WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Коллаген играет также важную роль в регулировании нормальной 4.

полифирации (размножения) клеток. Например: он регулирует активность клеток гладких мускулов во время клеточного деления.

Коллаген задерживает развитие некоторых опухолевых образований, 5.

например, клеток меланомы, в результате совместных действий с интегринами и индукции ингибитора циклина. В механизмах подавления патологических клеточных трансформаций принимает также участие гидроксипролин, структурный признак этого белка.

Коллаген обеспечивает возможность роста (адгезии) и укрепления 6.

клеток во внеклеточном матриксе в результате взаимных действий с рецепторами оболочки.

Коллаген стимулирует создание оболочек клеток.

7.

Множество наследственных генетических дефектов, связанных с мутациями в молекулах коллагенов или ферментов, принимающих участие в их биосинтезе, говорит о важной роли коллагеновых белков. Такие дефекты могут оказывать влияние на структуру и функцию цитоскелета, связок, сухожилий, кожи, глаз, кровеносных сосудов, волос и даже размеров тела (например синдром ЭлераДанлоса).

Гидроксилирование остатков пролина и лизина в молекуле проколлагена катализируется проколлаген-гидроксилазами, имеющими в активном центре атомы железа. В качестве кофермента используется аскорбат (витамин С).

Симптомы дефицита витамина С, такие, как выпадение зубов, кровоточивость десен или повреждения кожи (цинга), объясняются нарушением биосинтеза коллагенов.

Рыбные коллагены по большей части относятся к I и III типам, аналогично коллагенам скелетных мышц человека. Рыбный и животный коллаген состоит из субъединиц, закрученных в спираль и имеющих относительную молекулярную массу 300000. Большое содержание глицина и пролина является характерной особенностью аминокислотного состава коллагена. Эти аминокислоты формируют повторяющуюся последовательность: пролин – глицин – Х, где Х – другая аминокислота. Такая повторяющаяся последовательность и получающиеся в результате связи обуславливают спиралевидную структуру коллагена. Еще одной отличительной особенностью рыбного коллагена является более низкое содержание аминокислот (гистидин, фенилаланин, лизин, лейцин, валин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты) и как следствие, меньшее число поперечных связей, а также несколько иной аминокислотный состав (гидроксопролин и гидроксилизин) одной из цепей. Поэтому температура сокращения и разложения рыбного коллагена ниже аналогичной температуры теплокровных животных. Так, если коллаген КРС после нагревания в течение 2,5 минут подвергается желатинизации примерно на 10%, то коллаген рыбного происхождения при тех же условиях разрушается на 50-60 и до 75% [56].

32 Важно отметить, что глубокие исследования особенностей строения коллагеновых белков, функций, свойств, способов их получения, сохранения в нативном виде, эффективности и т.д. имеют большое прикладное значение для различных отраслей экономики, которые используют коллаген в своей деятельности.

1.3 Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях экономики

В последние годы в средствах массовой информации часто говорится о коллагене как о модном средстве, возвращающем молодость коже, придающем блеск и крепость волосам, здоровье костям и суставам. Однако в медицине и фармацевтике коллаген нашел широкое применение уже довольно давно.

Коллаген является вспомогательным веществом в технологии различных лекарственных форм. Коллаген раскрывает всю гамму фармакологических свойств препарата, обеспечивает оптимальное действие лекарственного вещества, позволяет снизить концентрацию лекарственного вещества при сохранении терапевтического эффекта, понижает токсичность ряда лекарственных веществ, что позволяет вводить эти препараты в большем количестве. [45,55,56,59,84] Уникальная структура коллагена, наличие на его поверхности большого количества активных функциональных группировок позволяют использовать его в качестве матрицы для иммобилизации различных биологически активных и лекарственных веществ. К настоящему времени изучены комплексы коллагена со различными веществами. Например, в комплексе с гепарином установлено, что пролонгированный антикоагуляционный эффект связан с существованием достаточно прочного коллаген-гепаринового комплекса. После растворения в крови имеются агрегаты-молекулы гепарин-коллагена, которые функционируют достаточно активно до тех пор, пока полностью не деградирует белковая часть комплекса, после чего гепарин инактивируется обычным путем.[57,75,] Большое значение имеет взаимодействие коллагена с антибиотиками.

Коллаген не только пролонгирует действие антибиотиков, но в ряде случаев снижает их токсичность. [126] Учеными З. Рущак и В. Фрисс (Германия, США) изучена возможность использования коллагена в качестве носителя антибиотиков для их доставки к участку воздействия в офтальмологии, стоматологии и для заживления ран.[87,88] К достоинствам препарата можно отнести также его способность избирательно адсорбировать на себе отдельные белковые компоненты биологических жидкостей, обладающие сродством к определенным участкам молекулы коллагена, что позволяет эффективно использовать его и как матрицу при выполнении аффинной хроматографии.

Преимущество коллагена перед синтетическими полимерами заключается в том, что он является растворимым полимером и подвергается резорбции в живом организме, сроки которой можно регулировать в широких пределах. [87] Коллагена обладает способностью ускорять заживление ран, усиливать адгезию тромбоцитов и вызывать гемостаз и другие свойства при отсутствии антигенности обусловили его широкое применение в реконструктивной хирургии (дефекты кожи, обширные ожоги, деформирующие шрамы, пигментация, хирургия сухожилий, травма мышц и т.д.) [6,9,84,88,91,108] В медицине на основе коллагена были разработаны различные средства для быстрой остановки кровотечений (средства местного гемостаза), для лечения ран, ожогов, трофических язв, пролежней, а также лекарственные формы (мягкие и жидкие), специальные пластыри, пленки, нити, трубки и губки, импланты для ортопедии, травматологии, челюстно-лицевой хирургии и др. (рисунок 1.7) [5,6,33,87,88] а б в г Рисунок 1.7 – медицинские коллагеновые продукты: а – дентальные импланты; б – гель для лечения повреждений кожных покровов; в – кровеостанавливающие миркотупферы и губка, биоповязка, г – гелевое раневое покрытие.

В последнее время коллаген становится популярным компонентом БАДов.

Чаще всего его используют в сухом виде. Лиофилизация является одним из методов получения высушенных продуктов. Она основана на сублимационной сушке и проводится при температуре ниже 0°С при пониженном давлении. Этот процесс используется для сушки особенно чувствительных соединений и веществ, в частности неустойчивых к нагреванию. В результате этого процесса активные вещества остаются активными и не разрушаются ценные соединений, т.е.

витамины, белки, ферменты, минеральные компоненты и т.д.

Лиофилизированные препараты содержат только следовые количества воды и не требуют консервирования. После лиофилизации полученный препарат можно легко регидратировать без потери каких-либо органолептических и биологических свойств. [29,34] Коллагенсодержащие препараты предназначены для укрепления связок и суставов, для повышения эластичности кожи, а также для укрепления ногтей, волос. Так же коллаген показан при высоких нагрузках, в качестве дополнения к питанию при занятиях спортом, а также после травм. Такие препараты часто рекомендуют в послеоперационный период. На рисунке 1.8 приведены примеры таких БАД. [36,103] а б в г д Рисунок 1.8 – Биологически активные добавки с коллагеном: а - «Коллагенультра», производство Франция; б – коллагенсодержащий кофейный напиток «Nescafe»; в – пептид коллагена «Hua-shen», г – «Артрос», производство Россия, д

- Colvita, производство Польша.

Главным свойством, обуславливающим применение коллагенсодержащего сырья в косметологии, является его способность стимулировать выработку собственного коллагена и восстанавливать коллагеновый каркас кожи (безоперационный лифтинг лица), не маскируя тем самым проблемы, а устраняя их причину. Именно поэтому специалисты в области эстетической медицины признают коллаген лечебным: по своей эффективности он сопоставим с инъекциями профессиональных косметологов и для разглаживания морщин не нужен скальпель. [49,54,56,89] Коллаген и его гидролизаты часто входят в рецептуры разнообразных кремов, шампуней, бальзамов, кондиционеров, эликсиров, масок, в том числе тканевых, коллагеновых листов и др.

как влагоудерживающие и питательные компоненты. Эффективность этих косметических средств объясняется тем, что коллаген образует пленку, которая действует как влажный компресс и приводит к снижению трансэпидермальной потери воды кожей. Благодаря гигроскопическим свойствам коллаген повышает влажность рогового слоя кожи, что позволяет считать косметические средства с коллагеном геронтопротектором. Крупнейшими производителями косметики с коллагеном являются Польша (Colway, Kolastyna), Китай (Hua-shen, TianDe) и Япония (Amicolla, Sakura, EJI, EJI-extra, KWC)(рис.

1.9)[54,89,135,141]

–  –  –

В пищевой промышленности коллаген и его гидролизаты используются в производстве желатина, для осветления вин, получения пищевых пленочных покрытий и съедобных оболочек, в качестве структурообразователя, при производстве искусственной икры, бульонов, студней, соусов, различных оздоровительных напитков и коктейлей и как добавки в хлебопекарном и кондитерском производствах. [147,148] Коллаген очень плохо поддается действию пищеварительных ферментов и является не полноценным белком, что объясняется особенностями аминокислотного состава. Однако в последнее время роль коллагена в питании пересмотрена. Физиологическое действие коллагена позволяет отнести его к пищевым волокнам. В то же время доказано, что при оптимальном сочетании мышечных белков и коллагенов показатель чистого усвоения белка максимален.[55,56] Продукты гидролиза коллагена, такие как глютин, желатин и др.

стимулируют секреторную и двигательную функции ЖКТ, оказывают положительное влияние на состояние и функционирование полезной микрофлоры кишечника, поэтому могут быть использованы в качестве аналога пищевых волокон.[55] В результате комплекса исследований, проведенных группой авторов под руководством проф. Антиповой Л.В., изучено коллагенсодержащее сырье животного и рыбного происхождения, его свойства и способы модификации (в том числе биотехнологические). Получены коллагеновые дисперсии, определены их свойства и перспективы применения.

Коллективом ученых под руководством Сапожниковой А.И. был проведен широкий спектр исследований по получению коллагенов из отходов кожевенного производства, изучению их свойств и способам применения. [90,125,126] Дворяниновой О.П. показана возможность получения коллагеновых дисперсий из кожи морских рыб и ее применение в технологии желейных продуктов, рубленых полуфабрикатов, как аналогов пищевых волокон и съедобных покрытий.[75] Предложена технология получения коллагеновой субстанции из шкур пресноводных рыб. Установлена ее сорбционная способность, в качестве носителя йода.[76] Глотовой И.А. обоснованы условия получения и очистки коллагеновых белков, методами биотехнологии. Получены пищевые дисперсионные системы на основе коллагенов. Предложена их классификация по технологической функциональности и прикладному значению.[64,65] Болтыховым Ю.В. изучался вопрос получения и применения коллагенсодержащих пленкообразующих композиций с использованием СО2экстрактов растительного сырья в технологии мясных продуктов. Такие покрытия обладают антиоксидантной и бактериостатической активностью, а продукты имеют улучшенные потребительские свойства, показатели биологической ценности и сроки годности. [50] С использованием методов биотехнологии Сторублевцевым С.А. из жилок КРС был получен коллагеновый гидролизат, который проявляет сорбционную активность в отношении ионов тяжлых металлов и устойчив к действию ферментов ЖКТ, что дает основание отнести его к аналогам пищевых волокон.

[134] В результате исследований Вторушиной И.В. обоснован биотехнологический способ получения коллагена. Доказана нетоксичность и биологическая активность иммобилизованных коллагеновых препаратов селена. [57] Галиной Ю.Ф. определены условия биомодификации отходов жиловки говядины с целью получения продуктов гидролиза.

Установлено, что применение гидролизата коллагена улучшает функционально-технологические свойства (ФТС) продуктов. [62] Хаустовой Г.А разработана технология глубокой и комплексной переработки шкуросырья пресноводных рыб для получения биополимеров: коллагена, гиалуроновой кислоты и готовых кож. [145] Пащенко Л.П. было показано, что добавление коллагенового гидролизата в технологии производства пряников, повышает биологическую и пищевую ценность, а так же позволяет сэкономить сырье, и является экономически целесообразным. [112] Кафедра химии ФГОУ ВПО «Кубанского государственного технологического университета» в течение нескольких лет проводит исследования в области переработки коллагенсодержащих рыбных отходов с целью использования их в кормовом и пищевом направлениях. На основании проведенных исследований разработаны способы получения кормовой белковоминеральной муки и пищевой добавки [55,56].

Сотрудниками Московского государственного университета прикладной биотехнологии разработаны технологии применения коллагенсодержащего сырья при производстве пищевых продуктов (Е.И. Титов, С.К. Апраксина, Л.Ф.

Митасева, А.Ю. Соколов, 2008), показана разработка пищевых продуктов с использованием субпродуктов II категории и коллагенсодержащего сырья. [138].

Сербскими учеными [20] проведены исследования влияния концентрации красителей на свойства пищевых коллагеновых оболочек. Установлено, что красители снижают прозрачность, увеличивают прочностные характеристики сухих и уменьшает влажных оболочек, не влияют на прохождение водяного пара.

Применительно к технологии продуктов питания с повышенным сроком годности представляет интерес цикл работ ученых проблемной лаборатории биополимеров Московского государственного университета прикладной биотехнологии под руководством Розанцева А.Г. по модификации натуральных, искусственных белковых оболочек водными растворами антимикробных действующих веществ в сочетании с добавками синергического действия. В качестве антимикробных действующих веществ использована натриевая соль дегидрацетовой кислоты (ДГК) и ее смеси с пищевыми кислотами - лимонной, молочной и т.д. Улучшение физико-химических свойств модифицированных коллагеновых оболочек, авторы связывают со специфическими взаимодействиями в системе коллагеновые компоненты оболочек – ДГК (натриевая соль ДГК) – вода [134].

Широко известны коллагеновые оболочки для мяса и мясных продуктов, например «Белкозин» (рисунок 1.7). Бразильские ученые [11] разработали пищевые коллагеновые покрытия для фруктов. Их использование снижет передачу газов и увеличивает срок хранения.

Рисунок 1.10 – пищевые коллагеновые оболочки В комбикормовой промышленности коллаген используется для производства кормов с целью увеличения их биологической ценности, прочности гранул и увеличения времени их растворения при нахождении в воде.

Особенно актуально использование продуктов гидролиза коллагена при производстве стартовых комбикормов для молоди ценных пород рыб и гидробионтов, способствующих увеличению процента их выживаемости. [56] В зависимости от степени гидролиза отходов рыбопереработки можно получить продукты с различными свойствами: обогащающую кормовую добавку (полипептиды, свободные аминокислоты) или увеличивающую пищевую привлекательность корма.[55,132] Добавление коллагенсодержащего сырья в корма для птиц, положительно влияет на оперяемость, сокращает срок линьки и повышает яйценоскость. В пушном звероводстве способствует получению качественного (прочного, блестящего) меха.[145] Коллагеновые гидролизаты используют в качестве питательных сред при культивировании микроорганизмов.[134] Кроме того коллаген применяется в полиграфии, при производстве фотопленок, телевизионных трубок и видеокамер, а также используется в качестве держателя кремниевых чипов в компьютерах и микропроцессорах, в красках для автомобилей и как клей.[31].

В связи с большой востребованностью коллагеновых белков, остается актуальным вопрос поиска новых источников безопасных, экономически целесообразных и эффективных коллагенов.

ГЛАВА 2. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЕКТЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристика объектов исследований и условия эксперимента Объектами исследования служило вторичное коллагенсодержащее сырье рыбной промышленности - шкуры, выделяемые в качестве отходов при разделке прудовых рыб в условиях цеха рыбоперерабатывающего предприятия ООО «Фосфорель» г. Воронежа.

В качестве объекта исследования использовали шкуры следующих видов рыб:

- промысловых – сазан, щука; - прудового выращивания – толстолобик пестрый.

Рыбу в возрасте 3 - 4 года, масса 1 - 3 кг (масса толстолобика в среднем 2,5-3,0 кг на одну голову, щуки - 1,5 – 2,5 кг, сазана 1,0 - 1,5 кг). Сырье доставляли из Павловского района Воронежской области.

Свежую рыбу очищали от чешуи, удаляли внутренности, отделяли плавники, голову и хвост. Шкуры с рыбы снимали вручную или на шкуросъемной машине Nock CF 460 с последующей зачисткой внутренней стороны шкуры от остатков мышечной ткани, после чего промывали проточной водой при температуре 8-12оС.

Замороженные рыбные шкуры хранили в морозильных камерах при температуре минус 18С, перед использованием дефростировали при 10 – 15С в течение 6 – 12 часов.

Вспомогательное сырье и материалы, применяемые для исследования:

- дистиллированная вода по ГОСТ 6709-72;

- кислота уксусная для пищевой промышленности по ГОСТ Р 55982-2014;

- раствор перекиси водорода по ГОСТ 177-88;

- натрия гидроксид по ГОСТ Р 55064-2012;

43

- спирт этиловый по ГОСТ17299-78;

- культура Parameciа caudatum;

- кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908-2004;

- кислота янтарная по ГОСТ 6341-75;

- кислота молочная ГОСТ 490-2006;

- мыло хозяйственное твердое 72% ГОСТ 30266-95;

- 2% раствор коллагена животного происхождения по P N 000835/01-170807, «Белкозин»;

- глицерин дистиллированный. Общие технические условия ГОСТ 6824-96.

2.2 Порядок проведения экспериментов

Экспериментальные исследования проводили в условиях кафедр технологии продуктов животного происхождения, физической и аналитической химии Воронежского государственного университета инженерных технологий; научно исследовательских лабораторий Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко; научно-исследовательских лабораторий Пущинского научного центра Российской академии наук (г. Пущино); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» (г. Воронеж); ИЦ «Бирюч» (Белгородская обл.). Схема экспериментальных исследований представлена на рисунке 2.1

–  –  –

Общий химический состав коллагенсодержащего сырья рыбной промышленности, коллагена определяли методами:

- массовая доля влаги – термогравиметрическим методом в соответствии с требованиями ГОСТ 9793-74 [57] и рекомендациям [37];

- жир – рефрактометрическим методом после проведения экстракции жира из высушенной навески образца монобромнафталином в соответствии с рекомендациями [37];

- минеральные вещества - гравиметрическим методом после минерализации С, пробы в муфельной печи при температурном режиме 500-700 продолжительностью 5-6 часов до постоянного значения массы соответственно рекомендациям [37];

– белок – методом Кьельдаля [111].

Поваренную соль в пищевых продуктах определяли согласно рекомендациям [95] Для определения фракционного состава белков применяли последовательное экстрагирование дистиллированной водой, солевым раствором Вебера и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10 % водо-, соле- и щелочерастворимых белковых фракций соответственно, белок количественно определяли биуретовым методом. [37].

Концентрация белка в растворах определялась с помощью калибровочного графика, который строили для растворов сывороточного альбумина.

Содержание коллагена в шкурах прудовых рыб количественно определяли по методу Воловинской [37]. Он основан на экстрагировании фракций коллагеновых белков с последующим определением в экстрактах белкового азота методом Биурета.

Определение органолептических показателей осуществляли согласно методике [37].

Микроструктурные исследования шкур исследуемых видов рыб проводили прямым микроскопированием парафиновых срезов тканей, которые готовили соответственно методике [37,136]. Образцы для исследования фиксировали в 10 %-м нейтральном формалине. Срезы получали на охладителе микротома ОМТ

0228. Окрашивание проводили методом гематоксилин эозин, где ядерным красителем выступает квасцовый гематоксилин Эрлиха, основным – эозин В.

Микробиологическую чистоту определяли в соотвествии с указаниями [67,136].

Водородный показатель измеряли при помощи портативного pH-метра "HANNA Instruments"HI 8314 F.

Окраску (цветность) жидкостей определяли визуальносогласно рекомендациям [37,134,145].

Для определения подлинности коллагена проводили биуретовую реакцию [37,66].

Определение функционально-технологических свойств Функционально-технологические свойства фаршевых систем включают показатели: влагосвязывающая (ВСС), влагоудерживающая (ВУС), жироудерживающая (ЖУС) способности, которые определяли согласно методике [37].

Определение безвредности и биологической активности проводили на биотесте (культура Parameciа caudatum). В качестве биотеста использовался легко культивируемый свободноживущий одноклеточный организм – Parameciа caudatum, который очень чувствительны и реагирует на активные вещества, которые могут содержаться в испытуемых объектах и отражает их отношение к жизнеспособности организма. Исследования проводили в соответствии с рекомендациями [46,52]

2.4 Инструментальные и специальные методы исследований

Идентификацию коллагена определяли методом инфракрасной спектроскопии [71]. ИК-спектры коллагеновых фракций снимали на многофункциональном ИК-спектрофотометре Specord M-80 (Германия) и Vertexв диапазоне 4000-400 см-1.

Образцы сушили до значения постоянной массы при температуре 37 С, далее проводили измельчение в вибраторе фон Ардена в течение 4 мин., взвешивали 1,5 мг образца и 9,5 мг подготовленного КВr, мешали, брали 2 мг полученной порошкообразной смеси и помещали в пресс-форму, где путем вращения пуансона выравнивали поверхность смеси. Дальше смесь подвергали прессованию (при давлении 150 кг/см2) в течение 10 мин. Получившуюся таблетку, имеющую диаметр 3 мм, вставляли во внутренние направляющие держателя спектрофотометра. Все время проведения процесса влажность воздуха в помещении не должна превышать 75 %.

Рассмотрение спектра начинали с области больших значений волновых чисел, ориентировочно 4000 – 2500 см-1. В этой спектральной области проявляются валентные колебания О-Н-, N-H- и С-Н-связей (рис. 2.2).

Рисунок 2.2 – Инфракрасный спектр органического вещества

Колебания свободных, не образующих водородных связей О-Н-групп, проявляются в виде узкой полосы средней интенсивности в области 3800-3650 см-1. В этой области О-Н-группы проявляются редко, что обусловлено стремлением соединений, содержащих О-Н-группы, образовывать водородные связи. Включение О-Н-групп в систему водородных связей смещает сигнал в область 3600-3200 см-1 и значительно его уширяет.

Валентные колебания N-H-связей наблюдаются в области 3400-3200 см-1, соответствующая им полоса поглощения имеет среднюю интенсивность, из-за меньшей склонности к образованию водородных связей – небольшую полуширину. Положение полос, соответствующих валентным колебаниям С-Нсвязей зависит от гибридизации атома углерода.

Спектральная область (2400 – 1900 см-1) является бедной на сигналы. К характеристическим колебаниям, проявляющимся в этой области, относят валентные колебания тройных связей CN и CС. Положение и интенсивность полосы, соответствующей колебаниям CN-связей, зависит от прочности образуемых азотом координационных связей, а интенсивность полосы, соответствующей колебаниям CС-связи – от симметрии молекулы относительно нее.

Аминокислотный состав определяли методом ионообменной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия).

Метод включает обязательный предварительный гидролиз белков кислотой или щелочью с целью получения свободных аминокислот. Их затем определяли с помощью ионообменной хроматографии на колонках, заполненных твердым носителем, химически соединенным с заряженными группами, которые обеспечивали электростатическое взаимодействие с исследуемым объектом.

Аминокислоты исследуемого раствора элюируются буферным раствором, вызывая десорбцию аминокислот, выходящие на колонки в следующем порядке:

кислые, нейтральные и основные.

Окрашенный раствор пропускали через спектрофотометр с длиной волны 570 нм для измерения интенсивности окраски, которая фиксируется самописцем в виде пиков. По расположению пиков судят о наличии индивидуальных аминокислот в гидролизате, а по площади пиков — об их содержании.

Измеряли площади пиков с помощью потенциометра или вычисляли путем умножения высоты пика на его ширину, взятую на половине его высоты.

Массовую долю аминокислот рассчитывали по формуле (2.1):

Sn M 10 X (1) (2.1) Scт m где Sn– площадь пика соответствующей аминокислоты на полученной аминограмме, см2;

М – молекулярная масса аминокислоты, Да;

50 – объем раствора, полученный после кислотного гидролиза, см3;

Sст – площадь пика стандартного раствора аминокислоты, см2;

m– масса навески образца, г;

10-3 – концентрация аминокислоты в стандартном растворе, моль/дм3.

В соответствии с прописью метода коллагеновые субстанции подвергали анализу не менее, чем трех повторностях, в качестве результатов использовали среднестатистические данные. Исключения составляют инструментальные методы характерные высокой точности, иллюстративностью.

Оценка молекулярно-массового распределения белковых фракций образцов Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях.

Буферы для электрофореза:

анодный буфер для белкового SDS – электрофореза (10x): 30mМ Tris-HCl (рН 8,45); 1,92М глицин; 1%SDS;

катодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-HCl (рН 8.45), 1.92М глицин;

буфер для концентрирующего геля: 4% акриламид (акриламид: бисакриламид

– 29:1); 0.13M Tris-HCl (pH 6.8); 2% SDS; 0,004% персульфат аммония; 0,003% TEMED;

буфер для разделяющего геля: 10% акриламид (29:1 акриламид:

бисакриламид); 0,375М Tris-HCl (pH 8.7); 2% SDS; 0.004% персульфат аммония;

0.003% TEMED.

Фракцию растворимых белков анализировали с помощью SDS-электрофореза в 8% ПААГ. Образцы наносили по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле (~10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода:этанол:уксусная кислота (6:4:1). [39] Идентификация коллагенов на основании электронномикроскопического анализа – атомно-силовая микроскопия. [102,121] Оценку морфологических отличий коллагеновых дисперсий различно происхождения проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Этот метод используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется наноразмерное остри, располагающееся на конце упругой консоли, называемой кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под острим приводит к изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод о рельефе поверхности. [147] При работе в полуконтактном режиме также возбуждаются колебания кантилевера. В нижнем полупериоде колебаний кантилевер касается поверхности образца. Такой метод является промежуточным между полным контактом и полным бесконтактом.

Достоинства метода:

- Наиболее универсальный из методов АСМ, позволяющий на большинстве исследуемых образцов получать разрешение 1-5 нм;

- Латеральные силы, действующие на зонд со стороны поверхности, устранены - упрощает интерпретацию получаемых изображений;

Недостатки метода:

- Максимальная скорость сканирования меньше, чем в контактном режиме.

Для калибровки атомно-силового микроскопа Интегра–Вита (NT-MDT, Россия) были использованы плазмидаpGem длиной 8896 н.п., ДНК фага (Progema, Россия) длиной 48502 п.о. так как изучаемые препараты скорее всего содержат именно коллаген, который является фибриллярным белком. Препараты в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут, затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут.

Определение суммарных ароматов [96,97,98] «Электронный нос» – прибор на основе пьезокварцевых резонаторов (ПКР), который позволяет электронным способом различать всевозможные запахи. Это набор датчиков с тонкими пленками – полимерами. С помощью которых определяются отдельные компоненты запаха исследуемого вещества. Схема прибора представлена на рисунке 2.3.

Пленки формируются методом статического испарения капли раствора сорбентов. Сорбенты – неподвижные газохроматографические фазы с высокими параметрами избирательности и эффективности сорбции спиртов, эфиров и альдегидов (полиэтиленгликоль адипинат ПЭГА, полистирол с метиловым оранжевым, поливинилприрралидон ПВП), а также нетрадиционные фазы на основе фотометрических реагентов, природных материалов (пчелиный клей).

Химические сенсоры широко применяются в качестве детектирующих устройств во многих хроматографических методах анализа как самостоятельные датчики, реагирующие световым или звуковым сигналом на изменение концентрации в газовых или жидких средах органических и неорганических соединений различной природы.

Принцип действия химических сенсоров – превращение аналитического сигнала, возникающего в результате химической реакции анализируемой пробы с реагентами в околосенсорном пространстве или на поверхности, в любой физический сигнал.

Электроды 8-и пьезокварцевых резонаторов с собственной частотой колебания 10 МГц модифицировали путем равномерного нанесения микрошприцем 0,5-2,0 мкдм3 (в зависимости от концентрации и вязкости растворов) этанольных растворов полиэтиленгликоль адипината и пчелиного клея, ацетоновых растворов поливинилпирролидона, смесь полистирола с индикатором метилового оранжевого с последующим статическим испарением свободных растворителей в сушильном шкафу. Модифицированные резонаторы охлаждают в эксикаторе над слоем осушителя до 20±2 °С в течение 10-15 мин.

Масса пленок после охлаждения составила 10-20 мкг.

Сенсоры закрепляли в держателях на крышке и помещали в герметичную ячейку детектирования.

Подготовка образцов заключалась в отборе средней пробы, которую помещали в бюкс с притертой пробкой и полиуретановой мембраной, выдерживали 10-15 мин, после насыщения газовой фазы парами легколетучих соединений через полиуретановую мембрану отбирали шприцем 3-5 см3 равновесной газовой фазы. Газовую пробу быстро инжектировали в ячейку детектирования.

Отклики сенсоров регистрировали частотомером или IBM PC в течение 2 мин. Сигналы сенсоров формировали в кинетический «визуальный отпечаток», рассчитывали их площадь.

Продолжительность анализа составляла 40-50 мин; повторное применение сенсоров снижает затраты времени до 15-20 мин

–  –  –

наименьших квадратов, линейного программирования. Графические зависимости на рисунках представлены после обработки экспериментальных данных по методу наименьших квадратов [134], реализованные в Microsoft Excel.

–  –  –

3.1 Обоснование выбора источников В последнее время бизнес, связанный с разведением, выращиванием и переработкой рыбы становится все более популярным. Наравне с производителями морской рыбы, прудовые рыбные хозяйства имеют большое значение в системе Агропромышленного комплекса (АПК). Добыча рыбы в местных прудовых хозяйствах позволяет минимизировать затраты на транспортировку к месту реализации, повышает уровень занятости людей, обеспечивает пополнение местного бюджета. К тому же себестоимость прудовой рыбы меньше морской в 2-4 раза и в 1,5-2 раза по сравнению с мясными продуктами.

При производстве рыбы и рыбных продуктов перед производителями возникает вопрос утилизации отходов. На современном этапе рыбные предприятия являются источниками большого количества органических отходов, которые быстро разлагаются и наносят вред окружающей среде и человеку.

Поэтому переработка отходов является важной задачей для снятия напряженности экологической ситуации.

К основным отходам рыбоперерабатывающей промышленности относятся:

головы, кожа, чешуя, внутренности и плавники, которые являются источником белков, в том числе коллагеновых, и представляют собой важный продовольственный резерв, который часто недооценивают. Получение коллагенов является актуальным в связи с дефицитом пищевых белков, в том числе животных. Согласно литературным данным наиболее перспективным источником коллагеновых белков является шкура рыб. [8,31,75,76,145] В соответствии с поставленными целями и задачами оценивали гистоморфологическую характеристику, исследовали химический и фракционный 58 состав нативных шкур пресноводных рыб, для оценки возможности получения из них коллагеновых субстанций.

3.2 Гистоморфологическая характеристика и химический состав исследуемого сырья Микроструктурный анализ является одним из наиболее объективных и поэтому был выбран для идентификации коллагеновых структур в шкурах.

От рыбы отделяли голову, хвост, плавники, очищали от чешуи, машинным способом снимали шкуру, вручную зачищали от прирезей мышечной ткани и жира, затем промывали.

Шкура рыб является соединительной тканью, существенной особенностью которой, отличающей ее от других видов, является значительное количественное преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами.

Межклеточный матрикс состоит из волокнистых компонентов, а пространство между ними заполнено основным веществом, содержащим гликопротеины.

Коллагеновые и эластиновые волокна являются волокнистыми компонентами [76].

При микроскопировании нативных образцов шкур с применением красителя Амидо-черный 10б выявили плотную архитектонику дермальной части кожи щуки (рисунок 3.1 а). В случае препаратов шкур рыб сазана и толстолобика (рисунок 3.1 б, в), значительную часть занимают межструктурные пространства, что характеризует рыхлость ткани. Для получения коллагена предпочтительней использование тканей с более рыхлой структурой, так как для их разволокнения требуется меньше усилий.

–  –  –

Рисунок 3.2 Химический состав шкур пресноводных рыб Как видно на рисунке 3.

2, массовая доля влаги в шкуре пресноводных рыб колеблется от 73,01 % для сазана до 76,84 % для толстолобика.

Массовая доля белка варьирует от 16,5 % для толстолобика до 18,59 % у щуки; жира – от 4,79 % для щуки до 7,39 % у сазана; золы, а, следовательно, минеральных веществ, от 1,38 % для толстолобика до 1,73 % для сазана.

Данные об общем содержании белковых веществ в шкурах использовали для определения фракционного состава белков.

Рисунок 3.3 Фракционный состав шкур рыб

На диаграмме (рисунок 3.3) видно, что во всех случаях превалирующей фракцией является щелочерастворимая, максимальное содержание которой отмечается в шкуре толстолобика, наименьшее – в шкуре щуки. Как известно [4,29] эта группа белков объединяет протеиноидные белки, главным образом коллагеновые. В целом же массовая доля протеиноидной фракции (щелочерастворимой) варьируется в пределах 84,7 - 90,73% относительно общего содержания белков в объектах исследования.

Так как в данной работе шкуры рыб рассматриваются как альтернатива коллагенсодержащим источникам животного происхождения, то представляло интерес определить количественное содержание коллагена в сырье животного и рыбного происхождения.

–  –  –

Гольевой спилок шкур КРС (по 36,29 55,62 73,88 88,01 Сапожниковой А.И., Месроповой Н.В.) Шкуры рыб 42,88 72,12 84,96 86,0 62 Как видно из данных табл. 3.2, в случае рыбного сырья процесс выплавления желатина происходит быстрее, что, вероятно связано с особенностями аминокислотного состава образцов, который обеспечивает наличие прочных связей, укрепляющих структуру коллагеновых фибрилл в случае сырья животного происхождения.

Так как шкура толстолобика имеет достаточно рыхлую структуру по сравнению с другими образцами, ее массовая доля белка составляет 16,5%, большая часть которого (90,73%) приходится на щелочераствоирмые, к которым относится коллаген, было принято решение выбрать именно этот объект (шкуру толстолобика) как источник коллагеновых белков. Дополнительно заметим повсеместную распространенность и невысокую стоимость этого вида сырья.

3.3 Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновыхдисперсий

Результаты исследования гистоморфологической характеристики, химического и фракционного состава белков шкур рыб и говорят о возможности использования рыбного шкуросырья как источника коллагена при условии его очистки от балластных фракций.

Существуют биотехнологические способы очистки коллагена от балластных веществ [24,29,90,125,130,131,134,138,145]. Однако применение ферментных препаратов является дорогостоящим, требует жестких условий и увеличивает количество технологических операций, например, таких как ввод и инактивация фермента. Немаловажное значение имеет существующий дефицит и высокая стоимость препаратов Для разработки модифицированной технологии выделения коллагена исследовали влияние физико-химических методов модификации на структуру коллагеновых белков.

Отбеливание, удаление балластных белковых фракций и разрыхление структуры соединительной ткани возможно при использовании смеси растворов гидроксида натрия и пероксида водорода, данный метод в конце 90-х годов прошлого века был успешно апробирован для спилка шкур КРС (Сапожникова и др.). [125] Данный способ так же был применен к рыбным шкурам: образцы шкур погружали в перекисно-щелочную смесь, концентрацию гидроксида натрия и время замачивания подбирали экспериментально (таблица 3.3, 3.4), концентрацию пероксида водорода брали равной 3%, гидромодуль 1:4, а соотношение компонентов NaOH : H2O2 - 7:3, так как в этом случае наблюдается максимальный выход – 85%. [145]. Обработку проводили при температуре 2±2 С.

–  –  –

1 54,27 55,81 67,95 71,07 66,43 2 90,68 89,93 96,64 94,38 96,64 3 82,84 88,64 92,98 74,92 74,22 4 76,98 81,78 88,68 66,63 63,87 Из данных таблицы 3.4 видно, что максимум набухания происходит при использовании пероксидно-щелочной смеси №3, в течение 2 часов. В течение этого времени, образцы поглощают порядка 40-45 % смеси от исходного количества и отбеливаются. Увеличение продолжительности данной операции не приводит к увеличению выхода продукта, а использование концентрации гидроксида натрия свыше 3% не целесообразно.

При перекисно-щелочной обработке сырья в результате взаимодействия компонентов реакционной среды происходит растворение коллагеновых белков за счет ускорения разрыва водородных связей с экзотермическим эффектом. Кроме того, воздействие гидроксида натрия и пероксида водорода способствует более глубокому проникновению щелочи в структуру коллагеновых фибрилл.[145] После перекисно-щелочной обработки для установления рациональных условий химической модификации образцов шкуросырья под действием органических кислот различных концентраций определяли максимальную степень набухания коллагенсодержащего сырья и рационального соотношения применяемых реагентов.

Для получения коллагена шкуры заливали растворами органических кислот различной концентрации: молочной, уксусной, лимонной и янтарной в концентрациях 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 и 1%, гидромодуль 1:4, при температуре 2±2 С.

Результаты представлены на рисунке 3.4.

–  –  –

Рисунок 3.4 - Степень набухаемости шкур рыб в органических кислотах с различной концентрацией На диаграмме видно, что наибольшее набухание происходит при обработке органическими кислотами с концентрацией 0,5%.

Наибольшая степень набухаемости наблюдается в случае уксусной кислоты. Использование уксусной кислоты с концентрации менее 0,5% не обеспечивает достаточного выхода продукта. Применение кислоты с большей концентрацией приводит к перерасходу реагента.

Действие органических кислот на шкуросырье оценивали на уровне микроструктурных исследований (рис. 3.5) а б в г д Рисунок 3.5 – Изменение микроструктуры шкуры рыб: а – контроль (не обработанная шкура); б – шкура после обработки лимонной кислотой; в – шкура после обработки молочной кислотой; г – шкура после обработки уксусной кислотой; д – шкура после обработки янтарной кислотой. Увеличение 200.

Окраска Гематоксилин-Эозин В гистологических срезах необработанной шкуры (рисунок 3.5 а) хорошо просматривается волокнистая структура сырья. После обработки шкуры водным раствором лимонной кислоты (рисунок 3.5 б) наблюдается набухание, вследствие чего волокнистая структура просматривается нечетко.

Обработка шкуры водным раствором молочной кислоты (рисунок 3.5 в) разрушает структуру волокон коллагена. Более существенно изменилась микроструктура шкуры после обработки е водным раствором уксусной кислоты (рисунок 3.5 г). Наблюдается сильное набухание с частичной деструкцией соединительной ткани.

Слабое действие на структурные компоненты шкуры проявил водный раствор янтарной кислоты (рисунок 3.5 д).

На основании микроструктурных исследований шкуры рыб и подобранной экспериментальным путем перекисно-щелочной смеси и концентрации органической кислоты для обработки коллагенсодержащего сырья провели оценку динамики изменения массы коллагенсодержащего сырья в зависимости от времени обработки.

Результаты представлены на рисунке 3.6, где видно, что степень набухания рыбной шкуры после часа максимальна при обработке молочной кислотой.

Однако с увеличением продолжительности обработки наилучший эффект наблюдается в случае уксусной кислоты и степень набухания имеет наибольшее значение.

Рисунок 3.6 - Динамика набухания рыбной шкуры в водных растворах органических пищевых кислот На основании полученных данных можно обозначить рациональные параметры обработки коллагенсодержащего сырья, обеспечивающих максимальный выход продукта (табл.

3.5).

–  –  –

На рисунках 3.7-3.10 показаны визуальные изменения шкуры толстолобика в процессе получения коллагеновой дисперсии.

Рисунок 3.7 - не очищенная шкура толстолобика На рисунке 3.

7 показана шкура толстолобика сразу после снятия с чешуей и прирезями мяса.

Рисунок 3.8 - очищенная шкура толстолобика На рисунке 3.

8 показана шкура толстолобика после очистки от чешуи, остатков мышечной ткани и промывки.

Рисунок 3.9 - шкура толстолобика после перекисно-щелочной обработки На рисунке 3.

9 изображена шкура толстолобика после обработки перекиснощелочной смесью. Произошло набухание и не полное обесцвечивание. При этом она остается прочной, плохо поддается измельчению.

Рисунок 3.10 - шкура толстолобика после обработки уксусной кислотой На рисунке 3.

10 показана шкура толстолобика после этапа обработки уксусной кислотой. Произошло удаление оставшихся пигментных веществ, легко поддается измельчению.

Установленные закономерности обосновывают режимы обработки шкур рыб внутренних водоемов для получения коллагеновой дисперсии. Разработанная технология реализована в лабораторных условиях с получением дисперсии из шкуры толстолобика.

В растворенной форме коллаген часто используется в косметической и медицинской промышленности. В фармацевтической технологии для любого нового вспомогательного вещества необходимо наличие его стандартной субстанции. Для коллагена такой субстанцией является 2%-й раствор в 0,2 – 0,5 М уксусной кислоте щелочно-обработанной дермы КРС [70,145]. Поэтому в ходе дальнейших исследований мы проводили сравнительный анализ свойств 2% коллагеновых субстанций рыбного (полученной по предлагаемой нами технологии) и аналога животного (произведенного на заводе «Белкозин», г. Луга) происхождения. На рисунках 3.11 и 3.12 показан внешний вид коллагеновых субстанций различного происхождения. Можно сделать вывод, что коллагеновые дисперсии животного и рыбного происхождения не имеют внешних различий.

Рисунок 3.11 – коллагеновая дисперсия животного происхождения Рисунок 3.

12 – коллагеновая дисперсия рыбного происхождения

3.4 Идентификация структурных особенностей коллагена Инфракрасная спектроскопия (ИК) - один из основных методов анализа органических соединений. Она основана на поглощении инфракрасного излучения молекулами изучаемого вещества. При поглощении инфракрасного излучения происходит возбуждение колебаний и вращений молекул.

Возможности ИК-спектроскопии позволяют определять присутствующие в молекуле функциональные группы и устанавливать строение индивидуальных соединений.[] Для идентификации строения полученной коллагеновой дисперсии из рыбного сырья был изучен спектр поглощения в инфракрасной области (рисунок 3.13).

Обнаружены характерные полосы поглощения: 3335- 2908, 2404 - 16551611, 1502, 1493, 1211, 893, 611см-1, что, по литературным данным, соответствует соединениям типа (CH3,С-H) (3335-2908); (NO2,N-CN)(2404-1655);

эти данные (C=0,NO2)(1611); (C-C-H)(1431,1211); (893-623)(-C-C,C-H), подтверждают, что полученная дисперсия рыбного происхождения содержит коллагеновые белки.

Рисунок 3.13-ИК-спектроскопия коллагена

3.5 Оценка качества и безопасности коллагеновых дисперсий

–  –  –

Как видно из данных таблицы 3.6, дисперсии близки по свойствам, но имеют и некоторые отличия, связанные, по всей вероятности, с особенностями строения и способов получения коллагеновых дисперсий.

Все новые лекарственные средства, препараты и добавки должны быть не только эффективными, но и безвредными для животных и человека. В связи с этим проведено определение безвредности и биологической активности рыбного коллагена на биотесте (культура Parameciа caudatum) (табл. 3.7, рис. 3.14 и 3.15). Исследования выполнены в соответствии с требованиями ВОЗ, Минздрава РФ, Ветеринарнофармакологического совета департамента России [67]

–  –  –

Примечание:

+ - превышение общего число аэробных бактерий и грибов - суммарно более 10 в 1 см3;

+, + - превышение общего число аэробных бактерий и грибов, наличие энтеробактерий в 1 см3.

На основании табличных данных, можно рекомендовать следующие режимы и сроки хранения:

При 0 0С – не более 26 недель;

При 4 0С – не более 22 недель;

При 10 0С – не более 18 недель;

При 15 0С – не более 8 недель;

При 20 0С – хранение не рекомендуется.

76 ГЛАВА 4. Исследование свойств коллагеновых субстанций

4.1 Определение аминокислотного состава

–  –  –

4.2. Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых белков Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 

Похожие работы:

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.