WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N ...»

-- [ Страница 2 ] --

зондов, которые применялись для обнаружения и идентификации специфических фрагментов ДНК и РНК. «Гибридизационные» анализы использовались для определения наличия или отсутствия специфических РНК или ДНК последовательностей в сложных смесях нуклеиновых кислот, с помощью специально разработанного комплементарного молекуле ДНК или РНК зонда, содержащего радиоактивную метку. Исследуемая нуклеиновая кислота сначала сорбировалась на твёрдой фазе, а затем происходила гибридизация с меченным зондом. После точной гибридизации и последующих этапов отмывки наличие анализируемого фрагмента ДНК определяется по наличию или отсутствию радиоактивно-меченного зонда на твёрдой фазе.

Кроме того результат реакции гибридизации можно визуализировать с помощью электронной микроскопии, результат гибридизации можно определить количественно т.к. ширина двухцепочечной (гибридизованной) нуклеиновой кислоты больше ширины одноцепочечной (не гибридизованной) нуклеиновой кислоты. Самым удобным видом гибридизационных анализов является фильтр-гибридизация, когда образец ДНК гибридизуется на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране (фильтре) в сочетании с пост-гибридизацией, авторадиографией или сцинтиллографией. Данные модификации гибридизационного метода значительно увеличивают чувствительность анализа, а также значительно улучшают техническую надежность и скорость гибридизации, позволяя обнаруживать пикограммы анализируемого материала. Однако одним из главных недостатков гибридизационного метода была необходимость использования радиоактивно-меченных зондов, что не безопасно для здоровья оператора, требует специального разрешения, соответствующей схемы утилизации и является довольно дорогим. По этим причинам радиоактивные метки были в большинстве случаев заменены различными нерадиоактивными химическими метками, используемыми при колориметрическом, хемолюминесцентном и хемо-флуоресцентном гибридизационном анализе. Однако, это «второе поколение» химических флуоресцентных зондов и систем детекции, как правило, уступает в чувствительности радиоактивно-меченным зондам, хотя оба способа обнаружения позволяют автоматизировать проведение анализа и обладают высокой эффективностью. На сегодняшний день разработано большое количество разнообразных методик на основе гибридизационного анализа, например, сэндвич-гибридизация, используемых для клинической диагностики и фундаментальных исследований (Ellis J.S., 2001).

Полимеразная цепная реакция позволяет синтезировать специфический участок определенного фрагмента ДНК с помощью двух небольших фрагментов ДНК, называемых праймерами. Праймеры связываются с участком ДНК, который нужно амплифицировать. Реакция амплификации при постановке ПЦР высокоспецифична. Специфичность реакции определяется точной гибридизацией праймеров на определенной последовательности, комплементарной последовательности на молекуле ДНК, которую следует амплифицировать. ПЦР-праймеры – это специфические нуклеотидные последовательности, предназначенные для гибридизации на положительной или отрицательной цепи ДНК. После гибридизации праймеров на специфических участках ДНК требуется термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза для синтеза новой цепи ДНК. Благодаря тому, что для ПЦР используется два праймера (по одному для каждой цепи двухцепочечной ДНК) и многократно повторяются процессы гибридизации праймеров и диссоциации, амплификация ДНК по направлению 5’-3’ происходит на обеих цепях (Ellis J.S., 2002).

ПЦР-амплификация – это циклический процесс, при котором сначала происходит денатурация двойной цепи ДНК в одинарные цепи (Глик Б., 2002). Обычно это достигается с помощью нагревания образца ДНК на водяной бане при температуре 940С от 30 секунд до 5 минут. Гибридизация специфических олигонуклеотидных праймеров на каждую цепь происходит при снижении температуры реакционной смеси до температуры отжига, которая обычно составляет от 400С до 650С (в зависимости от вида олигонуклеотидной последовательности, используемой в качестве праймера).

После гибридизации праймеров температуру поднимают примерно до 720С, которая является оптимальной для репликации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Далее весь цикл повторяется заранее намеченное количество раз. После каждого цикла репликации, каждая вновь синтезированная молекула двухцепочечной ДНК (называемая амплимер или ампликон) содержит концевые последовательности, являющиеся комплементарными последовательностям используемых праймеров. Этот процесс позволяет использовать каждый вновь синтезированный ампликон в качестве матрицы для синтеза последующих ампликонов в следующих раундах ПЦР (Vernet G., 2004).

При детекции молекул РНК необходимо провести обратную транскрипцию (ОТ), т.е. синтез копии ДНК (кДНК)на матрице РНК. Затемна матрице кДНК амплифицируют специфические фрагменты. Поэтому ПЦР для РНК-содержащих вирусов называется ОТ/ПЦР (рисунок 3.).

–  –  –

Рисунок 3. Схема ОТ/ПЦР.

На рисунке 4 представлены компоненты, необходимые для проведения ПЦР на матрице РНК (например, вируса гриппа).

1. ДНК-матрица – ДНК или кДНК, содержащая специфический фрагмент с местами посыдки праймеров;

2. Праймеры –олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК или кДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – смесь четырех дНТФ, составные части новых комплементарных цепей ДНК.

4. Фермент термостабильная ДНК-полимераза – термостабильная Taqполимераза или Tth- полимераза или др., катализирующая удлинение праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК.

5. Фермент ревертаза – синтезирует кДНК на матрице РНК.

6. Фермент RNA-зин – фермент, препятствующий работе РНК-аз (ферментов деструктурирующие молекулы РНК) (Брюханов А.Л., 2012; Viljoen G.T., 2005).

РНК праймер

–  –  –

Рисунок 4. Компоненты для проведения ПЦР.

ПЦР имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами диагностики инфекционных заболеваний:

прямое определение возбудителя по специфическому участку его нуклеиновой кислоты высокая специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК высокая чувствительность (до 10-100 клеток в пробе), универсальность процедуры выявления различных возбудителей, возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы высокая скорость получения результата анализа по сравнением с выделением возбудителя в культуре клеток (4-8 часов, в зависимости от количества проб и используемой техники).

возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций :

возможность определения трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов возможность эффективной детекции возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широкое внедрение в область практического здравоохранения полимеразной цепной реакции обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью и надежностью. Вместе с тем, сегодня уже очевидно, что дальнейшее развитие ПЦР получит в области количественного определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) инфекционных агентов.

Количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе лечения позволяет получать информацию о правильности или безрезультатности проводимой терапии, помогает предсказывать периоды обострения заболевания и принимать адекватные меры для скорейшего излечения больного без нанесения ущерба для его здоровья, связанного с неэффективной терапией.

2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

–  –  –

гасителя. Таким образом, пропорционально накоплению ампликона в растворе, накапливается свободный источник флуоресценции.

Флуоресцентный сигнал автоматически измеряется прибором после каждого цикла и в конце реакции мы получаем график зависимости интенсивности флуоресценции от номера цикла (рисунок 5). Таким образом, необходимость детекции ампликона методом электрофореза отпадает.

Важным показателем при проведении ПЦР в реальном времени является пороговый цикл, который характеризуется как минимальный уровень флуоресценции. Данный минимальный уровень флуоресценции во всех проведенных с данной парой праймеров реакциях будет соответствовать началу экспоненциальной стадии. Этот показатель важен при количественной оценке проведённой ПЦР в реальном времени (Saunders N.A., 2004).

Дополнительными преимуществами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является: возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале и возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько возбудителей в одном образце (Heid C.A., 1996, Bustin, 2004 Stone B., 2004 Smith C.J., 2009, Гребенникова Т.В., 2005).

–  –  –

Химические реагенты:

Агар (Difco), дрожжевой экстракт (Gibco BRL, Life Technologies), триптон (Difco), Bacto-agar (Difco), трис основной (Promega), хлорид магния (Sigma), хлорид натрия (Sigma), соляная кислота (Химмед), глицерин (Merck), агароза (PeqLab, HYBAID-AGS, Sigma), легкоплавкая агароза (Sigma), дезоксинуклеотидтрифосфаты (Promega), тризол (Gibco BRL, Life этиловый спирт – ректификат (Реахим; Химмед), Technologies), изопропиловый спирт – ректификат (Реахим; Химмед), тритон (ICN), масло минеральное (ESSO), ЭДТА (Promega), метиловый оранжевый (Реахим), бромистый этидий (Serva), силика (Sigma), гуанидинтиоцианат (PeqLab).

Реагенты и наборы для молекулярной биологии:

Маркеры молекулярной массы Плазмида pUC 19, обработанная рестриктазой MspI ДНК фага, обработанная рестриктазами Hind III, EcoRI – Promega (USA) Наборы и тест-системы Набор для выделения ДНК из геля (Promega, DNA Purification System, Wizard).

Набор для выделения плазмидной ДНК (Promega, DNA Purification System, WizardPlus, SV Minipreps).

Набор для выделения РНК (OOО «Ветбиохим», Россия) pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, США).

Ферменты Taq-полимераза (Promega);

Ревертаза (обратная транскриптаза) M-MLV(AMV) (Promega.ю США);

IRNase («Promega», США);

Клеточные культуры и вирусы.

Клеточные культуры Накопление вирусов гриппа проводили с использованием монослоя клеток MDCK (S.H. Madin and N.B. Darby, 1958, Canine Kidney), как наиболее чувствительной линии в отношении вирусов гриппа А (Richardson J.C.W.

1981), а также на СПФ куриных эмбрионах.

Трансформацию компетентных клеток проводили в клетках E. Coli штамма TOP TEN.

Вирусы Штаммы вируса гриппа А были любезно предоставлены руководителем лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России «Института вирусологии им.Д.И.Ивановского», академиком РАМН, проф. Н.В. Кавериным. Штаммы, использованные в данной работе, перечислены в таблице 1.

Использованные в работе штаммы вируса гриппа В (табл. 1) были любезно предоставлены доктором биологических наук, ведущим научным сотрудником лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России «Института вирусологии им.Д.И.Ивановского» В.Т. Ивановой.

Исследованные в работе образцы от птиц были собраны в Новосибирской, Астраханской, Ростовской, Волгоградской областях;

республиках Калмыкия, Бурятия, Тыва; Приморском и Краснодарском крае с середины 2005 по 2008 гг. (таблица 2).

Полевые образцы от птиц представляли собой клоакальные и трахеальные смывы и 10%-ные суспензии внутренних органов (мозг, печень, селезенка). Клоакальные и трахеальные смывы собирались ватной палочкой, после чего экстрагировались в раствор гуанидин тиоцианата и замораживались в жидком азоте.

–  –  –

Сыворотки для исследования: референтные сыворотки от кур, инфицированных вирусом А/H5N1 (LPAI), были предоставленны др. Д. Л.

Суарэсом (USDA Agricultural Research Service (USDA-ARS), South East Poultry Research Laboratory, Атенс, Джорджия, США), а также сыворотки были получены после вакцинации кур инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц типа А подтипа H5 «Флупротект H5»

производства ФГУП «Ставропольская Биофабрика» (серия 040306).

–  –  –

Вортекс “Fisons” (UK), твердотельный термостат “Гном” (ДНКТехнология), источник питания “Эльф” (ДНК-Технология), настольные микроцентрифуги “Eppendorf”, центрифуга с охлаждением RC2-B (Sorvall), прибор для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле (OOO Хеликон), вакуумный насос (Gast), генератор льда AF100 (Scotsman), низкотемпературный холодильник (Nuare), водный термостат “Bromma” (LKB), амплификатор Терцик (ДНК-Технология), термостат воздушный ТС1/20 (СПУ), ультрафиолетовый трансиллюминатор, фотокамера для съемки гелей Polaroid, холодный шкаф “Bromma” (LKB), механические пипетки переменного объема Gilson, Eppendorf, автоклав настольный Sanyo, дистиллятор (СПУ), холодильник - Stinol, система для очистки воды Milli Q (Millipore, USA), электронные настольные весы 1219МР (Sartorius), дозатор со сменными насадками и переменным объемом Multipipette plus (Eppendorf), магнитная мешалка ММ-5 (СССР), орбитальная напольная качалка G10 (New Brunswick, USA), PH-метр 420A+ (Thermo Orion, USA), прибор для учёта результатов ИФА “Multiscan PLUS”, цифровой фотоаппарат Olimpus.

Расходные материалы и лабораторная посуда: пробирки на 0,6 мл тонкостенные для ПЦР (QSP, Greiner), 1.6 мл и 2 мл микроцентрифужные пробирки с градуировкой (Greiner, Eppendorf), микронаконечники на 0,5-10 мкл (Greiner), микронаконечники на 0,1-2,5 мкл (Greiner), микронаконечники на 1-200 мкл желтые (Greiner), желтые с фаской (Treff), наконечники на 100мкл голубые (Greiner), микронаконечники с фильтром на 1-20, 1-200 и 100-1000 мкл (QSP), насадки к дозатору Eppendorf на объемы 1 мл, 2,5 мл и 5 мл, до пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой на 15 и 50 мл (Greiner), культуральные флаконы (Greiner), чашки Петри 90 мм (Greiner), центрифужные пробирки Nalgene, стеклянная лабораторная посуда с градуировкой и пластиковыми завинчивающимися крышками Scott Duran, конические колбы на 100, 250 и 500 мл, мерные цилиндры на 50, 250, 500 и 1000 мл, 96-луночные планшеты для ИФА (ВНИИ-Медполимер, Labsystems), фотопленка листовая PalopanPro100 (Polaroid).

–  –  –

Выделение РНК из культуральных и полевых образцов.

Выделение РНК из культуры клеток и полевых образцов проводили с использованием неорганического сорбента (SiO2).

К 300 мкл образца добавляли 600 мкл раствора L6 (лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут при равномерном перемешивании на шейкере. Затем центрифугировали 5 минут, 13000 об/мин, переносили надосадочную жидкость (если формировался осадок) в чистые пробирки и добавляли 40 мкл сорбента, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре на шейкере. Центрифугировали 30 секунд, 13000 об/мин при, удаляли надосадок. Затем промывали осадок сорбента с РНК 2 раза 200 мкл раствора L2 (промывочный буфер), и 2 раза 70% этанолом.

Осадок подсушивали в течение 10 минут при 560С и элюировали РНК с сорбента 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (Гребенникова Т.В., 2005).

Проведение ОТ-ПЦР.

Реакция проводилась в конечном объёме 65 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 10 мМ Tris-HCl (pH 9,0 при 25C), 50 мM KCl, 0,1% Triton X-1000, 0,25 мМ MgCl2, 0.25 мM каждого dNTP, по 10 pmol каждого праймера, 0,5 мкл IRNase, 0,25 ед. Taq-полимеразы, 50 ед. MMLV-ревертазы.

Объём доводили водой до 25 мкл. К ПЦР смеси добавляли 40 мкл минерального масла.

–  –  –

Анализ результатов ОТ-ПЦР.

Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле. В 1% гель вносили по 7,5 мкл продуктов ПЦР (или по 1-2 мкл очищенной плазмидной ДНК) при длине фрагмента более 1000 пар нуклеотидов, в 2% - при длине фрагмента менее 1000 пар нуклеотидов.

Электрофорез проводили с использованием Трис-ацетатного буфера, содержащего бромистый этидий в концентрации 0,4 – 0,5 мкг/мл, при напряженности электрического поля 10 – 15 В/см в течение 30 минут. Гели просматривали в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм.

Проведение ПЦР в реальном времени.

Реакция проводилась в конечном объёме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 4 мкл 10-кратного TAE-буфера буфера с 0,25 мМ MgCl2, 0.25 мM каждого dNTP, по 10 pmol каждого праймера, 10 pmol зонда 0,5 мкл IRNase, 0,25 ед. Taq-полимеразы, 50 ед. MMLV-ревертазы. Объём доводили водой до 25 мкл.

–  –  –

Анализ результатов ПЦР в реальном времени.

Результаты ПЦР в реальном времени автоматически выводились на экран монитора компьютера в виде графика зависимости интенсивности флуоресценции от порогового цикла.

Базовую линию выбирали как среднее значение флуоресценции в широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е.

до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона игнорировали циклы, находящиеся вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдались скачки флуоресценции.

За пороговый уровень выбирали минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с данной парой праймеров реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы.

Конструирование генно-инженерных положительных контролей Для получения генно-инженерного контроля ПЦР был использован фирменный вектор pGEM T-Easy (Promega, США).

Для получения генноинженерного положительного контроля использовали пары праймеров, разработанные для диагностических тестсистем (см. Материалы и методы). Названия пар праймеров представлены в таблице 6.

–  –  –

Положительный контроль для обнаружения гена Н вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени pGEM-H5-RT H-F, H-R Положительный контроль для обнаружения гена N вируса гриппа

–  –  –

Наработанные фрагменты вырезали из геля и выделяли с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Promega) по методике производителя.

Реакцию лигирования проводили в конечном объеме 10 мкл.

Реакционная смесь содержала 5 – 7 мкл фрагмента ДНК, 0,5 – 1 мкл вектора, 1 мкл лигазы Т4, 1 мкл буфера. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 – 12 часов при 160С (Маниатис Т., 1984.).

Получение компетентных клеток.

Свежую колонию клеток Е.Coli пересевали вольфрамовой петлёй (стерильно) и растили в течение ночи при 370С в режиме качания. Далее производили посев ночной культуры в 200мл среды LB и инкубировали культуру при 370С на качалке, контролируя величину оптической плотности культуры. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре при =600 нм, по достижении середины логарифмической фазы роста оптическая плотность составляет 0,4-0,6. Затем культуру быстро переносили в центрифужные пробирки и охлаждали во льду. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге “Beckman” при 1000g (3000 об/мин.) в течение 10 минут при +40С. К осадку добавляли 0,1М CaCl2 (1/2 начального объёма). Клетки ресуспендировали и инкубировали во льду 30 минут, затем центрифугировали при 1000g в течение 10 минут при +4 0С. Тщательно удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали в 2 мл 0,1М CaCl2 c 15% глицерина. Клетки расфасовывали по 200мкл в стерильные полипропиленовые пробирки и хранили при –700С.

Трансформация (электропарация) компетентных E. coli.

Для трансформации был использован штамм TOP TEN. Выполнение работы включало в себя следующие этапы:

Размораживание на льду компетентные клетки Добавление к клеткам плазмиды в количестве 0,5-2мкл (в зависимости от ее концентрации) Аккуратный перенос смесь клеток с плазмидой в пробирку для электропарации, стараясь избежать пузырьков в жидкости.

Помещение пробирки в электропаратор и установка напряжения (для пробирки с толщиной стенки 2 мм – 2500, а для 1 мм – 1800).

Проводение электропарации.

Добавление среды LB (600мкл) в пробирку. Перенос жидкости из пробирки для электропарации в пробирку типа «Eppendorf».

Инкубация 1-1,5 часа при 370С, и высеивание клетки на чашки Петри по 200мкл (LB amp100).

Инкубация чашек Петри в термостате при 37 0 С в течение ночи.

Рестриктный анализ.

Для проведения рестриктного анализа реакция проводилась в конечном объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержала 5-10 мкл очищенного амплификата, 1 мкл рестриктазы, 2 мкл соответствующего 10х буфера (для рестриктаз SalI и SpeI – buffer D (Promega), EcoRI и XhoI - buffer Y+/Tango 2* (Fermentas)). Объем доводили водой до 20 мкл. Реакция инкубировалась 1 час, при 370С.

Определение массовой и молекулярной концентрации рекомбинантной плазмиды.

Массовую концентрацию С (мкг/ мл) раствора рекомбинантной плазмиды определяли спектрофотометрически на спектрофотометре «Biophotometr». В кювету для спектрофотометра помещали 50 мкл деионизованной воды и 2 мкл рекомбинантной плазмиды. Смесь аккуратно пипетировали для полного перемешивания. Кювету помещали в ячейку

–  –  –

Приготовление стандартных растворов рекомбинантной плазмиды для количественной ПЦР в реальном времени Для приготовления стандартных растворов брали 9 пластиковых пробирок на 1,5 мл, маркировали их цифрами и наливали в каждую из них по 90 мкл деионизованной воды. В 1-ю пробирку добавляли 10 мкл концентрированной референтной плазмиды известной концентрации (определена спектрофотометрически), раствор тщательно пипетировали.

Отбирали 10 мкл полученного в 1-й пробирке раствора и вносили его во 2-ю пробирку, пипетировали. Отбирали 10 мкл полученного во 2-й пробирке раствора и вносили его во 3-ю пробирку, пипетировали. Таким образом, последовательно перенося по 10 мкл свежеприготовленного раствора из пробирки с предыдущим номером в пробирку с последующим, готовили 9 разведений рекомбинантной плазмиды с амплифицируемым фрагментом вируса.

Статистическая обработка результатов Анализ и статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft office, 2007». Обработку данных ПЦР в реальном времени проводили с помощью программного обеспечения «RealTime_PCR v 7.3»

детектирующего амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Синтез рекомбинантного неструктурного белка NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 в прокариотической системе экспрессии.

Для получения и последующего клонирования гена, кодирующего белок NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 при синтезе его в прокариотической системе экспрессии, использовали праймеры, представленные в таблице 5.

Температурные условия проведения реакции для синтеза кДНК участка

РНК гена NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 :

–  –  –

Продукт ПЦР встраивали в вектор pET32b+ (“Novagen”, США) по имеющимся в полилинкере соответствующим сайтам рестрикции. Данный вектор содержит последовательность, кодирующую шесть гистидиновых остатков - (His)6, а также содержит тиоредоксиновый домен (trx).

Продукция рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1.

Очищенную рекомбинантную плазмиду pET32b+, содержащую ген NS1, использовали для химической трансформации штамма BL21trxB(DE3)pLysS.

Бакмассу осаждали центрифугированием и использовали для выделения рекомбинантных белков.

Очистка рекомбинантного белка NS1методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ).

Рекомбинантный белок очищали из биомассы клеток E. coli на NI-NTA агарозе (Qiagen, США) в нативных и денатурирующих условиях по модифицированной методике фирмы-производителя.

Нативные условия очистки Клеточную массу лизировали охлажденным буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCL + 300 мМ NaCl + 10мМ имидазол + 0,1% тритон X100 + 1мМ PMSF, рН 8,0 из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы.

Лизат дезинтегрировали ультразвуком, 6 раз по 10 сек с интервалом 10 сек (на ультразвуковом гомогенизаторе Sonifier Model 250/450, США), и центрифугировали 60 мин при 10 000 об/мин. Супернатант смешивали с NiNTA агарозой, уравновешенной фосфатно-солевым буферным раствором [ФСБ: (20 мМ Na2HPO4–NaH2PO4)+ 150 мМ NaCl], рН 8,0). Смесь инкубировали при 40С и перемешивании в течение 16 часов.

Очистку белков проводили после перенесения Ni-NTA агарозы в хроматографическую колонку размером (1х10)см. Агарозу последовательно отмывали от избытка белка трис-буферным раствором (ТБР: 20 мМ трис-НСl + 300 мМ NaCl + 1 мМ PMSF), рН 8,0; содержащим 10, 20 и 50 мМ имидазола, контролируя процесс по оптической плотности элюатов (= 280 нм), регистрируемой самописцем. Продукт элюировали в одну пробирку трис-буферным раствором, содержащим 250мМ имидазола.

Денатурирующие условия очистки Клеточную массу лизировали охлажденным буферным раствором [20 мМ трис-НСl + 300 мМ NaCl + 6 М Gu-HCL + 10 мМ имидазол + 1 мМ PMSF, рН 8,0] из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы. Далее производили те же операции, что и при очистке белков в нативных условиях, но во все буферные растворы добавляли 6М мочевину (Johnson R.D., 1995).

Иммунохимическую активность в каждой фракции определяли методом непрямого ИФА и иммуноблоттинга со специфическими моноклональными антителами (мкАТ).

Степень чистоты полученных препаратов проверяли методом SDSэлектрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ).

Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора “Micro BCA Protein Assay Kit” фирмы “PIERCE” (США).

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). В лунки иммунологического планшета (Greiner, Германия) вносили 0,1 мл очищенного рекомбинантного белка, разведенного 0,1 М карбонатнобикарбонатным буфером (КББ) рН 9.5. Планшет инкубировали 18 час при 4оС, после чего удаляли избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 150 мM NaCl, 0,1% твин-20, pH 7,4). Свободные участки пластика блокировали 1% Top Block (Yuro, Швейцария) в ФСБТ (1 час при 370С), удаляли блокирующий раствор и вносили в лунки 0,1 мл мкАТ в растворе ФСБТ + 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Планшет инкубировали 1 час при 370С, промывали ФСБТ и добавляли 0,1 мл меченых пероксидазой антител к иммуноглобулину G человека в растворе ФСБТ + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (“Sigma”, США). Через 1 час инкубации при 37оС отмывали планшет ФСБТ и вносили в лунки 0,1 мл субстратного раствора перекиси водорода с 3,3',5,5'-тетраметилбензидином (ТМB, “МДЛ”, Россия). Инкубировали 20 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 1M H2SO4. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan MCC, Flow, Англия) при 450 нм (А450).

Наличие в исследуемой сыворотке антител к гену NS1 определяли по коэффициенту связывания конъюгата (Ксв.) сывороточными антителами, величину которого вычисляли по формуле ( А450 ИСср. А450 К ср.) где:

, Ксв. х 100 ( А450 К ср. А450 К ср.)

- (А450 ИСср) - среднее (из двух повторов) арифметическое значение оптической плотности (А450) для каждой исследуемой сыворотки (ИС);

- (А450 К+ср) – среднее (из двух повторов) арифметическое значение оптической плотности (А450) для проб К+ А450 К-ср ) - среднее (из двух повторов) арифметическое значение оптической плотности (А450) для проб К- (Mateo C., 2001).

Иммуноблоттинг.

На первом этапе проводят электрофоретическое разделение сложной смеси биологических макромолекул в присутствии додецилсульфата натрия.

Затем осуществляют собственно электрофоретический перенос разделённых белков из геля на твёрдую подложку. Наконец, перенесённые белки выявляют на полученной таким образом блоте с помощью непрямого иммуноферментного анализа.

–  –  –

4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР.

4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР.

Учитывая большую вариабельность генома вируса гриппа типа А, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома. Основой для поиска мест посадок праймеров стало сопоставление нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина и нейраминидазы всех вирусов гриппа, находящихся в базе данных. Всего использовали более 10000 нуклеотидных последовательностей геномов вирусов гриппа.

При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования: специфичность праймеров для всех последовательностей вирусов подтипа H5N1, отсутствие мест посадки праймеров на последовательности вирусов других подтипов. В качестве дополнительных критериев, определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие:

отсутствие дупликсов праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложной посадки на матрицы геномов различных штаммов вируса гриппа А и родственных вирусов. Этим критериям удовлетворяют все отобранные праймеры.

Рисунок. Выравнивание фрагментов нуклеотидных 6.

последовательностей гена НА различных штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1. Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР.

В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезируется отрезок генома гена Н размером 184 п.н (рис.6).

–  –  –

Рисунок. Выравнивание фрагментов нуклеотидных 7.

последовательностей гена NА различных штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1. Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР.

В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезируется отрезок генома гена N размером 213 п.н (рис.7).

4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы.

Эффективность и специфичность тест-системы проверена на референтных штаммах вируса гриппа, полученных из коллекции ФГБУ «ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России «Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского» (таблица 1). Штаммы имели различную специфичность поверхностных белков. Результаты проведения ПЦР с использованием разработанной тест-системы представлены на рисунке 8.

Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от людей, показали, что с помощью разработанной тест-системы можно выявить геном вируса гриппа А подтипа N1. Специфичность тестсистемы также была проверена с эпидемическими и эталонными штаммами вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц.

Показано наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах А/Mallard/Pensylvania/10218/84 и А/Grebe/Novosibirsk/29/05, а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах A/WSN/33, A/FPV/Росток и А/Grebe/Novosibirsk/29/05. При обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 положительные результаты были получены с эпидемическими штаммами А/СССР/90/77 (Н1N1) и A/WSN/33 (Н1N1), хранившимися в

-700С).

замороженном состоянии длительное время (несколько лет при Показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Paramyxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae).

–  –  –

М Рисунок.8. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа H5 и N1.

Треки 1-26 – результаты анализа образцов, содержащих вирусы гриппа А и В, треки М – маркер молекулярного веса «GeneRuler 100 bp». Номера треков совпадают с порядковыми номерами вирусов, представленных в таблице 1.

Также с помощью разработанной тест-системы были протестированы 6 штаммов вируса гриппа А с различными титрами в РГА (таблица 7).

–  –  –

Рисунок 9. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа N1.

Треки 1-6 – результаты анализа референтных штаммов вируса гриппа А.

Номера треков совпадают с порядковыми номерами вирусов, представленных в таблице 6.

Результаты ПЦР показали, что положительный результат получали только при наличии гемагглютинина 5 типа и нейраминидазы 1 типа в различных титрах. ПЦР с использованием других подтипов вируса гриппа А показала отрицательный результат. На рисунке 9 пример электрофореза после проведения ПЦР на матрице гена нейраминидазы. Видно, что положительный результат получен в случае детекции вируса гриппа А подтипа N1.

4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы

Для определения чувствительности разработанного метода использовали образец вируса A/Grebe/Novosibirsk/29/05 с начальным титром 105 ЭИД50/мл.

Далее готовили серию последовательных десятикратных разведений образца вируса.

Затем проверяли в ПЦР на наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 (рисунок 10) и N1 (рисунок 11).

Рисунок 10. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа Н5.

1. Исходный Вирус гриппа А/Н5N1 (105 ЭИД50/мл). 2-6. разведения вируса гриппа А/Н5N1 от 104 ЭИД50/мл до 1 ЭИД50/мл.

Рисунок 11. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа N1.

1. Исходный вирус гриппа А/Н5N1 (105 ЭИД50/мл). 2-6. разведения вируса гриппа А/Н5N1 от 104 ЭИД50/мл до 1 ЭИД50/мл.

Исходя из полученных результатов можно говорить о том, что предел обнаружения РНК вируса гриппа подтипа Н5 составляет 10 2 ЭИД50/мл, а предел обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа N1 – 103 ЭИД50/мл.

4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы Для синтеза «положительного» контроля на вирус гриппа А подтипа Н5N1 были использованы праймеры, разработанные ранее для этой тестсистемы. Матрицей для синтеза специфических фрагментов был референтный штамм вируса гриппа А подтипа Н5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Фрагмент гена НА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 184 п.н. и фрагмент гена NА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 213 п.н клонировали в плазмиду pGEM-T Easy.

После трансформации компетентных клеток E.coli проводили скрининг клонов методом ПЦР, чтобы обнаружить присутствие плазмиды со специфичным фрагментом. Также было проведено секвенирование полученных вставок. Последовательности, полученные в результате секвенирования, были сопоставлены с последовательностью A/Grebe/Novosibirsk/29/05.

Сравнение показало, что нуклеотидные последовательности вставок на 100% совпадают с нуклеотидными последовательностями вируса, использованного для изготовления «положительных» контролей.

Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при длине волны =260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по результатам 6-ти измерений (табл. 8). Плазмиды в десятикратных разведениях использовались в качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР.

–  –  –

Концентрация выделенных рекомбинантных плазмид pGEM-H5 и pGEMN1 оказалась равна 0,2 мкг/мкл и 0,205 мкг/мкл соответственно. Данная концентрация соответствует количеству ДНК, равному 5,7107 молекул/мкл для плазмиды pGEM-H5 и 5,8107 молекул/мкл для плазмиды pGEM-N1.

После измерения концентрации готовили серию разведений плазмид (от 10 -1 до 10-10). В качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР использовали серию разведений исходных плазмид. (Рисунок 12,13). Таким образом, были получены генно-инженерные положительные контроли, представляющие собой бактериальную плазмиду со вставкой фрагмента гена HА и гена NА вируса гриппа А подтипа Н5N1.

Рисунок 12. Результаты ПЦР на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды pGEM-H5 Трек 1. Исходная рекомбинантная плазмида (5,7107 молекул/мкл) Треки 2 –10. - разведения рекомбинантной плазмиды (5,7 106 – 5,7 молекул/мкл).

Рисунок 13. Результаты ПЦР на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды pGEM-N1 Трек 1. Исходная рекомбинантная плазмида (5,8107 молекул/мкл) Треки 2 –10. - разведения рекомбинантной плазмиды (5,8 106 – 5,8 молекул/мкл).

На основе представленных данных разработана «Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР». Проведены испытания разработанной тест-системы, совместно с Всероссийским государственным Центром качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ») и разработан пакет разрешительных документов: СТО 42418073-0001и Инструкция по применению тест-системы, утвержденные в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система запатентована и имеет сертификат соответствия № РОСС RU.ФВ01.Н26634.

4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени.

4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР.

Олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР в реальном времени были подобраны на основе сравнительного анализа геномов различных штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1.

В результате были подобраны олигонуклеотиды со сходными температурами плавления (Tm). Температура плавления праймеров различалась не более чем на 10С. Температуру отжига праймеров вычисляли по упрощенной формуле: (4GC+2AT)-50C, где АТ – суммарное содержание нуклеотидов А и Т, GC – суммарное содержание нуклеотидов G и C в праймере. Расчетная температура отжига составила 570С. При выборе оптимальных праймеров обращали внимание на то, чтобы их температуры плавления различались не более чем на 20С, а Tm зонда была на 100С выше Tm праймеров. Для системы детекции были использованы излучатель флуоресцентного сигнала FAM и гаситель BHQ1.

Рисунок Выравнивание фрагментов нуклеотидных 14.

последовательностей гена NА различных штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1. Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР в реальном времени.

В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезируется отрезок генома гена NА размером 196 п.н (рис.14).

Рисунок. Выравнивание фрагментов нуклеотидных 15.

последовательностей гена HА различных штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1. Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР в реальном времени.

В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезируется отрезок генома гена HА размером 173 п.н (рис.15).

4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

Эффективность и специфичность тест-системы была проверена на вирусах, полученных из коллекции ФГБУ «ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи»

Минздрава России «Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского». Штаммы имели различную специфичность поверхностных белков (табл.1).

Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа, показали возможность определять наличие РНК вируса гриппа А подтипа N1 и дифференцировать его от других типов и подтипов вируса гриппа. В частности, было установлено, что с помощью разработанной тест-системы можно определить наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1, а детекция вируса гриппа А подтипа Н3N2 и вируса гриппа В дает отрицательный результат (рисунок 16, 17).

Кривые 9, 10, 11, 12, 13, 16, 22, 26 и 27, согласно рисунку 16, соответствуют образцам, содержащим вирусы гриппа А подтипа N1.

Кривые 21, 26 и 27, согласно рисунку 17, соответствуют образцам, содержащим вирусы гриппа А подтипа Н5.

К+ Относительная интенсивность флуоресценции К

–  –  –

Специфичность тест-системы была проверена с эпидемическими штаммами вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц. С помощью разработанной тест-системы показано наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах А/Mallard/Pensylvania/10218/84, А/курица/Покров/09 и А/Grebe/Novosibirsk/29/05 (таблица 1, рисунок 17), а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах A/WSN/33, A/FPV/Росток и А/Grebe/Novosibirsk/29/05 (таблица1, рисунок 16). Особый интерес представляли исследования тест-системы с эталонными штаммами вируса, хранившимися в замороженном состоянии длительное время – несколько лет при -700С. Так, эпидемические штаммы А/СССР/90/77 (Н1N1) и A/WSN/33 (Н1N1) при обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 с помощью разработанной тест-системы показали положительные результаты (рисунок 16). Также было показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Paramyxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae).

4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

Для определения чувствительности разработанного метода использовали образец вируса A/Grebe/Novosibirsk/29/05 с начальным титром 105 ЭИД50/мл.

Образец вируса последовательно разводили до конечного разведения 10-5.

Затем проверяли методом ПЦР в реальном времени на наличие РНК вируса гриппа А подтипа N1 (рисунок 18) и H5 (рисунок 19).

Относительная интенсивность флуоресценции

Рисунок 18. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа N1.

1. Исходный вирус гриппа А/Н5N1 (105 ЭИД50/мл). 2. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 104 ЭИД50/мл. 3. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 103 ЭИД50/мл. 4. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 102 ЭИД50/мл. 5. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 101 ЭИД50/мл. 6. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 1 ЭИД50/мл.

Относительная интенсивность флуоресценции

Рисунок 19. Детекция РНК вируса гриппа А подтипа H5.

1. Исходный вирус гриппа А/Н5N1 (105 ЭИД50/мл). 2. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 104 ЭИД50/мл. 3. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 103 ЭИД50/мл. 4. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 102 ЭИД50/мл. 5. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 10 ЭИД50/мл. 6. Вирус гриппа А/Н5N1 в разведении 1 ЭИД50/мл.

Исходя из полученных результатов, можно говорить о том, что предел обнаружения РНК вируса гриппа подтипа Н5 составляет 102 ЭИД50/мл, а предел обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа N1 – 10 ЭИД50/мл.

4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени С целью создания положительного контроля для разработанной тестсистемы использовались специфические праймеры, входящие в состав данного теста. Матрицей для синтеза специфических фрагментов был референтный штамм вируса гриппа А подтипа Н5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Фрагмент гена НА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 173 п.н. и фрагмент гена NА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 196 п.н клонировали в плазмиду pGEM-T Easy.

После трансформации компетентных клеток E.coli проводили скрининг клонов методом ПЦР, чтобы обнаружить присутствие плазмиды со специфичным фрагментом. Также было проведено секвенирование полученных вставок. Последовательности, полученные в результате секвенирования, были сопоставлены с последовательностью A/Grebe/Novosibirsk/29/05.

Сравнение показало, что нуклеотидные последовательности вставок на 100% совпадают с нуклеотидными последовательностями вируса, использованного для изготовления «положительных» контролей.

Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при длине волны =260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по результатам 6-ти измерений (табл. 9).

–  –  –

Концентрация выделенных рекомбинантных плазмид pGEM-H5-RT и pGEM-N1-RT оказалась равна 0,192 мкг/мкл и 0,215 мкг/мкл соответственно.

Данная концентрация соответствует количеству ДНК для плазмиды pGEMH5-RT (5,5107 молекул/мкл) и для плазмиды pGEM-N1-RT (6,1107 молекул/мкл).

В качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР использовали серию разведений исходных плазмид. Положительный сигнал в обеих реакциях был получен при использовании всех разведений плазмиды, кроме 10-10, однако оптимальными для использования полученной рекомбинантной плазмиды являются разведения 10-2 – 10-6.

4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 Для проведения количественного анализа строили калибровочный график с использованием стандартных растворов рекомбинантной плазмиды с известной концентрацией. График выражал линейную зависимость значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла с помощью компьютерной программы проводили расчёт концентрации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 в нескольких положительных пробах от птиц.

В качестве стандартных растворов были использованы разведения полученной ранее рекомбинантной плазмиды pGEM-H5-RT с концентрацией 5,51010 молекул/мкл.

Концентрации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 в исследуемых пробах составили (молекул/мкл): проба 1 - 2,4106, проба 2 – 5,0106, проба 3 проба 4 – 5,0104, проба 5 – 5,2103, проба 6 – 1,6103, проба 7 – 1,3102 (рисунок 20).

Рисунок 20. Определение количества вируса гриппа А подтипа H5N1 (молекул/мкл) в пробах.

- калибровочные растворы, - исследуемые образцы.

4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики.

В работе были исследованы стадии получения рекомбинантного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом обратной генетики, на основе вируса гриппа А pR8 (Н1N1). У одной из 8 плазмид инфекционного клона, ген гемагглютинина H1 был заменен на ген гемагглютинина вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1). После трансфекции клеток 293Т/MDCK 8-ю плазмидами инфекционного клона и пассирования в культуре клеток МДСК, а затем в куриных эмбрионах получен рекомбинантный вирус А/H5N1.

На рисунке 21 представлены результаты тестирования рекомбинантного вируса гриппа А/H5N1 на различных стадиях его получения: в культуре клеток МДСК и в аллантоисной жидкости после первого и второго пассажей на куриных эмбрионах.

Рисунок 21. Накопление рекомбинантного вируса H5N1 в процессе пассирования и детекция плазмиды инфекционного клона pHW 2000, со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1).

4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) Разработанные тест-системы были использованы для тестирования 9-й панели, в ходе международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа, проходившей в марте 2011. В таблице 10 представлены результаты молекулярного анализа, полученные в ходе лабораторного экзамена.

–  –  –

По результатам анализа получен Международный сертификат WHO об успешном прохождении теста и соответствии лаборатории международным стандартам по молекулярному анализу вируса гриппа.

–  –  –

Основной причиной вспышек вируса гриппа А подтипа H5N1 является его постоянное присутствие в популяциях птиц водного и околоводного комплекса, которые являются природным резервуаром инфекции и могут заражать домашних птиц. Контроль распространения вируса является важным этапом предотвращения последующих вспышек данного заболевания.

Разработанные тест-системы были применены для анализа 648 полевых проб от диких и домашних птиц, отобранных во время эпизоотий 2005-2008 г.г. (см. материалы и методы) (рис.22). Результаты анализа образцов различными тест-системами во время эпизоотий представлены в таблице 11.

Выявление вирусов молекулярными методами было подтверждено классическими методами идентификации вирусов в лаборатории экологии вирусов ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» МЗ РФ (руководитель д.б.н. М. Ю. Щелканов).

–  –  –

БКП – без клинических признаков заболевания; БЛН – больная птица; СПГ – свежепогибшая птица.

4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1.

4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа.

Получение ПЦР фрагмента гена NS1.Для наработки фрагмента гена NS1 вируса гриппа были разработаны специфические праймеры (таблица 4). С помощью разработанных праймеров и штамма вируса гриппа А/chicken/Kurgan/3/2005 был получен ПЦР фрагмент с генома вируса гриппа гена NS1. Неструктурный белок вируса гриппа NS1 является одним из консервативных белков вируса, поэтому матрицей для синтеза ПЦР фрагмента гена NS1 может быть вирус гриппа любого типа и подтипа.

Клонирование полученной плазмиды и экспрессия белка. Полученный участок был клонирован в экспрессионный вектор pET32b+ (рисунок 23).

Наличие нужной вставки было проверено с помощью секвенирования получившейся плазмиды.

Конструкция была трансформирована в экспрессионные клетки E.coli штамм BL21(DE3)pLysS, с помощью которых был проведен синтез белка.

Очистка полученного белка. Рекомбинантный белок очищали от примесей с помощью металл-афинной хроматографии. Затем различные фракции белка проверяли методом ИФА с моноклональными антителами против гистидина (рисунок 24). В экспрессионной плазмиде есть участок, кодирующий 6 аминокислот гистидина, которые транслируется на С-конец белка, поэтому проверка полученного белка на наличие гистидинов позволяет достоверно судить о его синтезе.

Рисунок 23. Схема получения рекомбинантной плазмиды pET32b+, несущей ген NS1 вируса гриппа 2,794 3,000 2,500 1,893 2,000 1,320 А450 1,500 0,962 1,000 0,660 0,500 0,000

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
 

Похожие работы:

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.