WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX ...»

-- [ Страница 2 ] --

Наиболее широко используются живые вакцины из штамма "H" серотипа Mass различного уровня аттенуации, которые были разработаны в Германии в начале 1960-х гг. В качестве живых вакцин используются аттенуированные штаммы, которые ослаблены последовательными пассажами в куриных эмбрионах, в культуре клеток или в ТОК. Было показано, что с увеличением количества пассажей, как правило, иммуногенность и эффективность препаратов падает [91, 130, 164]. Живые вакцины, прежде всего, применяют для защиты поголовья птицы от инфекции в раннем возрасте, а также для «праймирования»

иммунной системы птицы перед введением инактивированной вакцины. При этом они формируют комплексный иммунитет, в том числе и местный для защиты от инфекции в раннем возрасте [87]. Как правило, живые вакцины применяют одним из методов массовой иммунизации: аэрозольно в инкубаториях, методом выпаивания с водой или крупно-капельным распылением [13]. Было также показано одновременное применение с иммуностимуляторами, что способствовало улучшению иммунного ответа со стороны организма птиц [1, 19].

В зависимости от эпизоотической обстановки живые вакцины применяют методом крупно-капельного распыления среди кур-несушек в период яйцекладки.

Большинство используемых в мире вакцин против ИБК относится серотипу Mass.

Однако существуют вакцины на основе и других серотипов, применение которых в некоторых странах ограничено [87]. Вакцины определенного серотипа или генотипа, как правило, обеспечивают надежную защиту против гомологичного контрольного заражения. Существует определенная перекрестная защита от гетерологичного вируса ИБК, уровень которой может колебаться от высокого до самого низкого [80].

В последнее время в программе вакцинации против ИБК рекомендуют использовать вакцины на основе серологически отличных штаммов [86]. Было показано, что вакцинация живыми аттенуированными вирусами, относящимися к различным серотипам, например, и обеспечивает широкую Mass 4/91, перекрестную защиту [146]. Более высокого уровня защиты достигали, когда эти вакцины применяли последовательно с двухнедельным интервалом, в отличие от одновременного применения. Неудовлетворительные результаты были получены при одновременном инфицировании вирусом инфекционной бурсальной болезни [99, 150].

В некоторых странах мира, в частности, в США, широко применяются бивалентные живые вакцины, изготовленные из двух разных штаммов. Так, J.J.

Gelb et al. [94] пришли к выводу, что бивалентная вакцина против ИБК, состоящая из штаммов серотипов Mass и Ark, обеспечивает более надежную защиту от болезни, чем вакцины, изготовленные на основе штаммов серотипов Mass и JMK или на основе штаммов серотипов Mass и Conn.

Недостатком использования живых вакцин в производственных условиях является то, что вирус, ввиду своих природных свойств, чувствителен к факторам окружающей среды, которые могут легко его инактивировать [43]. Этот фактор часто приводит к недостаточной эффективности вакцинации в полевых условиях [75, 117]. Поэтому для получения эффективной защиты в производственных условиях среди бройлеров была показана необходимость ревакцинации.

Несоблюдение инструкции по применению вакцин часто приводит к снижению эффективности препаратов, пролонгированной циркуляции вирусвакцины, что в результате повышает восприимчивость поголовья к E. сoli и другим бактериям [26], а иногда к повышению вирулентности и реверсии штаммов [106].

При разработке вакцин на стадии доклинических исследований проводят оценку протективной активности вакцин. Для определения протективности вакцин используется метод контрольного заражения иммунных цыплят обычно через 3 недели после иммунизации. Протективность вакцин определяют методами реизоляции контрольного вируса, оценкой цилиарной активности трахеи, гистологической оценкой органов-мишеней и другими вирусологическими методами [31, 54]. Так, J. H Darbyshire et al. [72] в своих опытах по контрольному заражению с оценкой цилиарной активности после заражения показали, что цыплята, привитые вакциной из штамма Н120, были защищены против различных серотипов вируса ИБК.

Инактивированные вакцины против ИБК впервые были сконструированы в 1960-1970 гг. для получения длительного иммунитета у кур-несушек в период яйцекладки [43]. Данные препараты изготавливаются на основе масляного адъюванта, а в качестве антигена используют инактивированный вирус ИБК.

Однократное применение инактивированной вакцины не обеспечивает надлежащую защиту от снижения яйценоскости [38, 86, 92, 111] и повреждения цилиарной активности трахеи [45]. Многие авторы сообщали, что только двукратная вакцинация инактивированной вакциной обеспечивала сохранение цилиарной активности трахеи [113, 114, 115].

Общий подход к профилактике ИБК в стадах кур-родителей и в стадах курнесушек предполагает двукратное применение живой вакцины в период роста птицы и однократное введение инактивированной вакцины за месяц до начала яйцекладки [38, 90, 97].

В настоящее время разрабатываются субвирусные, векторные и другие генно-инженерные вакцины, не имеющие недостатков существующих биопрепаратов [90, 115,]. Экспериментально была показана эффективность векторной вакцины на основе гликопротеина S вируса ИБК [88, 114]. M.

Jackwood. et al. [126] сконструировали синтетические пептиды, основанные на аминокислотной последовательности белка S1 вируса ИБК штаммов Ark99 и Mass41. Введение вышеуказанных пептидов в организм птицы не дало положительного результата.

В литературе приводятся результаты экспериментов о применении ДНКвакцины, сконструированной на основе S1 белка вируса ИБК. Применение этого препарата in ovo обеспечивало защиту цыплят против контрольного заражения вирулентным вирусом штамма Ark в дозе 5 lg ЭИД50 в 8-суточном возрасте [156].

Применение ДНК-вакцины против ИБК in vivo также индуцировало адекватный иммунный ответ и обеспечивало эффективную защиту против контрольного заражения, по данным S.H. Seo et al. [171]. Вакцины, сконструированные на основе рекомбинантных белков и других технологий, имеют перспективу в будущем и могут изменить взгляд на настоящую программу специфической профилактики. Тем не менее, эти вакцины должны быть безопасными, эффективными и, что немаловажно, менее дорогими, чтобы было обеспечено их практическое применение в птицеводстве.

1.9 Заключение по обзору литературы Инфекционный бронхит кур заболевание, характеризующееся

– контагиозностью и широким распространением по всему миру. Это первое экономически значимое заболевание среди респираторных инфекций известное в птицеводстве [2, 6]. С момента открытия вируса до настоящего времени вирус ИБК объединяет более 50 серологических вариантов и еще больше генотипов.

Огромное разнообразие вирусной популяции ученые объясняют природой коронавирусов как одного из представителей РНК-содержащих вирусов, которые характеризуются неустойчивостью и склонностью к мутациям. Классификация штаммов и изолятов вируса ИБК не имеет единой концепции. В настоящее время при диагностических процедурах для дифференциации штаммов прибегают к молекулярно-биологическим методам исследования, определяя генотип вируса. С этой целью анализируют аминокислотные последовательности гена S1, индуцирующего образование нейтрализующих антител. Анализ литературных данных показывает, что результаты по определению генетической принадлежности вируса ИБК не всегда коррелируют с результатами серотипирования. Иммунитет, полученный на один серотип вируса ИБК, часто не способен защитить организм от заболевания, вызванного другим, неродственным серотипом. И наоборот, может наблюдаться перекрестная защита от контрольного заражения даже тогда, когда результаты РН показывали значительные отличия между вакцинным штаммом и изолятом. Поэтому наиболее достоверным, однако трудоемким, методом является классификация штаммов по концепции «протектотипа», который определяется in vivo.

Изучению вопросов профилактики ИБК в промышленном птицеводстве посвящено огромное количество публикаций [2, 6, 17, 21, 90, 97, 108, 155].

Неоднократно была доказана эффективность «классической» вакцины на основе штамма Н120 серотипа Mass, который широко применяют в промышленном птицеводстве. Генетическое разнообразие вируса ИБК, которое выявляют практически повсеместно, усложнило программу вакцинопрофилактики, но разработка новых вакцинных препаратов не нашла практического оправдания.

Это связано с тем, что существует высокий процент перекрестной защиты между антигенными вариантами вируса ИБК.

Несмотря на масштабные экономические контакты между странами, связанные с перемещением продуктов от птиц, и широкое распространение вируса ИБК в различных птицеводческих хозяйствах, существуют эндемичные штаммы, которые встречаются только в определенных странах. Появление новых вариантов вируса ИБК в несвойственных географических зонах характеризуется экзотичностью инфекции. Примером таких явлений может послужить недавно выделенная новая генетическая ветвь QX вируса ИБК. Впервые вирусы этой генетической группы с абсолютно нехарактерной клинической картиной заболевания – провентиркулитом-были выделены в КНР, в 1997 г. Позже, в других провинциях КНР вирус ИБК генотипа QX часто выделяли у бройлеров с патологией почек. Уже через несколько лет вирусы, отнесенные к этой генетической группе, встречали в РФ и в других странах Евразии.

В коллекцию музея штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010 г.

депонирован вируса ИБК генотипа QX штамм IBV RF 08-10. Еще ранее учеными из этого учреждения были изучены биологические свойства изолята, относящегося к генотипу QX. Однако в существующих научных сообщениях комплексное изучение иммунобиологических свойств мало отражено, что делает актуальным эту тему для исследований.

33

–  –  –

- вакцинный штамм Н120, серотип Mass;

- вакцинный штамм D274, серотип D207;

- вакцинный штамм 4/91, серотип 793/В;

- штамм IBV RF 08-10 (далее QX), генотип QX;

- штамм L1148, серотип D388.

Штаммы Н120 и QX были паспортизированы и депонированы в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Штаммы D274, 4/91 и L1148 хранятся в рабочей коллекции штаммов микроорганизмов лаборатории профилактики болезней птиц.

2.1.2 Сыворотки Для серологических реакций использовали штаммоспецифические гипериммунные сыворотки, которые были получены к следующим штаммам вируса ИБК: Н120, серотип Mass, D274, серотип D207, 4/91, серотип 793/В, IBV RF 08-10 генотипа QX (серотип неизвестен). Для получения сывороток использовали 40–50-суточных цыплят категории СПФ, которых двукратно иммунизировали. Для первичной иммунизации использовали исследуемый штамм живого вируса ИБК, репродуцированный в эмбрионах кур и полученный в виде ЭЭЖ, который вводили внутривенно. Для второй иммунизации использовали смесь инактивированного вируса того же штамма и полного адъюванта Фрейнда в соотношении 1:1. Через 14 сут после последней иммунизации цыплят обескровливали (Приложение №3). Далее методом отстоя и центрифугирования отделяли сыворотку и исследовали на активность в ИФА. Затем образцы объединяли в общий пул сывороток и хранили при температуре минус 200С до проведения исследований.

2.1.2 Эмбрионы кур, культуры клеток Использовали эмбрионы кур 9-11- и 20-21-суточного срока инкубации, категории СПФ фирмы Lohman Tiehrzuch (Германия) для культивирования и для изготовления культуры клеток, соответственно. Эмбрионы инкубировали при температуре 37±0,5°С и относительной влажности воздуха 60%.

В опытах использовали следующие культуры клеток: первично трипсинизированные культуры фибробластов (ФЭК) и почек эмбрионов кур (ПЭК), перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки (клетки Vero), почки КРС (MDBK), почки теленка (RBT), трахеальная органная культура (ТОК) куриных эмбрионов. ФЭК готовили из кожно-мышечной ткани 10-12-суточных СПФ КЭ, ПЭК из почечной ткани 20-21-суточных КЭ. ТОК – по ранее стандартной методике с небольшими модификациями [9]. Эксплантаты трахеи инкубировали в культуральных плашках при температуре 37,50С в присутствии 5% CO2.

2.1.3 Подопытная птица В лабораторных экспериментах использовали цыплят категории СПФ.

Цыплят выводили из оплодотворенных СПФ-яиц фирмы Lohman Tiehrzuch. Птиц содержали в изолированных боксах. Условия содержания и кормления поддерживали в рамках соответствующих зоогигиенических нормативов.

2.1.4 Растворы и реактивы В работе использовали следующие растворы и реактивы.

Фосфатно-буферный раствор (ФБР), pH 7,2-7,4.

1.

Раствор натрия хлорида 0,9%, рН 7,0.

2.

Раствор L-глютамина.

3.

Сыворотка крови КРС.

4.

Фетальная сыворотка крови теленка (BIOCLOT, Бразилия).

5.

0,25% раствор трипсина.

6.

Смесь растворов трипсина (0,25%) и версена (0,02%).

7.

Раствор Хенкса (рН 7,1-7,2).

8.

Раствор Хенкса с добавлением ГЛА, рН 7,2-7,4.

9.

10. Среды культуральные Игла, 199, ПСС, ПСП, а также DMEM или DMEM/F12 (Sigma, США).

11. Желатин порошкообразный из кожи свиней, тип А (Sigma, США).

12. Антибиотики (бензилпенициллина натриевая соль, стрептомицина сульфат, гентамицина сульфат (4% раствор), «Байтрил» (5 и 10% растворы).

Все реактивы имели квалификацию «ч.д.а.» и «х.ч.», для приготовления растворов использовали бидистиллированную или деминерализованную воду.

2.1.5 Диагностикумы Использовали набор для обнаружения антител к вирусу ИБК в непрямом ИФА, Synbiotics (США). В соответствии с Инструкцией по использованию набора определяли наличие антител к вирусу ИБК в сыворотке крови. Положительной оценкой реакции считали величину Sp0,150 что соответствует титру антител 1:165. Отрицательным значением титров антител считали значения 1:164 и ниже.

Набор РТГА для выявления антител к вирусу ИБК (производитель GD Animal Health, Нидерланды). РТГА выполняли согласно Инструкции по применению набора.

2.1.6 Оборудование и лабораторная посуда В процессе выполнения экспериментальных работ использовали следующее оборудование:

- низкотемпературные холодильники MDF-792 и U5386S («Sanyo», Япония);

- термостат электрический с водяной рубашкой тип 3Ц-1125 (Украина);

- СО2 термостат Sanyo МСО-15АС (Япония);

- магнитные мешалки ММ-3М (Россия);

- инвертированный микроскоп «Макромед И» (Россия);

- центрифуга «Mistral 6L» (Measuring Scientific equipment LTD, Англия);

- культуральные пластиковые флаконы и плашки («Costar», США);

- пипетки серологические одноразовые;

- автоматические дозаторы 25 мкл-1000мкл;

2.2 Методы исследований 2.2.1 Оценка эпизоотической ситуации Объектом исследования являлись результаты лабораторных исследований, оригинальных работ и первичных публикаций по нозогеографии, эпизоотологии ИБК. Поиск информации осуществлен в базах данных (PubMed, OIE Publications) и научных изданиях «Avian Disease», «Avian Pathology».

2.2.2 Подготовка вируссодержащего материала При проведении вирусологических исследований использовали суспензии вируса ИБК штамм QX в составе ЭЭЖ КЭ и культуральной жидкости.

2.2.3 Определение условий культивирования штамма QX вируса ИБК в куриных эмбрионах Культивирование вируса ИБК в КЭ проводили по общепринятой методике [20]. Вируссодержащий материал вносили в аллантоисную полость в объеме 0,2см3 с титром инфекционной активности 1000 ЦД50. После заражения отверстия в скорлупе заливали парафином. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили через 24 ч после заражения, затем с интервалом не более 6 ч. Гибель эмбрионов до 24 ч считали неспецифической. Через заданный интервал времени от инфицированных эмбрионов отбирали пробы ЭЭЖ и ХАО для исследований.

2.2.4 Репродукция вируса ИБК в культурах клеток Репродуктивную способность вируса ИБК в культурах клеток изучали путем выполнения серийных «слепых» пассажей. Первый пассаж вируса ИБК на всех культурах выполняли материалом, инфекционная активность которого составляла 100 ЦД50/см. Для следующих пассажей использовали соответствующие культуральные жидкости. Вируссодержащие материалы вносили на освобожденный от среды клеточный монослой в объеме 0,1см. Далее инфицированную культуру в течение часа выдерживали в термостате при температуре после чего удаляли инокулят и вносили (37,0 ±0,5)°С, поддерживающую среду. Параллельно для каждой клеточной линии проводили контроль на исключение неспецифических дегенеративных изменений.

Ежедневно проводили микроскопию всех клеточных культур и оценивали морфологическое состояние клеток.

2.2.5 Титрование вируса Для оценки инфекционного титра вируса ИБК в качестве чувствительных тест-объектов использовали исследуемые клеточные культуры, выращенные в виде монослоя на дне пенициллиновых флаконов, ТОК в полистироловых плашках и эмбрионы СПФ-кур. Применяли стандартный метод последовательных разведений, при котором разбавление вирусных материалов проводили на питательной среде или на ФБР.

Инфицирование клеточных культур выполняли путем внесения приготовленных разведений вирусных материалов во флаконы с монослоем или в лунки плашек с ТОК. КЭ инокулировали в аллантоисную полость через перфорированную скорлупу с помощью шприца. Отверстие в скорлупе закрывали стерильным парафином. Учитывали ЦПД в монослое культур клеток, цилиостаз в ТОК, гибель КЭ и другие патологоанатомические проявления. Неспецифической реакцией считали гибель КЭ или ЦПД на культуре или в ТОК в период 24 ч после заражения. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера через 7 сут инкубации.

2.2.6 Определение степени антигенного родства Реакция нейтрализации Для постановки реакции нейтрализации использовали ТОК по методике О.А. Чупиной [8] с небольшими модификациями. В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в Руководстве по вирусологии [20].

Титр вируснейтрализующих антител вычисляли по Керберу на основании полного цилиостаза на ТОК и ЦПД в культуре клеток через 5-6 сут инкубации после инокуляции культуры. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали индексом нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

Оценкой антигенной «близости» штаммов (по сыворотке или по вирусу) считали соотношение гомо- и гетерологичных индексов, установленное в виде доли 38 инфекционного вируса, который не образовал иммунных комплексов в гетерологичной системе обратная стандартной величине (оценка, "r", характеризующей антигенную близость или "родство").

2.2.7 Оценка патогенных свойств штамма QX Патогенные свойства вируса изучали в острых опытах. Для исследования использовали суточных СПФ-цыплят, серонегативных кур-несушек 180суточного возраста и серонегативных петушков этого же возраста. Для выявления клинического проявления ИБК птиц осматривали 2 раза в день. Регистрировали и отмечали птиц с депрессией, конъюнктивитами, чиханием и с признаками диспноэ. У павших и подвергшихся диагностическому убою птиц проводили некроскопию. С особым вниманием исследовали трахею, легкие, почки и репродуктивные органы. Патогенные свойства вируса для кур-несушек определяли путем сравнения показателей продуктивности до инфицирования и после инфицирования в течение месяца. По окончании опыта также учитывали результаты патологоанатомического изменения внутренних органов.

2.2.8 Оценка протективной функции вакцины из штамма Н120 серотипа Mass против заражения штаммом QX Для изучения протективных свойств вакцины для цыплят СПФ-кур против заражения штаммом QX провели ряд опытов. Эффективность вакцинации исследовали по следующим параметрам: клинико-патологоанатомическому проявлению болезни, активности ресничек мерцательного эпителия трахеи, наличию вирусного генома в органах-мишенях с помощью ПЦР.

2.2.8.1Тест на цилиостаз Цилиарная активность мерцательного эпителия трахеи является одним из критериев оценки патогенности вируса ИБК и защищенности цыплят. С целью определения его активности через 6 сут после инфицирования группу цыплят подвергали эвтаназии и препарировали трахею до бифуркации с минимальным травматизмом. Затем трахею помещали в питательную среду ПСС и с помощью бритвенного лезвия готовили срезы колец трахеи (эксплантаты) по 0,5-1 мм.

Использовали следующие оценки: 0 - цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра внутренней поверхности трахеи, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00-охват более 3/4 периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце (CS) являлось среднее значение из n – числа единичных оценок (CS=cs/n).

2.2.8.2 Выделение вирусной РНК Для выделения РНК из исследуемого образца применяли набор для выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucleoS+ (ООО «Биоком», Россия) в соответствии Инструкцией производителя.

2.2.8.3 ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и секвенирование фрагмента гена S1 ОТ-ПЦР проводили согласно Методическим указаниям [12]. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена S1 вируса ИБК осуществляли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных терминирующих нуклеотидов на автоматическом секвинаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями референс-штаммов вируса ИБК, опубликованными в международной базе данных GenBank с помощью программы BioEdit, версия 7.0.5.3.

2.2.9 Статистическая обработка результатов экспериментов Использовали общепринятые в биологии методы статистической обработки данных. Применяли стандартные методы обработки выборок варьирующих переменных, в том числе с использованием непараметрической статистики [7, 22].

Вычислительные операции и графические построения выполняли с помощью приложения Microsoft Office Excel. При обработке экспериментальных данных и интерпретации результатов оказывал консультативную помощь и принимал непосредственное участие ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики болезней птиц кандидат ветеринарных наук В.Ю. Кулаков.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Вирус ИБК генотипа QX. Эпизоотическая ситуация Анализ распространения вируса ИБК генотипа QX среди кур включал в себя следующие этапы:

- определение нозоареала и хронологии распространения вируса ИБК генотипа QX в мире (по данным научных публикаций);

- изучение распространения вируса ИБК генотипа QX на территории России в 2005-2014 гг.

3.1.1 Распространение вируса ИБК генотипа QX в мире На основании анализа научных публикаций [15, 58, 78, 124, 146, 158, 159]., содержащих информацию об эпизоотологии вируса ИБК генотипа QX в период с 1996 по 2014 гг., была построена хронология начальных этапов распространения возбудителя, проведено картографирование неблагополучных территорий и определен нозоареал (рисунок 2).

Вирус ИБК, демонстрирующий не свойственную данному возбудителю клиническую картину болезни (провентрикулит - воспаление железистого желудка), был обнаружен в сентябре 1996 г в провинциях Циндао и Шандонг в КНР. Болезнь сопровождалась высокой смертностью среди кур 25-70-суточного возраста. Генетический анализ показал, что в сравнении с известными в то время генотипами вируса ИБК, структура генома выделенного изолята имела существенные отличия в гене S1. На этом основании выделенный изолят был определен как вирус ИБК отдельного генотипа, который позже назвали QX.

В РФ распространение генотипа QX было отмечено в 2001 г на территории Дальнего Востока, и в 2002 г – на европейской части.

В Европе первые сообщения о циркуляции вируса QX-генотипа, появились в Голландии в 2003 г. В период с 2003 по 2004 гг. болезнь отмечалась на бройлерах и характеризовалась поражением почек. Среди кур-несушек болезнь проявлялась повреждением репродуктивных органов Рисунок 1. Нозоареал вируса ИБК генотипа QX в период с 1996 по 2014 гг. (выделен красным).

Стрелками показаны наиболее вероятные направления первичного распространения возбудителя В последние 10 лет изоляты вируса ИБК, генетически родственные китайскому вирусу (так называемые QX-подобные), выделяли во Франции, Бельгии, Италии, Венгрии, Швейцарии, Германии, Англии, Польше, Греции, Словении, Швеции, Дании, Финляндии.

3.1.2 Встречаемость вируса ИБК генотипа QX на территории России и стран СНГ в 2005-2014 гг.

В основу данного анализа были положены результаты лабораторных исследований, проведённых в ФГБУ «ВНИИЗЖ», по выявлению генома вируса ИБК из патматериала птицеводческих хозяйств разных регионов РФ и стран СНГ.

Исследования по выявлению генома вируса ИБК за 2005-2014 гг. были проведены сотрудниками лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» при непосредственном участии к.б.н. Овчинниковой Е.В.

Всего за указанный период в ПЦР было исследовано 2330 проб внутренних органов птиц более чем из 300 птицефабрик, где присутствовал характерный для ИБК респираторный симптомокомплекс и прилагаемые сопроводительные документы указывали на необходимость подтверждения соответствующего диагноза. Геном вируса ИБК был выявлен в 815 пробах, что составило 35% от общего количества изученных образцов.

Большинство положительных образцов относились к генотипу Mass (30%).

Существенную часть (28%) составили образцы, отнесенные к генотипу 793/В.

Также, 28% были отнесены к генотипу D274. Генотип QX был выявлен в 14% случаев.

Исследовали динамику встречаемости генотипа QX.в период 2005-2014 г.г., продолжительность которого составила восемь лет. Поскольку общее количество тестируемых образцов за год, содержащих геном вируса ИБК, было приблизительно одинаковым (т.е 815/9 90), то считали возможным определять среднегодовой процент встречаемости (Pc) генотипа QX по общему знаменателю, а именно по формуле: Y= (S+/90) 100, где S+- число образцов отнесенные генотипу QX.

Таким образом, была получена хронологическая диаграмма встречаемости вируса ИБК генотипа QX в границах изученного периода. Кроме этого был проведен корреляционно-регрессионный анализ, который позволил определить коэффициент корреляции изучаемых параметров K=0,83 и построить модель (полином) их связи (рисунок 2).

40 Y

–  –  –

Представленная на рисунке 3 хронологическая диаграмма частоты встречаемости на указанной территории не была равномерной. Распределение оценок Y имело два выраженных максимума, которые были отмечены в 2008 г (34%) и в 2011 г.(27%). При этом в 2005 г (7%), в 2009 г. (9%) и в 2013 г.(5%) присутствовали очевидные минимумы, и 2014 г. QX-положительных образцов зарегистрировано не было.

44 Однако присутствие явной хронологической волнообразности процесса не дает оснований считать, что среди вариантов вируса ИБК представительство QXгенотипов монотонно снижается. При этом построенная регрессионная модель, имеющая коэффициент адекватности K=0,7, прогнозирует в ближайшие два года очередной подъем показателя Y.

Проведенный эпизоотологический анализ показал, что распространение вируса ИБК генотипа QX с 1996 г. имело очевидную направленность, и течение последних 19 лет возбудитель регистрируется во многих странах Европы, Азии и Африки, где присутствует развитое птицеводство. Хронология частоты встречаемости данного генотипа имеет волнообразный характер. Очередной вероятный подъем распространения вируса QX-генотипа ожидается на период 2015 -2017 гг.

3.2 Культивирование вируса ИБК штамма QX в КЭ и в культурах клеток Культивирование в КЭ Проведение научно-исследовательских работ по изучению иммунобиологических свойств вирусов требует стандартизации вируссодержащего материала, используемого для проведения исследований, главным образом по гомогенности вирусной популяции, отсутствию контаминации посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами, а также по показателю инфекционной активности.

Поэтому изучение условий культивирования вируса в КЭ и получение необходимого объема высокоактивного вирусного материала для иммунологических исследований стали нашей первой задачей.

В качестве исходного вирусного материала использовали лиофилизированный вирусный материал вируса ИБК штамма с QX инфекционной активностью 4,1 lg ЦД50/см3, полученный из коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Эмбрионы СПФ-кур 10-суточного срока инкубации использовали для заражения исходным вирусом. В экспериментах определяли динамику накопления инфекционного вируса, элективные зоны вируса для репликации в КЭ.

Наиболее простым и практичным методом заражения КЭ является заражение в аллантоисную полость. Было проведено три серии экспериментов.

Накопление вируса в организме КЭ оценивали титрованием ЭЭЖ и суспензии ткани ХАО на ТОК. Перед титрованием из тканей ХАО готовили 10% суспензию на физиологическом растворе с добавлением антибиотиков. Экспериментальный материал в виде установленных значений титра вируса представлен на рисунке 4.

–  –  –

3,5 2,5 1,5 Время культивирования,ч Рисунок 4. Динамика накопления инфекционного вируса ИБК штамма QX в ЭЭЖ и в ХАО Результаты, приведенные на рисунке 4, демонстрируют, что в обоих типах исследуемых образцов для вируса существовал явно выраженный период накопления, который заканчивался после 54 ч инкубации. В период с 36 по 54 ч культивирования вирус накапливался в максимальных титрах. Величина среднего значения титра в этот период в ЭЭЖ составила 3,2±0,2 lgЦД50/0,1 см3, тогда как в ткани ХАО средний титр был 2,3±0,19 lgЦД50/0,1 см3. Указанные величины имели существенные различия (p0,02). Далее, в период снижения титра, статистической разницы в оценках инфекционного тира вируса не было. Полученные данные указывали на то, что концентрация вируса в ЭЭЖ более чем на порядок превосходила аналогичный показатель в ХАО. Поскольку развитие вируса не могло происходить вне живых клеток, то, вероятно, ЭЭЖ явилась "резервуаром", где возбудитель скапливался, размножаясь в ткани ХАО. При этом ткань ХАО в период наиболее интенсивной репродукции вируса сохраняла свою структурную целостность крайней мере на макроуровне). В период до ч (по культивирования при овоскопии явных вирусобусловленных эмбриопатических явлений не наблюдали.

Информация о репродукции вируса в эмбрионах СПФ-кур может быть полезна при составлении хронологического графика культивирования.

В процессе дальнейших исследований развития вируса ИБК в эмбрионах СПФ-кур установлено, что эмбриопатическое действие возбудителя могло быть обнаружено у определенного процента эмбрионов после 50 ч культивирования.

Патологические процессы выявлялись только при вскрытии эмбрионов, где наблюдались точечные кровоизлияния на ХАО и патологию развития самого эмбриона. Инфицированный эмбрион, как правило, был деформирован и существенно отставал в росте по отношению к (карликовость) неинфицированным контрольным эмбрионам (рисунок 5).

Таким образом, на основании проведенных опытов можно сделать заключение о том, что штамм QX при инфицировании СПФ-эмбрионов кур в аллантоисную полость в период 36 54 ч. культивирования способен был накапливаться в экстраэмбриональной жидкости в титре 4,2±0,2 lgЦД50/1 см3.

А В Рисунок 5. Эмбриопатическое действие вируса ИБК штамма QX А- геморрагическое воспаление ХАО;

B-отставание в развитии инфицированного эмбриона по отношению контроля;

Адаптация вируса ИБК штамма QX к культурам клеток Основной задачей данного этапа исследований было определение спектра клеточных культур, чувствительных к данному возбудителю. Предметом исследований были следующие культуры: первичная культура фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), первичная культура почек эмбрионов кур (ПЭК), перевиваемая культура почки зеленой мартышки (Vero), перевиваемая культура гепатоцеллюлярной карциномы цыпленка (LMH), перевиваемая культура почки КРС (MDBK), перевиваемая культура почки теленка (RBT).

В экспериментах планировали исследовать возможность стимуляции репродукции и цитопатического действия вируса в результате добавления в состав питательной среды трипсина (1мг/100 мл).

Все клеточные культуры были выращены в виде монослоя на плоскостенных культуральных флаконах с рабочей поверхностью 25 см (Costar, США). Для испытания каждой клеточной культуры использовали не менее 15 флаконов с завершенным монослоем, которые были разделены на 4 группы с соответствующим числом флаконов (фл): I-фл (вирус+среда+трипсин), II- фл.

(вирус+среда), III-3 фл (среда+трипсин), IV- 3 фл (среда). Для заражения использовали вирусный материал, который представлял из себя разбавленную с питательной средой ПСС ЭЭЖ в соотношении 1:2. Инфекционная активность составляла 4,1 lgЦД50/см.

Все флаконы освобождали от соответствующей ростовой среды. Во флаконы из групп I и II вносили вирусный материал в объеме 0,1 см. Во флаконы из групп III и IV в том же объеме вносили питательную среду. Все культуральные флаконы содержали в течение 1 часа в термостате при 37С.

Далее, во флаконы из групп I и III добавляли 10 мл среды ПСС, содержащей трипсин, а во флаконы из групп II и IV в том же объеме аналогичную среду без трипсина. Все культуральные флаконы содержали в термостате при 37С.

Ежедневно проводили микроскопию всех клеточных культур и оценивали морфологическое состояние клеток. Использовали оптический инвертированный микроскоп «Микромед» (объективы х6, х10, окуляр х4). При необходимости морфологию инфицированной культуры сравнивали с соответствующим контролем. Также по контрольным флаконам определяли время наступления спонтанной токсико-трофической дегенерации клеток. Продолжительность наблюдения за данным типом клеточной культуры устанавливали по сроку наступления спонтанной токсико-трофической дегенерации в контроле культуры (группа III и/или IV). До обнаружения указанных явлений из флаконов группы I и II отбирали пробы, считая их ВСМ. Пробы сохраняли до следующего пассажа при 4С. Все последующие пассажи выполняли по аналогии с первым пассажем. Из флаконов, где наблюдали признаки морфологических изменений монослоя, которые отличались от контроля, отбирали пробы культуральной жидкости для оценки величины титра вируса.

Результаты наблюдения морфологии клеточного монослоя соответственно испытанным клеточным культурам и пассажам приведены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 следует, что вирусиндуцированный цитопатический эффект в подавляющем большинстве наблюдали только в группах I. При этом действие вируса полностью отсутствовало без стимуляции трипсином (группа II).

Трипсин в испытанной концентрации не оказал заметного влияния на состояние клеточного монослоя Продолжительность полноценного (группа III).

существования клеточных линий до появления признаков дегенерации (группа IV) составляла от 4 до 6 сут. Более продолжительное культивирование приводило к закислению среды и указанным дегенеративным процессам. На этом основании отбор проб культуральной жидкости проводили в период до 96 ч.

Исследовали накопление инфекционного вируса в культурах клеток ФЭК, ПЭК, RBT. С этой целью в образцах культуральной жидкости, которые были отобраны на 3, 5, 7 пассажах возбудителя, определяли величину инфекционного титра вируса для данной культуры. Указанные типы культур выращивали в виде монослоя на дне пенициллиновых флаконов, которые использовали для титрования. Присутствие признаков ЦПД во флаконе считали положительной реакцией единичного тест-объекта.

Таблица 1 - Оценки морфологического состояния клеточного монослоя в исследуемых культурах клеток соответственно проведенным пассажам вируса

–  –  –

Титрование проводили путем последовательных разведений изучаемого материала, величину инфекционного тира вируса (ТЦД50) рассчитывали по методу Кербера. Оценку титра проводили не менее чем в трех повторностях (n3).

Полученные результаты представлены в виде диаграммы, отражающей средние значения титров, на рисунке 6.

–  –  –

Рисунок 6. Величина инфекционного титра (T, lgТЦД50/см) вируса ИБК штамм QX в культуральной жидкости соответственно пассажам, проведенным в культурах клеток ФЭК, ПЭК и RBT Приведенные на графике данные позволяют считать, что все перечисленные культуры клеток после третьего пассажа демонстрируют увеличение накопления вируса.

Установленные на третьем пассаже титры инфекционного вируса (lgТЦД50/см) для культур ФЭК, ПЭК и RBT (2,11±0,3; 2,58±0,17 и 1,85±0,1, соответственно) к пятому пассажу значительно возросли (2,5±0,2, 3,5±0,3 и соответственно). После пятого пассажа накопление вируса 1,95±0,2, стабилизировалось. Усредненные оценки титров 5-7 пассажа включительно для исследованных культур ФЭК, ПЭК, RBT составили: 2,83±0,17; 3,73±0,18;

2,49±0,53, соответственно.

Исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к культуре клеток RBT. С этой целью провели реакцию нейтрализации. Использовали сыворотку от СПФ-цыплят в возрасте 53 сут через 28 сут после их иммунизации исходным (не адаптированным к культуре) вирусом. Чувствительной тестсистемой являлась указанная культура, выращенная в виде монослоя на дне пенициллиновых флаконов (аналогия с тест системой для титрования вируса).

Реакцию ставили с переменными разведениями сыворотки и постоянной дозой вируса (-вариант). Для испытания каждого разведения использовали не менее 6 флаконов с культурой. Реакцию ставили стандартным способом. В подготовленные двукратные разведения сыворотки в диапазоне (1:161:512) вносили одинаковый объем вируса в дозе 100 ТЦД50. Параллельно аналогичную операцию проводили с нормальной сывороткой СПФ-цыплят. Кроме этого, на среде без сыворотки контролировали величину дозы испытанного вируса.

Величину нейтрализующего эффекта сыворотки (НД50) и оценку использованной дозы вируса (ТЦД50) рассчитывали по методу Кербера. Эксперимент повторяли в трех повторностях.

Было установлено, что средняя оценка нейтрализующего действия сыворотки составила величину 7,4±0,32 log2 НД50/0,1см против инфекционного вируса в дозе 100 ТЦД50. При этом нейтрализующего эффекта сыворотки от СПФцыплят для исследованных разведений не наблюдали. Полученные результаты свидетельствовали, что вирус 7 пассажа на культуре клеток RBT активно реагировал в РН с сывороткой, имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е сохранил соответствующие антигенные свойства.

В результате проведенной работы на этапе исследований адаптации вируса ИБК штамма QX было установлено, что вирус ИБК при стимулирующем действии трипсина может быть адаптирован к первичным культурам клеток ФЭК и ПЭК, а также перевиваемой культуре RBT. Наибольшее накопление вируса было отмечено на 6 и 7 пассажах на культуре ПЭК (приближенно 4 lgТЦД50/см).

При этом вирус седьмого пассажа на культуре клеток RBT мог быть нейтрализован сывороткой гомологичной исходному вирусу.

3.3 Оценка антигенной чистоты рабочих расплодок Исключали присутствие контаминантов, которые могли бы индуцировать антитела у цыплят. С этой целью получали гипериммунные сыворотки от СПФцыплят. Цыплят в возрасте 25 сут прививали инфекционным вирусом окулярно в дозе 3 lg ЦД50/0,2см3 двукратно с интервалом 2 недели. Затем провели третью иммунизацию внутримышечным введением вирусного антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Отбор проб крови для получения сывороток проводили через 4 недели после последней прививки. Далее сыворотки были объединены в общий материал. В тексте материал обозначен как сыворотка против вируса ИБК штамм QX.

Полученную сыворотку исследовали в ИФА и РТГА с использованием стандартных диагностических наборов для определения антител против вируса ИБК, ИББ, РЕО, метапневмовируса, ИЛТ, ИЭП, ССЯ-76 и M.gallisepticum. За основу был принят перечень возможных контаминантов, которые требуют исключения при паспортизации вирусных штаммов в коллекции микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Активность сыворотки, полученной к вирусу ИБК штамм QX в РТГА и в ИФА с гомологичным антигеном и антигенами других вирусов

–  –  –

Величина среднего геометрического титра и диапазон стандартной ошибки, полученной * в результате не менее трех повторностей;

Величина порогового значения, соответствующая положительной реакции в данном ** диагностическом наборе Приведенные в таблице 2 данные иллюстрируют, что как в ИФА, так и в РТГА ни одна из гетерологичных реакций не вышла за рамки порогового положительного показателя. В биологическом смысле это означало, что в пределах разрешимости использованных реакций антитела против перечисленных вирусов, а также микоплазм в сыворотке, полученной на вирус ИБК штамм QX, не регистрировались. Следовательно, предназначенные для экспериментов расплодки вируса ИБК штамм QX контаминантов не содержали.

3.4 Изучение антигенной «удаленности» штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК Анализ литературных данных показывает, что, несмотря на широкое применение и высокую достоверность молекулярных методов исследования, данные по генотипированию не всегда кореллируют с серотипированием. Задачей настоящего этапа исследований являлось определение количественных показателей, характеризующих антигенную близость штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК, выделенным в разное время и относящимся к разным генетическим группам. В работу были включены штаммы Н120, 4/91, D274 и штамм L1148. Перечисленные штаммы вируса находились в составе экстраэмбриональной жидкости, полученной после расплодок в эмбрионах СПФкур.

В серологических экспериментах по антигенной дифференциации штаммов использовали реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации сыворотки и переменных доз вируса (-вариант). При данном способе постановки реакции оценочным показателем был принят стандартный индекс нейтрализации как соотношение инфекционных титров вируса, установленных в гомо- и гетерологичных системах.

Для проведения реакции нейтрализации были получены иммунные сыворотки от СПФ-цыплят в возрасте 53 сут через 28 сут после их иммунизации штаммами QX, Н120, 4/91 и D274, соответственно. Указанные сыворотки в заданной концентрации использовали при титровании соответствующих штаммов вируса для оценки нейтрализующего эффекта.

В качестве чувствительной тест-системы использовали трахеальную органную культуру (в виде срезов толщиной 0,5-1 мм), которую инкубировали в лунках на пластиковых панелях в среде ПСС. Индикацию инфекционного действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза с помощью инвертированного оптического микроскопа.

54 Для проведения реакции нейтрализации готовили последовательные десятикратные разведения вирусного материала на среде ПСС, содержащей иммунную сыворотку. Контроль инфекционной активности вируса проводили путем параллельного титрования на 5% нормальной сыворотке крови кур, приготовленной также на культуральной среде. Далее смесь выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут. Для испытания каждого разведения вируса использовали не менее 4 чувствительных тест-объектов (лунок на планшете со срезами трахеи). Цилиостатический эффект оценивали через 6 сут.

Значение инфекционного титра вируса (ЦД50) вычисляли по методу Кербера.

3.4.1 Исследование гомологичной нейтрализующей активности иммунных сывороток крови кур Определяли величину наименьшей концентрации иммунных сывороток при которой в гомологичных реакциях происходит (антисывороток), статистически полная нейтрализация инфекционного вируса. С этой целью на культуральной среде готовили растворы антисывороток, содержащие 10, 5, 2,5 и сыворотки. На приготовленных растворах проводили титрование 1,25% гомологичных штаммов вируса. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Анализ данных, приведенных в таблице 3, позволил сделать заключение, что если иммунные сыворотки имели концентрацию 10%, то их нейтрализующая способность для всех гомологичных штаммов была абсолютна (остаточная инфекционность вируса не регистрировалась, полный цилиостаз). При снижении концентрации антисывороток признаки инфекционного действия вируса начинали проявляться, т.е отмечали цилиостаз.

Таблица 3 – Результаты исследования нейтрализующего действия иммунных сывороток крови кур против штаммов вируса ИБК в гомологичных реакциях

–  –  –

3.4.2 Оценки антигенной удаленности штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК При выполнении серологических исследований, задачей которых являлось установление антигенной близости изучаемых штаммов на основе гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, был принят ряд условий, ограничивающих возможное влияние различных неспецифических факторов на результат эксперимента. Принято, что:

• исходным титром инфекционного вируса данного штамма считать оценку ЦД50, установленную при титровании с 5% нормальной сывороткой кур;

• иммунные сыворотки в гомо- и гетерологичных реакциях использовать в концентрации 5%;

• определять гомологичный индекс нейтрализации как соотношение исходного и гомологичного титров данного штамма;

• гетерологичные индексы нейтрализации определять по сыворотке (при титровании тест-штамма с гетерологичными иммунными сыворотками) и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с гетерологичными штаммами вируса);

• оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по вирусу) считать соотношение гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, установленное в виде доли инфекционного вируса, который не был нейтрализован в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной величине "r", характеризующей антигенную близость или "родственность").

Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и производных показателей в виде алгоритма представлен в таблице 4.

Таблица 4 - Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и производных показателей, используемых при установлении антигенной удаленности между штаммами вируса по индексам нейтрализации

–  –  –

При проведении статистического анализа результатов использовали следующие методы. По выборкам варьирующих переменных (x) определяли средние величины (X) и их статистические характеристики:

q=Ex-(Ex); m=[q/(n-1)1] [1]

Проверку значимости оценок X выполняли по t-критерию Стьдента:

t= X/mtp, где: tp - табличное значение коэффициента соответственно pуровню значимости. Для дифференциации средних величин в группе, состоящей из k-числа выборок, использовали метод Шеффе [22], основанный на статистическом операторе вида:

D=(Eq k-1)/(N-k), [2] где: Eq - общая сумма квадратов отклонений от средних во всех выборках;

N - общее количество элементов всех выборок (N=En, где: n - объем одной выборки).

На основании значения D проводили статистическое сравнение средних величин (X и Y) путем проверки выполнимости следующего неравенства:

Fxy=(X-Y)/(D/nx+D/ny)Fp, [3] где: табличное значение коэффициента Синедекора-Фишера Fp соответственно p-уровню значимости.

Для штаммов QX, Н120, 4/91 и D274 определили исходные титры инфекционного вируса, а также установили оценки остаточной инфекционности в реакциях с гомологичными сыворотками титры) и (гомологичные соответствующие индексы нейтрализации. Результаты приведены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 следует, что исходные титры изучаемых штаммов были неодинаковы. Инфекционная активность штамма QX имела существенные различия со всеми остальными материалами (p0.01). Это обстоятельство, очевидно, определенным образом отразилось и на значениях гомологичных индексов нейтрализации (INhom).

Однако следует отметить, что исходная инфекционная активность вируса не была связана с эффективностью гомологичной нейтрализации (Thom.). Например, установленное для самого активного штамма значение Thom.D274=0,688±0,104 существенно превосходило величину (p0,001) Thom.QX=0,063±0,063, соответствующую наименее активному штамму.

Таблица 5 - Значения исходных и гомологичных титров вируса, а также оценка гомологичных индексов нейтрализации вируса ИБК штаммов QX, Н120, 4/91 и D274

–  –  –

Таблица 6 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации штамма QX*, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, и SD27, и оценка соответствующих показателей односторонней антигенной удаленности (1/rs)

–  –  –

обозначения показателей см. в таблице 4;

* использованы средние оценки из таблицы 5;

** выделены средние значения;

*** # в скобках указан статистический оператор Шефе для дифференциации средних значений Приведенные в таблицах 6 и 7 данные демонстрируют, что все показатели односторонней антигенной удаленности (1/rs и 1/rv) штамма QX от исследуемых вариантов вируса ИБК по тесту были значимы. Это t=X/mtp0.05 свидетельствовало о том, что примененный тип оценок позволял обнаружить и количественно характеризовать искомый эффект антигенных различий. При этом установленные в обеих системах величины 1/r имели определенные различия.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.