WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Связывание МА преимущественно G- и P-белка и в меньшей степени нуклеопротеина и матриксного белка, вероятнее всего, связано с особенностями локализации вирусных белков в вирионе препарата, использованного для иммунизации. Для дальнейших исследований были отобраны МА № 4, наиболее активные по отношению к внутреннему наиболее консервативному N-белку, и МА № 15, проявляющие высокую активность к внешнему подверженному мутациям G-белку вируса ИНГТ.

–  –  –

Как следует из данных таблицы 10, детектирующие антитела против вируса ИНГТ взаимодействовали со специфичным антигеном: наблюдались сигналы только от тех лунок, которые сенсибилизированы антителами против вируса ИНГТ. Таким образом, МА № 4 и 15 проявляли специфичностью к вирусу ИНГТ.

С помощью двойного сэндвич-варианта ИФА определяли активность препаратов МА № 4 и 15, проводя титрование полученных антител с шагом 2, начиная с разведения 1:1000. В качестве антигена применяли суспензию вируса ИНГТ с концентрацией 1 мкг/мл. По результатам ИФА определили, что активность МА № 4 и 15 составляла 1:192000 и 1:384000, соответственно.

Таким образом, полученные препараты МА № 4 и 15 против N- и G-белков вируса ИНГТ с концентрациями 28,1 и 54,6 мг/мл и активностью 1:192000 и 1:384000, соответственно, характеризовались специфичностью к вирусу ИНГТ, что позволило их использовать при разработке диагностических тест-систем для выявления вируса ИНГТ.

3.2.3 Разработка реакции агглютинации латекса для выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани Одним из серологических методов диагностики инфекционных болезней является реакция агглютинации латекса (РАЛ), основанная на взаимодействии с антигеном вируса полистирольных латексных частиц, сенсибилизированных специфичными антителами, что в результате приводит к формированию видимого преципитата из агрегированных микросфер латекса. Метод широко используется как в медицине, так и в ветеринарной практике. В настоящее время существует широкий спектр тестов латексной аггютинации, которые производят на предприятиях «Microgen Bioproducts», «Biovitrum» и др. Анализ является простым и быстрым в проведении, не требует наличия дорогостоящего оборудования, достаточно чувствительный и специфичный. Однако получение латексных диагностикумов осложняется влиянием различных физикохимических факторов на процесс адсорбции специфичных антител. По этой причине проводили поиск оптимальных условий, позволяющих повысить степень сенсибилизации латексных частиц и получить тест-системы с высокими диагностическими показателями.

Поиск оптимальных условий для получения латексных диагностикумов с разными функциональными группами в процессе физической адсорбции С целью достижения высоких показателей степени физической адсорбции антител на поверхности латексных частиц проводили поиск оптимальных условий для получения диагностических суспензий, выявляющих вирус ИНГТ.

На первом этапе работы проводили поиск состава буферного раствора, подходящего для приготовления латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ. Полистирольные частицы с разными ионогенными группами (-COOH, -NH2, -SO4) и диаметром 340 нм отмывали от раствора сурфактанта и сенсибилизировали поликлональными антителами к вирусу ИНГТ (конц. 1 мг/мл) с применением буферных растворов разного состава: ББР, ФБР,

–  –  –

Как следует из таблицы 11, наибольшая степень сенсибилизации латексных микросфер с разными ионогенными группами отмечалась при использовании ГСБР. При замене глицина на дигидроортофосфат натрия в составе буферного раствора степень адсорбции белка на поверхности карбоксилированных частиц уменьшается на 4,1%, аминированных – 5,0%, сульфатированных – 2,4%. При использовании ФБР и ББР показатели были еще ниже.

Лучшие показатели аналитической чувствительности отмечали для латексных препаратов, полученных при использовании ГСБР. Визуальный достоверный предел обнаружения антигена на два креста для данных диагностикумов с разными ионогенными группами составил 3,50 lgТЦД50/см3.

Показатели количественной чувствительности препаратов, синтезированных с применением ФСБР, были на 0,3 lg ТЦД50/см3 ниже по сравнению с ГСБР. При использовании ФБР и ББР аналитическая чувствительность диагностических суспензий снижалась еще на 0,3 lg ТЦД50/см3 по сравнению с ФСБР.

Латексные препараты, полученные с применением буферных растворов разного состава (ББР, ФБР, ФСБР, ГСБР), испытывали в РАЛ с гетерологичными антигенами (вирусы ИНПЖ, ВГС и ВВК) с биологической активностью 7,0 lg ТЦД50/см3. Положительными и отрицательными контрольными препаратами служили 10%-ные суспензии клеток из гонад радужной форели (RTG-2), зараженные и не зараженные вирусом ИНГТ с тиром инфекционной активности 7,0 lg ТЦД50/см3, соответственно. Полученные препараты не вызывали агглютинацию с неспецифичными антигенами, что свидетельствовало о специфичности диагностикумов по отношению к вирусу ИНГТ.

Таким образом, для сенсибилизации полистирольных латексных частиц с разными функциональными группами рекомендуется использовать ГСБР, который обеспечивает высокую степень адсорбции антител, специфичных к вирусу ИНГТ, а также высокие показатели количественной чувствительности и специфичности полученных препаратов.

На втором этапе проводили поиск оптимального буферного раствора для блокирования открытых сайтов связывания на поверхности латексов.

В качестве блок-растворов использовали: 1) 1%, 5%, 10% BSA в ГСБР;

2) 1%, 5%, 10% неиммунную сыворотку лошади в ГСБР;

–  –  –

Как следует из таблицы 12, отсутствие спонтанной агглютинации приготовленных латексных препаратов наблюдалось при блокировании сайтов неспецифического связывания растворами 1%, 5%, 10% BSA, 5%, 10% неиммунных сывороток лошади и 0,5%, 1,0% желатина в ГСБР. При использовании в качестве блок-раствора 1% неиммунной сыворотки лошади и 0,1% желатина отмечалась спонтанная агглютинация со всеми латексными диагностикумами. Учитывая полученные значения аналитической чувствительности препаратов, для полного блокирования сайтов неспецифического связывания на поверхности латексов рекомендуется использовать следующие блок-растворы: 1-10% BSA или 10% неиммунную сыворотку лошади в ГСБР. С точки зрения экономии, рекомендуется блокировать открытые центры связывания 1% BSA в ГСБР.

Латексные препараты, полученные с использованием в качестве блокраствора 1% BSA в ГСБР, проявляли специфичность к вирусу ИНГТ при проведении РАЛ с антигенами вирусов ВГС, ИНПЖ, ВВК.

На следующем этапе работы проводили поиск оптимальных значений рН и ионной силы ГСБР, выбранного для получения латексных препаратов.

Сенсибилизацию полистирольных частиц латекса суспензией поликлональных антител с концентрацией 1 мг/мл проводили в ГСБР с разными значениями рН: 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 и ионной силой 5 ммоль/л. Концентрацию неадсорбированных антител при использовании ГСБР с указанными выше значениями рН определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА. Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Аналитическую чувствительность и специфичность препаратов определяли, как описано выше (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53. Результаты исследований представлены на рисунке 13 и в таблице 15.

Рисунок 13 – Влияние рН ГСБР на степень адсорбции антител на поверхности латексов с разными ионогенными группам Как видно из рисунка 13, зависимость степени адсорбции антител против вируса ИНГТ от рН ГСБР отражалась в виде параболического графика.

Наибольшая степень адсорбции белка достигалась при рН, близком к его изоэлектрической точке (pI). При удалении значения рН от pI возрастали силы электростатического отталкивания белковых молекул, что приводило к снижению степени адсорбции иммуноглобулина G. При этом катионные латексные частицы (с-NH2 группами) адсорбировали на своей поверхности на 4,2 и 10,0% больше антител по сравнению с анионными латексами (с -COOH, -SO4 группами, соответственно).

Результаты исследования представлены в таблице 13, из которой следует, что наиболее высокие значения степени адсорбции антител, а также лучшие показатели аналитической чувствительности и специфичности полученных диагностикумов отмечали при использовании ГСБР с рН 7,0.

Таким образом, для получения латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, сенсибилизацию микросфер специфичными антителами рекомендуется проводить с использованием ГСБР с рН, близким к изоэлектрической точки данного иммуноглобулина G (рН 7).

–  –  –

С целью поиска оптимального значения ионной силы (I) буферного раствора для получения латексных диагностикумов применяли ГСБР с рН 7,0 и разными концентрациями его компонентов: 150, 100, 50, 25 и 5 ммоль/л.

Сенсибилизацию поверхности микросфер проводили, как описано в главе «Материалы и методы». Концентрацию неадсорбированных антител при использовании ГСБР с указанными выше значениями ионной силы определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА.

Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52).

–  –  –

Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69).

Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53.

Результаты исследований приведены в таблице 14, из которой следует, что для всех исследованных латексов с разными ионогенными группами плато адсорбции достигалось в нейтральной среде. Наибольшее значение степени адсорбции IgG при рН 7,0 наблюдалось в ГСБР с низким значением ионной силы (5 ммоль/л). При росте ионной силы в нейтральной среде значения плато адсорбции антител уменьшались, и зависимость степени связывания IgG от показателя кислотности буферного раствора становилась менее выраженной.

Также была выявлена зависимость степени адсорбции антител против вируса ИНГТ на заряженной поверхности частиц с разными функциональными группами от ионной силы ГСБР в средах с кислой, нейтральной и щелочной реакциями. Данные таблицы 14 свидетельствуют о том, что в средах с кислой и щелочной реакциями при росте ионной силы ГСБР увеличивалась конформационная стабильность белка и степень его адсорбции. Наибольшая степень связывания IgG в этих средах достигалась при использовании буферного раствора с ионной силой 100 ммоль/л и более. При уменьшении концентрации хлористого натрия и глицина в этих условиях за счет ионизации концевых функциональных групп латекса поверхностный слой микросфер разрыхлялся, в результате этого снижались степень сенсибилизации частиц и аналитическая чувствительность полученных диагностикумов.

В нейтральной среде при увеличении ионной силы буферного раствора уменьшалась стабильность антител, ослабевали силы электростатического взаимодействия между IgG и поверхностью латекса, и тем самым снижалась степень адсорбции иммуноглобулинов G на поверхности частиц со всеми исследованными группами. При ионной силе 100 ммоль/л и более в нейтральной среде степень адсорбции белка была ниже 50%, и в этих условиях она практически не зависела от рН ГСБР. При снижении концентрации компонентов буферного раствора в среде с рН 7 наблюдался рост количества адсорбированных антител, который достигал своего предела при ионной силе 5 ммоль/л.

Таким образом, синтез латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, рекомендуется проводить в ГСБР с рН 7 и ионной силой 5 ммоль/л. В этих условиях достигали наиболее высоких значений степени адсорбции антител и лучшие показатели аналитической чувствительности и специфичности.

На следующем этапе работы проводили поиск оптимальных значений диаметра микросфер и концентрации активных групп на поверхности частиц для синтеза латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ. Исследовали полистирольные микросферы с разными диаметрами: 340, 650, 740, 950 нм, поверхность которых сенсибилизировали поликлональными антителами с концентрацией 1 мг/мл. Синтез препаратов осуществляли с предложенной выше схемой.

Концентрацию неадсорбированных антител при использовании частиц латекса с указанными выше значениями диаметра микросфер определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА.

Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53.

Результаты исследований приведены в таблице 15, из которой следует, что наиболее высокие значения степени адсорбции антител наблюдались у латексов с меньшим диаметром микросфер. С ростом размера частиц количество адсорбированных IgG снижалось. Это объясняется тем, что при уменьшении диаметра микросфер коэффициент их поверхностно-массового отношения возрастал, тем самым, увеличивалась концентрация ионогенных групп и площадь гидрофобной поверхности частиц, что позволяло адсорбировать

–  –  –

высокой вероятностью повреждения нативной структуры антител при высокоскоростном центрифугировании сенсибилизированных латексов.

Оценивали влияние концентрации активных групп латекса на диагностические характеристики полученных препаратов. Для исследования использовали микросферы с диаметром 340 нм и разными концентрациями поверхностных функциональных групп: 1,42, 1,70, 1,98 мкг-экв/м2. Получение диагностических суспензий проводили, как указано в главе «Материалы и методы». Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52).

Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69).

Синтезированные препараты сравнивали по степени адсорбции антител против вируса ИНГТ и аналитической чувствительности и специфичности.

Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53. Результаты исследования представлены в таблице 16.

Таблица 16 - Оптимальные значения концентрации активных групп латексных частиц для синтеза препаратов, выявляющих вирус ИНГТ (n=3)

–  –  –

всеми исследованными группами достигалась при их концентрации 1,98 мкгэкв/м2 и составляла 76,7% - для аминированных латексов, 72,5% – для карбоксилированных латексов, 66,7% – для сульфатированных латексов.

Все приготовленные латексные препараты в РАЛ с гетерологичными антигенами (вирусами ИНПЖ, ВГС, ВВК) проявляли специфичность к вирусу ИНГТ.

Таким образом, для синтез латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, с высокой аналитической чувствительностью и специфичностью рекомендуется использовать полистирольные латексы с диаметром микросфер 340 нм и концентрацией активных групп 1,98 мкг-экв/м2.

На следующем этапе работы осуществляли поиск оптимальных значений концентрации микросфер и сенсибилизирующих антител для получения латексных препаратов с лучшими диагностическими характеристиками.

Исследовали влияние концентрации латексных частиц в приготовленных препаратах на активность РАЛ. Для этого суспензии со следующими концентрациями микросфер: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0% сенсибилизировали антителами к вирусу ИНГТ с концентрацией 1 мг/мл. Концентрацию неадсорбированных антител при использовании латексов с указанными выше значениями концентраций частиц латекса определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА. Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53. Результаты исследования представлены в таблице 17, из которой следует, что наибольшая активность РАЛ наблюдалась при использовании латексных препаратов с концентрацией частиц 1,5% и более. Однако, увеличение количества микросфер в суспензии (до 2 – 3%) в некоторых случаях вызывало возникновение спонтанной агглютинации с неспецифичными антигенами, что лишало возможности правильно интерпретировать результаты

–  –  –

Таким образом, синтез препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, рекомендуется проводить на основе латексных суспензий с концентрацией частиц 1,5%.

Применяя латексы с диаметром микросфер 340 нм и концентрацией активных групп 1,98 мкг-экв/м2, осуществляли поиск максимально возможной адсорбционной емкости 1,5%-ных латексных суспензий. В эксперименте использовали разные концентрации сенсибилизирующих антител: 500, 750, 1000 и 1500 мкг/мл. Полученные диагностикумы сравнивали по степени адсорбции IgG, количественной чувствительности и специфичности. Концентрацию неадсорбированных антител определяли в ТФ непрямом варианте ИФА.

Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Результаты

–  –  –

Результаты исследования отражены в таблице 19, из которой следует, что наибольшую специфическую активность проявляли латексные диагностикумы, полученные при использовании сенсибилизирующей концентрации антител 1500, 1000 и 750 мкг/мл.

Таким образом, учитывая результаты, отраженные в таблицах 18 и 19, а также вероятность погрешности во время сенсибилизации частиц, для синтеза латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, рекомендуется использовать суспензии специфичных антител с концентрацией 1000 мкг/мл.

Оценивали возможность применения моноклональных и поликлональных антител для получения латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ. В работе использовали суспензии специфичных поликлональных антител с активностью в ТФ непрямом варианте ИФА 1:256000, а также суспензии моноклональных антител № 4 и 15 против N- и G-белка вируса ИНГТ с активностью 1:192000 и 1:384000, соответственно. Концентрация сенсибилизирующих антител 1 мг/мл. Латексы с разными группами разделили на 3 группы: микросферы первой группы сенсибилизировали МА № 4, второй – МА № 15, третьей – поликлональными антителами. Концентрацию неадсорбированных антител определяли в ТФ непрямом варианте ИФА. Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53. С целью дополнительного связывания антител с поверхностью частиц применяли 1% стрептококковый белок А в ГСБР.

Результаты исследований представлены в таблице 20, из которой видно, что при исследовании латексов с разными ионогенными группами степени физической адсорбции поликлональных и моноклональных антител практически не отличались друг от друга. При этом полученные препараты имели разную аналитическую чувствительность. Диагностикумы, синтезированные на основе поликлональных антител, выявляли вирус ИНГТ с титром накопления 3,50 lgТЦД50/см3, на основе МА № 4 и 15 - 3,80 lgТЦД50/см3.

–  –  –

Из таблицы 19 следует, что латексные препараты, полученные на основе поликлональных антител с концентрациями 250 и 500 мкг/мл, в РАЛ с гетерологичными антигенами (вирусы ВГС, ИНПЖ, ВВК) проявляли спонтанную агглютинацию. Применяя МА с концентрациями 250, 500 и 1000 мкг/мл, была синтезирована и исследована на специфичность новая партия латексных препаратов. Полученные диагностические суспензии в РАЛ проявляли специфичность к вирусу ИНГТ со всеми разведениями гетерологичных антигенов (титры накопления вируса 7,0; 6,5; 6,0 lgТЦД50/см3).

Таким образом, латексные препараты, синтезированные на основе МА, были более специфичными по сравнению с диагностикумами, полученными с применением поликлональных антител. При этом аналитическая чувствительность диагностических суспензий, полученных на основе МА и ПА, составляла 3,50 и 3,80 lgТЦД50/см3, соответственно.

Поиск оптимальных условий для синтеза латексных диагностикумов в процессе химической адсорбции С целью повышения аналитической чувствительности и специфичности латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, применяли различные компоненты для химической адсорбции антител, повышая степень связывания IgG и в большей степени сохраняя правильную пространственную организацию специфичного белка.

Синтез диагностикумов проводили на основе латексных суспензий с диаметром микросфер 340 нм и концентрацией активных групп мкг-экв/м2 с использованием ГСБР (рН 7, ионная сила 5 ммоль/л).

1,98 Открытые сайты связывания блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в ГСБР. Сенсибилизацию частиц осуществляли поликлональными и моноклональными антителами с концентрацией 1 мг/мл.

Ковалентное связывание иммуноглобулинов G против вируса ИНГТ с поверхностью микросфер проводили с использованием в качестве модификатора 1% раствора глутарового альдегида. Проводили сравнительный анализ латексных препаратов, полученных в процессе физической и химической адсорбции, по степени адсорбции IgG, количественной чувствительности и специфичности. Концентрацию неадсорбированных антител определяли в ТФ непрямом варианте ИФА. Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69).

Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53. Результаты исследования отражены в таблице 21. Согласно полученным данным, использование глутарового альдегида по сравнению с белком А позволило получить препараты, выявляющие вирус ИНГТ с более низким титром накопления. При увеличении или снижении концентрации глутарового альдегида степень адсорбции и количественная чувствительность снижались.

Таблица 21 - Влияние физической и химической адсорбции антител на активность латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ (n=3)

–  –  –

Латексные диагностикумы, полученные на основе моноклональных антител, характеризовались высокой специфичностью (отсутствие положительной реакции с гетерологичными антигенами с титром 7,0 lgТЦД50/см3). Специфичность препаратов на основе поликлональных антител была ниже (отсутствие положительной реакции с неспецифичными антигенами с титром 6,0 lgТЦД50/см3). Аналитическая чувствительность полученных препаратов составляла 3,11-3,20 lgТЦД50/см3.

Таким образом, для исследования проб патологического материала на ИНГТ надежнее использовать аминированные латексные препараты на основе МА, полученные с применением 1% глутаральдегида и учетом ранее подобранных оптимальных условий физической адсорбции.

Оценка влияния физико-химических факторов на стабильность латексных суспензий для выявления вируса ИНГТ Одним из основных требований, предъявляемых к латексным диагностическим суспензиям, является их способность противостоять агрегации частиц в течение длительного времени [46, 47, 118]. Снижение коллоидной стабильности суспензий может привести к возникновению спонтанной агглютинации и получению ложноположительных результатов РАЛ. С целью

–  –  –

Полученные результаты отражены в таблице 22, из которой следует, что при увеличении ионной силы ГСБР (до 160 ммоль/л) наблюдался рост интенсивности спонтанной агрегации частиц латекса в полученных препаратах.

Это было вызвано тем, что при увеличении концентрации электролитов буферного раствора силы Ван-дер-Ваальсового взаимодействия возрастали, а силы электростатического отталкивания ослабевали. В результате происходило снижение высоты энергетического барьера, который полностью исчезал при достижении критической концентрации коагуляции, равной в данном случае 80ммоль/л. При дальнейшем увеличении ионной силы ГСБР продолжался рост скорости агрегации частиц. При ионной силе более 160 ммоль/л наблюдалось снижение интенсивности агрегации микросфер и увеличение устойчивости диагностических суспензий. Данное явление объясняется существованием гидратных сил, которые, взаимодействуя с гидрофильными участками сенсибилизированных частиц латекса, способствовали увеличению сил электростатического отталкивания над силами молекулярного притяжения.

Таким образом, в течение 6 месяцев высокую коллоидную стабильность сохраняли латексные препараты, хранившиеся в ГСБР с рН 7 и ионной силой менее 80 или более 220 ммоль/л. Учитывая, что при низких значениях ионной силы достигалась наибольшая степень адсорбции антител против вируса ИНГТ на поверхности микросфер, а также с экономической точки зрения, данные латексные препараты рекомендуется хранить в ГСБР с ионной силой 5 ммоль/л.

Однако, при дальнейшем наблюдении за агрегативной устойчивостью полученных препаратов обнаружили, что спустя 7 месяцев хранения во всех суспензиях возникала спонтанная агглютинация частиц.

С целью сохранения в течение более длительного времени коллоидной стабильности диагностических суспензий в систему вводили стабилизаторы, которые адсорбировались на границе раздела фаз и вследствие этого снижали избыточную энергию поверхности микросфер. В качестве стабилизаторов использовали поверхностно-активные вещества (ПАВ), в частности, (2-оксиэтил)-триметиламмония хлорид, а также лаурилсульфат натрия (SDS) с концентрациями: 5, 10, 20, 50, 75, 100 ммоль/л в ГСБР с исходной ионной силой 5 ммоль/л. В течение 10 месяцев с периодичностью раз в 30 дней проводили оценку коллоидной стабильности латексных диагностикумов, хранившихся в ГСБР с добавлением ПАВ. Результаты наблюдений отражены в таблице 23.

Введение в буферный раствор ПАВ приводило лиофильную систему к состоянию, при котором силы электростатического отталкивания частиц преобладали над силами Ван-дер-Ваальсового взаимодействия. Как следует из таблицы 23, при увеличении концентрации ПАВ наблюдалось повышение коллоидной стабильности диагностических суспензий, однако при этом снижалась их аналитическая чувствительность, так как избыточное количество стабилизатора ингибировало специфичное взаимодействие антител и антигенов вируса ИНГТ. По этой причине с целью повышения коллоидной стабильности диагностикумов рекомендуется использовать стабилизаторы только в случае ковалентного связывания антител.

–  –  –

Из таблицы 23 следует, что применение (2-оксиэтил)-триметиламмония хлорида с концентрацией 50 ммоль/л позволяло сохранять коллоидную устойчивость диагностикумов в течение 9 месяцев. Использование в качестве стабилизатора SDS с концентрацией 50 ммоль/л продлевало устойчивость препаратов до 7 месяцев. Полученные диагностические суспензии спустя 270 суток после синтеза проявляли специфичность по отношению к вирусу ИНГТ при исследовании с гетерологичными антигенами (вирусы ВГС, ИНПЖ, ВВК).

Препараты, хранившиеся в смеси с (2-оксиэтил)-триметиламмоний хлоридом (50 ммоль/л), спустя 9 месяцев сохраняли аналитическую чувствительность 3,20 lg ТЦД50/см3. Таким образом, для хранения латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, рекомендуется применять ГСБР с внесением (2-оксиэтил)-триметиламмония хлорида (50 ммоль/л).

На основе проведенных исследований были определены оптимальные условия синтеза и хранения латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ (таблица 24).

–  –  –

Оценка диагностических характеристик латексных препаратов для выявления вируса ИНГТ С помощью разработанного метода РАЛ в 2014-2015 гг. было исследовано 50 образцов биологического материала, положительных по ИНГТ (5 положительных проб от лососевых рыб с титром накопления 4,0-5,0 lgТЦД50/см3, 45 образцов культурального вируса ИНГТ с титром накопления 3,2-5,0 lgТЦД50/см3) и 500 проб патматериала, отрицательных по данному заболеванию, по результатам вирусвыделения в культуре клеток, сэндвич-варианта ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР. Пробы патматериала от радужной форели, семги, атлантического и каспийского лосося были отобраны из рыбоводческих хозяйств на территории Мурманской, Архангельской, Ленинградской, Псковской, Тверской областей, Республики Карелия и Краснодарского края. Подготовку проб и постановку РАЛ осуществляли, как описано в главе «Материалы и методы». Пробы исследовали с помощью аминированных латексных препаратов, полученных за счет ковалентного связывания специфичных моноклональных и поликлональных антител с учетом ранее подобранных оптимальных условий. По результатам исследования с помощью латексных диагностикумов на основе поликлональных антител, из 500 проб, отрицательных в вирусвыделении на культуре клеток, ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР, 9 проб в РАЛ вызвали агглютинацию на 1-2+. По результатам второго исследования их количество снизилось до 8. Таким образом, учитывая, что положительным результатом считается агглютинация не ниже 2+, то в данном исследовании диагностическая специфичность латексного препарата, синтезированного при оптимальных условиях, составила 98,2 %.

При исследовании 50 положительных образцов, представляющих собой клеточные суспензии, инфицированные вирусом ИНГТ с разными значениями титра накопления вируса, в РАЛ 47 проб были определены как положительные, 2

– сомнительные (1 положительная по результатам повторного исследования) и 1

– отрицательная. По результатам РАЛ, к сомнительной была отнесена проба с титром накопления вируса ИНГТ 3,10 lgТЦД50/см3. Проба, имеющая титр накопления вируса ИНГТ 3,00 lgТЦД50/см3, в РАЛ была определена в качестве отрицательной. Таким образом, учитывая, что положительным результатом считается агглютинация не ниже 2+, то в данном исследовании диагностическая чувствительность аминированного латексного препарата составила 96,0%.

С помощью латексов, сенсибилизированных моноклональными антителами, из 500 образцов, отрицательных по результатам вирусвыделения в культуре клеток, ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР, 4 пробы в РАЛ вызвали агглютинацию на 1-2 креста. Следовательно, по результатам данного исследования, диагностическая специфичность полученной тест-системы составила 99,2%. При тестировании 50 положительных образцов, инфицированных вирусом ИНГТ, в РАЛ 46 образцов были определены в качестве положительных (титр накопления составлял 3,20-5,00 lgТЦД50/см3), 1 проба – сомнительная (3,18 lgТЦД50/см3), 3 (3,00, 3,10, 3,15 lgТЦД50/см3). Следовательно, пробы – отрицательные диагностическая чувствительность латексных препаратов на основе моноклональных антител составила 92%.

Таким образом, для проведения диагностических исследований на ИНГТ надежнее применять высокоспецифичные аминированные латексные препараты, полученные с применением моноклональных антител. Полученные латексные диагностикумы выявляли вирус ИНГТ с титром накопления 3,20 lgТЦД50/см3, имели высокие показатели диагностической чувствительности (92,0%) и специфичности (99,2%). По диагностической чувствительности данный метод приближается к ИФА, но при этом является более дешевым, простым и быстрым в исполнении. Полученные препараты соотвествуют необходимым требованиям по созданию коммерческих наборов для выявления возбудителей болезней и могут быть рекомендованы для использования в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и найти применение в лабораториях рыбоводческих хозяйств РФ с целью проведения скрининговых исследований рыбы на ИНГТ в РАЛ.

На основании полученных результатов были разработаны «Методические рекомендации по выявлению вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых в реакции агглютинации латекса» и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 2).

3.2.4 Разработка метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК Выбор праймеров для ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов. Для выявления вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК как с помощью ОТ-ПЦР, так и в ОТ-ПЦР-РВ, наиболее часто используют системы праймеров, амплифицирующие участки наиболее консервативного гена N [56, 78, 125, 140].

В литературе описаны системы праймеров и зондов для ОТ-ПЦР-РВ, позволяющие выявлять вирусы ИНГТ, ВГС, ВВК [54, 61, 66, 81, 85, 90, 117].

В работе при выборе систем праймеров для ОТ-ПЦР-РВ использовали штамм вируса ИНГТ «Аркус 32/87» и изолят вируса ИНГТ «Воронин 14/08», штамм вируса ВГС «Аланд», штамм вируса ВВК «Яяла». Структуры праймеров и зондов для амплификации фрагментов гена N вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК представлены в таблице 2.

Оптимизация условий проведения реакции. Оптимизация ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов проводилась по следующим параметрам: 1) температурному профилю реакции; 2) временному профилю реакции; 3) концентрации ионов магния. Поиск оптимальных условий для проведения проводили в ООО «Люмэкс-Маркетинг» (г. С.-Петербург).

С помощью программы «AriaDNA GUI» на амплификаторе «АриаDNA»

(ООО «Люмэкс-Маркетинг») задавали определенный режим термоциклирования (отжиг праймеров проводили с градиентом температур от 48 до 64°С с шагом 1С) и исследовали в ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов материал с титром накопления вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК, ИНПЖ 5,0 lg ТЦД50/см3. Результаты исследования представлены в таблице 25 (с отражением данных, полученных при 48, 51, 53, 55, 58, 60, 62, 64С).

Результаты проведенного исследования показывают, что оптимальной температурой отжига праймеров на ген N вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК является 60С. При этом не наблюдалась гибридизация праймеров с участками гена N гетерологичных вирусов.

–  –  –

По результатам исследований, обратную транскрипцию было предложено проводить в течение 20 мин при 37 С. Учитывая, что длина РНК вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК составляет примерно 11000 н.п., перед постановкой ПЦР проводили предварительную денатурацию в течение 2 минут при 94С. На каждом из 45 циклов амплификации для денатурации кДНК вирусов ИНГТ и ВГС достаточным было воздействие 94С в течение 3 секунд, а для отжига праймеров и элонгации - 60С в течение 20 секунд. Для денатурации кДНК вируса ВВК использовали 95С в течение 3 секунд, а для отжига праймеров и элонгации С в течение 24 секунд.

Данные по оптимальной концентрации ионов магния были предоставлены ООО «Люмэкс-Маркетинг» [164]. Проводили поиск оптимальной концентрации хлорида магния, используя смеси для реакции с содержанием MgCl2 1-4 мМ. По результатам исследований ООО «Люмэкс-Маркетинг», оптимальная концентрация хлорида магния составляла 3 мМ, что позволило повысить эффективность связывания праймеров с матрицей ДНК вирусов без потери специфичности.

Оценка специфичности тест-систем для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК методом ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦРчипов. Проводили оценку специфичности разработанных тест-систем для выявления вируса ИНГТ, ВГС, ВВК методом ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов. В качестве положительных контролей использовали геномы РНК вирусов ИНГТ (штамм «Аркус 32/87», депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2011 г.), ВГС (штамм «Аланд», депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2015 г.), ВВК (штамм «Яяла», депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2015 г.) с концентрациями 103 нг/мл. В качестве отрицательных контролей применяли ДНК генома радужной форели и зеркального карпа. Для оценки специфичности использовали вирус ИНПЖ (изолят «S-IPNV/FS12-01»).

Для лунок с положительным контролем должен наблюдаться интенсивный флуоресцентный сигнал, а на экране должны формироваться сигмоидные кривые с выходом на плато к концу реакции. В микрореакторах с отрицательными контролями флуоресцентное свечение не должно превышать пороговых значений. Результаты испытания полученных тест-систем представлены в таблице 27, из которой видно отсутствие положительной реакции с гетерологичным вирусом ИНПЖ в ОТ-ПЦР-РВ, что свидетельствовало о специфичности разработанных тест-систем по отношению к выявляемым вирусам (ИНГТ, ВГС, ВВК).

–  –  –

Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК методом ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических Оценку аналитической чувствительности тест-систем для ПЦР-чипов.

выявления возбудителя болезни методов ОТ-ПЦР-РВ проводят как с учетом этапа выделения вирусной РНК, так и без учета этапа выделения. РНК вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК менее устойчивы к внешним воздействиям, чем соответствующие им кДНК. Кроме того, этап выделения РНК существенно влияет на чувствительность анализа. В связи с этим, выбранный нами способ оценки аналитической чувствительности включает этап выделения РНК вируса ИНГТ, что позволяет наиболее полно характеризовать метод.

Исследовали разведения суспензии клеток ЕРС и RTG-2, содержащие вирусы ИНГТ, ВГС и ВВК с концентрациями 400, 40, 4, 1,75, 1,50, 1,25, 1,0, 0,4 нг РНК вируса/мл и титрами накопления: 4,0, 3,0, 2,0, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,0

–  –  –

Как следует из данных таблицы 28, разработанные тест-системы позволяли выявлять РНК вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК с концентрацией 1,25 нг/мл с титром инфекционной активности 1,5 lgТЦД50/см3 и более. Полученные результаты указывали на возможность применения метода для выявления данных вирусов в пробах патологического материала рыб с низкими значениями титра накопления.

Оценка эффективности амплификации фрагментов гена N вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК в ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦРчипов. Для более полной характеристики метода ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов определяли такой важный параметр реакции, как эффективность амплификации. Значение эффективности амплификации показывает количество полученных копий ДНК фрагмента мишени на единицу матрицы за один цикл ПЦР.

–  –  –

Как следует из данных таблицы 29, разработанные тест-системы характеризовались высокими значениями эффективности реакции амплификации – 98,0 – 99,5%.

Тестирование образцов биоматериала от разных видов лососевых и карповых рыб в ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов С помощью разработанной тест-системы методом ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов в 2014-2015 гг. было исследовано по 500 проб патологического материала от рыб, отрицательных по ИНГТ, ВГС, ВВК на основе данных вирусвыделения, ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР. Также тестировали по 50 образцов биоматериала, инфицированных вирусами ИНГТ, ВГС, ВВК, соответственно. Из них по 5 положительных проб, отобранных на территории РФ в 2004-2014 гг., с титрами накопления 4,0-5,0 lg ТЦД50/см3 и по 45 образцов культурального вируса ИНГТ, ВГС и ВВК с титрами накопления 1,5-2,0 lg ТЦД50/см3. Пробы патматериала от радужной форели, семги, атлантического и каспийского лосося были отобраны из рыбоводческих хозяйств на территории Мурманской, Архангельской, Ленинградской, Псковской, Тверской областей, Республики Карелия и Краснодарского края и исследованы на ИНГТ и ВГС. Пробы патматериала от карпа, белого и зеленого амура, толстолобика были отобраны из рыбоводческих хозяйств на территории Ростовской, Астраханской, Смоленской, Волгоградской, Брянской областей и

–  –  –

Как следует из таблицы 30, в результате исследования 50 инфицированных образцов вирусы ИНГТ, ВГС и ВВК были обнаружены во всех пробах. Таким образом, в данном исследовании диагностическая чувствительность разработанных тест-систем составила 100 %.

Из 500 проб, отрицательных по результатам вирусвыделения, ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР на ВВК, ВГС, в ОТ-ПЦР-РВ по 498 проб были определены в качестве отрицательных, на ИНГТ – 499. Остальные пробы были определены в качестве сомнительных. Следовательно, в данном исследовании диагностическая специфичность разработанных тест-систем составила 99,6-99,8 %.

Таким образом, разработанные тест-системы позволяли одновременно исследовать пробы патологического материала лососевых и карповых рыб на выявление ИНГТ, ВГС, ВВК, имели высокую эффективность амплификации (98,0 – 99,5%), высокие значения аналитической чувствительности (1,5 lgТЦД50/см3) и специфичности, а также диагностической чувствительности (100%) и специфичности (99,6-99,8%). Диагностические чипы удобны в эксплуатации. Для работы достаточно внести пробы в микрореакторы и начать реакцию, что упрощает процедуру анализа. За счет оптимизации режима термоциклирования и совмещения в одном микрореакторе обратной транскрипции и ПЦР время проведения анализа сокращается до 1 часа. Кроме того, данные тест-системы и амплификатор для проведения ОТ-ПЦР-РВ отечественного производства, поэтому они дешевле по сравнению с зарубежными аналогами. Разработанные тест-системы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ», а также могут найти применение в лабораториях рыбоводческих хозяйств нашей страны для проведения скрининговых исследований патологического материала на вирусные болезни рыб с высокой степенью достоверности. Такой подход позволяет своевременно принимать меры по защите здоровой рыбы и, как следствие, снижать экономический ущерб рыбоводческих хозяйств.

На основании полученных результатов были разработаны «Методические рекомендации по выявлению вирусов рыб в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением диагностических ПЦР-чипов» и утверждены заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 3).

3.3 Обсуждение результатов В соответствии с поставленными задачами была предложена методика выделения вируса ИНГТ из патологического материала рыб в чувствительных клеточных линиях RTG-2, EPC и FHM. Разработаны тест-системы на основе РАЛ и ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов, которые предназначены для выявления вируса ИНГТ в биологических материалах.

ИНГТ является высококонтагиозным вирусным заболеванием молоди лососевых рыб, наносящим значительный экономический ущерб рыбозаводам [40, 49, 125]. Диагностику ИНГТ осуществляют на основе комплекса вирусологических, серологических и молекулярно-биологических методов исследования [28, 125], которые в условиях проведения эпизоотологического мониторинга имеют ряд недостатков – значительная трудоемкость при проведении анализа и учете результатов, высокие требования к условиям постановки реакции, наличие дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала. Исходя из этого, актуальной задачей является разработка методов, позволяющих повысить экспрессность и упростить проведение анализа, что даст возможность исследовать пробы патологического материала на ИНГТ как в условиях лаборатории, так и непосредственно в рыбоводных хозяйствах.

Перечисленные проблемы были определены как основные направления настоящих исследований. Подробно рассмотрим использованные методы и полученные нами результаты в сравнении с опубликованными данными других авторов.

Разработка экспресс-методов выявления вируса ИНГТ предполагала необходимость предварительной подготовки культурального антигена. С целью поиска оптимального условий и источника для его получения проводили сравнительный анализ свойств штамма «Аркус 32/87» и изолята «Воронин 14/08» вируса ИНГТ. В работе использовали культуры клеток рыб RTG-2, EPC и FHM, чувствительность которых к вирусу ИНГТ ранее подтверждена исследованиями других авторов [7, 16, 24, 125]. С учетом особенностей культивирования данных клеточных линий [23, 24, 29, 50] в них проводили 15 пассажей вируса ИНГТ. Для исследуемых культур клеток уровень накопления вируса был примерно одинаково высоким, что подтверждалось результатами, полученными ранее при анализе других изолятов вируса ИНГТ [16, 61, 91, 101, 111]. Для наработки культурального антигена решили использовать клеточную линию RTG-2, так как она получена от типичного представителя семейства лососевых, радужной форели, которая восприимчива к вирусу ИНГТ в естественных условиях [53, 63, 67, 77, 78, 79, 89, 137]. В течение 15 последовательных пассажей вируса в культуре клеток RTG-2 титр накопления штамма «Аркус 32/87» увеличивался с 5,02 до 7,35 lg ТЦД50/см3, а полевого изолята «Воронин 14/08» - с 4,87 до 7,24 lg ТЦД50/см3, что свидетельствовало о стабильности их культуральных свойств. Полученные значения находились в диапазоне титров накопления вируса ИНГТ, которые фиксировались при исследовании других его изолятов и были указаны в публикациях [16, 53, 63, 78, 121, 125].

Для разработки диагностических тест-систем важно использовать вирус с высокими значениями титра накопления. Поэтому проводили поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ, оценивая влияние содержания сыворотки крови КРС в составе поддерживающей среды и дозы заражения вируса на его репродукцию в культуре клеток RTG-2.

Наибольщий титр накопления вируса ИНГТ при поражении клеточного монослоя на 90-100% отмечали при дозе заражения вируса 0,01-0,05 ТЦД50/кл. и концентрации сыворотки 1%, что подтверждается литературными данными [9, 16].

Штамм «Аркус 32/87» и изолят «Воронин 14/08» имели примерно одинаково высокие титры накопления вируса в культуре клеток RTG-2. При этом референтный штамм «Аркус 32/87» в большей степени изучен, а также депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», что позволило использовать его в качестве источника для получения специфичного антигена и разработки на его основе диагностических тест-систем.

Учитывая подобранные условия повышения эффективности культивирования вируса ИНГТ, нами была предложена процедура выделения вируса, которая изложена в «Методических рекомендациях по вирусвыделению из патологического материала рыб в культурах клеток», утвержденных директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 1). В них подробно описаны способы выделения вируса в чувствительных клеточных линиях RTG-2, EPC, FHM с одновременным определением титра его инфекционной активности.

Разработка методов РАЛ и ОТ-ПЦР-РВ предполагала необходимость получения очищенного культурального антигена вируса ИНГТ для наработки моноклональных и поликлональных антител, а также для получения контрольных препаратов. Известно, что структурная целостность антигена и отсутствие посторонних белковых примесей могут являться условиями, определяющими получение высокочувствительных и специфичных антител [14, 33, 37]. Исходя из физико-химических характеристик вируса ИНГТ [113, 125], использовали стандартные способы очистки и концентрирования вирусов, не обладающих внешней липопротеидной оболочкой [56, 84, 125, 153].

Идентификацию белков вируса ИНГТ проводили с помощью SDS-ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях. Отсутствие посторонних белков в геле свидетельствовало об относительной чистоте препарата. Полученный антиген был специфичен к антителам против вируса ИНГТ.

РАЛ также предполагала получение моноклональных и поликлональных антител для их иммобилизации на поверхность латексных частиц.

Гипериммунные сыворотки к вирусу ИНГТ получали с использованием очищенного антигена по стандартной методике [37]. Совместно с научными сотрудниками ФГБУН ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва) нами по стандартной схеме [99, 130] проведена гибридизация лимфоцитов из селезенки иммунных мышей с клетками миеломы Sp2/0. Было отобрано 18 стабильных клонов, продуцирующих моноклональные антитела против вируса ИНГТ. Для оценки специфичности выделенных моноклональных антител принято проводить иммуно-блот-анализ и двойной сэндвич-вариант ИФА [51, 62]. Проведенные нами исследования позволили считать, что полученные антитела характеризовались специфичностью по отношению к вирусу ИНГТ. По литературным данным [80], концентрация моноклональных антител в асцитных жидкостях может достигать 20 мг/мл, что позволяет получать препараты очищенных моноклональных антител с высокой концентрацией и активностью. В нашем исследовании для разработки латексных тест-систем, выявляющих вирус ИНГТ, использовали очищенные моноклональные антитела, специфичные к N- и G-белкам с активностью в двойном сэндвич-варианте ИФА 1:192000 и 1:384000, концентрацией 28,1 и 54,6 мг/мл, соответственно.

Одним из экспресс-методов выявления антигена является реакция агглютинации латекса (РАЛ), которая нашла широкое применение в медицине и ветеринарной практике [14, 47, 48, 83, 163]. Согласно литературным данным, разработка РАЛ предполагает поиск оптимальных условий, позволяющих синтезировать латексные препараты высокого качества [32, 47, 118, 119]. С целью получения латексных тест-систем для выявления вируса ИНГТ нами был проведен поиск оптимальных условий для достижения высоких значений степени физической и химической адсорбции антител на поверхности латексных частиц с -COOH, -NH2, -SO4 группами.

Для получения латексных диагностикумов проводят отмывание частиц от раствора сурфактанта, для этого авторы предлагают использовать различные буферные растворы с разными значениями ионной силы и показателем кислотности на основе водорастворимых боратов, гидро- и дигидроортофосфатов, хлоридов, нитратов, сульфатов металлов и т.

д. с добавлением аминокислот [38, 71, 94, 118]. Литературные данные указывают на то, что наибольшая степень адсорбции иммуноглобулинов G достигается в буферном растворе с показателем кислотности, близким к изоэлектрической точки белка [38, 118, 146]. Нами было установлено, что наибольшая степень сенсибилизации латексов антителами к вирусу ИНГТ наблюдалась при использовании глицин-солевого буферного раствора (ГСБР) с рН 7,0 и ионной силой 5 ммоль/л. Удаление рН буферного раствора от изоэлектрической точки приводило к снижению степени адсорбции IgG, так как в этих условиях возрастали силы электростатического отталкивания белковых молекул, что подтверждалось литературными данными, полученными при исследовании других белков [38, 47, 119, 147].



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.