WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

«ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Разница в реакции на введение вирусного антигена между линейными Balb/c и беспородными мышами обусловлена их генетическими характеристиками. Линейные мыши в этом аспекте рассматриваются как гомогенная популяция, в которой реакция входящих в нее особей в 87-94% случаев однотипна, что даёт возможность рассматривать данную популяцию как единый организм. Беспородные белые мыши по генетическим характеристикам являются фенотипически гетерогенной популяцией, в которой реакция животного определяется его индивидуальными особенностями.

Реакция мышей-самцов как Balb/c, так и беспородных, на введение инфекционного агента была более выражена, чем мышей-самок, что связано с 72-96 часовым половым циклом самок.

Анализ результатов по выбору биологической модели in vivo для воспроизведения ХГВИ показал, что введение ВПГ-1 как внутримышечно, так и внутрибрюшинно экспериментальным животным в возрасте до 1 месяца обуславливает у них развитие генерализованной инфекции. Летальность в результате генерализованной ГВИ составила от 80 до 98% особей для крыс и сирийских хомячков и от 94 до 100%– для мышей линии Balb/c и беспородных. У взрослых животных (2 месяца и старше) летальность в результате развития ГВИ существенно ниже – от 8 до 40% в зависимости от объема вводимого вируса и его инфекционного титра. Однако у взрослых сирийских хомячков ГВИ осложнялась бактериальной инфекцией слизистых оболочек защёчных мешков и развитием абсцессов подкожножировой клетчатки тканей шеи и грудной клетки.

Для исследования динамики развития инфекционного процесса на слизистых оболочках необходимо было проводить отбор материалов – мазков-отпечатков и смывов с глаз, ротовой полости и урогенитального тракта с интервалом 5-10 суток. В наших экспериментах отбор материалов у крыс и сирийских хомячков проводили под оглушающим эфирным наркозом. Неспецифическая гибель животных в результате действия эфира составляла 18% от общего числа крыс и 24% - хомячков. При выполнении аналогичных манипуляций у мышей, оглушающий эфирный наркоз не применяли.

Таким образом, наиболее соответствующими выдвинутым критериям к биологической модели in vivo для воспроизведения хронической ГВИ являлись лабораторные мыши. Воспроизведение хронической ГВИ на беспородных мышахсамцах обеспечивали многообразие клинических форм и сводили к минимуму влияние колебаний гормонального фона на развитие инфекционного процесса.

Экспериментальная модель для воспроизведения хронической герпесвирусной инфекции Белых беспородных мышей-самцов (250 особей) в возрасте 2-х месяцев массой 22,6 ± 0,2 г внутрибрюшинно инфицировали ВПГ-1 типа штамм Л2 с инфекционным титром 4,5 lg ТЦД50/мл в объёме 0,1 мл. Контрольная группа состояла из 45 интактных мышей-самцов в возрасте 2-х месяцев с массой тела 22,5 – 22,7 г, которым однократно внутрибрюшинно вводили 0,85 % физиологический раствор в объёме 0,1 мл. Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Экспериментальная модель для изучения влияния хронической герпесвирусной инфекции на биологический потенциал мышей-самцов В эксперименте использовали половозрелых самцов мышей (120 особей) без предварительного сексуального опыта. В возрасте 2 месяцев животных внутрибрюшинно инфицировали ВПГ-1 типа штамм Л2 с инфекционным титром 4,5 lg ТЦД50/мл в объёме 0,1 мл. Животные содержались в стандартных пластиковых клетках по 5-6 голов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище. За 3-4 суток до выведения животных из эксперимента их помещали в индивидуальные клетки для снятия эффектов группового содержания. У мышейсамцов исследовали репродуктивные ткани и жидкости.

–  –  –

Рисунок 1 – Алгоритм моделирования хронической герпесвирусной инфекции у лабораторных мышей.

Экспериментальная модель для изучения влияния хронической герпесвирусной инфекции на репродуктивную функцию мышей-самцов На 120-е сутки после инфицирования ВПГ-1 мышей-самцов (24 особи) спаривали с интактными самками. В качестве маток использовали мышей-самок в возрасте 4 месяца, имевших в анамнезе одну физиологическую беременность (n = 96).

Группу сравнения («Контроль») состояла из 8 интактных полугодовалых мышей-самцов без сексуального опыта и 32 мышей-самок в возрасте 4 месяца, имевших в анамнезе одну физиологическую беременность.

Спаривание животных проводили по обычной схеме разведения мышей: 1 самец + 4 самки [43]. Самок подсаживали к самцам сроком на 2 астральных цикла.

Регистрацию зачатия осуществляли по результатам исследования мазков из влагалища. У мышей-самок регистрировали сроки родоразрешения, наблюдали за физиологическим развитием потомства до окончания вскармливания (выживаемость, масса тела).

В течение беременности у мышей-самок проводили серологические и вирусологические исследования образцов слизистого эпителия ротовой полости, оболочки глаз и влагалища для определения уровня инфицированности вирусом простого герпеса. В после родовой период и во время вскармливания потомства у самок были проведены аналогичные диагностические тесты.

2.2.1.3 Методы лабораторной диагностики, использованные в экспериментальных исследованиях Выделение ВПГ-1 из экспериментального материала на клеточных культурах. Для вирусовыделения использовали следующие материалы, взятые у экспериментальных животных: смывы и мазки со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и гениталий; кровь, эякулят и ткани органов – головного и спинного мозга, легких, печени, селезёнки, почек, тестикул, матки и маточных труб. Все материалы, кроме эякулята и крови, собирали в стерильную посуду, содержащую 1 мл транспортной среды (0,85%-ный физиологический раствор с добавлением антибиотика – гентамицина 250 мкг/мл).

Из тканей органов готовили гомогенат на питательной среде 199. Гомогенат осаждали низкоскоростным центрифугированием. Для заражения использовали надосадочную жидкость. Для исключения бактериальной контаминации образцов надосадочной жидкости высевали на мясопептонный бульон, тиогликолевую среду и агар Сабуро [97].

Заражение клеточных культур – ЛЭЧ и Vero образцами надосадочной жидкости, крови и эякулята проводили по общепринятой методике [97]. Наблюдение за развитием цитопатического действия ВПГ-1 осуществляли при помощи микроскопа МБИ-3. Учет вели ежесуточно до начала дегенерации клеток в контрольной культуре (в течение 5-7 дней).

Инфекционный титр вируса, выделенного из экспериментальных образцов, определяли методом титрования на клеточной культуре по стандартной методике.

Титр вируса выражали в значениях обратного десятичного логарифма (lg) по методике Рида и Менча [84].

Люминесцентный метод. Для обнаружения антигена ВПГ-1 использовали коммерческие препараты – флюоресцирующие иммуноглобулины к вирусу простого герпеса «SimulFluor HSV 1/2 Kit». Исследовали мазки-отпечатки со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и гениталий, клеточных элементов крови и мочи, головного и спинного мозга, легких, печени, селезёнки, почек, тестикул, матки и маточных труб. Препараты подготавливали и окрашивали согласно инструкции производителя флюоресцирующих иммуноглобулинов к ВПГ.

Для оценки инфицированности тканей тестикул, образцов нативного эякулята и спермиев мышей-самцов выявление антигена ВПГ-1 проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции. В качестве специфического иммунного реагента использовали моноклональные антитела к индивидуальным белкам ВПГ (сверхранние –, ранние –, поздние – ), любезно предоставленные профессором Косяковой Н.П. (ГУ НИИ вирусологии РАМН).

Флюоресценцию учитывали под микроскопом ЛЮМАМ ЛБИ-15.

Детекция вирусной ДНК. Молекулярно-генетические исследования проводили в соответствии с методическими указаниями 1.3.2569-09 [69]. Выявление ДНК вируса простого герпеса 1 типа в экспериментальных материалах методом цепной полимеразной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией осуществляли на коммерческих тест-системах «АмплиСенс HSV 1, 11-FL». Подготовку материалов для реакции и постановку ПЦР проводили согласно инструкции производителя тест-систем.

Серологические методы. Уровень специфических антител в сыворотке крови экспериментальных мышей к ВПГ-1 определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) методом последовательных разведений с шагом 10. Реакцию проводили с использованием диагностикумов производства ФГБУ Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Флюоресценцию учитывали под микроскопом ЛЮМАМ ЛБИ-15.

Определение уровня нейтрализующих антител к ВПГ-1 в сыворотке крови осуществляли в реакции нейтрализации (РН) на клеточной культуре Vero по стандартной методике [97]. За вируснейтрализующий титр антител принимали разведение сыворотки, способное предотвращать развитие цитопатического действия ВПГ-1 (с множественностью инфицирования 0,001 ТЦД 50) и ингибировать его репродукцию в культуре клеток.

Гематологические исследования Клинический анализ крови экспериментальных мышей проводили на гематологическом автоанализаторе «System 9020»

программа Mouse/Rat”- 07.

Для характеристики выраженности воспалительного процесса у экспериментальных животных определяли лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) – по формуле Я.Я. Кальф-Калифа [68]:

(4 мц 3ю 2п с) (пл 1) ЛИИ =, ( л мо) * ( э 1) где мц - процентное содержание миелоцитов, ю – юных метамиелоцитов, п – палочкоядерных, с – сегментоядерных нейтрофилов; пл – плазматических клеток, л – лимфоцитов, мо – моноцитов, э – эозинофилов; 1, 2, 3, 4 – коэффициенты.

Иммунологические исследования. Лабораторные исследования включали набор тестов, которые позволяли оценить качественные и количественные параметры состояния иммунной системы, функциональную активность клеток моноцитарно-макрофагального звена, характер воспаления. Данные в экспериментальных группах сравнивались с медианными значениями, полученными от интактных животных контрольной группы. Достоверность полученных отличий определялась с помощью параметрических и непараметрических методов математического анализа. Материалом исследования были периферическая кровь, перитональный экссудат, селезенка, тучные клетки.

Определение относительных показателей популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов крови экспериментальных мышей Фенотипический состав лимфоцитов периферической крови оценивали по наличию мембранных дифференцировочных и активационных антигенов методом непрямой иммунофлюоресценции. Исследования проводили на панели ФИТЦмеченных моноклональных антител с дифференцировочными поверхностными маркерами: маркер зрелых Т-клеток (CD3 +); маркер Т-хелперных (индукторных) клеток (CD4+); маркер Т-супрессорных (цитотоксических) клеток (CD8+) производства «BioLine». Количество лимфоцитов, принадлежащих различным субпопуляциям, определяли на проточном цитометре FC-500 (Becman-Coulter).

Величину иммунорегуляторного индекса (ИРИ) рассчитывали по соотношению: ИРИ = CD4 + / CD8+ Исследования относительных показателей популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов крови были выполнены сотрудниками клинической лаборатории медицинского центра «Урал – ЛАЗАР».

Оценка функционально-метаболического состояния мононуклеарных клеток крови экспериментальных мышей Для выделения мононуклеарных клеток (МНК) крови использовали смесь фиколла и верографина с плотностью 1,077 г/мл. Гепаринизированную кровь наносили на градиент «фиколл – верографин». Разделение форменных элементов крови проводили стандартно [61].

Функциональное состояние МНК оценивали по их адгезивной способности, фагоцитарной активности и специфическому клеточному ответу на антиген ВПГ.

Реакции проводили по стандартным методикам [64].

Реакцию адгезии проводили в пластиковых панелях с диаметром 30 мм.

Индекс адгезии (АИ) рассчитывали по формуле:

АИ = (число «прилипших» МНК / общее число МНК) 100%

Реакцию фагоцитоза проводили с латексными частицами. Фагоцитарный индекс (ФИ) рассчитывали по формуле:

ФИ = (число фагоцитирующих клеток/ общее число МНК) 100% Реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ ) проводили в агарозном геле. В качестве антигена использовали инактивированную вируссодержащую суспензию эталонного ВПГ-1. Уровень торможения миграции лейкоцитов рассчитывали по формуле:

ТМЛ = [(А – В)/ А] 100%, где ТМЛ – торможение миграции лейкоцитов; А – среднее значение наибольшего радиуса миграции лейкоцитов из 5 лунок в «Контроле»; В – среднее значение наибольшего радиуса миграции лейкоцитов из 5 лунок в «Опыте».

Определение уровня мембранных оксидаз в мононуклеарных клетках крови экспериментальных мышей Активность мембранных оксидаз (НАДФ · Ф – оксидазной системы) определяли в лизате МНК спектрофотометрическим методом по уровню фермента миелопероксидазы (МПО). Содержание МПО в лизате измеряли на СФ-209 при длине волны 492 нм. Концентрацию МПО выражали в мкг/мл [84].

Оценка функционально-метаболического состояния перитонеальных макрофагов экспериментальных мышей Макрофаги из перитонеального экссудата выделяли по общепринятой методике [61]. Реакции адгезии, фагоцитоза, торможения миграции перитонеальных макрофагов и определение в их лизате уровня МПО осуществляли аналогично описанным методикам для МНК крови.

Оценка морфофункционального состояния селезёнки экспериментальных мышей Морфометрические параметры селезёнки мышей определяли по стандартной методике [97], полученные результаты выражали в виде относительных показателей:

«Индекс массы органа» = масса селезёнки в мг /масса тела мыши в г «Индекс клеточности органа» = количество клеток в органе/ масса селезёнки в мг Спленоциты выделяли из суспензии вылущенных клеток селезенки на градиенте «фиколл – верографин». Функционально-метаболическое состояние спленоцитов оценивали по показателям, описанным для МНК крови и перитонеальных макрофагов.

Морфофункциональные характеристики популяции тучных клеток у экспериментальных мышей Выделение тучных клеток (ТК) из брыжейки, перитонеального экссудата и соединительной ткани кожи осуществляли по методике, разработанной Юшковым Б.Г. с соавторами [115]. Образцы препаратов окрашивали гематоксилин-эозином по Ван-Гризону и Вейгерту. Подсчет тучных клеток проводили на микроскопе МБИ-3 при увеличении 40. Содержание в образцах клеток с дегрануляцией выражали в процентных долях от общего числа тучных клеток.

Исследование сывороток крови экспериментальных мышей в тестах II уровня для диагностики иммунного статуса

- Определение цитокинового профиля Количественное содержание цитокинов (ФНО-, ИНФ, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4) в сыворотке крови мышей определяли с помощью тест-систем, основанных на классическом твердофазном двухступенчатом «сэндвич» методе ИФА на микропланшетах «ProCon» (ООО «Протеиновый контур» Санкт-Петербург). Концентрацию цитокинов выражали в пкг/мл.

- Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) из сывороток крови мышей осаждали полиэтиленгликолем (мол. масса 6000) по стандартной методике [61].

Уровень ЦИК в сыворотках определяли на спектрофотометре СП-Ф- 403. Концентрацию ЦИК выражали в условных оптических единицах (у.е.).

- Определение содержания щелочной фосфатазы Количественное содержание щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови мышей определяли спектрофотометрическим методом с использованием тестсистем «Новофосфал» производства ЗАО «Вектор – Бест». Концентрацию ЩФ выражали в Е/л.

- Показатели перекисного окисления липидов Уровень перекисного окисления липидов учитывали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в сыворотках крови. Определение МДА проводили по общепринятой методике [62].

- Показатель выраженности воспалительной реакции и аутоиммунных процессов Уровень гистамина в сыворотках крови определяли на спектрофлуориметре HPF-4 в соответствии с методическими рекомендациями [67].

Биохимические исследования. Материалом для биохимических исследований были кровь, сыворотка крови, пузырная желчь, гомогенаты органов (легких, печени, головного мозга).

- Определение уровня глюкозы в крови экспериментальных животных проводили на тест-полосках «Accu - Chek® Active» с диапазоном измерения 0,6 – 33,3 ммоль/л производства «Roche Diagnostics GmbH» Германия.

- Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи с вычислением холато-холестиринового коэффициента (ХХИ) осуществляли по методу В.П. Мирошниченко и Л.Л. Громашевской [39].

- Уровень печеночных аминотрансфераз – АлАТ и АсАТ в крови мышей определяли по стандартной методике в тест-системах производства «Агат-Мед».

- Уровень перекисного окисления липидов учитывали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах органов. Определение МДА проводили по общепринятой методике [62].

Оценку параметров нативного эякулята осуществляли в соответствии с рекомендациями ВОЗ-2001 г [79, 83, 96]. Для исследования функционального состояния сперматозоидов использовали суспензию, полученную при продольном разрезе придатка семенника. Методику стандартизировали по количеству (2 мл) изотонического раствора хлорида натрия и времени перемещения (2 мин) при комнатной температуре (20-220 С). Для окрашивания сперматозоидов добавляли 0,4 мл 1% водного раствора эозина и оставляли на 30 минут. Подсчет сперматозоидов проводили в камере Горяева визуально под световым микроскопом при увеличении 200. При исследовании семенной жидкости учитывали следующие параметры: концентрацию половых клеток (· 106/мл, норма 11- 12 106); степень подвижности сперматозоидов (a+b, в %, норма 50%). Для учета количество морфологически нормальных форм сперматозоидов и их аномалий делали мазок суспензии окрашенных половых клеток. Образцы анализировали под световым микроскопом при увеличении 400. Для каждого образца эякулята подсчитывали 300 половых клеток с двукратным повторением.

Гистологические исследования препаратов образцов органов экспериментальных животных проводили по общепринятой методике [97]. Окраску препаратов производили гематоксилин – эозином, по Ван-Гизону и Вейгерту. Гистологические исследования препаратов и описание патоморфологических изменений тканей органов были выполнены научным сотрудником Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций Пашниной Н.Я.

Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований проводили, используя пакет программ «Statistica 6.0».

2.2.1.4 Характеристика референтных популяций человека и животных

Референтная популяция человека. Группы обследованных больных представляли мужчины (1768 чел.) и женщины (1455 чел.) в возрасте от 18 до 65 лет, обратившихся в Свердловский Областной кожно-венерологический диспансер в период 2006 – 2014 годов. Наряду с рутинными клинико-лабораторными исследованиями и ретроспективным анализом формы М.Д. № 025/у – 04 (амбулаторных карт) были проведена комплексная диагностика по выявлению пациентов, инфицированных вирусам герпеса (ВПГ, ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ-6). Анализ осуществляли по усовершенствованному нами алгоритму диагностики герпесвирусной инфекции [139]. Объектами исследований служили образцы клинических материалов: кровь;

сыворотка крови; моча; слюна; соскобы эпителия со слизистых оболочек ротовой полости, глаз, урогенитального тракта.

Референтная популяция животных была представлена крупным рогатым скотом (КРС) всех возрастных групп уральского типа черно-пёстрой породы, содержащимся в 38 сельскохозяйственных предприятиях Уральского региона (1200 особей). Наряду с рутинными клинико-лабораторными исследованиями и ретроспективным анализом государственной ветеринарной статистической отчетностью (формы 1-Вет, 1-Вет А, 2-Вет) был проведён анализ серопозитивности животных к вирусу инфекционного ринотрахеита (ИРТ). Объектами исследований служили образцы клинических материалов: кровь, сыворотка крови, соскобы эпителия со слизистых оболочек носовой полости и урогенитального тракта.

2.2.1.5 Клинико-лабораторные тесты, использованные для обследования референтных популяций человека и животных Комплексную лабораторную диагностику по выявлению инфицированности вирусами герпеса в референтных популяциях человека и животных по усовершенствованному нами «Алгоритму диагностики и лечению герпесвирусной инфекции» (рисунок 2). В алгоритме диагностики впервые было применено устройство для оценки активности вируса в клеточной системе [патент на полезную модель № 140 765 Российская Федерация / Владимиров А.П., Глинских Н.П., Порываева А.П., Малыгин А.С. и др.: опубликовано 20.05.2014, Бюл. № 14, С. 2]. Использование нового метода позволило проводить исследование инфекционной активности вируса в режиме «скрининг – анализ», что значительно повысило уровень и качество проводимой диагностики.

–  –  –

Рисунок 2 – Алгоритм диагностики и лечения герпесвирусной инфекции [А.П.

Порываева, Т.С. Некрасова, И.В. Устьянцев, 2009].

Определение серопозитивности в референтных популяциях человека и животных к вирусам герпеса проводили методом ИФА с использованием тестсистем производства «Вектор – Бест».

Определение генома герпесвирусов в крови, моче, слюне, эпителии урогенитального тракта осуществляли методом ПЦР на коммерческих тест-системах «АмплиСенс». Выявление антигена герпесвирусов в клетках крови, мочи, слюне, эпителия ротовой полости, глаз и урогенитального тракта проводили методом РИФ с использованием коммерческих препаратов «SimulFluor Kit».

Оценку иммунного статуса в референтных популяциях человека и животных (иммунологические тесты I-го уровня с определением соотношения CD4 / CD8, уровня ЦИК) и определение цитокинового профиля (тесты I-го уровня) проводили по общепринятым методикам [21, 103].

Статистическую обработку результатов клинико-лабораторных исследований проводили, используя пакет программ «Statistica 6.0».

2.2.1.6 Методика изучения эффективности применения лиофилизированного препарата аллофибробластов (АФБ) для лечения герпесвирусных поражений кожи и слизистых оболочек в референтных популяциях человека и животных Фармакологическая характеристика лиофилизированного препарата АФБ Аллофибробласты – это аллогенные (культивированные) фибробласты. Фибробласты (от лат. fibra – волокно и греч. blastos – зародыш, росток) – основная клеточная форма соединительной ткани организма позвоночных животных и человека. Фибробласты формируются в процессе эмбриогенеза из стволовых клеток мезенхимного происхождения.

Лиофилизированный препарат из аллофибробластов (АФБ) получен из штамма ЛЭЧ-4(81). Штамм ЛЭЧ-4(81) представляет собой штамм диплоидных клеток, полученный в ЕНИИВИ (А.С. СССР № 1147748), сертифицированный Минздравом России (регистрационное удостоверение Р № 001402/1, 2002), зарегистрированный в качестве оригинального, сохраняемого в низкотемпературном банкемузее разработчика (заявителя).

Клеточная культура ЛЭЧ-4(81) представляет собой морфологически однородную популяцию клеток с ограниченным сроком жизни, определенного тканевого происхождения, сохраняющую стабильный кариотип (2n 75% клеток), свободную от посторонних агентов, онкогенно безопасную, культивируемую на искусственных питательных средах в стандартных бутылках для кровезаменителей.

Клетки штамма ЛЭЧ-4(81) лишены антигенов гистосовместимости, что позволяет применять их, в том числе и для лечения животных.

Результаты исследований, проведенные сотрудниками ФБУН «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [84], показали, что аллофибробласты ЛЭЧ-4(81) в дополнение к ранее известному регенерирующему, иммуномодулирующему и антибактериальному действию, проявили новые свойства – противовирусное действие при лечении кожных и слизистых покровов, пораженных вирусом герпеса. Противовирусное действие препарата было изучено на экспериментальной модели ГВИ in vivo [25].

Схема применения лиофилизированного препарата АФБ для лечения герпесвирусных поражений кожи и слизистых покровов у человека В референтную группу обследования входило 17 мужчин в возрасте от 20 до 43 лет, находящихся на диспансерном учете с диагнозом «Генитальный герпес».

Исследование эффективности применения лиофилизированного препарата АФБ для лечения герпесвирусных поражений кожи и слизистых покровов проводили по схеме, представленной в таблице 6.

–  –  –

Схема применения лиофилизированного препарата АФБ для лечения герпесвирусных поражений кожи и слизистых покровов у крупного рогатого скота Изучение возможности применения лиофилизированного препарата АФБ для лечения генитальной формы ИРТ у коров было проведено в референтной группе животных в период стельности. Исследование проводили совместно с сотрудниками отдела инфекционной патологии животных Уральского НИВИ и АОА «Мезенское», Белоярского района.

Референтная группа животных была представлена 18 коровами уральского типа черно-пёстрой породы 2-ой лактации. Диспансеризацию референтных животных проводили во второй половине стельности. Для лечения герпетических эрозий препарат АФБ приготавливали в виде линимента. В качестве протектора применялся тизоль. Концентрация препарата АФБ составляла 50 тыс. клеток на 1 см 3 тизоля. Исследование эффективности применения лиофилизированного препарата АФБ проводили по схеме, представленной в таблице 7.

–  –  –

Анализ результатов вирусологических исследований образцов органов от экспериментальных мышей показал, что в распространение возбудителя в организме осуществлялось как нейрогенным, так и гематогенным путем. В течение 10 суток после инфицирования происходила агрессивная экспансия организма ВПГ (рисунок 3). Активное размножение вируса регистрировалось в тканях головного, спинного мозга и печени. Вирусный антиген, указывающий на репродукцию ВПГ, выявлялся в клетках слизистых оболочек глаз, ротовой полости и уретрального канала у 93,1 % особей. Латентная фаза развивалась через 2 – 2,5 недели после инфицирования животных и длилась до 2 месяцев. В течение этой скрытой фазы лабораторными исследованиями органов и тканей была выявлена персистенция ВПГ в тканях головного и спинного мозга, печени молекулярно-биологическим методом.

–  –  –

0,8 0,6 0,4 0,2

–  –  –

Рисунок 3 – Уровень репродукции персистирующего вируса простого герпеса в тканях органов экспериментальных мышей Реактивация персистирующего ВПГ и его репродукция в тканях и органах экспериментальных животных регистрировалась лабораторными методами в периоды с 60 по 80-е сутки; со 160 по 180-е; с 240 по 250-е; с 300 по 320-е; с 390 по 430-е сутки. Во все периоды в тканях головного, спинного мозга и печени был выявлен инфекционный вирус. В эндотелиальных клетках кровеносных сосудов головного, спинного мозга и печени антиген вируса обнаружен на 90-е сутки после инфицирования. На 160-е сутки антиген ВПГ тестировался в клетках синовиальных оболочек коленного и нижнечелюстного суставов, в тканях мезодермального слоя кожи, в тканях почек; на 240-е сутки – в тканях легких. Исследованием смывов и мазков – отпечатков со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и уретрального канала мышей-самцов было показано, что репродукция ВПГ выявлена на 70-е сутки в 27,6 % случаев; на 170-е – в 96,1%; на 250-е – в 53,7 %; на 310-е – в 92,4 %; на 430-е сутки – 84,6 % (таблица 8).

Таблица 8 – Динамика распространения вируса простого герпеса в организме экспериментальных мышей-самцов (n =250)

–  –  –

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в организме экспериментальных животных сформировались многочисленные очаги персистенции вируса, в которых его репродукция происходила непрерывно. В роли «органов-мишеней» выступали головной и спинной мозг, печень, клетки эндотелия кровеносных сосудов.

Наблюдение за развитием заболевания у инфицированных ВПГ-1 мышей выявило его определенную цикличность – периоды клинических проявлений ГВИ чередовались с временным улучшением здоровья животных. За время наблюдения (460 суток) было зарегистрировано 5 клинических эпизодов проявления ГВИ (Таблица 9).

–  –  –

Первые 5-23-и сутки после заражения характеризовались острыми клиническими проявлениями ГВИ в виде поражений слизистых оболочек глаз и ротовой полости (конъюнктивиты и стоматиты) – рисунок 4.

На пике заболевания через 15 – 18 суток у 62% мышей наблюдали выраженный менингиальный синдром. Течение заболевания осложнялось интоксикацией в 100% случаев. Исследование экспериментально-клинических материалов и показало, что в острый период заболевания в инфекционный процесс вовлекаются внешние слизистые оболочки глаз, ротовой полости и уретрального канала. Вирусный антиген методом РИФ обнаруживался также в перитонеальных макрофагах. Процесс восстановления жизнедеятельности у экспериментальных мышей происходил в среднем за 18-21 день после исчезновения всех клинических проявлений ГВИ. Наиболее длительным он был у мышей, у которых в острый период заболевания отмечено критическое снижение массы тела (на 30-35% от первоначального веса).

Рисунок 4 – Поражение глаз, стоматит у мыши, 15-е сутки после заражения ВПГ-1. Фотография А.П. Порываевой.

Период ремиссии с 30 по 60-ые сутки характеризовался персистенцией ВПГ в клетках головного и спинного мозга. На фоне видимого клинического благополучия, адекватных поведенческих реакций, соответствующих нормам физических параметров (возраст/вес) лабораторные исследования в период с 60 по 80-е сутки выявили латентное течение ГВИ у зараженных мышей (Таблица 10). Активный инфекционный процесс наблюдали в клетках слизистых оболочек уретрального канала и ротовой полости. Латентное течение ГВИ сопровождалось вирусемией.

Клиническим проявлениям ГВИ у экспериментальных мышей на 162-169 сутки после заражения предшествовало обнаружение антигена ВПГ в клетках осадка мочи на 155-е сутки и в клетках крови на 160-е сутки. Заболевание начиналось остро и носило характер системного поражения: выраженный менингиальный синдром, тремор конечностей, манежные движения, конъюнктивит, стоматит, ринит, поражения кожных покровов в области нижней челюсти и/или поясничнокаудальном отделе (Рисунок 5).

Рисунок 5 – Ренит, поражение глаз, 160 сутки после заражения ВПГ-1. Фотография А.П. Порываевой На протяжении 30-и суток с момента обострения ГВИ у животных антиген ВПГ выявляли не только в клетках слизистых оболочек, тканях головного и спинного мозга и печени, но и в клетках синовиальных оболочек коленного и нижнечелюстного суставов, в тканях мезодермального слоя кожи. В поведении животных отмечали обособленность, сонливость и вспышки агрессивности. Затухание клинических проявлений происходило медленно. Длительное время у 35,3% мышей наблюдали манежные движения, тремор конечностей на фоне выраженного астенического синдрома.

Четвертый эпизод обострения ГВИ был зарегистрирован на 240-е сутки после инфицирования. При исследовании крови экспериментальных животных был выделен инфекционно активный ВПГ, а в клетках перитонеального экссудата выявлен его антиген. Однако клинические проявления заболевания отмечались спустя 7-8 суток только у 52,7% мышей. Острый период заболевания в среднем продолжался 3-5 суток в виде острого катарального конъюнктивита с отчетливым блефароспазмом и умеренно выраженном тремором конечностей. Острота клинических проявлений быстро снижалась, но слабо выраженные признаки заболевания сохранялись до 14-17 дней. Только у одной мыши острые катаральные проявления конъюнктивита наблюдались длительное время и закончились помутнением роговицы и развитием экземы под медиальным углом глаза (Рисунок 6).

Рисунок 6 – Поражение кожи, поражение глаз, 240-е сутки после заражения ВПГ-1. Фотография А.П.Порываевой.

Почти у всех экспериментальных мышей (82,3%) антиген ВПГ был обнаружен в клетках осадка мочи и клетках слизистой оболочки глаз. Основными симптомами интоксикации у мышей в этот период обострения ГВИ были сонливость, замедленные поведенческие реакции.

Периоду рецидива ГВИ с 308 по 325-е сутки предшествовала длительная вирусемия и активизация инфекционного процесса в тканях головного и спинного мозга.

Клинические проявления заболевания – ринит, конъюнктивит, стоматит – имели умеренный, но в основном слабо выраженный характер. Обращает на себя внимание тот факт, что на фоне замедленных поведенческих реакций, животные стали проявлять повышенную агрессивность друг к другу. Колебание массы тела у мышей было в пределах физиологической нормы, но состояние шерсти (отсутствие глянцевого блеска, взъерошенность), кожи лап и хвоста (снижение тургора, наличие шелушений, сухость) указывало на интоксикацию организма.

–  –  –

МПО НОС РОТ

–  –  –

У 52,7% мышей по результатам исследований в клетках слизистой оболочки уретры протекал активный инфекционный процесс. У 4,1% животных антиген ВПГ выявляли в течение 1,5 месяцев (с 310 по 350-е сутки). Таким образом, рецидив ГВИ у мышей имел вялое длительное течение, характерное для хронического процесса.

На 397 – 400-е сутки после инфицирования рецидив заболевания характеризовался сочетанными поражениями в виде слабовыраженных конъюнктивита, ринита, кожного зуда, тремора конечностей. Менингиальный синдром с яркой клинической картиной наблюдали только у 2 мышей, которые погибли во время судорожного припадка. В последующие 30 суток заболевание протекало монотонно. В большинстве случаев антиген ВПГ-1 обнаруживали в клетках слизистой уретры – 61,5% и глаз – 38,4% экспериментальных мышей. На 430-е сутки эксперимента у 24,4% мышей отмечено обострение: поражение полового органа в виде отечности, гиперемии; обильное слизистое отделяемое из мочеиспускательного канала; острый болевой синдром, протекающий на фоне острого ринита и выраженного кожного зуда. Через 3-5 суток у них появлялись манежные движения и тремор конечностей. В этот период обострения у 39,6% особей сформировался выраженный астенический синдром. В течение 10-12 суток острые клинические проявления исчезали. Однако практически все экспериментальные животные имели болезненный вид: матовую взъерошенную шерсть, бледные и сухие кожные покровы лап, ушей и хвоста, заострившийся контур морды. Животные были вялыми, сонливыми, отказывались от пищи.

Дальнейшие наблюдения (до 465-ых суток включительно) за инфицированными животными изменений в характере течения клинических проявлений ГВИ не выявили. Эксперимент был завершён по нескольким причинам. Во-первых, продолжительность жизни лабораторных мышей составляет в среднем 2 года, и первые признаки старения организма – изменение состава крови и биохимических показателей – у мышей отмечаются в возрасте 17-18 месяцев [48, 82, 115]. На момент завершения исследования возраст экспериментальных животных составлял 16 месяцев, то есть был критическим. При продолжении эксперимента необходимо было бы учитывать показатели геронтологических особенностей, что не входило в цель нашего исследования. Во-вторых, общее состояние животных с признаками астенизации организма могло в значительной степени осложнить интерпретацию результатов эксперимента.

Анализ полученных результатов показал, периоды клинических проявлений экспериментальной ГВИ у мышей чередовались с периодами «клинического благополучия», что соответствовало «классической» форме течение герпесвирусного заболевания – «рецидив – ремиссия» [37, 72]. Стадия первичного инфицирования (до 30-х суток наблюдения) характеризовалась острой клинической симптоматикой: катаральным конъюнктивитом, стоматитом, выраженным менингиальным синдромом и острой интоксикацией. Затем длительная персистенция вируса в организме экспериментальных мышей-самцов проявлялась тремя основными формами инфекции:

«Хроническая рецидивирующая» форма герпесвирусной инфекции, при которой персистенция вируса манифестировалась клинической симптоматикой заболевания в течение длительного времени;

«Хроническая латентная» форма ГВИ, при которой полный цикл репродукция вируса был нарушен и/или минимален, клиническая симптоматика заболевания отсутствовала;

«Медленная» форма ГВИ, при которой инкубационный период был длительным (до 300-х суток наблюдения) с последующим медленным прогредиентным течением с развитием тяжелых поражений нервной системы.

«Медленной» формой ГВИ регистрировалась в 3,6 % случаев, «Хроническая рецидивирующая» и «Хроническая латентная» формы – в 96,4% случаев.

По характеру клинических проявлений герпесвирусная инфекция в популяции экспериментальных мышей имела следующие формы. В 46% случаев наблюдалось сочетанное поражение слизистых оболочек глаз, ротовой полости, урогенитального тракта. Сочетанное поражение урогенитального тракта и кожных покровов отмечалось в 18% случаев. Поражение центральной нервной системы с развитием моно- и поли – параличей и парезов, приводящих к летальному исходу, зарегистрировано в 14%. Опухолевидные образования в области шеи и паха были выявлены в 6%. Признаки астенизации организма у мышей-самцов на момент завершения эксперимента наблюдались в 90,5% случаев.

Таким образом, было показано, что реализация биологического потенциала инфекционного вируса в организме экспериментальной модели осуществлялась через экспансию «органов – мишеней»: головного и спинного мозга, печени, легких, с формированием множественных очагов персистенции возбудителя. Диссеминирование герпесвирусного генома в ткани и сосудистое русло «органов – мишеней» происходило в течение 15 суток после инфицирования. Алгоритм реализации биологического потенциала инфекционного вируса характеризовался фазностью его репродукции в тканях «органов – мишеней» в виде литической и абортивной форм, которые происходили непрерывно и одновременно в одном макроорганизме на разных уровнях локализации очагов персистенции возбудителя, что отражало патогенез процесса в естественных условиях. Длительная персистенция вируса и характер вызываемых им клинических проявлений свидетельствовали о развитии системного хронического заболевания у экспериментальных мышейсамцов.

2.2.2.2 Динамика изменений иммунологического статуса, биохимического профиля и морфофункциональных показателей в популяции рандбредных мышей при хронической герпесвирусной инфекции Одним из критериев, определяющих тяжесть инфекционного процесса, является оценка состояния общей резистентности организма. Исследование крови экспериментальных мышей показало, что на начальных стадиях развития герпесвирусного заболевания наблюдалась адекватная картина развития защитной реакции организма (Рисунок 7). В первую очередь увеличивалась лейкоцитарная составляющая крови, происходила стимуляция моноцитарно-макрофагального звена, активировались окислительные процессы. Вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови, характеризующие уровень специфического иммунитета, выявлялись, начиная с 10-ых суток в титре 1:10. Далее титр антител увеличивался, достигая максимального уровня к 90-ым суткам (1:80) и сохранялся до 8-го месяца наблюдения. В последующий период отмечалось умеренное снижение титра вируснейтрализующих антител до уровня 1:40, который сохранялся до времени окончания эксперимента На выраженность иммунного ответа у экспериментальных мышей указывали не только изменения иммунологических реакций клеток крови. О морфофункциональной реакции костного мозга на введение ВПГ свидетельствовало изменении количественного содержания тучных клеток (ТК) в коже, брыжейке и перитонеальном лаваже у экспериментальных животных. Острая фаза заболевания (10 – 15-е сутки) сопровождалась достоверным снижением количества ТК и их массовой дегрануляцией. В период реконвалесценции (20 – 40-е сутки) содержание ТК в организме экспериментальных животных возрастало и несколько превышало исходный уровень, что вероятно было обусловлено компенсаторной репродукцией клеточных предшественников ТК в костном мозге (таблица 11).

–  –  –

288,3 ± 8,4 221,3 ± 8,7 24,0 ± 1,3 43,0 ± 1,6 20 284,7 ± 9,2 207,6 ± 9,3 19,1 ± 0,9 58,0 ± 1,3

–  –  –

Таким образом, реакция тучных клеток на антиген ВПГ проявлялась в виде изменения их количественного содержания, морфологических и функциональных признаков. Начало инфекции характеризовалось первичной активацией тучных клеток с высвобождением медиаторов воспаления и гистамина. Разгар заболевания сопровождался угнетением функции ТК, стадия реконвалесценции - вторичной активацией и стабилизацией морфофункционального состояния.

–  –  –

ЛИИ ЛИИ ЛИИ

–  –  –

В паренхиматозных органах, таких как печень и легкие, регистрировались выраженные морфофункциональные реакции, направленные на элиминацию вируса из организма. В первую очередь отмечалось изменение интенсивности метаболических процессов. В тканях органов достоверно повышался уровень содержания МДА (малонового диальдегида), что свидетельствовало об интенсивных процессах мембранного транспорта и утилизации токсичных субстратов. Максимальное повышение уровня МДА в печени и легких отмечалось на 10 – 15-е сутки после инфицирования, на пике развития клинических проявлений заболевания. Так же были выявлены существенные изменения в холестероловом метаболизме. Исследования пузырной желчи у экспериментальных мышей показали, что индекс соотношение содержания жирных кислот и холестерина (ХХИ) достоверно снижался. Изменение соотношения происходило в результате подъема уровня холестерина в 1,6 раза по сравнению показателем у интактных животных. Холестерин, как известно, обладает локальным стимулирующим действием на адгезию и миграцию макрофагов при сосудистых воспалительных ответах. Усиленный хемотаксис макрофагов и интенсивная лейкоцито-эндотелиальная адгезия были подтверждены морфогистологическими исследованиями образцов органов экспериментальных мышей.

В печени и легких мышей наблюдался стаз в мелких сосудах и капиллярах, обнаруживались очаги пролиферации ретикулоэндотелия, очаги гистиоцитарной и макрофагальной инфильтрации. Нарушения микроциркуляции в тканях органов ЦНС, почках и селезенки носили аналогичный характер – стенки мелких сосудов были отечны, эндотелий разрыхлен, в тканях органов мелкие очаги лейкоцитарной инфильтрации. Репаративные процессы с незначительными следами глиофиброзной пролиферации в органах были отмечены на 30 – 40-е сутки после инфицирования, однако в околососудистых зонах сосредоточение макрофагальных клеток сохранялось. В наших исследованиях (методом ИФ) в макрофагах сосредоточенных в околососудистых зонах в печени и был выявлен антиген ВПГ, что свидетельствовало о задержке клиренса вируса из «органов – мишеней».

Таким образом, проведенные исследования показали, что нарушение холестеролового метаболизма у экспериментальных мышей являлось одним из факторов длительной презентации вирусного антигена в эндотелии сосудов и околососудистой зоне.

Результаты наших вирусологических, серологических, гистологических исследований материалов от экспериментальных животных подтвердили, что полноценный иммунный ответ на первичную ГВИ не обеспечивал полную элиминацию ВПГ из организма «хозяина». Таким образом, защитно-приспособительные реакции организма у экспериментальных мышей разворачивались в условиях «постоянного стресса».

Период манифестации ГВИ с 60-х по 80-е сутки характеризовался минимальной репродукцией возбудителя, клинические проявления заболевания отсутствовали. Иммунологический ответ развертывался значительно быстрее, минуя индуктивную фазу. Реакции, происходящие в кроветворной ткани, были продолжительнее и сочетались с повышением уровня ЦИК, МПО и титра антител Ig G в периферической крови. Воспалительные реакции в этот период выражены умеренно (рисунок 8). Наиболее выраженные морфофункциональные изменения отмечались в печени зараженных мышей. У животных развивалась длительная ферментемия (уровень печеночных аминотрансфераз достоверно повышался) с одновременным увеличением активности ЩФ, что указывает на гепатоцеллюлярное поражение печени. В этот же период наблюдался дисбаланс уровня желчных кислот и холестерина в пузырной желчи (ХХИ – 5,8-6,0 при норме у интактных животных – 8,74-8,84). При гистологических исследованиях в препаратах печени обнаружены очаги вакуолизации и некробиоза гепатоцитов гипертрофия эндотелиоцитов прилежащих к ним капилляров.

–  –  –

ФНО

–  –  –

Рисунок 8 – Развитие защитной реакции организма инфицированных мышей в период рецидива ГВИ 60-80 сутки (синяя область – фоновые значения, бордовая область - экспериментальные значения) Манифестация ГВИ у экспериментальных мышей в период 160 – 180-х суток сопровождалась острой воспалительной реакцией, на что объективно указывало увеличение ЛИИ. Если на начальных стадиях заболевания он превышал нормальные значения в 2-2,4 раза, то в описываемый период - почти в 6 раз. Изменение процентного соотношения клеточных элементов крови в лейкоцитарной формуле обусловлено повышением количества в ней незрелых форменных элементов (юных метамиелоцитов, плазматических клеток) вследствие стимулирующего действия факторов воспаления на лейкопоэтическую функцию кроветворных органов (Рисунок 9).

Рисунок 9 – Динамика показателя ЛИИ воспалительной реакции у мышейсамцов, ифецированных ВПГ-1.

Аналогично увеличению значений ЛИИ отмечался подъем уровня ЦИК (в 2,5

– 3,2 раза), что говорит об усиленной продукции токсинов и недостаточности компенсаторной защиты организма. В сыворотках крови экспериментальных мышей были выявлены высокие уровни содержания МДА, МПО, гистамина и пониженное содержание глюкозы, что указывало на эндогенную интоксикацию (Рисунок 10). Действие эндогенных токсинов на внутренние органы животных в первую очередь выражалось в расстройстве микроциркуляции в сосудистом русле. Сосудистые стенки вен и артерий головного мозга, спинного мозга, легких, печени, почек, селезенки находились в состоянии отека. В сосудистом русле органов происходило расслоение крови, образование сладжей эритроцитов, агрегация форменных элементов, десквамация эндотелия. В тканях органов наблюдались мелкоочаговые кровоизлияния.

К началу периода клинической ремиссии (180 – 190-е сутки) у экспериментальных мышей наблюдалось достоверное повышение иммунологических показателей по сравнению с величинами, определяемыми у здоровых животных. Обращал на себя внимание тот факт, что и в период самой клинической ремиссии иммунологические показатели соответствовали показателям периода рецидива ГВИ.

Выявленные изменения, на наш взгляд, были обусловлены хронической антигенной нагрузкой и отражали состояние функционального перенапряжения иммунной системы у больных животных в период ремиссии.

Сценарий развития защитно-приспособительных реакций в период клинического рецидива ГВИ на 240 – 260-е сутки после заражения почти в точности повторял развитие воспалительного процесса и иммунного ответа при рецидиве в 160 – 180-е сутки. Однако воспаление, как типовой патологический процесс, приобретало системный характер, что в корне изменило суть воспалительной реактивности и самого воспалительного процесса в целом. В составе форменных элементов крови преобладали агранулоциты, юные метамиелоциты (до 12,3%) и плазматические клетки (до 5-7%), то есть наблюдалась типичная для хронических заболеваний картина нарушения кроветворных функций. В крови происходило накопление провоспалительных и противовоспалительных цитокинов с доминированием последних. Достоверно повышалась функциональная активность моноцитарно-макрофагального звена, тем не менее, высокий уровень МПО в сыворотке крови свидетельствовал о постоянном напряжении секреции этими клетками и их истощении (Рисунок 11). Также были выявлены стойкие изменения метаболических процессов (дыхания, липидного и углеводного обменов), которые свидетельствовали о формировании системного синдрома эндогенной интоксикации.

–  –  –

ЛИИ

ЛИИ ЛИИ

–  –  –

МДА ИЛ-1

–  –  –

ЛИИ ЛИИ ЛИИ

РТМЛ 40

–  –  –

70 МДА ИЛ-1

–  –  –

В период клинической ремиссии отсутствовала положительная динамика изменения иммунологических и биохимических показателей у экспериментальных мышей. В гистологических препаратах органов (головного мозга, печени, селезенки, легких, почек) обнаружены очаги некробиоза тканей, участки лимфоидногистиоцитарных скоплений, в ряде случаев тромбоз капилляров и десквамация эндотелия в артериях.

Дальнейшие лабораторные исследования материалов от экспериментальных мышей показали, что патологические изменения гомеостаза, вызванные длительной персистенцией ВПГ, носили необратимый характер (рисунок 12). В период с 300-х по 460-е сутки наблюдалась генерализация воспалительной реакции с тяжелым синдромом системной эндогенной интоксикацией, угнетением иммунной защиты и развитием полиорганной дисфункции.

Нарушения иммунорегуляторных процессов выражалось в количественных и качественных изменениях клеточного иммунитета. В крови количество Тлимфоцитов было снижено почти в 1,5 раза, в составе нейтрофильных гранулоцитов преобладали палочкоядерные Н (до 27,6%), юные Н и миелоциты (до 15,8%).



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В. Москва 20 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 1. Введение 2. Обзор литературы 2.1. Описание заболевания 2.2. Общая характеристика вируса гриппа 2.3. Эпидемиология вируса гриппа А...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.