WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

«РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ ...»

-- [ Страница 3 ] --

В результате получены фракции: водорастворимые полисахариды (ВРПС) – 8,32%, пектиновые вещества (ПВ) – 7,02%, гемицеллюлозы А (Гц А) – 13,17%, гемицеллюлозы Б (Гц Б) - 2,12%. Содержание свободных углеводов (СУ), определенных антронным методом [80], соcтавляет 9,23%. Следует отметить, что выделенные фракции давали фиолетовое окрашивание с раствором йода, что указывает на присутствие в корнях астрагала перепончатого глюкана типа крахмала. Компонентный состав СУ: мальтотриоза - 87,3%, ксилоза - 10,0% и манноза - 2,7% (рисунок 10) Рисунок 10 - Хроматограмма свободных углеводов (СУ) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого ВРПС представляли собой белый аморфный порошок, растворимый в воде, в водных растворах кислот и щелочей, но не растворимый в органических растворителях, осаждается спиртом и ацетоном. После кислотного гидролиза данный комплекс давал положительную реакцию с реактивом Фелинга.

Компонентный состав фракции после гидролиза: глюкоза - 94,0%, мальтоза – 2,7%, полимер - 0,2% (рисунок 11).

Рисунок 11 - Хроматограмма водорастворимых полисахаридов (ВРПС) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) ПВ представляли собой светло-бежевый аморфный порошок, растворимый в воде. Водные растворы ПВ осаждались 1% Al2(SO4)3 c образованием пектатов.

Компонентный состав фракции после гидролиза: манноза - 99,2%, глюкоза - 0,8 % (рисунок 12).

Рисунок 12 - Хроматограмма пектиновых веществ (ПВ) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) Гц А представляли собой светло-коричневый аморфный порошок.

Компонентный состав фракции после гидролиза: мальтоза – 74,0%, глюкоза – 12,0%, ксилоза – 4,4%, полимер – 6,6% (рисунок 13).

Рисунок 13 - Хроматограмма гемицеллюлоз А (Гц А) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) Гц Б представляют собой светло-бежевый аморфный порошок.

Компонентный состав фракции после гидролиза: мальтоза - 56,5%, глюкоза – 28,0%, ксилоза – 4,8%, манноза – 2,3%, галактоза – 0,4%, полимер – 3,0% (рисунок 14).

Рисунок 14 - Хроматограмма гемицеллюлоз Б (Гц Б) углеводного комплекса корней астрагала перепончатого (после гидролиза) 3.4.7. Количественное определение тритерпеновых сапонинов в корнях астрагала перепончатого Значимой группой в химическом составе корней астрагала перепончатого являются тритерпеновые сапонины, влияющие на фармакологическую активность данного растения [150, 175, 189, 216]. Определение суммарного содержания тритерпеноидов проводили спектрофотометрическим методом с использованием галохромной реакции с серной кислотой концентрированной (рисунок 15). За основу взята методика количественного определения сапонинов в корневищах аралии маньчжурской в пересчете на олеаноловую кислоту [99].

Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 4 г сырья (точная навеска) измельченного сырья пятикратно (по 30 минут) экстрагировали 95% спиртом порциями по 50 мл на кипящей водяной бане в плоскодонной колбе вместимостью 250 мл с обратным холодильником.

Полученные извлечения фильтровали и объединяли в мерную колбу вместимостью 250 мл (раствор А), недостающий объем восполняли экстрагентом.

Далее из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 20 мл, помещали ее в коническую колбу вместимостью 100 мл, выпаривали раствор на кипящей водяной бане досуха, к полученному сухому остатку добавляли 10 мл смеси для гидролиза (ледяная уксусная кислота – хлористоводородная кислота концентрированная – вода 3,5:1:5,5) и проводили гидролиз на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч с момента закипания бани. После кипячения гидролизную смесь разбавляли водой в 2 раза, выпавший осадок отделяли фильтрованием и промывали его многократно водой. Далее осадок на фильтре растворяли в 25 мл горячего 95% спирта и собирали в мерной колбе вместимостью 25 мл (раствор Б). К 1 мл раствора Б прибавляли 4 мл серной кислоты концентрированной, выдерживали 10 минут и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 310±2 нм (для получения спектра измеряли оптическую плотность в области 220-450 нм), раствор сравнения – серная кислота концентрированная. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО олеаноловой кислоты в аналогичных условиях эксперимента. Полученные спектры продуктов реакции суммы тритерпеновых сапонинов астрагала перепончатого и стандарта олеаноловой кислоты с серной кислотой представлены на рисунке 15.

0,5 0,45 0,4

–  –  –

Рисунок 15 - Спектры продуктов взаимодействия сапонинов с серной кислотой концентрированной: 95% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого и раствора РСО олеаноловой кислоты.

–  –  –

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО олеаноловой кислоты;

m – масса сырья, г;

m0 – масса РСО олеаноловой кислоты, г;

W – влажность сырья, %.

Метрологические характеристики методики приведены в таблице 9.

–  –  –

Таким образом, содержание тритерпеновых сапонинов в корнях астрагала перепончатого составляет 1,51±0,04%.

3.4.8. Количественное определение суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого Определение содержания суммы органических кислот проводили титриметрическим методом в пересчёте на яблочную кислоту по методике ГФ ХI изд., вып.1, ст. 38 [26], количественное определение дубильных веществ перманганометрическим методом в пересчёте на таннин по методике ГФ ХI изд., вып.1, с. 286 [26] (таблица 10).

Таблица 10 - Метрологические характеристики методик количественного определения суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого

–  –  –

Таким образом, содержание суммы органических кислот и дубильных веществ в корнях астрагала перепончатого составляет 1,96±0,03% и 0,44±0,02% соответственно.

Проведенные исследования показали, что корни астрагала перепончатого являются источником разнообразных БАВ. В таблице 11 приведены полученные данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, произрастающего в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, и данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, приведенные в литературе.

Таблица 11 – Сведения по химическому составу корней астрагала перепончатого, полученные в экспериментальной работе, и приведенные в литературе

–  –  –

Таким образом, полученные данные по химическому составу корней астрагала перепончатого, произрастающего в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, согласуются с данными, приведенными в литературе. Отмечено высокое содержание свободных и связанных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, что учитывалось при стандартизации исследуемого растительного сырья.

3.5. Стандартизация и разработка нормативной документации на корни астрагала перепончатого Для характеристики сырья – корней астрагала перепончатого предложены следующие показатели качества: подлинность, доброкачественность и стабильность сырья в условиях естественного старения.

В качестве критериев подлинности корней астрагала перепончатого предложены макро- и микродиагностические признаки, качественные реакции определения флавоноидов, аминокислот, полисахаридов и сапонинов в извлечениях корней астрагала перепончатого, определение свободных аминокислот методом ТСХ в присутствии стандартов-свидетелей.

Качественные реакции. 5 г измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильников в течение 30 минут.

Извлечение охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный складчатый фильтр «красная лента», упаривают до 5 мл (раствор А).

Для проведения качественных реакций:

- смешивают равные объемы раствора А и 0,1% спиртового раствора нингидрина и осторожно нагревают. При охлаждении появляется краснофиолетовое окрашивание (аминокислоты);

- к раствору А приливают 95% спирт в соотношении 1:5, появляется белый хлопьевидный осадок (полисахариды);

- к 2 мл раствора А приливают 1 мл 10% раствора натрия нитрита и 1 каплю серной кислоты концентрированной, появляется кроваво-красное окрашивание (тритерпеновые сапонины);

- 1 мл раствора Б переносят в пробирку вместимостью 10 мл, вносят 50 мг порошка металлического магния и 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной. После прекращения реакции раствор окрашивается в красно – оранжевое окрашивание (флавоноиды).

Хроматография. На линию старта хроматографической пластинки ПТСХПА-УФ «Sorbfil» размером 15х15 см или 10х15 см наносят дробно в первую точку 0,05 мл раствора А. Рядом на расстоянии 3 см от первой точки во вторую точку наносят 0,005 мл 0,02% раствора РСО аспарагина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе и помещают в камеру со смесью растворителей пропанол - вода (70:30) и хроматографируют восходящим способом. После прохождения фронтом растворителей 10 см, пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе. Затем хроматограмму опрыскивают 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100С в течение 10 - 15 минут. На уровне зоны-свидетеля должна обнаруживаться доминирующая фиолетовая зона с Rf ~ 0,28. Допускается наличие других фиолетовых, розово-оранжевых зон (аминокислот).

В качестве критериев доброкачественности корней астрагала перепончатого разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин и установлены числовые показатели по результатам товароведческого анализа (глава 3, п. 3.3.).

Разработка методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого Проведенные исследования с помощью ионообменной хроматографии (п.

а также дальнейшие измерения с использованием метода 3.4.4.), спектрофотометрии показали большое содержание аминокислот в корнях астрагала перепончатого. Поэтому количественную стандартизацию корней растения проводили по данному показателю.

Разработана методика количественного определения суммы свободных аминокислот, основанная на нингидриновой реакции с образованием комплекса голубого цвета с максимумом поглощения при длине волны 569 ± 2 нм [46].

Количественное определение суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого рассчитано по стандартному образцу аcпарагина, оптическую плотность которого измеряли параллельно с раствором исследуемого образца. Выбор этой аминокислоты в качестве стандартного образца основан на спектрах поглощения комплексов аминокислот корней астрагала перепончатого и аспарагина с нингидрином (рисунок 16) и данных ионообменной хроматографии (п. 3.4.4.).

0,6

–  –  –

Рисунок 16 - Спектры поглощения комплексов 10% спиртового извлечения корней астрагала перепончатого и раствора РСО аспарагина с 0,4% водным раствором нингидрина При разработке методики проведен подбор оптимальных условий извлечения суммы свободных аминокислот из корней астрагала перепончатого (таблица 12).

Таблица 12 – Содержание суммы свободных аминокислот в извлечениях корней астрагала перепончатого в зависимости от условий экстракции

–  –  –

Для интенсификации процесса экстракции и полноты выхода свободных аминокислот из корней астрагала перепончатого изучено влияние кратности и времени экстракции (таблица 13).

Таблица 13 – Содержание суммы свободных аминокислот в извлечениях корней астрагала перепончатого в зависимости от кратности и времени экстракции

–  –  –

Установлено, что максимальная оптическая плотность фотометрической реакции достигается при использовании 1 мл извлечения корней астрагала перепончатого с 1 мл 0,4% водного раствора нингидрина, время нагревания на кипящей водяной бане полученной реакционной смеси – 30 минут, устойчивое окрашивание после охлаждения наступает через 20 минут и сохраняется в течение 25 минут.

Немаловажное значение имеет соблюдение следующих условий - рН реакционной смеси и наличие восстановительной среды.

Интенсивность развивающейся окраски зависит от кислотности среды, и при рН 5 - 6 для всех аминокислот становится максимальной [46]. Окислители, в частности кислород воздуха, снижают интенсивность окраски, особенно при малой концентрации аминокислот. Присутствие восстановителей, окисляющихся в первую очередь, снимает мешающий эффект кислорода воздуха. Первое условие достигается добавлением к реагенту буферного раствора, второе - добавлением какого-либо восстановителя (мы использовали 0,05% водный раствор аскорбиновой кислоты).

Для выбора типа буферного раствора изучена зависимость окраски нингидриновой реакции от рН буферного раствора в области рН 5,0 - 6,0. Для стабилизации нингидринового комплекса в реакционную смесь добавляется 2 мл ацетатного буфера рН = 4,5 (таблица 15) и 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты.

Таблица 15 - Влияние рН среды на выраженность протекания реакции комплексообразования

–  –  –

Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 10% спирта, нагревают на водяной бане при температуре 40°С с обратным холодильником в течение 1 часа.

После охлаждения извлечение фильтруют через складчатый бумажный фильтр «красная лента» в мерную колбу вместимостью 200 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Экстракцию повторяют со 100 мл 10% спирта в течение 30 минут. Полученное извлечение также фильтруют в мерную колбу, доводят объем раствора в колбе 10% спиртом до метки, перемешивают (раствор А). В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,4% водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 569±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Параллельно проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аспарагина (1 мл) с 0,4% водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 569±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D m0 1 200 100 100 D m0 200 X ;

D0 m 100 100 1 (100 W ) D0 m 100 W где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 – оптическая плотность раствора РСО аспарагина;

m – масса сырья, г;

m0 – масса РСО аспарагина, г;

W – влажность сырья, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого приведены в таблице 16.

Таблица 16 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого

–  –  –

Относительная ошибка единичного определения не превышает 5%.

Установлена норма содержания суммы свободных аминокислот в пересчете на аспарагин в корнях астрагала перепончатого – не менее 10,0% (Приложение 5).

Данные, полученные в результате проведения валидации методики количественного определения суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого в пересчете на аспарагин, позволяют оценить метод положительно по параметрам: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность (Приложение 4).

В нашей дальнейшей работе с помощью разработанной методики количественного определения свободных аминокислот изучены образцы сырья корней астрагала перепончатого, собраннные в различных местах произрастания (таблица 17).

Таблица 17 – Содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различных местах произрастания

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различных районах Республики Бурятия и Забайкальском крае, находится в пределах 10,48 – 12,92%.

Наибольшее содержание свободных аминокислот отмечено в Баргузинском и Заиграевском районах и в Забайкальском крае.

Динамика накопления свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого С целью установления оптимальных сроков заготовки растительного сырья исследована динамика накопления суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого в зависимости от фазы вегетационного периода (таблица 18).

Определение содержания свободных аминокислот проводили по разработанной нами методике (с. 79). Образцы сырья были собраны в маесентябре в Тарбагатайском районе Республики Бурятия (с. Вахмистрово).

82 Таблица 18 – Содержание свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого, собранных в различные фазы вегетационного периода

–  –  –

Проведенные исследования показали, что наибольшее содержание суммы свободных аминокислот в корнях астрагала перепончатого наблюдается в фазу плодоношения поэтому оптимальными сроками сбора корней астрагала перепончатого являются август-сентябрь.

Установление срока годности корней астрагала перепончатого При хранении в естественных условиях (в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре) показатели качества определялись через каждые 6 месяцев. На основании полученных данных, срок годности корней астрагала перепончатого установлен в 2 года, что подтверждено результатами изучения стабильности средства в течение 2,5 лет (Приложение 5).

–  –  –

механических волокон с характерными утолщенными стенками и продольными трещинами, сетчатых сосудов древесины, каменистых клеток изодиаметрической или вытянутой формы с утолщенными, бороздчатыми стенками и простых крахмальных зерен.

2. Качественными реакциями, а также методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ подтверждено наличие в корнях астрагала перепончатого аминокислот, флавоноидов (катехин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кемпферол, нарингенин), фенолкарбоновых (галловая), оксикоричных (о-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая, феруловая, изоферуловая), коричной и аскорбиновой кислот, дубильных веществ (таннин), кумаринов (кумарин, о-метоксикумарин), тритерпеновых сапонинов, углеводов, белковых веществ и алкалоидов.

3. Состав жирных кислот корней астрагала перепончатого представлен 11 соединениями, в наибольшем количестве присутствуют ненасыщенные – линолевая (37,75%), -линоленовая (14,05%), олеиновая (6,88%) и насыщенная – пальмитиновая (25,23%) кислоты.

4. В корнях астрагала перепончатого обнаружены 17 свободных и 19 связанных аминокислот, среди них 9 незаменимых аминокислот (треонин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, гистидин, аргинин, валин, фенилаланин);

суммарное содержание свободных аминокислот в сырье составляет 7,09 мг/г, в наибольшем количестве присутствуют аспарагин – 31,60%, аргинин – 27,11%, глютамин – 21,27% и глутаминовая кислота – 10,14% (от общего количества аминокислот); суммарное содержание связанных аминокислот – 47,94 мг/г, среди которых преобладают пролин – 15,75%, глутаминовая кислота – 13,65%, аспарагиновая кислота – 12,98%, гистидин – 10,68% и аргинин – 10,22% (от общего количества аминокислот).

5. Установлено наличие 28 макро- и микроэлементов в корнях астрагала перепончатого методом эмиссионного спектрального анализа; макроэлементы представлены K – 0,51%, Ca – 0, 25%, Р – 0,15%, Mg – 0,11% и Na – 0,005%, среди микроэлементов преобладают Fe – 168,90 мг/кг, Mn – 14,70 мг/кг, B – 13,80 мг/кг;

содержание азота общего 2,30%.

6. Углеводный комплекс корней астрагала перепончатого представлен фракциями: свободные углеводы (СУ) – 9,23%, водорастворимые полисахариды (ВРПС) – 8,32%, пектиновые вещества (ПВ) – 7,02%, гемицеллюлозы А (Гц А) – 13,17%, гемицеллюлозы Б (Гц Б) – 2,12%, компонентный состав которых представлен: СУ – мальтотриоза, ксилоза, манноза; ВРПС – глюкоза, мальтоза, полимер; ПВ – манноза, глюкоза; Гц А – мальтоза, глюкоза, ксилоза, полимер; Гц Б – мальтоза, глюкоза, ксилоза, манноза, галактоза, полимер.

7. Установлено количественное содержание БАВ в корнях астрагала перепончатого: органических кислот 1,96±0,03%, дубильных веществ 0,44±0,02%, тритерпеновых сапонинов 1,51±0,04%.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО

СРЕДСТВА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО

4.1. Обоснование состава растительного сбора Разработка состава сбора нейропротективного проводилась на основе изучения сведений об этиологии и патогенезе цереброваскулярных заболеваний, химическом составе биологически активных веществ растений, опыте их использования в официальной, традиционной и народной медицинах.

В сбор нейропротективный были включены растения антиоксидантного, анксиолитического, гипотензивного, успокаивающего, противовоспалительного и нейромодулирующего действия, отличающиеся по химическому составу и имеющие особенности фармакологического действия, что позволяет достичь в полной мере комплексного нейропротективного действия.

Одними из основных причин инсульта являются гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет, что также учитывалось при выборе лекарственных растений.

Доля каждого вида сырья и рациональность их сочетания определялись с учетом механизма развития нарушений мозгового кровообращения, официнальности и состояния сырьевой базы. Лекарственные растения, включенные в растительную композицию, содержат флавоноиды, сапонины, кумарины, дубильные вещества, органические кислоты, витамины, макро- и микроэлементы, обеспечивающие синергетическое антиоксидантное действие. Антиоксидантное действие осуществляется путем защиты липидов и мембранных белков клеток от перекисного окисления, укрепления стенок капилляров и сосудов, выведения излишек холестерина из состава крови, усиления и потенциирования действия сопутствующих компонентов. Наличие в растениях заменимых и незаменимых аминокислот способствует восстановлению структуры клеток, усилению регенеративных процессов, уменьшению дистрофических проявлений.

Использование комплекса биологически активных веществ в таком сочетании в сборе необходимо для обеспечения адекватной фармакологической коррекции нарушений кровообращения головного мозга.

Исследования на животных, проведенные в ИОЭБ СО РАН, показали выраженные нейропротективные свойства сочетания трех видов лекарственного растительного сырья – корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского и корневища и корни вздутоплодника сибирского, что послужило основанием для разработки сбора на основе данной растительной композиции.

4.2. Выбор оптимального варианта и соотношения компонентов сбора С целью выбора оптимального варианта и соотношения компонентов, входящих в растительную композицию, изучено 4 варианта сбора следующих составов (таблица 19):

Таблица 19 - Варианты сбора нейропротективного № Наименование компонентов сбора Варианты и соотношения компонентов сбора, в п/п г

–  –  –

На основании фитохимического изучения сборов выбран вариант сбора № 1, т.к. он отличался большим содержанием экстрактивных и действующих веществ, подтверждена его нейропротективная активность (Приложение 2).

Таким образом, на основании результатов фитохимического анализа и фармакологических испытаний объектом дальнейшего исследования выбран сбор из лекарственного растительного сырья следующего состава: корни астрагала перепончатого - 40 ч; корни шлемника байкальского - 35 ч; корневища и корни вздутоплодника сибирского - 25 ч.

4.3. Разработка технологии получения сбора Технологическая схема получения сбора разработана в соответствии с требованиями Стандарта отрасли ОСТ 42-510-98 и «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP)», утвержденным Министерством здравоохранения Российской Федерации 25 февраля 1998 г. (ред.

от 25.11.2001) и отработана на лабораторном оборудовании. Технологическая схема получения сбора представлена на рисунке 17.

Основные стадии технологического процесса:

BP. 1. Вспомогательные работы.

ТП. 1. Измельчение растительного сырья.

ТП. 2. Получение готового продукта (сбора).

УМО. 1. Фасовка, маркировка и упаковка сбора.

Изложение технологического процесса.

ТП. 1. 1. Подготовка растительного сырья Растительное сырье, соответствующее требованиям нормативной документации (НД), предварительно просматривали и просеивали, чтобы исключить механические включения. Затем сырье поступает на измельчение.

ТП. 1. 2. Измельчение растительного сырья Корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского измельчали на универсальной мельнице до размера частиц 2 мм. Установленное соотношение между размерами частиц сырья в сборе обеспечивают более равномерное смешивание. Перед началом измельчения проверяли мельницу и отсутствие остатков другого сырья после измельчения. Сырье засыпали и выгружали вручную.

ТП. 1. 3. Просеивание измельченного сырья.

Сырье, необходимое для приготовления сбора, предварительно просеивали, чтобы исключить механические примеси и иметь сырье с однородной величиной частиц, обеспечивающей равномерное смешивание.

Приступая к работе проверяли чистоту сит, чистоту и целостность сеток.

Просев вели вручную через сито с закрепленным донышком. В случае необходимости просеиваемый материал протирали рукой (в перчатке). При просеве необходимо работать осторожно, избегая пылеобразования. Работать в маске «Лепесток».

Корни астрагала перепончатого просеивали в количестве 408 г, получали 400 г; корни шлемника байкальского – 357,6 г – 350 г; корневища и корни вздутоплодника сибирского – 252,5 г – 250 г. Полученное растительное сырье передавали на следующую стадию.

Потери сырья при измельчении составляли 0,018 кг или 1,78 %.

Выход на стадии – 98,22 % Выход от начала технологического процесса – 98,22 %.

ТП. 2. Получение готового продукта - сбора ТП. 2. 1. Смешивание компонентов сбора Просеянные компоненты сбора тщательно смешивали в смесителе до получения однородной массы. Оценку внешнего вида сбора выполняли на основании осмотра невооруженным глазом. Отбирали среднюю пробу для анализа.

УМО 1. Фасовка и упаковка сбора Процесс фасовки осуществлялся вручную и состоял из следующих операций:

1. Штамповка серий на бандеролях.

2. Открытие торцевых клапанов пачки.

3. Формирование пакетов.

4. Укладка пакетов в пачки.

5. Взвешивание сырья.

6. Засыпка сырья в пачки при помощи совка.

7. Закрытие пакетов.

8. Закрытие торцевых клапанов пачек.

Пачки со сбором поступали на стол укладки и вручную укладывали в:

- ящики фанерные по ГОСТ 5959 – 80, выстланные бумагой мешочной по ГОСТ 2228 – 81, или под пергаментом по ГОСТ 1760 – 86;

- ящики из гофрированного картона по ГОСТ 9142 – 90, выстланные бумагой мешочной по ГОСТ 2228 – 81, или под пергаментом по ГОСТ 1760 – 86. Ящики фанерные должны быть закрыты крышкой и забиты гвоздями, ящики из гофрированного картона должны быть оклеены лентой из бумаги марки М – 70 по ГОСТ 2228 – 81, или лентой клеевой на бумажной основе по ГОСТ 18251 – 87.

Потери сырья при фасовке и упаковке сбора составили 0,017 кг или 1,70%.

Выход на стадии – 98,30%.

Выход от начала технологического процесса – 96,52%.

91

Рисунок 17 - Технологическая схема производства сбора нейропротективного

4.4. Товароведческий анализ сбора нейропротективного При составлении сбора использовалось растительное сырье, отвечающее требованиям НД (корни астрагала перепончатого – проект ФС – приложение 3, корни шлемника байкальского - ФС 42-453-91, корневища и корни вздутоплодника сибирского - ФС 42-2667-89).

Для установления числовых показателей сбора нейропротективного проведен товароведческий анализ 5 серий сбора, которые оценивали по

–  –  –

2 021211 5,29 2,31 7,08 1,12 1,78 2,10 4,25 26,12 3 031211 8,33 4,38 7,90 1,25 1,85 2,50 4,37 27,39 4 041211 7,55 4,02 8,03 1,49 1,82 2,60 4,48 30,05 Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, в опытных сериях сбора составило от 26,12% до 30,05%; золы общей от 5,29% до 8,33%; золы не растворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – от 2,31% до 4,38%;

влажность – от 7,08% до 7,80%; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм – от 2,10% до 2,80%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм – от 4,25% до 4,90%; органической примеси – от 1,12% до 1,49%, минеральной примеси – 1,82% до 1,96%.

На основании полученных данных определены числовые показатели для сбора нейропротективного: экстрактивных веществ не менее 26,0%; золы общей не более 10,0%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 5,0%; влажность не более 10,0%; частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, не более 3,0%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм, не более 5,0%;

органической примеси не более 1,5%, минеральной примеси не более 2,0%.

4.5. Изучение внешних признаков сбора Установление подлинности сбора нейропротективного проводили согласно статье «Сборы» (ГФ ХI, вып.1, с. 266). Наиболее сохраняемые и воспроизводимые анатомо-морфологические признаки компонентов сбора имеют основополагающее диагностическое значение для его идентификации.

Компоненты, входящие в состав сбора, были измельчены до размера частиц 2,0 мм и просеяны сквозь сито с размером отверстий 0,18 мм для удаления пыли.

Изучение внешних признаков проводили в 2 этапа: сначала осматривали невооруженным глазом, отмечая общую структуру и цвет растительной смеси, затем сбор изучали под лупой и стереомикроскопом. Вкус водного извлечения определяли, анализируя отвар сбора.

Сбор нейропротективный представляет собой порошок, состоящий из неоднородных частиц от желтого до бежевого цвета с темно-коричневыми включениями. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения сладковато-горький.

При просмотре сбора под лупой (х10) обнаружены фрагменты подземных органов:

– кусочки корней светло-бежевого цвета с коричневыми частицами коры (корни астрагала перепончатого);

- кусочки корней от лимонно-желтого до коричневого цвета (корни шлемника байкальского);

- кусочки корневищ и корней различной формы желтовато – белого цвета с коричневыми частицами коры (корневища и корни вздутоплодника сибирского);

Данные внешних признаков сбора рекомендованы как характерные диагностические признаки и включены в нормативные документы на сбор нейропротективный.

4.6. Изучение микроскопических признаков сбора Предварительно изучались анатомо-диагностические признаки каждого компонента сбора.

Данные по анатомическому строению корней астрагала перепончатого (поперечный срез и порошок) представлены в главе 3, п. 3.2.

При исследовании микропрепаратов поперечного среза корней шлемника байкальского (рисунок 18) под микроскопом обнаружены: группы склереид в коровой части корня, расположенные концентрическими прерывистыми поясами.

Сосуды и трахеиды древесины расположены тангенциально вытянутыми группами, сердцевидные лучи широкие, многорядные. Клетки паренхимы и сердцевинных лучей заполнены крахмальными зернами.

Для порошка корней шлемника байкальского (рисунок 19) характерно наличие участков паренхимы, состоящей из округлых или округлопрямоугольных клеток; крахмальные зерна, склереиды, расположенные группами и обрывки сосудов.

При рассмотрении поперечного среза корневищ и корней вздутоплодника сибирского (рисунок 20) видны: узкий слой темно-коричневой пробки, широкая кора, с радиально вытянутыми разрывами вдоль сердцевинных лучей, четкая линия камбия и древесина. Диагностическое значение имеют многочисленные секреторные каналы, расположенные концентрическими кругами. Секреторные каналы корней 1 - 2 мм, под пробкой в сердцевине – до 300 - 600 мкм. В анатомическом строении корневищ и корней растения – стеблекорня, гипокотиля и корня – наиболее характерным является строение секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру, как правило, цилиндрической формы. В самом наружном слое коры корня и гипокотиля, под пробкой, из ответвлений секреторных каналов образуются гигантские резервуары округлой или овальной формы до 2 - 4 мм в диаметре.

Порошок корневищ и корней вздутоплодника сибирского (рисунок 21) представляет собой смесь участков коры, волокон оранжевато-желтого цвета и скопления узких сосудов, расположенных очень плотно друг к другу.

3 А В Б Г Д Рисунок 18 - Микроскопическое строение поперечного среза корня шлемника байкальского (А – увеличение 4х10, Б, В, Г, Д - увеличение 40х10, 1 – клетки пробки, 2 – склереиды, 3 – древесина, 4 – крахмальные зерна, 5 – клетки паренхимы) Е Ж 6 З И К

–  –  –

Е Ж З Рисунок 21 - Микроскопическое строение порошка корневищ и корней вздутоплодника сибирского (Е, Ж, З – увеличение 10х10, 2 – клетки паренхимы, 8 – волокна либриформа, 9 – сосуды ксилемы, 10 – клетки пробки) Далее порошок сбора нейропротективного исследовали на совместное присутствие компонентов в микропрепарате с целью выявления частоты встречаемости диагностически значимых признаков (рисунок 22) и расчета индексов участия компонентов сбора (таблица 23), используя методику количественного определения компонентов сбора [120] (с. 452 в приведенном источнике литературы). Каждое растение имеет свой набор анатомодиагностических признаков (как минимум 6 - 7), но для данной методики необходимо выбрать диагностически значимые признаки – это явные, резко отличающие растение от других, имеющие высокий процент встречаемости, признаки. Так, для корней астрагала перепончатого диагностически значимыми признаками выбраны бесцветные механические волокна и сетчатые сосуды древесины. Механические волокна наблюдались на микропрепаратах корней астрагала перепончатого (бесцветные и оранжевато-желтые волокна) и А Б

–  –  –

корневищ и корней вздутоплодника сибирского (оранжевато-желтые волокна), однако только у астрагала перепончатого наблюдались бесцветные волокна и они имели высокую частоту встречаемости в растении. Сетчатые сосуды также являются отличительной особенностью корней астрагала перепончатого и имеют высокий процент встречаемости в растении. Таким же образом выбраны диагностически значимые признаки для остальных растений (по 2 признака от каждого растения): для корней шлемника байкальского – клетки паренхимы и склереиды, для корневищ и корней вздутоплодника сибирского – клетки паренхимы и группы узких сосудов, расположенных, как правило, очень плотно друг к другу.

Таблица 23 - Индексы участия компонентов сбора нейропротективного

–  –  –

Представленные результаты свидетельствуют, что средняя ошибка определения составляет 4,65 %.

Таким образом, при микроскопическом исследовании 10 серий сбора на совместное присутствие его компонентов установлено, что в каждом микропрепарате обнаруживаются бесцветные механические волокна и сетчатые сосуды корней астрагала перепончатого, клетки паренхимы (округлой формы, окрашенные в желтый цвет) и склереиды корней шлемника байкальского, клетки паренхимы (извилистой формы, бесцветные) и группы сосудов (расположенных очень плотно друг к другу) корневищ и корней вздутоплодника сибирского.

Определены индексы участия для компонентов сбора: 42,30±2,10 – для корней астрагала перепончатого, 34,67±1,58 – для корней шлемника байкальского, 23,03±1,02 – для корневищ и корней вздутоплодника сибирского. Полученные данные свидетельствуют о том, что найденные индексы участия компонентов соответствуют их содержанию в сборе, что может служить дополнительным критерием доброкачественности сбора нейропротективного.

Проведенные исследования по изучению диагностических признаков сбора были использованы при разработке проекта ФСП на сбор нейропротективный.

4.7. Фитохимическое изучение сбора нейропротективного 4.7.1. Обнаружение основных групп биологически активных веществ с помощью качественных реакций Для предварительной химической оценки был проведен анализ извлечений сбора нейропротективного на наличие основных групп биологически активных соединений. В результате качественного анализа, проведенного по приведенным выше методикам (глава 3, п. 3.4.1), в сборе нейропротективном обнаружены аминокислоты, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, тритерпеновые сапонины, углеводный комплекс, белковые вещества и алкалоиды.

4.7.2. Обнаружение веществ методом БХ Проведено изучение 70% спиртового извлечения сбора методом двумерной хроматографии на бумаге марки Filtrak FN-8 и FN-16, в системах растворителей 1 и 2. Хроматограммы просматривали в УФ-свете, проявляли 5% раствором алюминия хлорида (для идентификации флавоноидов) и парами аммиака (для фенолкарбоновых кислот).

На хроматограммах выявлены 12 зон фенольных соединений, которые в УФ-свете обладают собственной флуоресценцией желтого, фиолетового и голубого цвета. После обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида флуоресценция усилилась, и зоны приобрели желтый, желто-зеленый, коричневый и фиолетовый цвет. Из обнаруженных 12 зон 8 отнесено к веществам флавоноидного характера (идентифицировано 4 веществ), 7 – к фенолкарбоновым кислотам. Результаты хроматографического анализа фенольных соединений сбора методом двумерной бумажной хроматографии представлены на рисунке 23 и в таблице 26.

Рисунок 23 - Схема двумерной хроматограммы 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного после обработки раствором AlCl3 (в УФ-свете) 1 – рутин, 2 – кверцетин, 3 – гиперозид, 4 – лютеолин, 5 – мирицетин, 6 – лютеолин-7гликозид, 7 – 70% спиртовое извлечение сбора нейропротективного Таблица 26 - Результаты хроматографического анализа фенольных соединений 70% спиртовых извлечений сбора нейропротективного методом двумерной БХ

–  –  –

Продолжение таблицы 26 - Результаты хроматографического анализа фенольных соединений 70% спиртовых извлечений сбора нейропротективного методом двумерной БХ

–  –  –

Таким образом, при хроматографировании 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного со стандартными образцами установлено присутствие в анализируемом образце кверцетина (Rf1=0,05, Rf2=0,78), лютеолина (Rf1=0,07, Rf2=0,84), лютеолин-7-гликозида (Rf1=0,11, Rf2=0,47), рутина (Rf1=0,56, Rf2=0,64).

3.1.3.3. Идентификация соединений методом ТСХ

Качественное определение байкалина проводили в системе 8 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil». 0,05 мл спиртового извлечения сбора 70% нейропротективного (1:10) наносили микропипеткой на линию старта пластинки и хроматографировали в соответствующей системе параллельно с достоверным образцом байкалина. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 10% раствором серной кислоты и наблюдали оранжевую зону на белом фоне пластинки на уровне зоны РСО байкалина Rf ~ 0,19 (рисунок 24).

Рисунок 24 - Схема хроматограммы 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного (1) и 70% спиртового раствора байкалина (2) в системе хлороформ – метанол (6:4) после обработки 10% раствором H2SO4 Качественное определение кумаринов Хроматографирование проводили на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в системах растворителей 5, 6, 7. По 0,1 мл хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1:5) и 0,05 мл спиртовых растворов стандартов наносили микропипеткой на линию старта хроматографической пластинки. Пластинку с пробами высушивали на воздухе в течение 15 минут и помещали в предварительно насыщенную камеру. Когда фронт растворителя проходил до 10 см, ее вынимали, сушили на воздухе до полного удаления системы и просматривали окраску пятен в УФ-свете, затем пластинку обрабатывали последовательно 0,5% спиртовым раствором и диазореактивом, NaOH высушивали, прогревали в сушильном шкафу при 110°С в течение 5 минут и наблюдали изменение окраски зон адсорбции.

При использовании системы 5 происходило лучшее разделение веществ. В системе же 6 разделение было самым худшим, зоны адсорбции находились практически на одной линии, и возникали трудности при определении Rf веществ.

В системе 5 было обнаружено 6 зон адсорбции (рисунок 25):

Рисунок 25 - Схема хроматограммы хлороформного извлечения сбора нейропротективного (1) и спиртовых растворов стандартов (2 - фловерин - сумма дигидросамидина и виснадина, 3 пеуцинидин, 4 - умбеллиферон, 5 - скополетин) в системе гексан – бензол – метанол (5:4:1) в УФ-свете

1) Rf (1) = 0,14 (Rf (1) соответствует Rf скополетина (7), голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH;

вишневая – при последующей обработке диазореактивом);

2) Rf (2) = 0,25 (Rf (2) соответствует Rf дигидросамидина (8); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором оранжевая – при последующей обработке NaOH;

диазореактивом);

3) Rf (3) = 0,34 (Rf (3) соответствует Rf умбеллиферона (9); голубая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; светло-оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

4) Rf (4) = 0,57 (Rf (4) соответствует Rf пеуцинидина (10); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

5) Rf (5) = 0,68 (Rf (5) соответствует с Rf виснадина (11); фиолетовая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором NaOH; оранжевая – при последующей обработке диазореактивом);

6) Rf (6) = 0,76 (светло-зеленая окраска зоны в УФ-свете; желтая – при обработке 0,5% спиртовым раствором оранжевая – при NaOH;

последующей обработке диазореактивом).

Качественное определение аскорбиновой кислоты проводили в водном извлечении сбора нейропротективного в системе растворителей 3 на пластинах «Silufol UV254».

На линию старта пластины микропипеткой наносили 0,5 мл водного извлечения сбора (1:10) и рядом 0,003 мл РСО аскорбиновой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил 13 см, пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 5 минут и обрабатывали 0,04 % раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

При просмотре хроматограммы наблюдали белую зону на розовом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf ~ 0,90 (рисунок 26).

А Б Рисунок 26 - Схемы хроматограмм водного извлечения сбора нейропротективного (1) и раствора аскорбиновой кислоты (2) в системах этилацетат - ледяная уксусная кислота (80:20) (А) и этанол-уксусная кислота-вода (90:9:1) (Б) Также водное извлечение исследовали на содержание аскорбиновой кислоты в системе растворителей 4 на пластинах ПТСХ-ПА-УФ «Sorbfil» в темной камере.

При достижении фронта растворителя 15 см, пластину вынимали, высушивали при комнатной температуре и обрабатывали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 95% спирте. При просмотре хроматограммы наблюдали синюю зону на желтом фоне пластинки на уровне зоны РСО кислоты аскорбиновой Rf ~ 0,75 (рисунок 26).

4.7.4. Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ На основании данных литературы и проведенных качественных реакций установлено, что в изучаемом сборе содержатся вещества фенольной природы.

Проведен анализ водно-спиртового извлечения сбора методом ВЭЖХ.

Методика приготовления 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Около 3 г (точная навеска) измельченного сбора помещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 60 мл 70% спирта, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили 70% спиртом до метки (исследуемый раствор).

По 50 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п.

2.2, с. 47).

Результаты проведенных исследований приведены в таблице 27 и на рисунке 27.

Рисунок 27 – Хроматограмма 70% спиртового извлечения сбора нейропротективного (детектирование при длине волны 254 нм)

–  –  –

Как видно из представленных данных (рисунок 27 и таблица 27) в сборе нейропротективном обнаружены флавоноиды (байкалин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кверцетин, эпигаллокатехингаллат, эпикатехин), фенолкарбоновые (галловая, вератровая), оксикоричные кислоты (хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая и феруловая кислоты), дубильные вещества (таннин) и кумарины (дикумарин, кумарин).

4.7.5. Идентификация свободных и связанных аминокислот, свободных углеводов, жирных кислот, компонентов эфирного масла Свободные и связанные аминокислоты Аминокислоты играют важную роль в биосинтезе биологически активных соединений, пептидов и белков [46].

По содержанию аминокислот можно судить о скорости протекания биохимических процессов. Лекарственные растения являются источниками БАВ, среди которых значительное место принадлежит аминокислотам. Свободные аминокислоты выполняют в живом организме ряд специфических задач, участвуя в процессах связывания, транспорта и выведения из организма биологически активных форм азота, способствуя поддержанию азотистого баланса, обладая иммуноактивными свойствами и оказывая гиполипидемическое действие. Они оказывают положительное влияние на сердечно - сосудистую систему, участвуют в процессах нервной регуляции различных функций организма, а также влияют на сосудистый тонус [91].

Качественный состав и количественное содержание аминокислот в сборе определяли на аминокислотном анализаторе (таблица 22) по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 42).

В результате проведенного исследования в сборе нейропротективном определены 21 свободная и 19 связанных аминокислот, среди которых 9 незаменимых аминокислот - треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, аргинин.

Суммарное содержание свободных аминокислот в сборе составляет 4,71 мг/г. В наибольшем количестве присутствуют аргинин – 41,92%, аспарагин – 22,15%, глютамин – 9,86% и глутаминовая кислота – 6,47% (от общего количества аминокислот). Суммарное содержание связанных аминокислот – 45,54 мг/г, среди которых преобладают аргинин – 15,82%, глутаминовая кислота – 12,41%, аспарагиновая кислота – 11,87%, цистеин – 9,77% (от общего количества аминокислот).

Свободные углеводы и органические кислоты Нами проведено исследование состава свободных углеводов и органических кислот в водном извлечении сбора нейропротективного методом ВЭЖХ.

Методика приготовления водного извлечения сбора нейропротективного.

Около 1 г (точная навеска) сбора, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл воды очищенной, присоединяли колбу к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания водной смеси в колбе. Полученное извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объём содержимого колбы до метки водой и перемешивали (исследуемый раствор).

По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения свободных углеводов и органических кислот вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике (глава 2, п. 2.2, с. 47). Результаты исследований приведены на рисунке 28 и в таблице 28.

Рисунок 28 - Хроматограмма водного извлечении сбора нейропротективного

–  –  –



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.