WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

«ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Взаимодействие клеточного рецептора с ИФН активизирует киназы Jak 1 и Tyk 2, в результате чего усиливается транскрипция около 100 интерферонстимулированных генов [55]. ИФН «тормозят» репликацию ВПГ, препятствуя экспрессии – генов вируса [66, 123]. ДК эпителия фагоцитируют вирусные антигены и мигрируют региональные лимфатические узлы, где презентируют вирусные пептиды Тклеткам. Презентация Т-клеток вызывает их активацию и секрецию цитокинов, действие которых направлено на дифференцировку CD4+ и CD8+ - Т-лимфоцитов, то есть происходит запуск реакций системного адаптивного иммунного ответа.

Однако, как выяснилось, ВПГ-1 способен блокировать каскад событий, вызываемых ИФН-индуцированным сигналом [28].

Вирусный – белок ICP0 предотвращает гиперфосфорилирование и накопление в клеточном ядре фактора IRF-3 (interferon regulatory factor) и при взаимодействии с индуцированными ИФН-белками способствует их деградации. Таким образом происходит торможение опосредованной ИФН- и ИФН- защиты клеток от инфицирования ВПГ [28, 44].

Миграция ДК эпителия в региональные лимфатические узлы приводит в движение клетки эффекторы 3 фазы селективного иммунного ответа. В первую очередь НФ, затем моноциты и NK преодолевают активированный сосудистый эндотелий капилляров и движутся за градиентом концентрации хемокинов, которые распространяются из очага инфекции. Достигая очага инфицирования, клеткиэффекторы фагоцитируют вирусные частицы и/или зараженные вирусом клетки [42]. Хемотаксис нейтрофилов (НФ) опосредован интерлейкином (ИЛ – 18), цитокинами (ФНО-, ГМ-КСФ, и ИФН-), продуктами расщепления комплемента (С3а и С5а), которые секретируются резидентными МФ и эпителиальными клетками [53]. Мобилизированный в очаг инфекции НФ секретируют большое количество ФНО- и ПМП ( – дефенсин). Противовирусный эффект ФНО- в отношении ВПГ в значительной степени усиливается ИФН- и/или ИФН-. В исследованиях in vitro и in vivo было показано, что сочетанное действие ФНО- и ИФН ( и/или ) снижает содержание ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках эпителия в 1000 раз [65]. Секретируемый – дефенсин встраивается в липидную оболочку вируса и разрушает фагоцитированные вирионы [52]. Таким образом, НФ за счет продуктов секреции угнетают размножение ВПГ и уничтожают вирус путём лизиса инфицированных клеток [130].

Фагоцитоз вирионов и пораженных вирусом клеток осуществляется МФ, при этом, как было показано в ряде исследований, сами макрофаги не восприимчивы к герпесвирусной инфекции [28, 57]. Макрофаги являются основным источником соединения азота (NO – окись азота), который обладает выраженной противовирусной активностью. Антивирусный эффект NO выражается в угнетение репликации вирусной ДНК и сборке вирионов на этапе экспрессии поздних генов. В исследованиях Benencia F. et al (2001 г) было показано, что блокирование продукции NO приводило к более широкому распространению инфекции у экспериментальных животных, но не влияло уровень летальности среди них в процессе заболевания [136]. Подобно ДК макрофаги экспрессируют на своей поверхности сигнальные рецепторы TLR («оповещающие о приходе чужого»), которые служат проводниками специфических сигналов, индуцирующих синтез цитокинов, необходимых для активации Т-клеток [57]. Макрофаги играют одну из центральных ролей в защитной реакции воспаления, продуцируя ряд важных хемокинов (ФНОИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18) и цитокинов (ИФН- и ИФН-) [47, 99]. В экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что при герпесвирусной инфекции наблюдается угнетение хемотаксиса МФ, снижение их фагоцитарной активности на фоне уменьшения секреции этими клетками ФНО-, ИЛ-1 [88, 103].

Натуральные киллеры (NK) непосредственно лизируют инфицированные вирусом клетки. Цитолитическая активность NK обусловлена уменьшением экспрессии на клетках-мишенях антигенов HLA класса I и увеличением экспрессии NKG2D (natural killer-activating signal). ИНФ-, продуцируемый активированными NK, индуцирует дифференцировку Т-клеток [66]. Уровень продукции цитокинов клетками-эффекторами в значительной степени, по мнению большинства российских и зарубежных исследователей, определяет устойчивость организма к герпетической инфекции [31, 56].

Таким образом, реакции селективного иммунитета защищают организм на ранних этапах развития ГВИ, подготавливая «информационную почву» для последующей реализации адаптивного иммунного ответа. Однако существуют механизмы, которые позволяют ВПГ нарушать или «извращать» связи между реакциями селективного и адаптивного иммунитета.

Особенности адаптивного иммунитета при герпесвирусной инфекции. Ведущим механизмом в патогенезе герпетических заболеваний является индуцированное ВПГ иммунодефицитное состояние организма. Наиболее часто встречаются нарушения иммунорегуляторной функции Т-лимфоцитов (CD4+ - Т-хелперов и CD8+ Т-лимфоцитов специфических «клеток-киллеров»). Показатели В-звена иммунной системы нарушаются реже. В большинстве случаев количество Влимфоцитов и содержание сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G имеют нормальный уровень [23].

Функция факторов клеточного иммунитета связана с блокированием репликации вируса, миграцией и удержанием МФ, лимфоцитов и нейтрофилов в очаге воспаления. Компоненты клеточного иммунитета вызывают лизис инфицированных клеток и высвобождают внутриклеточный вирус для последующей нейтрализации антителами, и кроме того, через систему интерферона оказывают влияние на нормальные клетки, находящиеся в пограничной зоне очага воспаления [31, 44].

Основным критерием разделения Т-хелперов является их участие в индукции преимущественно клеточного (Th1) или гуморального (Th2) иммунного ответа.

Определяющим звеном в индукции того или иного класса Th-клеток служит комбинация молекул ко-активации, экспонируемых антиген презентирующей клеткой, и цитокиновый сигнал, получаемый Т-хелпером [57, 62].

Однако, как было установлено, герпесвирус обладает способностью модулировать защитные иммунные реакции хозяина. Модуляция иммунного ответа начинается с нарушения презентации антигена Т-лимфоцитам, но не ограничивается им. Это обусловлено наличием в вирусном геноме ряда генов, кодирующих белок, «используемых» вирусом для противодействия иммунным реакциям организма. Генетическое картирование штаммов ВПГ- 1 и 2 типов и установление гомологичных последовательностей с клеточными белками хозяина позволяют считать, что эти гены были «захвачены» вирусами в процессе эволюции и «модифицированы в пользу» вируса [7, 24]. Многие из таких вирусных генов имеют высокую степень гомологичности с соответствующими клеточными генами, другие обладают ей в меньшей степени, но, тем не менее, имеют функциональное сходство. Функционирование этих генов может вести к ингибированию синтеза и/или процессинга клеточных белков, важных для иммунных процессов (например, цитокинов), к блокированию связывания антивирусных цитокинов с клеточными рецепторами, к блокированию передачи внутриклеточных сигналов. Соответственно это оказывает влияние на природу иммунного ответа (Th1 или Th2) [44, 46].

Важную роль вирусиндуцированной иммуносупрессии играет синтез вирусных гомологов иммуносупрессивных цитокинов. Как было установлено, герпесвирусы кодируют белок, аналогичный клеточному цитокину ИЛ-10 (с 27 – 84% гомологии). Синтез этого белка - гомолога снижает синтез ИНФ-, усиливает пролиферацию В-клеток и продукцию антител. Таким образом, герпесвирус осуществляет стратегию повреждения иммунных реакций, избегая иммунного распознавания и клиренса [8, 23, 46]. Герпесвирусы «владеют» и другими способами подавления иммунного ответа через влияние на систему регуляторных цитокинов.

Все представители Herpesviridae модулируют ответ суперсемейства ФНО, важнейших медиаторов защитных воспалительных реакций и регуляторов адаптивного иммунитета [130]. В норме через рецепторы ФНО активирует в клетке широкий спектр ответов, включая антивирусный. Вирусные белки, гомологичные белкам рецепторов ФНО препятствуют связыванию 2 –микроглобулина с молекулами комплекса гистосовместимости (МНС) в эндоплазматическом ретикулуме и нарушают их перемещение к поверхности клетки. Таким образом, «нагруженные»

вирусными пептидами МНС становятся «неузнаваемыми» для NK-клеток, а сниженная экспрессия МНС I на поверхности инфицированной клетки приводит к снижению напряженности специфического CD 8+ - ответу [64, 66].

Многочисленные исследования показали, что ВПГ способен модулировать синтез хемокинов – медиаторов межклеточных взаимосвязей, участвующих в росте, развитии, гомеостазе и иммунитете хозяина.

Именно модуляция вирусом синтеза хемокинов в клетках-мишенях (Т-лимфоцитах и МФ) служит мощным инструментом регуляции защитных реакций организма. Начальной фазой антигениндуцированного этапа гуморального ответа является активация В-лимфоцитов, которая происходит под влиянием двух основных сигналов: от непосредственного распознавания антигенов Ig-рецепторами и Th-клеток, через продуцируемые ими цитокины. Активированные В-лимфоциты синтезируют антитела против оболочечных антигенов ВПГ и мембранных антигенов инфицированных клеток. Как при первичном инфицировании, так и при рецидивирующем течении ГВИ последовательно синтезируются антитела классов Ig M, Ig G и Ig A. Образование комплекса вирус-антитело способствует угнетению выхода вируса из инфицированных клеток, что препятствует его распространению к другим восприимчивым клеткам [128]. Однако комплекс вирус-антитело может вызывать развитие иммунологических повреждающих изменений в организме. Так было показано, что, связываясь с Fc-рецепторами инфицированных ВПГ клеток, антитела самостоятельно или в комплексе с антигеном нарушают распознавание этих клеток и их лизис сенсибилизированными лимфоцитами, а это, в свою очередь, поддерживает персистенцию вируса и вызывает повреждение иммунных реакций организма [64]. Таким образом, возникает своеобразный «замкнутый порочный круг», в цикле которого клеточная кооперация может нарушаться на различных этапах. Так, например, от взаимодействия Т-лимфоцитов с инфицированными клетками и от продукции В-лимфоцитами антител зависит развитие и состояние адаптивного иммунитета. С другой стороны активность клеток моноцитарно-макрофагального звена на индуктивной стадии ГВИ определяет резистентность организма к этой инфекции. И, в тоже время ВПГ не только персистирует, но и репродуцируется в клетках иммунной системы, обуславливая гибель и/или снижение функциональной активности этих клеток [46].

Механизмы иммунопатологии при ГВИ разнообразны и включают как ответ на персистирующий антиген, так и неадекватную регуляцию вирусоспецифического иммунного ответа. Иммунологические состояния характеризуются функциональной неполноценностью многих факторов неспецифической резистентности, угнетением и разбалансированием системы Т- и В - клеточного иммунитета. Причем выявленные нарушения в иммунном гомеостазе регистрируются как в стадии рецидива, так и в стадии ремиссии заболевания [64, 72]. Не вызывает сомнение, что противостояние «вирус – хозяин» в процессе совместной эволюции разрешалось «изобретением» всё новых приемов, обеспечивающих выживание обеих сторон, и вирус герпеса яркое тому подтверждение. Иммунная система обладает уникальными возможностями маневрирования в организации защитных реакций, однако течение и исход одной и той же инфекции имеют множество вариантов, которые зависят от генотипа хозяина [103].

В заключении необходимо отметить, что сравнительные исследования герпесвирусов животных и человека позволили выявить некоторые общие закономерности развития инфекции на микро- и макро- уровнях. Во-первых, герпесвирусы обладают тропизмом к эпителиальным и нервным клеткам, что обуславливает многообразие клинических проявлений [23]. Во-вторых, герпесвирусы инфицируют сенсорные ганглии вегетативной нервной системы и персистируют в них [31]. В-третьих, поражение вирусами клеток иммунной системы создает условия рецидивов заболевания и вызывает развитие вторичного иммунодефицита [5, 47, 70, 103].

Выявленные закономерности развития герпесвирусных заболеваний, накопленный фактический материал, современные технологии методологического анализа создают условия для детального изучения патогенетических механизмов латенции и реактивации герпесвирусов. Многофакторный анализ и системный подход к изучению патогенного действия герпесвирусов на организм животных и человека позволит решить, как теоретические, так и научно-прикладные проблемы по охране здоровья и воспроизводства в биологических популяциях. Создание гибких программы диагностики и лечения, обоснованный подход к профилактике герпесвирусной инфекции, обеспечат, во-первых, улучшение качества жизни человека, во-вторых, сохранение и рациональное использование биологических ресурсов.

2.1.2 ОСОБЕННОСТИ МОДЕДИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Экспериментальное исследование с использованием моделей in vitro и in vivo является одним из ведущих методов изучения патогенеза вирусных инфекций.

Молекулярные основы взаимодействия вирусов с клеткой, механизмы репликации вирусов и развитие морфогенетических изменений в клетке при вирусных инфекциях были изучены на модели in vitro. Так Skott et all (1971) на модели клеточной культуры ВНК была доказана способность встраивания генома вируса простого герпеса (ВПГ) в генетическую структуру клетки [7]. Создание хронически инфицированной ВПГ линии клеток WF-23 позволила не только детально изучить механизм репликации, но и исследовать биохимические изменения, возникающие при неопластических процессах [96]. Обладая несомненными достоинствами, клеточные культуры не могут, к сожалению, заменить организм в целом.

На модели in vitro невозможно проследить динамику изменений иммунных, обменных, биохимических процессов в совокупности при вирусной инфекции, воспроизвести определенную форму вирусного заболевания и системно описать патологические изменения на уровне макроорганизма.

Изучение закономерностей развития герпесвирусного заболевания у человека и животного в клинике затруднено по целому ряду причин. Во-первых, достоверно установить время заражения и определить место первичной инокуляции вируса не представляется возможным. Во-вторых, детальное наблюдение за развитием клинических проявлений ГВИ при первичном инфицировании и/или при рецидиве заболевания у человека и сельскохозяйственного животного без оказания соответствующей терапевтической помощи недопустимо по морально-этическим нормам. В-третьих, невозможно максимально контролировать внешние и внутренние условия, в которых находится больной.

Взаимодействие вируса с клетками организма в условиях экспериментального моделирования инфекции in vivo близко к развитию и течению заболевания у человека и сельскохозяйственного животного, что позволяет изучать характер этого взаимодействия, динамику развития причинно-следственных связей между «вирусом и хозяином» и определять некоторые закономерности патогенеза. Поэтому для понимания патогенеза вирусных инфекций важное значение имеют, как опыт изучения хронической вирусной инфекции у человека, так и данные по её моделированию на лабораторных животных. Кроме того, экспериментальное моделирование in vivo позволяет выяснить роль специфических и неспецифических факторов, действие которых не проявляются при моделировании инфекции in vitro.

Выбор модели in vivo для воспроизведения инфекционного заболевания обусловлен фактором патогенности вируса для экспериментального животного [82].

Характер взаимодействия «вирус – модель in vivo» определяется как биологическими особенностями лабораторного животного, так качественными и количественными характеристиками возбудителя. Как описано ранее (1.1), подавляющее число представителей семейства герпесвирусов патогенны для одного вида «хозяина», поэтому для воспроизведения заболевания in vivo может быть только сам «хозяин». В другом случае модель in vivo необходимо подвергать действию иммунодепрессантов или оперативному вмешательству [48].

Сравнительное изучение антигенной структуры герпесвирусов позвоночных показало, что ВПГ обладает большинством группоспецифических и типоспецифических антигенных детерминант, характерных не только для герпесвирусов человека. Также было выявлено от 2 до 5 группоспецифических антигенов общих для ВПГ и герпесвирусов животных: вируса Люкке лягушек, вируса болезни Марека птиц, вируса ИРТ, вируса аборта лошадей [24, 27, 119]. Наличие у ВПГ общих антигенных детерминант, как с герпесвирусами животных, так и человека позволяет использовать его в качестве почти «идеальной» модели для выявления общих закономерностей взаимодействия «вирус – макроорганизм». Данные о патологических изменениях в «макроорганизме» в результате действия ВПГ, могут также служить основой для определения характерных особенностей, присущих отдельным видам герпесвирусов.

Во-вторых, ВПГ патогенен для широкого спектра лабораторных животных.

В-третьих, позволяет воспроизвести in vivo характерные для герпесвирусов заболевания – генитальный герпес, офтальмогерпес, герпетический менингит.

2.1.2.1 Патогенность вируса простого герпеса для лабораторных животных

По данным литературы обезьяны вида Astus trivirgatus восприимчивы к вирусу герпеса, особенно при инфицировании в конъюнктивальный мешок, при котором развивается генерализованная инфекция с поражением печени, надпочечников и легких. Через 6-8 дней после заражения животные погибают [133]. Восприимчивость к ВПГ-1 обезьян шимпанзе и макак-резус зависят от возраста животного и способа введения вируса. Введение вируссодержащего материала в брюшину или в кожно-мышечную складку шеи 2-3 месячным обезьянам вызывает развитие менингитов и менингоэнцефалитов, в 73% случаев животные погибают через 10-12 дней после инфицирования [6, 77].

Кролики. Животные восприимчивые к вирусу простого герпеса используются в основном в качестве экспериментальных для воспроизведения модели «офтальмогерпеса». При инфицировании на скарифицированную роговицу глаза развивается кератоконъюнктивит. Летальность при этом способе заражения составляет от 3 до 12 % экспериментальных животных [54]. Введение вируса непосредственно в слюнную железу у кролика развивается бессимптомная инфекция протоков [48].

Инфицирование ВПГ-1 новорожденных крольчат и молодняка вызывает у них развитие острых менингоэнцефалитов, гибель животных наблюдается в течение 3-5 суток в 100% случаев [58].

Морские свинки являются одной из самых часто используемых экспериментальных моделей для изучения «генитального герпеса» и «герпетических поражений кожи»[32, 84, 119]. Заражение вирусом на скарифицированную роговицу глаза ведёт, как и у кроликов, к развитию кератоконъюнктивита. После внутримозгового инфицирования взрослых особей морских свинок развивается лихорадочная реакция с судорожным синдромом, гибель животных наблюдается в 8-15% случаев. Использование в качестве экспериментальной модели молодняка морских свинок, по мнению российских и зарубежных авторов, считается нецелесообразным, так как в 92-97% случаев животные погибают на 2-6 сутки после заражения вирусом [48].

Сирийские хомячки восприимчивы к вирусу простого герпеса, особенно при внутримозговом заражении, которое вызывает у них развитие менингита и менингоэнцефалита. При внутривенном введении развивается общая инфекция, но животные, как правило, не погибают [6, 43, 77].

Лабораторные крысы высоко восприимчивы к ВПГ при интраназальном заражении. У животных развивается пневмония, которая заканчивается гибелью в 60-87% случаев. Почти 100% смертность наблюдается при заражении 4-8 недельных крыс [77, 90].

Белые мыши. Восприимчивость белых мышей к вирусу герпеса варьирует в зависимости от возраста; наиболее восприимчивыми являются мыши в возрасте от 4 суток до 1 месяца, у которых независимо от способа и места введения вируса развивается герпетический энцефалит, заканчивающийся гибелью животных на 3сутки после заражения [48, 82].

Перечисленные выше лабораторные животные являются традиционными моделями in vivo для воспроизведения экспериментальной герпесвирусной инфекции. Реже используются суточные цыплята, куриные эмбрионы, хорьки, кошки, собаки [119]. В исследованиях Rell R., Dick G. et all приведены данные по инфицированию ВПГ-1 карпов и лимонных акул для получения особо чистых моноклональных антител [122].

Анализ литературных данных и собственных, ранее проведенных исследований [Порываева А.

П., Григорьева Ю.В. 2000 г] показал, что у новорожденных и молодняка всех видов лабораторных животных, независимо от дозы и способа введения вируса, развивается острая генерализованная инфекция ЦНС с летальным исходом в 96-100% случаев. Высокая чувствительность новорожденных и молодняка традиционных лабораторных животных к ВПГ-1 обусловлена не только нейротропностью вируса, но и физиологическими особенностями. Большинство лабораторных животных рождается физиологически незрелыми, что в первую очередь сказывается на функциональном состоянии центральной нервной системы, эндокринной и кроветворной систем. Компенсаторноприспособительные реакции на патогенное воздействие ограничивается реакциями гуморального звена иммунитета [115]. В патологический процесс при инфицировании ВПГ-1 сосунков и молодняка лабораторных животных сразу же вовлекаются печень и селезенка. Эти органы в I постнатальном периоде у животных осуществляют гемо- и лимфопоэз. Только к 4-5 неделе жизни физиологические, гематологические, биохимические и функциональные показатели достоверно приближаются или соответствуют таковым показателям у взрослых животных [82].

По мере старения у животных наблюдаются изменения активности многих ферментов, нарушаются обменные процессы, снижается функциональная активность желез, возникают дистрофические процессы в органах и тканях. Старение сопровождается сужением адаптационных и регуляторных механизмов организма;

быстрее наступает истощение компенсаторных возможностей [82, 100].

Таким образом, возраст лабораторных животных является одним из важных объективных критериев при выборе модели in vivo для изучения хронических вирусных инфекций. Описанные выше возрастные особенности сосунков, молодняка и стареющих животных значительно влияют на степень гематологических, биохимических, функциональных и морфологических сдвигов и гибель экспериментальных животных.

2.1.2.2 Чувствительность лабораторных животных к возбудителям в зависимости от их генетических характеристик У лабораторных животных восприимчивость к ВПГ-1 зависит не только от вида и возраста, но и от генетических особенностей популяции.

Породные или линейные лабораторные животные являются результатом селекции, как правило, инбридинга. По генетическим характеристикам линейные животные представляют собой гомозиготную популяцию [82]. Характерные признаки линейных животных касаются не только внешних особенностей – масть, анатомо-физиологические параметры, но также и своеобразия биохимических, иммунологических, морфологических показателей, выраженности специфических реакций на фактор воздействия, которые изменяются и протекают однотипно у 97-99% особей [48]. Поэтому популяцию линейных животных рассматривают как единый организм. Использование линейных животных в качестве экспериментальной модели обеспечивает стабильность результатов и высокую воспроизводимость исследований. Наиболее часто экспериментальные исследования проводятся на линейных мышах и крысах, реже – на морских свинках, хомячках и кроликах [82].

Однако вследствие возникновения инбридинговой депрессии линейные животные характеризуются пониженной жизнеспособностью, низкой плодовитостью, высокой восприимчивостью к бактериальным и паразитарным заболеваниям, повышенной чувствительностью к незначительным изменениям различных факторов внешней среды. Так, например, продолжительность жизни мышей различных линий существенно различается: Balb/c – 18-19 месяцев, у животных старше 12 месяцев развивается специфическая спонтанная патология сердца в 64,4%; NZW – 15-17 месяцев, гломерулонефрит наблюдается в 100% случаев;

C57BL/6 – 20-21месяцев, с возрастом прогрессирует депрессия функционального состояния антисвертывающей системы крови [115]. Аналогичные результаты инбридинговой депрессии наблюдаются и у линейных крыс, и у морских свинок, у хомячков и кроликов [58].

В этом аспекте беспородные лабораторные животные рассматриваются как гетерогенная популяция, в которой размножение проводится путем рандомбридинга

– случайного скрещивания. Рандомбредные (беспородные) животные являются фенотипически однородными с определенным размахом генетической изменчивости. Реакция животного на применяемое в эксперименте воздействие определяется его индивидуальными особенностями. Рандомбредные животные характеризуются высокой жизнеспособностью и плодовитостью, низкой чувствительностью к незначительным изменениям внешней среды [43].

Выбор беспородных или линейных животных в качестве экспериментальной модели определяется целью и задачами проводимого исследования. Полученные в результате данные должны быть сопоставимы с общими закономерностями жизнедеятельности организма человека и течения у него патологических процессов, обусловленных вирусной инфекцией [84]. Учитывая то, что человеческая популяция состоит из генетически разнородных индивидуумов, для изучения общих закономерностей развития хронической инфекции необходимо использовать рандомбредных животных. Поэтому в наших исследованиях были использованы беспородные белые мыши, что обеспечивало не только многообразие клинических проявлений, но и позволило получить сравнительные данные по течению патологических процессов при герпесвирусной инфекции.

2.1.2.3 Влияние половых гормонов на реализацию инфекционного потенциала возбудителя Известно, что защита организма от любого инфекционного агента представляет собой сложную цепь взаимодействия всех систем организма, и в первую очередь иммунной и эндокринной систем, которые являются ключевым звеном, влияющим на течение и исход заболевания [42]. Ряд исследований свидетельствует о том, что восприимчивость к различным инфекционным заболеваниям особей мужского пола существенно отличается от таковой у особей женского пола. Так ещё в работах Э.А. Рудзит и Л.И. Лисицы (1978) было показано, что пролактин, фолликулинстимулирующий и лютенизирующий гормоны являются мощными стимуляторами иммунных реакций [78]. В экспериментальных условиях Han X., Lundberg P., Tanamachi B. et al установили, что герпесвирусная инфекция век у мышей-самцов протекает тяжелее, чем у мышей-самок [125]. Образование роговичных рубцов при экспериментальном офтальмогерпесе у кроликов-самцов наблюдается в 2 раза чаще, чем у самок [51].

Чувствительность лабораторных животных-самок к инфекционному агенту зависит не только от общего гормонального статуса, но и от полового цикла [110].

Так интравагинальное и/или на скарифицированную кожу гениталий заражение ВПГ самок морских свинок во время I и III фазы полового цикла только в 5-7% случаев приводит к развитию генитальной инфекции. В то время как, у самцов морских свинок при инфицировании на скарифицированную кожу пениса генитальная герпесвирусная инфекция с характерными клиническими признаками развивалась в 80% случаев [83, 91]. При изучении влияния половых гормонов на активность макрофагальной системы было показано, что у самок-кроликов уровень стимуляции фагоцитоза в отношении золотистого стафилококка напрямую коррелировал с уровнем пролактина, фолликулинстимулирующий и лютенизирующий гормонов. Во время Iи II фазы полового цикла у них наблюдалось достоверное повышение уровня -глобулиновой фракции в сыворотке крови, индекса фагоцитоза и усиленную дифференцировку стволовых клеток в сторону эритроидного ряда [109].

Сведения о влиянии мужских половых гормонов на инфекционный процесс и динамику течения заболевания малочисленны [29, 87, 110]. Половой цикл самок лабораторных животных составляет от 72 часов у мышей и крыс до 15-17 суток у морских свинок и кроликов. Изменения уровня половых гормонов в течение цикла могут существенно повлиять на восприимчивость животного к инфекционному агенту. Синхронизация полового цикла у самок возможна при введении соответствующих гормональных препаратов. Для исключения влияния андрогенов необходимо проводить инфицирование индивидуально с учетом фазы полового цикла, что требует трудоемких дополнительных исследований. Поэтому с целью исключения влияния указанных выше факторов на течение инфекционного процесса целесообразно использовать в экспериментах самцов лабораторных животных.

2.1.2.4 Влияние способа введения вируса на развитие экспериментальной герпесвирусной инфекции В зависимости от цели исследования для моделирования экспериментальной ГВИ используют различные штаммы ВПГ-1, основным различием, между которыми является их способность поражать определённые клетки, ткани и системы органов «хозяина». Некоторые из них способны вызывать заболевания преимущественно кожи (например, штаммы УС и FD), или глаз, или слизистых оболочек ротовой полости и глотки (штамм GR-4). Все штаммы ВПГ-1 обладают выраженный нейротропностью и большинству из них присущ политропизм [8,15, 27].

Интрацеребральное заражение. У животных, при введении ВПГ-1 в головной мозг, как правило, развивается заболевание с симптомами энцефалита, с парезами и параличами конечностей. Гибель экспериментальных животных регистрируется в 80-100% случаев на 2-5 сутки от момента заражения [77, 133].

Внутримышечное и внутрикожное заражение. В зависимости от дозы и места введения вируса у экспериментального животного может развиться либо бессимптомная, либо манифестная герпетическая инфекция. Например, при введении вируса в мышцу задней лапы у сирийского хомячка развивается инфекция пояснично-крестцовых ганглиев без клинических проявлений. При введении в мышцу передней лапы в 62,5% случаев наблюдается острая герпетическая нейроинфекция [48]. У морских свинок при внутримышечном и внутрикожном заражении в месте введения развивается воспаление и отек и образуются везикулы. Внутрикожное введение вируса в подошву задней конечности мышей вызывает их гибель в 75% случаев на 7 – 9-й день после заражения, а при введении в кожу спины или живота у них развивается латентная инфекция с персистенцией вируса в спинальных ганглиях [7, 127].

Заражение на скарифицированную роговицу глаза вызывает у экспериментальных животных развитие герпетических конъюнктивитов и кератоконъюнктивитов. Однако у обезьян и кроликов генерализованная инфекции наблюдается в 5случаев, у крыс – в 3-7%, у морских свинок – в 6-10%, а у мышей летальный исход составляет почти 70% [48, 77].

Внутривенное и внутрибрюшинное заражение. При введении взрослым половозрелым животным вируса в брюшину или кровяное русло инкубационный период заболевания более продолжителен, а летальность в 2-3 раза ниже, чем, например, при интрацеребральном заражении [77]. По мнению как российских, так и зарубежных исследователей, при таком способе инокуляции вируса максимально исключается фаза местного реагирования слизистых оболочек и кожи, характерная при естественных путях инфицирования – контактном и половом [27, 51, 138]. Вирус проникает в организм, во-первых, минуя механические факторы защиты – нормальную бактериальную флору, гликокаликс; во-вторых, не подвергается атаке комплимента, ПМП и селективных Ig M [103]. При внутрибрюшинном введении диссеминация вируса в организме невральным и гематогенным путем происходит с равной долей вероятности, что имеет большое значение при моделировании хронической ГВИ [48, 77].

Внутриорганное заражение. Инокуляция вируса непосредственно в полость или ткань органа экспериментального животного применяется для изучения особенностей патогенеза конкретного герпесвирусного заболевания. Например, при заражении кроликов в переднюю камеру и/или белковую оболочку глаз Зайцевым Н.С. и Канцнельсоном Л.А. (1983) была изучена динамика развития герпетических поражений внутренних оболочек глаза [51]. Клинические особенности течения герпесвирусного фульминатного гепатита выявлены Майером К.-П. с соавторами при инфицировании крыс и кроликов ВПГ-1 и ВПГ-2 в ткани печени [50].

Необходимо также отметить, что степень вирусной нагрузки – инфекционная доза и объём вводимого вирусного материала – существенно влияют на количество летальных случаев в экспериментальных группах животных. Hill et all (1980) инфицировали взрослых мышей в подушечку лап ВПГ-1 с инфекционным титром 0,33 lg ТЦД50/мл в объёме 0,001 мл, летальных исходов у экспериментальных животных не наблюдалось.

При подкожном введении мышам этого же вируссодержащего материала в объёме 0,3 мл у них развивалась генерализованная инфекция ЦНС с летальным исходом в 73,8% случаев [6]. В эксперименте на морских свинках Scriba et Tatzbeer (1986) было показано, что подкожное инфицирование животных вируссодержащим материалом в объёме 0,5 мл с инфекционным титром ВПГ-1 1,0 lg ТЦД50/мл приводит персистенции вируса в коже. При аналогичном введении ВПГ-1, но с инфекционным титром 5,0 lg ТЦД50/мл, наблюдали инфицирование нервных ганглиев [58].

Наиболее подробно взаимосвязь вирусной нагрузки и клинической формы заболевания описана в исследованиях Баринского И.Ф. и Шубладзе А.К.. По мнению авторов, инфекционная доза и объём вводимого вирусного материала имеют прямо пропорциональную зависимость – чем больше вирусных частиц проникает в клетки организма, тем больше очаг инфекционного поражения организма [7].

Модели хронической герпесвирусной инфекции 2.1.2.5

Хроническая форма герпетического миелита была воспроизведена у морских свинок подкожным введением вируса. Бессимптомное течение инфекции характеризовалось продолжительной вирусемией (до 100-110 дней). Однако гибель наступала внезапно на фоне спастических судорог [7]. Воспроизведение хронической ГВИ у сирийских хомячков показало, что при генитальном, подкожном и в защечный мешок способах заражения развитие заболевания сопровождается развитием параличей у 50% особей. И хотя энцефалит у животных не развивался, у них наблюдались спастические судороги, ремитирующая лихорадка и агрессивные поведенческие реакции [77].

Клинические признаки офтальмогерпеса у крыс, вызванного заражением скарифицированной роговицы глаза нарастают медленно, в течение 7-10 дней. Заболевание редко осложняется развитием энцефаломиелита (менее 3 – 4 %). После острого заболевания развивается бессимптомная инфекция с продолжительным периодом вирусемии (до 90-100 дней). У животных наблюдается сочетанное поражение конъюнктивы и век на начальном этапе заболевания с последующими глубокими поражениями роговицы глаза [51]. Баринский И.Ф. с соавторами воспроизвели хроническую герпесвирусную инфекцию у мышей, используя при этом различные методы заражения: внутрикожные, на слизистую оболочку губ и ротовой полости, на роговицу глаза и интравагинальный. Половина животных погибла на 7 – 9-й день после заражения. У выживших мышей, как отмечают авторы, развилась хроническая инфекция, о чем свидетельствовала постоянная персистенция вируса в нервных ганглиях. Животных наблюдали в течение 110 суток. Бессимптомное течение инфекции у некоторых мышей сопровождалось обострением процесса и развитием острого герпетического энцефалита [7].

Патоморфологические исследования показали, что у всех экспериментальных животных, независимо от их вида и способа инокуляции вируса, отмечаются изменения в тканях головного мозга в виде развития очагов менингита с резко выраженной реакцией со стороны кровеносных сосудов. В печени отмечаются очаги пролиферации ретикулярного эндотелия, что связывают со способностью ВПГ-1 заражать печеночные клетки [77, 91, 138]. Изменения ретикулярного эндотелия обнаружены также в селезенке, легких и почках. Считается, что вирус проникает в органы и ткани именно в результате прикрепления к клеткам эндотелия капилляров [66]. Связанный с эндотелием вирус не может быть полностью элиминирован макрофагами. Однако наряду с установленными фактами специфических изменений, вызванных вирусом в различных органах и тканях организма большое значение имеет вирусемия, при которой вирус прочно связан с эритроцитами и лейкоцитами. Адсорбированный на поверхности эритроцитов вирус диссеминирует во внутренние органы и заражает новые и новые клетки [138]. На экспериментальных моделях герпесвирусной инфекции in vivo были также получены многочисленные данные по иммунопатогенезу заболевания. Показано, что тяжесть заболевания, определяемая частотой рецидивов и длительностью ремиссии, обусловлена иммунологическим статусом организма [77].

Клинические и экспериментальные исследования доказали, что герпесвирусная инфекция протекает как общее системное заболевание организма с поражением многих органов и тканей нередко в тяжелой форме. Тем неимение механизмы взаимодействия «вирус – хозяин» и оценка проявлений этих взаимодействий на процесс развития хронического заболевания требуют системного и детального изучения. Разработка экспериментальной модели хронической герпесвирусной инфекции in vivo для изучения механизмов перехода острой герпесвирусной инфекции в хроническую форму и ее влияние на развитие патологических процессов в организме на протяжении всего жизненного цикла экспериментального животного позволить, во-первых, уточнить этапы формирования системного заболевания, во-вторых, определить наиболее рациональной схемы проведения клиниколабораторной диагностики.

2.2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1 МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена в 2006-2014 гг. в отделе мониторинга и прогнозирования инфекционных болезней ФГБНУ «Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт» в соответствии с планом научно-исследовательских работ «Разработать и усовершенствовать существующие средства и методы борьбы с массовыми инфекционными болезнями молодняка животных на основе изучения их этиологической структуры, факторов, патогенности возбудителей, закономерностей формирования иммунитета» (№ госрегистрации 01201267271, № госрегистрации 01201359410).

Лабораторные исследования выполнены в ФБУН «Екатеринбургский научноисследовательский институт вирусных инфекций» в соответствии с планом научно-исследовательских работ «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации (№ госрегистрации 01201174323);

по заданию Министерства промышленности и науки Свердловской области (Госконтракт № 8/ЛС от 03.11.2010).

Экспериментальные и клинико-лабораторные исследования в референтных популяциях человека и животных проводили согласно требованиям Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. и Национального стандарта РФ ГОСТ Р53434-2009, СП 1. 3. 2322-08, МУ 1. 3. 2569-09 соответственно. Анализ государственной ветеринарной статистической отчетности (формы 1-Вет, 1-Вет А, 2-Вет), Медицинских документов № 25/у – 04, и результатов клинико-лабораторных исследований проведен в соответствии с ФЗ № 152 от 27.07.2006 и Приказом Роспотребнадзора РФ № 4 от 10.01.2014 [59, 71, 73].

2.2.1.1 Объекты экспериментальных исследований Эталонный вирус. В экспериментальном разделе работы был использован эталонный штамм вируса простого герпеса человека 1 типа штамм Л2 – ВПГ-1, полученный из института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Вирус поддерживали в серийных пассажах на чувствительной культуре клеток Vero. Инфекционный титр вируса определяли методом титрования на клеточной культуре по стандартной методике. Титр вируса выражали в значениях обратного десятичного логарифма (lg) по методике Рида и Менча [84].

Клеточные культуры для поддержания эталонного штамма ВПГ-1 и вирусологических исследований. Штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ -4/81) получен в 1981 году из нормальных легких эмбриона человека в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Среда культивирования состоит из смеси 1:1 сред Игла МЕМ и 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и антибиотиков, в среду поддержания СКРС не добавляют. Доза посадки на пробирки – 200 тыс.кл./мл; на матрасы – 150 тыс.кл./мл; на планшеты – 250 тыс.кл./мл.

Линия перевиваемых клеток почки обезьяны (Vero). Среда культивирования состоит из смеси 1:1 сред Игла МЕМ и 199 с добавлением 10% СКРС и антибиотиков, в среду поддержания СКРС не добавляют. Доза посадки клеток на пробирки – 100 тыс.кл./мл; на матрасы – 50 тыс.кл./мл; на планшеты – 220 тыс.кл./мл.

Лабораторные животные. Для проведения экспериментальных исследований было использовано 265 беспородных лабораторных крыс; 135 сирийских хомячков; 60 мышей линии Balb/c; 426 беспородных белых мышей. Животных получали из питомника-вивария ОКБ №1 г. Екатеринбурга и вивария ФБУН «Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций Роспотребнадзора».

Животные содержались в соответствии с правилами по использованию экспериментальных животных (GLP) [25]. Мониторинг здоровья животных осуществляли согласно «Положению о государственном ветеринарном надзоре в РФ» от 16.04.2001 № - 295 [73]. Определение микробиологического статуса лабораторных животных для исключения носительства патогенной флоры осуществляли в стандартных процедурах. Методом ИФА исследовали сыворотки крови лабораторных животных на антитела к Ectromelia virus, LCM, Hantaan virus. Индикацию Salmonella spp., Listeria monocito-genes, Streptobacillus moniliformes, Leptospira spp проводили рутинными культуральными методами. Наличие экзо – и эндопаразитов исключали микроскопическими исследованиями экскрементов и соскобов с кожных покровов. Контрольные обследования интактных животных проводились 1 раз в 3 месяца. Выборка составляла 10 животных каждого вида, из которых 5 – в возрасте 7 месяцев и 5 – в возрасте 10-11 недель. Экспериментальные животные для исключения патогенной флоры обследовались 1 раз в 30 дней [82].

2.2.1.2 Методика подбора экспериментальной модели для воспроизведения хронической герпесвирусной инфекции

Выбор экспериментальной модели in vivo для воспроизведения ХГВИ проводили в соответствии следующими критериями:

1) восприимчивость животного к ВПГ-1 при любом способе заражения;

2) возможность длительного наблюдения, которое позволяет охватить весь жизненный цикл животного;

3) выполнение манипуляций исключает или требует минимального применения наркоза;

4) содержание и уход за группой численностью свыше 30 особей не требуют значительных материально-технических затрат.

На первом этапе исследований в качестве экспериментальных моделей были выбраны лабораторные крысы, сирийские хомячки и белые мыши. Животных однократно инфицировали вируссодержащим материалом внутримышечно или внутрибрюшинно, так как при этих способах введения исключается фаза местного реагирования слизистых оболочек и кожи, характерная при естественных путях инфицирования. В качестве «антигена» использовали вируссодержащий материал, полученный методом пассирования лабораторного штамма Л2 ВПГ-1 типа на диплоидных и перевиваемых клеток ЛЭЧ-3, Vero. Содержание балластных белков в вируссодержащем материале, которые увеличивают антигенную нагрузку на организм экспериментальных животных, не превышало 1% (по результатам спектрофотометрического исследования). В процессе получения «антигена» антибиотики не применяли.

Характеристика экспериментальных групп животных

Беспородные лабораторные крысы. Для моделирования герпесвирусной инфекции были сформированы следующие группы:

группа 1 «Новорожденные» - суточные крысята массой 6,5 ± 0,5 г;

группа 2 «7-и суточные»- недельные крысята массой 10,0 ± 1,0 г;

группа 3 «14- и суточные» - двухнедельные крысята массой 20,5 ± 1,5 г; группа 4 «28-и суточные» - четырехнедельные крысята массой 52,5 ± 2,5 г; группа 5 «1,5 месяца» - крысы массой 97,5 ± 2,5 г ;

группа 6 «3 месяца» - крысы массой 195,0 ± 5,0 г;

группа 7 «Взрослые» - крысы массой 255,0 ± 25,0 г.

Инфицирование животных ВПГ-1 осуществляли по схеме, представленной в таблице 1, вирус вводили однократно. Животным контрольных групп вводили физиологический раствор.

–  –  –

Сирийские хомячки. Инфицирование животных в возрасте 1-и сутки, 7 суток, 14 суток и 28 суток вирусом простого герпеса проводили по схеме аналогичной для молодняка крыс. Взрослым сирийским хомячкам обоего пола (возраст 2 месяца, масса тела 84,7 ± 3,5 г) для моделирования герпесвирусной инфекции ВПГ-1 с титром 4,5 lg ТЦД50/мл вводили однократно по схеме, представленной в таблице

2. Животным контрольных групп вводили физиологический раствор.

–  –  –

Лабораторные мыши. Для исследования зависимости развития герпесвирусной инфекции от породности и пола животных было сформировано 2 группы: I группа – мыши линии Balb/c массой 21,5 ± 0,5 г (Ia группа – мыши-самцы n=30;

Iб группа – мыши-самки n=30; Iв группа «Контрольная» - мыши-самцы и мышисамки n=10);

II группа – беспородные мыши массой 21,7 ± 0,3 г (IIa группа – мыши-самцы n=30; IIб группа – мыши-самки n=30; IIв группа «Контрольная» - мыши-самцы и мыши-самки n=10).

Животным экспериментальных групп инфицировали внутрибрюшинно ВПГ-1 типа с титром 4,5 lg ТЦД мл в объёме 0,1 мл.

Мышам «Контрольных» групп вводили физиологический раствор в объёме 0,1 мл внутрибрюшинно.

Наблюдение за развитием клинических проявлений герпесвирусной инфекции у экспериментальных животных – крыс, хомячков, мышей – проводили ежедневно. Для выявления антигена ВПГ-1 в реакции иммунофлюоресценции у взрослых животных в динамике были взяты прижизненные пробы – смывы и мазки со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и гениталий. Отбор материалов осуществляли на 5-е, 10-е, 15-е, 25-е, 30-е сутки с момента инфицирования и далее с интервалом в 10 суток до момента окончания эксперимента. По завершению эксперимента у всех животных исследовали ткани головного и спинного мозга, легких, печени, почек, селезёнки вирусологическими, серологическими и патоморфологическими методами (Таблица 3). Всего было проведено 2522 тестовых исследований.

–  –  –

Примечание: * - при инфицировании вируссодержащим материалом и заборе клинического материала использовался эфирный наркоз У новорожденных и недельных крыс – даже при введении минимального объема инфекционного материала – летальность составляла 87-98%. Время наблюдения за развитием инфекционного процесса ограничивалось 3-8 сутками. При инфицировании ВПГ-1 крыс в возрасте от 14 дней до 1,5 месяцев у них развивались поражения центральной нервной системы. Максимальный период наблюдения за течением заболевания составлял 70 суток. У животных старше 3 месяцев развивалась персистирующая ГВИ сакрального отдела спинного мозга, что подтверждено гистологическими и вирусологическими исследованиями. Манифестные формы заболевания у взрослых крыс характеризовались поражением ротовой полости (в 10-11% случаев) и глаз ( 1%). Зарегистрированные клинические проявления ГВИ отмечались на 10-15 сутки после инфицирования. В дальнейшем клинических рецидивов заболевания не наблюдалось. При выполнении всех манипуляций с взрослыми крысами использовали оглушающий эфирный наркоз, что в известной мере не только затрудняло интерпретацию результатов гематологических и биохимических исследований, но и негативно влияло на поведенческие реакции животных. Наблюдение за развитием инфекционного процесса у экспериментальных крыс осуществляли в течение 250 суток.

Сирийские хомячки. Клинические проявления ГВИ при инфицировании новорожденных сирийских хомячков и молодняка до 1 месяца были аналогичны данным, полученным в экспериментах на крысах того же возраста. При внутримышечном и внутрибрюшинном заражении вирусом взрослых особей наблюдалось развитие общей инфекции, которая в 60% случаев осложнялась присоединением бактериальной. В 27,5% случаев летальность была обусловлена развитием абсцессов подкожно жировой клетчатки, кожно-мышечной ткани защечных мешков. В 15% случаев животные погибали в результате поражения ЦНС. Неспецифическая гибель хомячков наблюдалась в 37,5% случаев при использовании оглушающего наркоза, так как инфицированные животные были ослаблены и истощены.

Зараженные животные проявляли агрессивность и склонность к каннибализму, поэтому каждую особь содержали в отдельной клетке. Забор экспериментальных материалов – мазки и смывы со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и гениталий – проводили под оглушающим эфирным наркозом. Наблюдение за развитием инфекционного процесса у экспериментальных хомячков осуществляли в течение 210 суток.

Лабораторные мыши. Исследование проводили на 2 группах взрослых половозрелых животных – мышах линии Balb/c и беспородных лабораторных мышах обоего пола. Все манипуляции выполнялись без применения оглушающего наркоза. Наблюдения за экспериментальными мышами проводили ежедневно в течение 350-и суток, результаты представлены в таблице 5.

–  –  –

Моделирование экспериментальной ГВИ у мышей линии Balb/c показало, что эти животные высокочувствительны к ВПГ-1. Клинические проявления ГВИ имели выраженный характер. У них отмечено поражение ЦНС с развитием парезов и параличей задних конечностей, в 30-32% случаев заболевание сопровождалось тяжелой интоксикацией с формированием астенического синдрома. К 270 суткам наблюдения в живых осталось 35 % от общего числа экспериментальных особей.

Массовая гибель мышей линии Balb/c отмечалась в период 300-320 суток после инфицирования: 93,3% мышей-самцов и 80% мышей-самок.

У беспородных белых мышей летальность вследствие развития ГВИ была значительно ниже и составляла 30 % к 270-ым суткам после заражения и 35 % особей обоего пола – к 320-ым.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.