WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX ...»

-- [ Страница 3 ] --

По результатам реакций с гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для штамма Н120, для которого соответствующий средний показатель составил величину lg(1/rs.H120) = 3,500. Указанная оценка была достоверно (p0,01) наибольшей по группе. Также соответствующее штамму Н120 значение lg(1/rv.H120) =5,000 было статистически наибольшим (p0,01) и в другой системе при дифференциации по вирусу.

Таблица 7 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации для SQX*, установленные в реакциях со штаммами VН120, V4/91 и VD274, а также оценки соответствующих показателей односторонней антигенной удаленности (1/rv)

–  –  –

обозначения показателей см. в таблице 2;

* использованы средние оценки из таблице 3;

** выделены средние значения;

*** # в скобках указан статистический оператор Шефе для дифференциации средних значений

–  –  –

Из результатов, представленных в таблице 8, следует, что независимо от типа примененной дифференцирующей системы средние параметры положения оценок lg(1/rs) и lg(1/rv) соответственно изученным штаммам были практически одинаковы. Это обстоятельство позволило считать использованные системы и соответствующие показатели антигенной дифференциации штаммов эквивалентными. Обобщенный результат в виде дендрограммы представлен на рисунке который схематично демонстрирует показатель антигенной 7, удаленности штамма QX от референс-штаммов.

–  –  –

3.4.3 Сравнение антигенных свойств вируса ИБК штаммов QX и L1148 в реакциях с сыворотками к штаммам Н120, 4/91, D27, и QX Исследовали возможность антигенной дифференциации генетически близких штаммов QX и L1148. Использовали методический подход, изложенный в виде алгоритма в таблице 2. Оценивали гетерологичные индексы нейтрализации (lgINhet.s) штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, SD274, и SQX. При постановке реакций в качестве положительного контроля параллельно использовали нормальную сыворотку (S0). Полученные результаты приведены в таблице 9.

Из данных таблицы 9 следует, что все полученные значения lgINhet.s по тесту t=X/mtp0.05 были статистически значимы (lgINhet 0), т.е. во всех реакциях нейтрализующее действие иммунной сыворотки превышало реакцию вируса с нормальной сывороткой. Однако эффективность нейтрализации у исследуемых сывороток имела значительные различия.

Таблица 9 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации (lgINhet.s)* штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, SD27, и SQX

–  –  –

(lgINhet.s.4/91=1,147 и lgINhet.s.D27=1,00), заняли промежуточное положение и между собой существенных различий не имели.

Важно отметить, что приведенные в таблицах 6 и 7 индексы нейтрализации (lgIN.), полученные в реакциях сывороток SН120, S4/91, SD274, и SQX со штаммом QX, и аналогичные показатели, полученные с этими сыворотками со штаммом L1148 (таблица 9), демонстрировали очевидное подобие.

Для проверки этого предположения был проведен анализ соответствия средних параметров положения соответствующих значений lgINhet.s, установленных в реакциях указанных сывороток с отмеченными штаммами. С этой целью была использована ранее описанная процедура ранжирования, вычисления нормированных рангов и средних значений Z. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Таблица 10 - Средние нормированные ранги индексов нейтрализации (lgINhet.s) сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со штаммами QX и L1148

–  –  –

Результаты, представленные в таблице 10, иллюстрируют, что средние параметры положения индексов нейтрализации (lgIN.), полученных в реакциях сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со штаммами QX и L1148, имели высокий уровень совпадения. Следовательно, реакция каждой использованной иммунной сыворотки с указанными штаммами имела близкую количественную характеристику. В биологическом смысле это могло свидетельствовать об подобии антигенных структур данных штаммов.

3.5 Патогенные свойства штамма QX Известно, что вирус ИБК генотипа QX может вызывать разную клиническую картину болезни у кур всех возрастов и направлений продуктивности. При этом клинико-патологоанатомическое проявление болезни у молодняка связано с респираторным и нефрозо-нефритным синдромами, а среди кур-несушек - с репродуктивным синдромом. Учитывая эти данные, опыты по определению степени патогенности штамма QX выполняли на птице разного возраста. С этой целью использовали серонегативных к вирусу ИБК СПФ-цыплят суточного возраста, кур-несушек и петушков 180-суточного возраста.

Эксперимент 1. Было сформировано 2 группы цыплят (20 голов в опытной, 10 голов в контрольной), которых выводили в лабораторных условиях из оплодотворенных яиц СПФ-кур. Цыплят содержали в изолированных боксах с положительным атмосферным давлением. В 5-суточном возрасте цыплят опытной группы интраназально инфицировали вирусом ИБК, штамм QX в дозе 3 lg ЦД50/0,1см3, тогда как цыплят контрольной группы не заражали. Затем проводили клиническое наблюдение за цыплятами и определяли показатели заболеваемости в виде доли заболевших особей от общей численности группы на момент наблюдения (с=a/b, где: а - количество заболевших особей; b - численность группы) Кроме клинических показателей оценивали (рисунок 8).

патологоанатомические показатели болезни. Согласно протоколу опыта через 6 сут после инфицирования 10 цыплят из опытной и 5 цыплят из контрольной группы подвергали эвтаназии. Проводили патологоанатомическое вскрытие и оценивали патологическую картину болезни, определяли активность реснитчатого эпителия трахеи (CS-показатель). За остальными цыплятами наблюдали еще 2 недели, после чего также оценивали патологическую картину болезни.

Диаграмма на рисунке 8 иллюстрирует, что в течение заданного периода наблюдений распределение оценок заболеваемости в контрольной и опытной группах имели выраженные отличия. У цыплят опытной группы первые клинические симптомы ИБК регистрировались спустя 72 ч после инфицирования, и в дальнейшем количество больных птиц возрастало и достигало максимума через 6 сут. Клинические признаки в основном характеризовались депрессией, серозными истечениями из носовых отверстий и признаками диспноэ.

Наблюдалась связь между интенсивностью показателя заболеваемости и полным цилиостазом у цыплят, подвергшихся диагностическому убою через 6 сут после инфицирования (данные не представлены).

–  –  –

ОПЫТ

КОНТРОЛЬ

0,6 0,4 0,2

–  –  –

Особое внимание заслуживает анализ результатов патологоанатомического вскрытия инфицированных птиц. Основные признаки болезни через 6 сут после инфицирования штаммом QX наблюдали со стороны респираторных органов и почек. При этом изменения были следующими: наличие серозно-слизистого экссудата в носовой полости и в трахее, отек легких, увеличение размеров и отёк почек; почки имели пестрый рисунок вследствие скопления в канальцах уратов, иногда до 0,5 см в диаметре (рисунок 9). Проведенные исследования показали, что вирус ИБК, штамм QX характеризуется умеренной вирулентностью для СПФцыплят и вызывает у них развитие респираторного и нефрозо-нефритного синдрома.

Рисунок 9. Почки СПФ-цыплят через 6 сут после инфицированния вирусом ИБК штамм QX Эксперимент 2.

Необходимость проведения экспериментов по изучению патогенных свойств вируса ИБК штамм QX для кур-несушек обоснована тем, что вирус ИБК является одной из главных причин снижения яичной продуктивности, а изоляты вируса генотипа QX в некоторых местах были причиной появления «ложных несушек» и развития патологии яйцеводов, сопровождающейся характерным клиническим признаком «поза пингвина».

Кур-несушек 180-суточного возраста в количестве 7 голов инфицировали вирусом ИБК штамм QX в дозе 4 lg ЦД50/см3/гол окулярно-назальным методом.

Пять несушек такого же возраста оставили интакными для контроля. Птиц помещали в отдельные боксы и далее содержали в одинаковых условиях. В контрольной и опытной группах еженедельно в течение месяца вычисляли процент яйценоскости до инфицирования и в течение месяца после инфицирования. Таким образом судили о влиянии вируса на уровень яйценоскости. Процент яйценоскости до и после инфицирования приведён на рисунке 10.

–  –  –

Представленный на рисунке 10 график иллюстрирует, что яйценоскость кур до заражения составляла в среднем в пределах 75-77%. У кур опытной группы после введения штамма QX яйценоскость снизилась и находилась на уровне 71%.

Это снижение считали существенным.

Кроме того, по результатам патологоанатомического вскрытия, проведённого после завершения эксперимента у двух голов в опытной группе, выявляли атрофию яичников без явных признаков их функционирования.

Таким образом, было показано, что вирус ИБК штамм QX имеет тропность к репродуктивным органам кур-несушек и может вызывать у них снижение продуктивности.

Эксперимент 3. Поражение органов размножения петушков вирусом ИБК обусловлено репликацией вируса в придатках семенника, которые выстилает мерцательный эпителий. Проведение экспериментов было обусловлено данными о том, что вирус ИБК может вызывать эпидидимит и образование камней в придатках.

Из петушков возраста сформировали опытную и 180-суточного контрольную группы, которые содержали в отдельных боксах. Опытную группу петушков (7 голов) инфицировали вирусом ИБК, штамм QX в дозе 4lg ЦД50/см3/гол интраназальным методом. Цыплят контрольной группы оставили интактными (5 голов). Условия содержания и кормления цыплят в обеих группах в течение всего опыта были идентичны. Ежедневно за птицами вели клиническое наблюдение. Через 10 недель после инфицирования петушков подвергали эвтаназии и провели патологоанатомическое вскрытие.

У инфицированных петушков первые признаки ИБК появились через 5 дней после введения вируса и характеризовались непродолжительным чиханием.

Данные респираторные признаки уже не отмечали через 10 сут после заражения.

Далее в течение всего времени эксперимента клинический статус опытных птиц не отличался от контрольных.

Патологоанатомическое вскрытие продемонстрировало значительные изменения в морфологии семенников у инфицированных петушков. Так, 5 из 7 петушков имели относительно небольшие размеры семенника, тогда как у петушков в контрольной группе они были значительно больше. Кроме того, у 4 из 7 инфицированных петушков обнаруживали в придатках камни размером примерно 0,1-0,5 мм (рисунок 11).

Рисунок 11. Морфология семенников с придатками у петушков, инфицированных вирусом ИБК (контрольная (А) и опытная (В) группы) Таким образом, можно сделать заключение, что вирус ИБК штамм QX имеет широкий тканевой тропизм и может вызывать различную патологию у цыплят, а также у взрослых птиц.

3.6 Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки результативности вакцинации (протективного действия вакцины) Развитие инфекционного процесса, обусловленного вирусом ИБК, не всегда может сопровождаться выраженной клинической картиной.

Это обстоятельство затрудняет диагностику заболевания птиц в производственных условиях и существенно снижает достоверность получаемых результатов при проведении научных исследований, связанных с необходимостью клинических наблюдений болезни. Данная проблема становится особенно важной при выполнении экспериментов, целью которых является оценка напряженности поствакцинального иммунитета.

В этой связи считали целесообразным исследовать возможность использования методов, позволяющих определить наличие инфекционного процесса в организме птицы при отсутствии клинической картины болезни на макроуровне.

Учитывая специфику патогенеза инфекционного бронхита кур, при изучении развития возбудителя в организме птицы наиболее вероятной областью для обнаружения вируса приняли трахею и почки. Указанные органы являются наиболее важными мишенями при "вирусной атаке" организма. В качестве методов, объективно отражающих присутствие вируса, приняли тест на цилиостаз (ЦС) и полимеразную-цепную реакцию в варианте реального времени (ОТ-ПЦРРВ).

План эксперимента предполагал введение гомо- и гетерологичного штамма вируса в организм иммунизированных и интактных птиц и последующее сравнение ЦС-показателей, отражающих вирусиндуцированные поражения реснитчатого эпителия трахеи, и данных ПЦР, отражающих концентрацию генетического материала возбудителя в тканях органов-мишеней.

Из цыплят, в возрасте 1 сут, выведенных из СПФ-яиц, образовали четыре группы (№ 1, 2, 3, 4) по 25 голов. Группы содержались в изолированных боксах, исключающих горизонтальную передачу вируса. В каждой группе цыплят пронумеровали (использовали номерные ножные кольца-клипсы). От цыплят выборочно отбирали пробы сыворотки крови.

В первые сутки группы 1 и 3 были привиты коммерческой вакциной против ИБК из штамма Н120. Вакцина в виде суспензии была введена интраназально в дозе 4 lgЭИД50 в объеме 0,1 см. Группы 2 и 4 не прививали (контрольные группы).

Через 21 сут после прививки цыплятам в группах 1 и 2 ввели вирус ИБК штамм QX. Вируссодержащий материал в виде суспензии на ФБР был введен интраназально в дозе 3 lgЭИД50 в объеме 0,1 см. Аналогичным образом цыплятам в группах 3 и 4 ввели вирус ИБК штамм H120. Перед прививками в группах 1 и 3 выборочно были взяты пробы сывороток крови. Результат серологических исследований представлены в таблице 11.

Из данных таблицы 11 следует, что до начала эксперимента СПФ-цыплята были серонегативны к вирусу ИБК. На 21 сутки после вакцинации, проведенной в группах 1 и 3, птица продемонстрировала гуморальный иммунный ответ. Средняя величина тира антител в ИФА составила 1:1096, что соответствует средним титрам антител, получаемых после применения живых вакцин против ИБК.

Через 6 сут. после введения штамма QX и повторной прививки штаммом Н120 птиц, имеющих в группах одинаковые номера, подвергли эвтаназии и произвели препарирование трахеи и почек.

Для исследования трахеи был определен участок органа длиной 8 12 мм в проксимальном направлении от бифуркации. От каждой группы по 20 отпрепарированных образцов было исследовано в ОТ-ПЦР-РВ. Одновременно определяли активность ресничек мерцательного эпителия трахеи (CS показатель).

Для исследования ткани почек от органа (в произвольном месте) отделяли участок массой 0,5 0,7 г. От каждой группы в ОТ-ПЦР-РВ было исследовано по 20 препарированных образцов.

–  –  –

* Представлены стандартные бланки результатов исследования титров сывороточных антител в лаборатории эпизоотологии и мониторинга "ВНИИЗЖ". Исполнитель: ведущий биолог А.С.Соркина Тест на цилиостаз. За основу была принята методика определения цилиларной активности эпителия трахеи птиц, изложенная в сообщении О.А.

Чупиной [8]. Для оценки состояния эпителиальных ресничек в образце одной трахеи в точках, равноудаленных от краев препарата, готовили не менее 4 кольцевых срезов толщиной около 1 мм. Срезы от каждого образца трахеи помешали в лунки пластиковых панелей в среде ПСС и исследовали в инвертированном оптическом микроскопе.

Индикацию инфекционного действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза. Оценкой масштаба цилиостаза единичной пробы (сs) считали долю неподвижных (или десквамированных) ресничек, наблюдаемую в горизонтальной проекции на окружности (периметре) внутренней поверхности среза трахеи. Использовали следующие оценки: 0 - цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00-охват более 3/4 периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце трахеи (CS) являлось среднее значение из n-числа единичных оценок (CS=cs/n).

В соответствии с назначенными номерами птиц в изученных группах определяли Кроме этого, соответственно штаммам, CS-показатели.

использованным для вторичной прививки, между параллельно установленными значениями CS в контрольной и в опытных группах вычисляли оценки контраста (dQX и dH120), которые характеризовали относительную "агрессивность" вируса для вакцинированных птиц. Полученные результаты приведены в таблице 12.

Из данных, представленных в таблице следует, что оценки 12, цилиостатических эффектов были значимы во всех исследованных группах птиц.

Это указывало, что во всех случаях воздействие вируса отражалось на состоянии реснитчатого эпителия трахеи. Однако установленные средние значения ('x) были неодинаковы. Например, показатель 'CS2= 0,77±0,06, характеризующий результат инфекции штамма QX для интактных (контрольных) птиц, существенно превосходил (p0,001) аналогичный показатель 'CS4, установленный для штамма Н120. На этом основании допустимо считать, что штамм QX в большей степени влиял на состояние чувствительных клеток.

–  –  –

в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм, * которым проводили вторую прививку;

приведены среднее значение и их стандартные ошибки ** Далее следует отметить существенное превышение цилиостатического эффекта (p0,002), обусловленного штаммом QX при использовании его на привитых птицах ('CS1=0,36±0,07) по отношению к штамму Н120 (CS3=0,10±0,03).

Это позволяет считать, что вирус штамма QX на иммунном фоне обладал относительно большей инвазивностью.

Сопоставление оценок 'dQX=0,41±0,03 и 'dH120=0,16±0,06, характеризующих относительный эффект цилиостатического воздействия вируса с учетом контрольной оценки, также показало превосходство штамма QX (p0,001).

Полимеразно-цепная реакция Предназначенные для (ОТ-ПЦР-РВ).

исследований пробы биоматериалов содержали в криопробирках при минус 70°С.

Нуклеиновую кислоту выделяли на роботизированной станции Tecan Freedom EVO-100 из 100 мкл образца суспензии с помощью набора «Magna DNA Prep 100»

(ООО БиоКом, г. Москва).

При постановке ОТ-ПЦР-РВ использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, выбранных для амплификации фрагмента нетранслируемой области генома вируса (UTR) согласно методическим указаниям [12]. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации.

Оценочным показателем реакции приняли номер цикла, при котором достигался пороговый уровень флюоресценции продуктов амплификации (Ct пороговый цикл). В соответствии с условиями выполнения теста установленное значение Ct находилось в обратной зависимости от концентрации исходного генетического материала вируса. При проведении исследований реакцию считали отрицательной (геном вируса не определяется), если Ct41.

Результаты, полученные в ОТ-ПЦР-РВ при исследовании образцов трахеи, представлены в таблице 13.

Приведенные данные позволяют считать, что во всех позициях анализа наличие и концентрация вирусного генома могли быть достоверно установлены.

Все средние оценки 'Ct являются статистически значимыми.

–  –  –

в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм, * которым проводили вторую прививку;

приведены средние значения и их стандартные ошибки ** Далее было установлено, что средние показатели 'Ct2=23,2±1,13 и 'Ct4=24,90 ±1,38 оказались статистически равным. Это, в свою очередь, указывало на одинаковое по величине количество вируса обоих штаммов, который находился в тестируемых образцах. Следовательно, интенсивность репродукции обоих штаммов в трахее интактной птицы была приближенно одинаковой.

Достоверные различия в пользу штамма QX (p0,02) были отмечены при сопоставлении показателей, характеризующих развитие возбудителя при введении его в организм привитых птиц 'Ct1=29,86±1,41 и 'Ct3=34,88±1,29. На этом основании возникает предположение, что у птиц, привитых штаммом Н120, вариант QX имел более эффективное воспроизводство, чем гомологичный вирус при повторном введении. На такую возможность также указывает и меньшая по величине и средняя оценка контраста 'QX =6,62±1,88 в сравнении с аналогичным показателем Однако при данных условиях проведения 'H120=10±1,52.

эксперимента это положение статистически не подтвердилось.

На основании полученных средних значений 'Ct в диапазоне 10'Ct35, в исследуемых образцах ткани трахеи вычисляли ожидаемую величину инфекционного титра вируса ИБК (“lgT). Для соответствующих расчетов использовали ранее опубликованную формулу [5]:

lg"T=(-0,2648)Ct + 9,3919 [4].

Установили, что у обоих штаммов прогнозируемое накопление вируса в трахее интактных птиц было приближенно равным. В границах ошибки измерений соответствующие величины составили от 2,8 до 3,6 (lgЭИД50/0,1 см).

При этом на иммунном фоне ожидаемый инфекционный титр для штамма QX составил приблизительно 1,5 lgЭИД50/0,1 см, тогда как для штамма Н120 средняя прогнозируемая оценка титра имела величину не более 0,16 lgЭИД50/0,1 см.

На этом основании допустимо сделать заключение, что влияние иммунной реакции птицы на развитие вируса штамма QX было менее выражено, чем на репродукцию штамма Н120, и коэффициент указанного соотношения составил величину1,34 lgЭИД50/0,1 см (соответствующие значения титров различались в 22 раза).

Изучение накопления генома вируса ИБК штаммов QX и Н120 в образцах ткани почек проводили в соответствии с ранее изложенной методикой и порядке, аналогичном исследованию ткани трахеи. Полученные результаты приведены в таблице 14.

Таблица 14 - Количество циклов амплификации (Ct) и результаты их сравнений в виде оценок контраста (Ct), установленные в почках соответственно использованным штаммам и порядку их применения

–  –  –

в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм, * которым проводили вторую прививку;

приведены средние значения и их стандартные ошибки ** Результаты, представленные в таблице 14, демонстрируют, что все средние оценки ('Ct), характеризующие накопления генома вируса ИБК, являются значимыми, пригодны для анализа и позволяют сделать следующие заключения.

Количество генетического материала штамма QX существенно превышало аналогичный показатель, установленный для штамма Н120 как у интактных [('Ct2 =25,14±1,77) ('Ct4=31,45±1,17)]p0,005, так и у привитых птиц [('Ct1 =28,89±1,50) 'Ct3=36,33±0,84)]p0,001. На основании приведенных оценок прогнозируемый средний титр инфекционного вируса составил 2,74 lgЭИД50/0,1 см и 1,06 lgЭИД50/0,1 см, в порядке упоминания штаммов, у интактных птиц, а так же 1,74 lgЭИД50/0,1 см и 0,23 lgЭИД50/0,1 см, в том же порядке, у иммунных птиц.

Таким образом, на невакцинированной птице эффективность воспроизводства штамма QX превосходила аналогичную оценку штамма Н120 в 48 раз, а на иммунном поголовье - в 32 раза.

Полученная для штамма QX оценка среднего контраста 'QX= 3,75±2,55 при данных условиях эксперимента была статистически незначима. В биологическом смысле это означало, что влияние иммунизации для репродукции вируса было несущественным. При этом развитие вируса штамма Н120 значимо зависело от наличия иммунитета у подопытной птицы [('H120/m =4,88/1,12= t p0,001 =3,65].

3.7 Обсуждение результатов исследования Несмотря на высокие достижения науки проблемы профилактики ИБК до конца не решены. Это подтверждается данными лабораторных исследований и часто возникающими вопросами со стороны ветеринарных специалистов птицехозяйств о мерах борьбы с ИБК. В дополнение к этому не может быть не отмечено наличие многочисленных публикаций ученых, касающихся ИБК, число которых за последнее время по данным PubMed увеличивается. Глобальность проблемы ИБК можно отметить также тем, что ежегодно, уже тринадцатый раз подряд, организуется Всемирный конгресс по проблемам коронаметапневмовирусов птиц.

В доступных научных публикациях анализу эпизоотической ситуации, или, точнее, аналитической эпизоотологии ИБК посвящено мало работ. Особенно это было характерно для первоначального периода изучения болезни в 1940-1980 гг.

Скорее всего это было связано с отсутствием достаточных данных о болезни и ее природе и, наконец, с экономическим интересом стран-импортеров продуктов птицеводческой промышленности. Сейчас с помощью современных методов молекулярной диагностики стало возможным изучать молекулярные основы и механизмы развития эпизоотического процесса и проводить филогенетический анализ.

Анализ эпизоотической ситуации по ИБК, связанный с вирусом генотипа QX, свидетельствует, что впервые вирус с отличительной генетической характеристикой появился в конце 1990-х гг. в КНР. При этом болезнь проявлялась не типичным для ИБК симптомом - провентрикулитом. В начале 2000-х гг. генетические родственные вирусы ИБК выделяли на Дальнем Востоке и в некоторых странах Европы. В настоящее время генотип QX является эндемичным в некоторых регионах мира.

На территории России вирус ИБК, относящиеся к генотипу QX, были выявлены на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [14], затем и в Европейской части РФ. В качестве главных факторов такого быстрого распространения вируса ИБК генотипа QX учёные выделяют такие, как тесные экономические связи между странами и перенос вируса дикими и синантропными птицами [4, 96, 170].

За последние три года выявление изолятов вируса ИБК генотипа QX на территории РФ значительно сократилось, а в 2014 г. их вовсе не было выявлено.

Одним из факторов снижения частоты выявления генотипа QX в России можно объяснить изменением стратегии вакцинопрофилактики, суть которой состоит в применением живых вакцин из разных серотипов. Эффективность такой стратегии вакцинации была доказана в отношении изолятов вируса ИБК генотипа QX, выполненных C. Terregino et al., 2008 [146].

Проведение научно-исследовательских работ по изучению иммунобиологических свойств вирусов требует стандартизации вируссодержащего материала, используемого для проведения исследований, главным образом по гомогенности вирусной популяции, по отсутствию контаминации посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмаим, а также по показателю инфекционной активности.

Поэтому изучение условий культивирования вируса в КЭ и получение необходимого объема специфичного и высокоактивного вирусного материала для иммунологических исследований стало нашей первой задачей.

Методика культивирования вакцинных штаммов вируса ИБК отработана производителями вирусвакцин, кроме того, имеются данные по динамике накопления вируса ИБК штамма Н120 в КЭ на основе количественной ПЦР [7].

Условия культивирования в КЭ нового вируса из генотипа QX не отработаны, и они могут отличаться.

Для культивирования вируса QX использовали 9-11 суточные эмбрионы СПФ-кур. Инфицирование проводили в полость аллантоиса и на ХАО. Через заданный интервал времени отбирали пробы ХАО и ЭЭЖ и определяли в них концентрацию вируса.

Таким образом, на основании проведенных опытов можно сделать заключение о том,.

По результатам опытов было установлено, что штамм при QX инфицировании СПФ-эмбрионов кур в аллантоисную полость в период 3654 ч культивирования способен был накапливаться в экстраэмбриональной жидкости в титре 4,2±0,2 lgЦД50/1 см3. При этом, в ткани ХАО «урожай» вируса был на порядок ниже. Схожие результаты в отношение штамма Н120 были получены С.В Фроловым и другими [16, 21].

Наряду с культивированием вируса ИБК штамм QX в КЭ была исследовано возможность его адаптации к различным культурам клеток. Выявление спектра чувствительных клеток естественного хозяина и других линий перевиваемых культур являлось основной задачей в исследованиях. Имеются сообщения, что вирус ИБК можно адаптировать к культурам клеток ПЭК и Vero [35, 179]. В наших опытах по адаптации вируса к культурам клеток испытывали влияние трипсина на репродуктивную способность вируса. В экспериментах было показано, что добавление трипсина в дозе 1 мг на 100 мл питательной среды стимулирует размножение вируса в культурах клеток. В результате проведенной работы на этапе исследований "адаптации" вируса ИБК штамм QX было установлено, что вирус ИБК при стимулирующем действии трипсина может быть адаптирован к культурам клеток ФЭК, ПЭК и RBT. Таким образом, нам удалось получить несколько культурально-адаптированных популяций вируса ИБК.

Аналогичные выводы по культивированию вируса ИБК в культурах клеток сделала L. Helena et al. [120].

Далее исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к культуре клеток RBT. Полученные результаты свидетельствовали, что вирус седьмого пассажа на культуре клеток RBT активно реагировал в РН с сывороткой, имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е был нейтрализован специфической сывороткой.

Антигенную чистоту вирусной расплодки подтверждали серологическими методами, при этом исключали присутствие контаминантов, которые могли бы индуцировать антитела у цыплят. С этой целью получали гипериммунные сыворотки от СПФ-цыплят.

Полученную сыворотку исследовали в ИФА и в РТГА с использованием стандартных диагностических наборов для определения антител против вирусов ИБК, ИББ, РЕО, ИЛТ, ИЭП, ССЯ-76, метапневмовируса и M.gallisepticum. Было установлено, что антитела против перечисленных вирусов, а также микоплазм, в сыворотке, полученной на вирус ИБК штамм QX, не регистрировались.

Следовательно, предназначенные для экспериментов расплодки вируса ИБК штамм QX контаминантов не содержали.

Вирусы ИБК генотипа QX являются относительно «новыми», недавно появившимися, в настоящее время широко распространёнными в птицеводстве во многих частях мира. вируса ИБК штамм QX был отнесён к генотипу QX на основании генетической структуры, однако другие его свойства были мало исследованы. Таким образом, изучение основных иммунобиологических свойств данного вируса стало предметом следующих исследований.

Задачей следующего этапа работы являлось определение количественных показателей, характеризующих антигенную близость штамма QX по отношению к другим референс-штаммам вируса ИБК, относящимся к разным генетическим группам. В работу были включены штаммы Н120, 4/91, D274 и штамм L1148. В серологических экспериментах по антигенной дифференциации использовали реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации сыворотки и переменных доз вируса (-вариант).

Для стандартизации реакции на первом этапе определяли нейтрализующую активность гомологичных сывороток. Испытывали разные концентрации сывороток. Было показано, что наименьшая концентрация антисывороток, при которой в гомологичных реакциях происходила статистически полная нейтрализация инфекционного вируса всех изучаемых штаммов, соответствует 5%. Указанная величина была принята для проведения всех гетерологичных реакций.

Второй этап экспериментов включал в себя проведение реакции перекрестной нейтрализации, где определяли гомо- и гетерологичные индексы нейтрализации. Оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке lg(1/rs) или по вирусу lg(1/rv)) считали соотношение гомо- и гереологичных индексов нейтрализации (оценка обратная стандартной величине "r", характеризующей антигенную близость или По результатам реакций с "родственность").

гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для штамма Н120, для которого соответствующий средний показатель составил величину lg(1/rs.H120) = 3,500. Также соответствующее штамму Н120 значение lg(1/rv.H120) = 5,000 было статистически наибольшим (p0,01) и в другой системе при дифференциации по вирусу.

Варианты 4/91 и D274 в обеих системах демонстрировали несколько меньшую удаленность от штамма QX. При этом средние оценки lg(1/rs.4/91)=2,687 и а также и были lg(1/rs.D274)=2,942, lg(1/rv4/91)=3,583 lg(1/rv.D274)=4,193 статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости указанных вариантов вируса ИБК к штамму QX была приближенно одинаковой.

Важно отметить, что порядок расположения штаммов по степени удаленности в обеих системах был подобен. Различия использованных систем состояли лишь в масштабах полученных оценок 1/rs и 1/rv. Это указывало на эквивалентность реакций, происходящих в различных системах. Вероятно, что как антитела, так и вирусный антиген в гетерологичных системах реагировали подобным образом.

Далее исследовали возможность антигенной дифференциации генетически близких штаммов и Оценивали гетерологичные индексы QX L1148.

нейтрализации (lgINhet.s) штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, SD274, и SQX. При постановке реакций в качестве положительного контроля параллельно использовали нормальную сыворотку (S0). Полученные результаты продемонстрировали, что средние параметры положения индексов нейтрализации (lgIN.), полученных в реакциях сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со штаммами QX и L1148, имели высокий уровень совпадения. Следовательно, реакция каждой использованной иммунной сыворотки с указанными штаммами имела близкую количественную характеристику. В биологическом смысле это могло свидетельствовать об подобии антигенных структур данных штаммов.

Для изучения патогенных свойств вируса ИБК штамм QX был проведен острый опыт на СПФ-цыплятах и взрослой птице. По результатам клинических наблюдений, патологоантомического вскрытия и теста на цилиарную активность было устновлено, что штамм имеет широкий тропизм и поражет многие органы и ткани. Изучаемый штамм патогенен для СПФ-цыплят, вызывая поражение респираторных органов и почек. Он также патогенен и для врослой птицы, вызывая поражение органов репродуктивной системы у несушек и петушков.

На заключительном этапе исследований изучали эффективность вакцинации в отношении изучаемого вируса. Оценка напряженности иммунитета при ИБК является непростой задачей и выполняется комплексно. В качестве методов, позволяющих определить наличие инфекционного процесса после повторного введения вируса в организм птицы, использовали тест на цилиостаз и ПЦР. Многие авторы, в том числе и О.А. Чупина [8], отмечали изменение активности мерцательного эпителия трахеи в результате введения вируса ИБК [55, 62, 72].

На основании анализа показателей цилиостаза на интактных (контрольных) птицах было показано, что штамм QX обладает большей «агрессивностью» для эпителиальных клеток респираторного тракта по сравнению со штаммом Н120 и в большей степени влиял на состояние чувствительных клеток. Также было установлено, что вакцинация гетерологичным штаммом (Н120) не оказывала существенного влияния на репликацию вируса в эпителиальных клетках респираторного тракта.

J.K. Cook et al. [62] также установили низкую эффективность вакцинации гетерологичным вирусом в отношении QX – подобного штамма. Основываясь на показателе цилиостаза, они пришли к выводу, что эффективность вакцинации составляла не более 55%.

Использование молекулярно-биологических способов для оценки иммунитета является перспективным подходом. В соответствии с условиями ОТПЦР-РВ значение Ct (цикл амплификации) находится в обратной зависимости от концентрации исходного генетического материала вируса, что и позволило нам оценить накопление вирусного генома в органах иммунных и неиммунных цыплят. Установили, что у обоих штаммов прогнозируемое накопление вируса в трахее интактных птиц было приближенно равным. В границах ошибки измерений соответствующие величины составили от 2,8 до 3,6 lgЭИД50/0,1 см.

При этом на иммунном фоне ожидаемый инфекционный титр для штамма QX составил приближенно 1,5 lgЭИД50/0,1 см, тогда как для штамма Н120 средняя прогнозируемая оценка титра имела величину не более 0,16 lgЭИД50/0,1 см.

На этом основании сделали заключение, что влияние иммунной реакции птицы на развитие вируса штамма QX было менее выражено, чем на репродукцию штамма Н120, и коэффициент указанного соотношения составил величину 1,34 lgЭИД50/0,1 см.

Однако накопление вирусного генома в тканях почек иммунных и неиммунных цыплят имело особенности. Количество генетического материала вируса штамма существенно превышало аналогичный показатель, QX установленный для штамма Н120 как у интактных [('Ct2 =25,14±1,77) так и у привитых птиц ('Ct4=31,45±1,17)]p0,005, [('Ct1 =28,89±1,50) 'Ct3=36,33±0,84)]p0,001. На основании приведенных оценок прогнозируемый средний титр инфекционного вируса составил 2,74 и 1,06 lgЭИД50/0,1 см, в порядке упоминания штаммов, у интактных птиц, а так же 1,74 и 0,23 lgЭИД50/0,1 см, в том же порядке, у иммунных птиц.

Таким образом, на невакцинированной птице эффективность воспроизводства штамма QX превосходила аналогичную оценку штамма Н120.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что однократное применение вакцины против ИБК штамм Н120 не обеспечивает полную защиту от контрольного заражения штаммом QX, что сопровождалось выраженным накоплением вирусного генома в почках иммунных цыплят.

88

5 ВЫВОДЫ

1. Согласно данным эпизоотологического обследования и лабораторных исследований вирус инфекционного бронхита кур нового для РФ генотипа QX имеет широкое распространение во многих странах Евразии и в период 2005-2014 гг. регулярно регистрируется на территории страны.

2. К вирусу инфекционного бронхита кур генотипа QX чувствительны 9-11 суточные куриные эмбрионы категории СПФ с развитием специфических эмбриопатических изменений. Эта система может быть использована для культивирования вируса.

3. Репродукция вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX в культурах фибробластов, клеток почек куриных эмбрионов (ФЭК и ПЭК), перевиваемых клетках почки теленка (RBT) активируется в присутствии трипсина. Это условие может быть использовано для адаптации вируса к клеточным культурам.

4. Вирус генотипа по результатам серологических исследований и QX статистической интерпретации имеет существенные (математической) антигенные отличия от референсных штаммов вируса инфекционного бронхита кур Н120, 4/91, D274, выражающиеся в неполной перекрестной нейтрализации инфекционности с индексами от 2,9 lgЦД50/см до 3,5 1 lgЦД50/см.

5. К вирусу генотипа QX, выделенному на территории РФ, восприимчивы куры различного возраста. Патогенные свойства характеризуются преимущественным поражением почек у цыплят и репродуктивным синдромом у взрослой птицы.

6. По данным количественной ПЦР коммерческая вакцина против инфекционного бронхита кур на основе штамма Н120 не обладает достаточной протективной способностью в отношении вируса генотипа предупреждая у QX, вакцинированных цыплят только респираторную инфекцию, но не вирусную репродукцию в тканях почек.

89

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки антигенного родства штаммов вируса ИБК рекомендуется использовать разработанный алгоритм:

§ исследование гомологичной нейтрализующей активности иммунных сывороток с целью определения концентрации антисывороток в вариант реакции нейтрализации;

§ определение гетерологичного индекса нейтрализации по сыворотке (при титровании тест-штамма с гетерологичными иммунными сыворотками) и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с гетерологичными штаммами вируса);

§ Оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по вирусу) считать соотношение гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, установленное в виде доли инфекционного вируса, который не был нейтрализован в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной величине характеризующей антигенную близость или "r", "родственность").

2. Для оценки степени защиты птиц против инфекционного бронхита после вакцинации рекомендуется комплексный подход, включающий регистрацию изменений в респираторных органах (цилиостаз) и репродукцию вирулентного вируса методом ПЦР.

3. Для научно-исследовательских и практических целей предлагаются комиссионно испытанные, одобренные Ученым советом и утвержденные заместителем директора ФГБУ следующие нормативноВНИИЗЖ»

методические документы:

§ Методические рекомендации по культивированию и титрованию вируса инфекционного бронхита кур в перевиваемой культуре клеток RBT (приложение 1);

§ Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу инфекционного бронхита кур в реакции нейтрализации в культуре клеток RBT (приложение 2);

§ Методические рекомендации по получению гипериммунных сывороток птиц к вирусу инфекционного бронхита кур (приложение 3).

Список сокращений и условных обозначений:

ВСМ – вируссодержащий материал ИБК – инфекционный бронхит кур ИН – индекс нейтрализации ИФА – иммуноферментный анализ МАТ – материнские антитела НД50 - 50% нейтрализующее действие сыворотки ПСП – питательная среда полусинтетическая ПСС – питательная среда синтетическая ПЦР – полимеразная цепная реакция РГА – реакция гемагглютинации РДП – реакция диффузной преципитации РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы РН – реакция нейтрализации РНК – рибонуклеиновая кислота РТГА – реакция торможения гемагглютинации СПФ – свободный от патогенных факторов ТОК – трахеальная органная культура ФБР – фосфатно-буферный раствор ХАО – хориоаллантоисная оболочка ЦА – цилиарная активность ЦД50 – 50% цилиостатическая доза (доза вируса, вызывающая цилиостаз в 50% инфицированных трахеальных колец) ЦПД – цитопатическое действие ЭИД50 – 50% эмбриональная инфицирующая доза ЭЭЖ – экстраэмбриональная жидкость 92

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балашов, В. В. Влияние препарата ветостим на некоторые гематологические показатели и иммунный статус цыплят-бройлеров при профилактике болезни Ньюкасла и инфекционного бронхита кур / В. В. Балашов, В. И. Плешакова // Ученые записки Казанской гос. акад. вет. медицины. – 2013. – Т. 214. – С. 77– 82.

2. Борисов, А. В. Инфекционный бронхит кур: особенности эпизоотологии и профилактики / А. В. Борисов, В. В. Борисов // Farm Animals. – 2014. – № 1. – С. 72–74.

3. Борисов, А.В. Инфекционный бронхит кур, современная ситуация и меры борьбы, влияние вариантных штаммов на продуктивность кур / А.В. Борисов // 8-й Международный ветеринарный конгресс по птицеводству, г. Москва, 19-22 апр. 2012 г. (2-й Международный ветеринарный конгресс, г. Москва, 19-23 апр. 2012 г.). - М., 2012. - С. 53-57.

4. Бочков, Ю.А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России:

дис...канд. биол. наук / Бочков Юрий Александрович. – Владимир, 1999. -126 с.

5. Дандал, А. Ш. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса инфекционного бронхита кур / А.Ш. Дандал, Х.С. Абдуллоев // Ветеринарная практика. - 2013. - № 3. - С. 28-32.

6. Джавадов, Э. Д. Диагностика и профилактика новых инфекционных болезней птиц / Э. Д. Джавадов // Farm Animals. – 2013. – № 2. – С. 69–75.

7. Закс, Л. Статистическое оценивание / Л. Закс. – М.: Статистика, 1976. – 598 с.

8. Изучение антигенного родства изолята «Калужский» к различным серотипам вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, С.В.Фролов, Г.В Батченко [и др.] // Ученые зап. УО ВГАВМ. 2005. – Т. 41, вып. 2, ч. 1, - С. 56Иммуногистохимический метод выявления штамма М41 вируса инфекционного бронхита кур в железистой части желудка и нервной системе экспериментально заражённых куриных эмбрионов / А.С. Абдель-Монейм, П.

Злотовски, Дж. Вейтс [и др.] // Рос. вет. журн. С.-х. животные. - 2009. - № 2. C. 34-37.

10. Каспарьянц, С. А. Профилактика инфекционного бронхита кур вакциной «Пулвак IB Праймер» на одной из птицефабрик Центрального региона России / С.А. Каспарьянц, Н.Л. Соколова // Биозащита и биобезопасность. – 2011. - №4. – С.15-18.

11. Каспарьянц, С.А. Вакцина Пулвак IB Праймер против вариантных штаммов вируса инфекционного бронхита кур / С.А. Каспарьянц, А.Д. Чекмарев // Ветеринария. - 2009. - № 1. - C. 15-16.

12. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени / Е. В.

Овчинников, Л. О. Щербакова, А. В. Андриясов [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2010. – 10 с.

13. Николаева, И.П. Инфекционный бронхит кур / И.П. Николаева, С.Н.

Гаврилов // Ветеринарная газета. - 2011. - № 2. - C. 6.

14. Овчинникова, Е.В. Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с 2005 по 2011 гг: дис… канд. биол. наук / Овчинникова Евгения Валерьевна. – Владимир, 2012 – 117с.

15. Овчинникова, Е. В. Биологические свойства изолята IBV08-10 вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX / Е. В. Овчинникова, А. В.

Селиверстов // Ветеринария и кормление. – 2012. – № 5: материалы 3-й Междунар. науч.-практ. конф. "Достижения молодых ученых – в вет.

практику". – С. 36–37.

16. Оптимальные условия культивирования вакцинных штаммов вируса ИБК / А.В.Борисов, А.А.Гусев, Т.В. Хлыбова [и др.] // Пробл. инфекц. патологии сх. животных: тез. докл. конф. – Владимир, 1997. – С.144.

17. Профилактика инфекционного бронхита кур / Б. Я. Бирман [и др.]. – Изд. 2-е, доп. и перераб. - Минск: Бизнесофсет, 2008. - 88 с.

18. Разработка высокоиммуногенной вакцины против инфекционного бронхита кур, вызванного вариантными штаммами / М.В. Гирин, Д.С. Сурнев, Д.А.

Лозовой [и др.] // 2-й Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по биотехнологии и биоэнергетике "ЕвразияБио-2010": сб. тез. - М., 2010. - С.

55-56.

19. Симакова, Н.М. Влияние вакцинации против инфекционного бронхита на фоне применения пробиотиков на иммуноморфогенез у цыплят раннего возраста / Н.М. Симакова, П.А. Красочко, Е.А. Карпенко // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. - 2010. - №1. - С. 32-42.

20. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.:Колос, 1999. – 272с.

21. Фролов, С.В. Разработка ассоциированной вакцины против инфекционного бронхита кур и ньюкаслской болезни: дис...канд. вет. наук / Фролов Сергей Владимирович - Владимир, 200. -172 с.

22. Холлендер, М. Непараметрические методы статистики / М. Холлендер, Д.А.

Вульф. - М.: Финансы и статистика, 1983. - С. 214 - 220.

23. Эпизоотологический лексикон: учеб. пособие / В.В. Макаров, А.А. Гусев, Е.В. Гусев. – М.: Колос, 2001. – 176 с.

24. VII. International Symposium on Avian Corona- and Pneumoviruses and

Compilating Pathogens, Rauischholzhausen, Germany, 18-21 June 2012:

Proceedings / World Vet. Poultry Assoc., Clinic for Birds, Reptiles, Amphibians and Fish Justus Liebig University, Giessen, Germany. – Wetter, Germany, 2012. – 358 p.

25. A “new” strain of infectious bronchitis virus infecting domestic fowl in Great Britain / R. E Gough, C. J. Randall, M. Dagless [et al.] // Vet. Rec. – 1992. – V.130. – P.493–494.

26. Ability of Massachusetts-type infectious bronchitis virus to increase colibacillosis susceptibility in commercial broilers: a comparison between vaccine and virulent field virus / M.G. Matthijs, J.H. van Eck, W.J. Landman, J.A. Stegeman // Avian Pathol. – 2003. – Vol.32. – P.473-481.

27. Adler, H.E. The effect of infectious bronchitis virus on chickens infected with Mycoplasma gallisepticum / H.E. Adler, D.A. McMartin, H. Ortmayer // Avian Dis. – 2008. – Vol.6. – P.267-268.

28. Alexander, D. J. A long-term study of the pathogenesis of infection of fowls with three strains of avian infectious bronchitis virus / D.J. Alexander, R. E. Gough // Res. Vet. Sci. – 1978. – Vol.24. – P.228-230.

29. Alexander, D. J. Isolation of avian infectious bronchitis virus from experimentally infected chickens / D.J. Alexander, R. E. Gough // Res. Vet. Sci. – 1977. – Vol.23.

– P.344.

30. Antigenic and S-l genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious bronchitis virus / J.J. Gelb, C.L. Kceler, W.A. Nix [et al.] // Avian Dis. – 1997. – Vol.41. – P.661-669.

31. Avian infectious bronchitis [Электронный ресурс]. – Режим доступа:

http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.03.02_AIB. pdf (дата обращения 22.10.14)

32. Avian infectious bronchitis and deep pectoral myopathy—A case control study / D.

O. Almeida, R. Tortelly, E. R. Nascimento [et al.] // Poult. Sci. – 2012. – Vol. 91 – P. 3052–3056.

33. Baba, T. Harderian gland dependency of immunoglobulin A production in the lacrimal fluid of chicken / T. Baba, K. Masumoto, S. Nishida [et al.] // Immunology. – 1988. – Vol.65. – P.67-71.

34. Beach, J.R. A filterable virus distinct from that laryngotracheitis: the cause of respiratory disease of chicks / J.R. Beach, O.W. Schalm // Poult.Sci. – 1936. – Vol.15. – P.199-206.

35. Bhattacharjee, P. S. Susceptibility of organ cultures from chicken tissues for strains of infectious bronchitis virus isolated from the intestine / P.S. Bhattacharjee, R. C.

Jones // Avian Pathol. – 1997. – Vol.26. – P.553-563.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.