 2010; Coalier et al., 2013]. Белкам, представленным в обоих штаммах, соответствуют жлто-зелные сигналы, тогда как белки, образующие агрегаты исключительно в штамме [PSI+][PIN+], окрашены красным цветом. Красные пятна, как в случае обработки SDS, так и при обработке саркозинатом, были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии как белок Rnq1 – детерминант приона [PIN+] (данные спектрометрии представлены в таблицах 14 и 15). В обоих случаях белку Rnq1 соответствовали несколько сигналов, различающихся по изоэлектрической точке, но не по массе. Это может быть связано с посттрансляционными модификациями белка Rnq1. Белкам, формирующим агрегаты, устойчивые к 1% SDS как в штамме [PSI+][PIN+], так и в штамме [psi-][pin-], соответствовали жлтые сигналы, образующиеся в результате наложения флуорохромов Cy3 и Cy5. Этим сигналам соответствовали белки Gas1, Ape1 и Ape4 (рис. 19 А; таблица 14).

Белки Gas1, Ape1 и Ape4 были выявлены также при обработке фракции белковых агрегатов 3% саркозинатом натрия (рис. 19Б; таблица 15). Эти белки либо образуют конститутивные амилоидные полимеры в дрожжах, либо формируют детергент-устойчивые агрегаты неамилоидной природы. В результате обработки белковых агрегатов саркозинатом, который является более мягким детергентом в сравнении с SDS, на геле выявляется гораздо больше жлтых сигналов, которым соответствуют белки, образующие агрегаты в штаммах [PSI+][PIN+] [psi-][pin-].

и Существенная часть этих белков, являются компонентами 20S субъединицы протеасомы (рис. 19Б; таблица 15). К ним относятся все белки семейства Pre, а также белки Pup3 и Scl1 (SGD, http://www.yeastgenome.org). Очевидно, этот белковый комплекс не имеет отношения к амилоидам, но демонстрирует устойчивость к обработке 3% саркозинатом натрия.

Важно отметить, что наличие относительно большого количества белков не мешает выявлению прионов, поскольку использование разноцветных флуорохромов позволяет чтко выявлять белки, формирующие агрегаты исключительно в прионсодержащем штамме. Отметим, что белок Sup35, образующий прионные агрегаты в штамме [PSI+][PIN+], не выявлен с помощью двумерных электрофорезов (рис. 19 А и 19Б). Мы показали, что Sup35 выявляется в штамме [PSI+][PIN+], во фракции белковых агрегатов, нерастворимых в буфере для двумерного электрофореза. Белки из этой фракции, выделенные из опытного и контрольного штаммов, были денатурированы кипячением в 2% SDS, разделены с помощью одномерного гель-электрофореза и визуализированы окрашиванием кумасси R250. Полоска, представленная исключительно в штамме [PSI+][PIN+] (рис.19В), была идентифицирована масс-спектрометрией как белок Sup35 (таблица 16).

Рисунок 19. Белки, формирующие детергент-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-]. А - Изображение двумерного гель электрофореза белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты. Белки из штаммов [PSI+][PIN+] [psi-][pin-] и окрашены флуорохромами GT81-1C GT409 Cy5(красный) и Cy3(зелный), соответственно. Б – Изображение двумерного гель электрофореза белков, образующих саркозинат-устойчивые агрегаты. Белки из штаммов GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] окрашены флуорохромами Cy5(красный) и Cy3(зелный), соответственно. В – Изображение одномерного электрофореза, белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты, нерастворимые в буфере с хаотропными агентами.

Таким образом, мы показали, что прионные агрегаты Sup35 демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработке хаотропными агентами (8 M мочевина, 2 M тиомочевина и 4% CHAPS).

Таблица 14. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19A).

–  –  –

Примечания:

1 Здесь и далее - счт – показатель, отражающий достоверность идентификации белка (см. «Материалы и методы»). Указан счт, с которым были идентифицированы белки в образце из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].

* Белок выявлен и идентифицирован только в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] (Здесь и далее для таблиц 14 -17).

Таблица 15. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующих агрегаты, устойчивые к обработке саркозинатом натрия, в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19Б).

–  –  –

Таблица 16. Идентификация белков, выявленных на одномерном электрофорезе в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19В), методом массспектрометрии.

–  –  –

Несмотря на эффективность и удобство для демонстрации результатов, этот метод имеет определнные ограничения:

1) Белки с экстремальной изоэлектрической точкой (ниже 3,5 и выше 9,5) не разделяются с помощью двумерного электрофореза и выпадают из анализа;

2) Белки, которые продуцируются на крайне низком уровне, могут, не детектироваться на геле.

Для того, чтобы повысить разрешающую способность методики, мы отказались от использования двумерного электрофореза. Фракцию белков, образующих агрегаты устойчивые к обработке 1% SDS при комнатной температуре, выделяли так же как описано выше.

Таблица 17. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409[psi-][pin-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDI,

–  –  –

Указаны показания счта масс-спектрометрии для образца из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].

На следующем этапе белки растворяли в концентрированной муравьиной кислоте, высушивали в вакуумном испарителе и денатурировали кипячением в буфере с 2% SDS. Далее пробы обессоливали, расщепляли на пептиды с помощью трипсина, пептиды разделяли на колонке HPLC и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии (см. главу “Материалы и методы»). Такой подход лишн недостатков, которые возникают при использовании двумерного электрофореза.

Кроме того, отсутствие этапа выделения белка из геля повышает чувствительность метода. Необходимость использования муравьиной кислоты связана с тем, что фибриллы некоторых амилоидных белков не растворимы даже при кипячении в буфере с SDS.

В таблице 17 представлены белки, идентифицированные с помощью новой модификации нашего метода в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенном деривате GT409 [psi-][pin-]. Данный подход позволяет идентифицировать белки, представленные в пробах даже в следовых количествах. В таблице 17 представлены лишь первые 30 белков, идентифицированных в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] с самым высоким счтом. Из таблицы исключены данные идентификации белков большой и малой субъединиц рибосомы, которые были выявлены в обоих штаммах (результаты не представлены). Для всех этих рибосомных белков характерна экстремально щелочная изоэлектрическая точка (pI 10), что препятствовало их выявлению при использовании двумерного электрофореза (см. рис. 19А и 19Б). По всей вероятности, субъединицы дрожжевой рибосомы представляют собой прочный РНП-комплекс, который не полностью распадается на отдельные белки в результате обработки РНК-азой А и 1% SDS при комнатной температуре.