WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Рисунок 5 – Тест-полоски из нитроцеллюлозной мембраны

Центральным вопросом при разработке серологического метода диагностики является подбор анти-лигандов. Корректный выбор анти-лигандов определяет в конечном счете информативность и правильность теста. Выявление поствакцинальных антител подразумевает использование таких анти-лигандов, которые позволят максимально точно оценить серологический иммунный ответ на вакцину и сформулировать заключение о наличии у испытуемого достаточного уровня защиты от инфекции. Если говорить о коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцине, то наиболее спорным вопросом является выбор оптимального коклюшного антигена.

Летальность дифтерии и столбняка обусловлены в первую очередь действием на организм дифтерийного токсина и тетаноспазмина [45, 131]. Антитела (антитоксины), относящиеся по своей структуре к IgG, играют решающую роль в предотвращении развития этих заболеваний. Концентрация антитоксинов у вакцинированных лиц является четким индикатором степени их защищенности. В состав современных вакцин входят дифтерийный и столбнячный анатоксины:

токсины, лишенные после химической обработки способности вызывать развитие симптомов заболевания, но сохранившие иммуногенные свойства.

Обезвреживание токсинов формальдегидом приводит к изменению состава антигенных детерминант [4, 134]. Тем не менее, высокий уровень корреляции между ИФА-тестами на антитела к токсину и анатоксину [152], а также между ИФА на антитела к анатоксину и реакциями нейтрализации токсинов in vivo [73; 136] свидетельствуют о возможности использования анатоксинов в качестве антилигандов в твердофазном дот-иммуноанализе.

Куда более сложным вопросом является корректный выбор антигена коклюшного микроба, антитела к которому можно рассматривать как протективные. Более того, стоит сразу отметить, что до сих пор нет единого мнения по поводу того, антитела какой направленности являются протективными [81, 120].

Красноречивый показатель такой неопределенности – разнообразные по своему составу коклюшные компоненты бесклеточных вакцин Наиболее [120].

популярными «кандидатами» являются коклюшный токсин, пертактин, филаментозый гемагглютинин (ФГА) и фимбрии 2 и 3, также существуют предложения включить в состав вакцин фрагмент липоолигосахарида B. pertussis [125], транспортный белок BrkA [97]. Данные Storsaeter [142] и Cherry [54], полученные в ходе клинических испытаний противококлюшных вакцин, свидетельствовали о значительной роли антител к пертактину и фимбриям 2 и 3 в противококлюшном иммунитете. Вклад в защиту антител к коклюшному токсину был признан меньшим, а протективные свойства антител к ФГА были поставлены под сомнение. В то же время в качестве ответа на выводы, представленные Storsaeter и Cherry, вышла публикация Hewlett и Halperin [80], в которой авторы призывали не переоценивать значимость полученных результатов. Они указывали на эффективность противококлюшной монокомпонентной вакцины, включавшей обезвреженный коклюшный токсин [148], а также большую сравнительную эффективность цельноклеточнй коклюшной вакцины, вызывающей продукцию более высоких уровней антител к коклюшному токсину, чем к гемагглютининам Кроме того, в более ранней публикации была [44]. Storsaeter [143] продемонстрирована большая сравнительная эффективность двухкомпонентной неклеточной противококлюшной вакцины (КТ+ФГА), чем монокомпонентной (КТ). В значительной степени ситуацию усложнила находка патогенных штаммов B. pertussis, не содержащих пертактина [47, 76, 123], защитная роль которого подчеркивалась целым рядом авторов [34, 78, 103, 135].

Поскольку не существует единого мнения относительно вклада антител против отдельных антигенов коклюшного микроба в защиту от инфекции, нет данных и об их защитном уровне. В то же время тест-система, предназначенная для оценки эффективности вакцинации должна давать некоторое заключение о наличии или отсутствии противоинфекционной защиты. Как уже было сказано ранее, протективные значения концентраций антител к КТ и пертактину, приведенные в публикациях Cherry и Storsaeter не могут рассматриваться как точные и окончательные. В связи с этим в ходе разработки перед нами встала проблема выбора антигена коклюшного микроба, который было бы целесообразно использовать в качестве анти-лиганда. В работах, проведенных в середине ХХ в.

[98, 102, 128], была продемонстрирована корреляция между титром агглютининов к суспензии клеток коклюшного микроба и вероятностью возникновения заболевания. В частности, титр 1:320 и выше рассматривался как протективный.

Позже эти данные не были подтверждены или опровергнуты [131]. В РФ титр агглютининов 1:160 считается защитным [16]. Именно это значение и было принято нами в качестве пограничного при разработке теста.

Для дифтерийного и столбнячного антитоксина титры антител более 0,1 МЕ/мл считали защитными [45, 131]. Однако помимо информации о наличии защитного титра антител всегда желательно оценить степень защищенности привитого. Подобный подход реализован в ряде коммерческих ИФА-тестов на антитела к дифтерийному и столбнячному анатоксинам, а именно в тест-наборах от Euroimmun (Германия), Immunolab (Германия), IBL International (Германия), Virotech (Германия), Progen (Германия). Выражается он в наличии рекомендаций относительно сроков вакцинации лиц с различными уровнями IgG. Рекомендации (Таблица по срокам вакцинации и мониторинга иммунитета лиц, 1) вакцинированных против столбняка основаны на данных, приведенных в работе [132]. В статье приводится краткое описание базы знаний ProMD, посвященной различным аспектам иммунизации против столбняка. На основании накопленных данных в базе знаний сформирована таблица, содержащая сведения о том, требуется ли серологический контроль, бустерная доза столбнячной вакцины, а также сроки этих процедур в зависимости от титра столбнячного антитоксина.

–  –  –

Аналогичные рекомендации относительно вакцинации против дифтерии основаны на публикациях [117, 130] (Таблица 2).

Несомненно, это лишь общие рекомендации, динамика снижения титра антител может варьировать у разных лиц индивидуально, к тому же в случае противодифтерийных антител немалое значение имеет их авидность [12]. Тем не менее, значения титров антител 0,1 и 1,0 МЕ/мл были использованы в качестве пограничных в разрабатываемой тест-системе и процедуру иммуноанализа выстраивали таким образом, чтобы разрешающая способность и воспроизводимость были оптимальными именно в этом диапазоне.

–  –  –

Материалы данной главы представлены в следующих публикациях:

Раев, М.Б. Иммунохроматографическая система для диагностики 1.

псевдотуберкулеза / М.Б. Раев, М.С. Бочкова, П.В. Храмцов и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – Т. 158. – №12. – С. 804.

Храмцов, П.В. Применение диагностикума на основе 2.

функционализированных углеродных наночастиц для мониторинга аффинной очистки иммуноглобулинов / П.В. Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – №6. – С. 612-618.

Храмцов, П.В. Диагностическая система для комплексной 3.

персонализированной оценки эффективности вакцинации / Храмцов П.В. // Российский иммунологический журнал. – 2014. – Т.8(17). – №3. – С.926-929.

Храмцов, П.В. Система индивидуальной оценки напряженности 4.

иммунитета к коклюшу / П.В. Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Цитокины и воспаление. – 2014. – Т.13. – №1. – С.128.

Глава 6. Характеристика реагентов, использовавшихся при конструировании тест-системы Для синтеза твердофазного реагента использовали столбнячный и дифтерийный анатоксины производства «Микроген» (Пермь).

Диагностический реагент получали путем конъюгирования углеродных наночастиц с G белком стрептококка. Чистота препаратов, используемых в иммуноанализе, имеет первостепенное значение для достижения требуемого уровня аналитических характеристик тест-системы. Наличие примесей может приводить к появлению ложноположительных результатов, вызванных неспецифическими реакциями, снижению уровня диагностического сигнала, ухудшению воспроизводимости.

Гомогенность белковых препаратов, использованных при разработке тестсистемы оценивали при помощи электрофореза в ПААГ.

Молекулярные массы столбнячного и дифтерийного анатоксина составляют соответственно 150 (две субъединицы 50 и 100 кДА) и 58 (две субъединицы 37 и 21 кДА) кДа. На электрофореграмме (рисунок 6) видно, что препараты анатоксинов не содержат примесей. Сильное размытие белковых зон связано с воздействием формальдегида. Помимо анатоксинов анализу подвергли препарат G белка в концентрациях 1 и 2 мг/мл. Согласно электрофореграмме (рисунок 7) молекулярная масса препарата составляет порядка 35 кДа, что соответствует данным, заявленным производителем.

Помимо анализа белковых препаратов был всесторонне охарактеризован углеродный диагностикум с позиции его структурно-функциональных свойств. В первую очередь была проведена оценка рабочего титра диагностикума. Рабочий титр – это условная величина, служащая точкой отсчета при дальнейшем подборе оптимальной концентрации диагностического реагента. Эта величина была установлена эмпирически [21] и соответствует разведению углеродного конъюгата до конечной концентрации углеродных частиц 0,03%. Концентрацию углеродных частиц определяли спектрофотометрически. По величине поглощения при длине волны 450 нм было установлено, что массовая доля углеродных частиц в синтезированном конъюгате составляет 0,9%, что соответствует рабочему титру 1:30. Кроме того, при помощи анализатора частиц провели оценку распределения углеродных наночастиц в конъюгате по размеру. Средний размер функционализированных G белком углеродных наночастиц составил 97 нм, что соответствует полученным ранее данным для других партий диагностикума [26].

Рисунок 6 – Электрофоретическая оценка гомогенности препаратов столбнячного и дифтерийного анатоксинов. М – маркеры с соответствующими молекулярными массами, Д – дифтерийный анатоксин, С

– столбнячный анатоксин.

Рисунок 7 – Электрофоретическая оценка гомогенности препарата G белка. М – маркеры с соответствующими молекулярными массами, G1 и G2 – G белок в концентрациях 1 и 2 мг/мл

Материалы данной главы представлены в следующих публикациях:

Раев, М.Б. Углеродные наночастицы с ковалентно 1.

функционализированной поверхностью: синтез, физико-химические свойства, использование в клинической диагностике и перспективы применения / М.Б. Раев, П.В. Храмцов, М.С. Бочкова // Вестник Пермского университета. Серия: Биология.

– 2015. – № 1. – С. 82-90.

Раев, М.Б. Исследование размеров углеродных наночастиц, ковалентно 2.

функционализированных белковыми макромолекулами / М.Б. Раев, П.В. Храмцов, М.С. Бочкова // Российские нанотехнологии. – 2015. – Т.10. – №1-2. – С. 112-118.

Глава 7. Оптимизация процедуры оценки результатов анализа

7.1. Воспроизводимость измерений интенсивности сигнала Применение цифровой обработки результатов анализа и программного измерения интенсивности сигнала включает в себя несколько этапов. Во-первых, это сканирование тест-полосок, во-вторых измерение интенсивности фонового сигнала и окрашивания точек, в-третьих обработка результатов анализа в табличном редакторе. Особенности сканирования отдельных тест-полосок и индивидуальные особенности программной обработки результатов сканирования делают итоговый вклад в вариацию измерений. Степень этой вариации определяет пригодность метода для проведения оценки результатов. Так, если результаты измерений одной и той же тест-полоски отличаются между собой при проведении нескольких независимых измерений, то это означает, что метод измерения непригоден, и его результатам нельзя доверять. Характеристикой меры пригодности служит величина коэффициента вариации, полученного при проведении нескольких повторных измерений одной и той же тест полоски. В работе [95] пограничное значение коэффициента вариации составило 2%. Кроме того, в качестве сравнения можно обратиться к техническим характеристикам современных ИФА-ридеров. В качестве примера был выбран популярный микропланшетный ридер iMark™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad, США).

Коэффициент вариации его измерений составляет 1-1,5% в зависимости от оптической плотности образца.

Для установления степени вариации при измерениях оптической плотности отобрали 8 тест-полосок с точками различной степени яркости. Тест-полоски сканировали, убирали с поверхности сканера, затем вновь помещали на нее и повторно сканировали. Всего процедуру сканирования повторяли пятикратно.

Каждый скан сохраняли в виде отдельного файла. Далее на каждой тест-полоске выбирали одну из точек и проводили измерение их оптических плотностей.

Процедуру измерения также проводили для каждого скана, т.е. пятикратно. Для каждой точки по результатам пяти измерений находили среднюю величину оптической плотности и коэффициент вариации. Результаты выражали в виде профиля точности [62], т.е. зависимости величины коэффициента вариации (КВ) от оптической плотности (рисунок 8).

Из приведенного графика видно, что при оптической плотности более 10 единиц КВ меньше 2%, за исключением значения 20 единиц, где КВ равен 2,4%.

Если говорить об абсолютных величинах, то вариация находится в пределах 1 оптической единицы. Исходя из полученных данных можно заключить, что предлагаемый метод измерения оптических плотностей обладает требуемой степенью прецизионности.

Рисунок 8 – Профиль точности измерений оптической плотности точек на тест-полосках. КВ – коэффициент вариации. ОП – оптическая плотность

7.2. Подбор фактора коррекции гаммы изображения Программа ImageJ, используемая нами для измерения интенсивности сигнала предоставляет возможность производить программную коррекцию параметров изображения (яркость, контрастность, добавлять размытие и т.д.). Подобная программная корректировка является независимой от исследователя, и, следовательно, не влияет на объективность измерения, при этом она может привести к улучшению аналитических характеристик теста, в частности воспроизводимости. Разумеется, подобные манипуляции с изображением являются искусственными, однако упомянутое отсутствие субъективности не позволяет утверждать об их неправомерности. Мы не стали слишком усложнять процедуру измерения коррекцией всего ряда параметров изображения, которая может быть выполнена в программе ImageJ и ограничились лишь изменением фактора коррекции гаммы (Меню инструментов программы ImageJ Process Math Gamma). Опция позволяет применить функцию f(p) = (p255)Y 255 ко всем пикселям изображения. Параметр Y и является фактором коррекции гаммы, его величина может варьировать в диапазоне 0,1 Y 5,0. Ранее было продемонстрировано использование коррекции гаммы изображения при оценке результатов иммунохроматографических тестов [74], а также при определении общего белка в твердофазном иммуноанализе (http://dot-it-spot-it.com/wpcontent/uploads/2015/03/Detection-March-2015.pdf). Визуально легко заметить, что увеличение фактора Y в целом усиливает интенсивность окрашивания. Это приводит к тому, что точки становятся более насыщенными, однако поверхность тест-полоски приобретает неоднородность. Таким, образом с одной стороны происходит снижение КВ за счет увеличения средней оптической плотности точек, а с другой увеличение разброса значений при измерениях за счет неоднородности окрашивания. Нашей задачей было подобрать оптимальное значение фактора Y, при котором воспроизводимость анализа и его разрешающая способность были бы оптимальными.

Для проведения измерений были взяты тест-полоски, полученные в ходе оценки внутрисерийной воспроизводимости определения антител к столбняку.

Полное описание эксперимента будет приведено в дальнейшем.

Столбнячный анатоксин сорбировали на 32 нитроцеллюлозных стрипа, по 2 точки на стрип. После высушивания стрипы разделили на 8 групп по 4 штуки.

Каждую группу стрипов инкубировали с двукратными разведениями стандарта противостолбячного анатоксина, начиная с концентрации 0,1 МЕ/мл. Связавшиеся с анти-лигандом антитела детектировали углеродным диагностикумом. После окончания реакции диски промывали, высушивали и сканировали. Таким образом, реакция с каждым из разведений стандарта проводилась в 8 повторностях.

На графике (рисунок 9) показана зависимость формы калибровочной кривой от значения фактора коррекции. Уже двукратное его увеличение сопровождается возрастанием величины интервалов между отдельными точками, наиболее это выражено при значениях оптических плотностей менее 100. В пределах более высоких значений графики располагаются практически параллельно.

Рисунок 9 – Зависимость формы калибровочной кривой от значения фактора коррекции гаммы. ОП –оптическая плотность Воспроизводимость оценивали по профилям точности. В целом, увеличение Y-фактора приводило к снижению вариабельности результатов на всем протяжении диапазона концентраций. Для сравнения влияния фактора коррекции гаммы на воспроизводимость теста значения КВ для всех 8 точек суммировали и сравнивали между собой. Наименьшая сумма была получена при Y=2. Под разрешающей способностью анализа понимали отношение разброса значений оптической плотности для каждой точки (выраженное в виде стандартного отклонения) к разнице оптических плотностей между соседствующими с ней точками. Для минимального и максимального значений оптической плотности значение стандартного отклонения делили на удвоенное расстояние до соседней точки. Подобный подход связан с тем, что рост абсолютных значений расстояния между точками при возрастании фактора Y сопровождается увеличением разброса (стандартного отклонения).

Иными словами, при некотором высоком значении фактора Y ошибка измерений, вызванная повышением неоднородности окрашивания нивелирует позитивный эффект от увеличения абсолютных значений оптической плотности, т.е. снижается разрешающая способность анализа (Рисунок 10). Наименьшие значения отношения величины стандартного отклонения к интервалу между двумя значениями свидетельствует о лучшей разрешающей способности анализа.

Наибольшая разрешающая способность была получена при Y равном двум.

Рисунок 10 – Увеличение разброса значений оптической плотности при увеличении гамма-фактора. ОП – оптическая плотность

Материалы данной главы представлены в публикации:

Храмцов, П. В. Конструирование и оптимизация интерпретации результатов неинструментального столбнячного серологического теста / П.В. Храмцов, М.С.

Бочкова, М.Б. Раев // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т.9 (18). – №2 (1). – С.172–174.

Глава 8. Оптимизация процедуры анализа

8.1. Подбор оптимальной концентрации диагностического реагента Существуют различные подходы к определению оптимальной концентрации диагностикума в иммуноанализе. Разумеется, наиболее очевидный путь – подбор титра диагностикума и длительности детекции для конкретной пары «антилиганд—лиганд». Однако при разработке тест-системы, предназначенной для выявления нескольких лигандов такой подход неприменим. В нашей работе мы воспользовались методикой, описанной в монографии Crowther [60]. Она заключается в оценке калибровочной кривой, получаемой при прямом определении лиганда, сорбированного на твердую фазу. Наименьшее разведение диагностикума, обеспечивающее высокий уровень аналитического сигнала и высокую чувствительность теста принимается в качестве рабочего.

Предварительные испытания продемонстрировали, что традиционно применяемая нами схема детекции (15-минутная инкубация при комнатной температуре) не обеспечивает надлежащей чувствительности анализа для работы в заявленном диапазоне концентраций, в частности в отношении дифтерийного анатоксина.

Поэтому длительность инкубации подбирали с целью максимально увеличить уровень диагностического сигнала. Желание увеличить чувствительность анализа путем увеличения длительности инкубации, связано прежде всего с необходимостью минимизировать количество дорогостоящего конъюгата. При подборе длительности инкубации мы исходили из того, что максимальное приемлемое время детекции составляет 60 минут.

Первоначально нами был проведен подбор оптимальной длительности инкубации. На диски из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 5 мм сорбировали IgG, разведенный в ЗФР до концентрации 0,01 мг/мл, диски высушивали в течении двух часов и помещали в лунки 72-х-луночного планшета для серологических реакций.

Диски блокировали 100 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ в течение часа. Перед промывкой блокатор удаляли из лунок при помощи водоструйного насоса, вносили в них 300 мкл промывочного буфера и инкубировали в течение 5 мин., после чего описанный цикл промывки повторяли дважды. Пятиминутная инкубация с буфером необходима для эффективной промывки, поскольку нитроцеллюлоза является пористым материалом и биомолекулам требуется некоторое время на диффузию из толщи нитроцеллюлозного диска в раствор. После промывки в лунки вносили по 100 мкл дианостикума, разведенного в ЗФРТ до рабочего титра 1:30. Длительность инкубации с диагностикумом составляла 15, 30 и 60 мин. Каждое исследование проводили в 4-х повторностях. Таким образом, всего было использовано 12 дисков с сорбированным IgG. Кроме того, в каждом из исследований параллельно тестировали контрольные диски с сорбированным БСА в концентрации 0,01 мг/мл.

По окончанию детекции диски трехкратно промывали ЗФРТ описанным способом и высушивали.

Процедуры блокирования и детекции проводили во влажной камере при температуре +37°С и мягком перемешивании на шейкере. В дальнейших экспериментах в аналогичных условиях осуществляли все этапы анализа, за исключением промывки.

Было продемонстрировано, что при увеличении времени инкубации дисков в растворе углеродного диагностикума возрастает интенсивность сигнала (Рисунок 11). Наиболее существенна разница между 15-ю и 30-ю минутами. При продлении инкубации до 60 мин оптическая плотность точек увеличивается, но не столь существенно. Тем не менее на наш взгляд достижение высокой чувствительности сигнала более приоритетно, чем сокращение его длительности, поэтому в дальнейших экспериментах мы проводили часовую детекцию антител.

Для определения оптимального титра диагностикума мы осуществляли сравнение калибровочных кривых прямой детекции IgG на твердой фазе кратными разведениями углеродного конъюгата. Всего тестировали четыре 1,5-кратных разведения диагностикума: 1:30, 1:45, 1:67, 1:101.

На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны наносили по две точки IgG, разведенного в ЗФР. Для тестирования использовали 8 кратных двум разведений иммуноглобулина, начиная с концентрации 0,01 мг/мл. Стрипы высушивали в течение двух часов, помещали в лунки планшетов из ABS-пластика и блокировали 150 мкл 1%-ного раствора БСА в ЗФРТ в течение 60 мин. По окончании блокирования тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ. Затем в лунки вносили по 150 мкл углеродного диагностикума, разведенного в ЗФРТ до указанных выше титров. Спустя час стрипы трехкратно промывали ЗФРТ, высушивали и производили учет результатов.

Рисунок 11 – Влияние длительности инкубации иммуносорбента с диагностикумом на интенсивность сигнала (± 95% доверительный интервал).

ОП – оптическая плотность, БСА – бычий сывороточный альбумин Анализ полученных калибровочных кривых продемонстрировал, что все разведения диагностикума обеспечивают практически идентичную чувствительность. Наибольшая оптическая плотность была достигнута при разведении углеродного диагностикума в 45 раз, которое и использовалось в дальнейшем в качестве рабочего (Рисунок 12).

Рисунок 12 – Зависимость оптической плотности от титра диагностикума. ОП – оптическая плотность

8.2. Подбор режима блокирования неспецифических взаимодействий Неспецифические взаимодействия меду компонентами иммунодиагностической системы могут приводить к повышению уровня фонового сигнала, изменению оптической плотности окрашенных точек и, как следствие, ложноположительным, ложноотрицательным и неточным результатам. В ходе анализа такие взаимодействия могут происходить между диагностикумом и твердой фазой (ввиду способности последней к сорбции белков), между белками сыворотки и твердой фазой и т.д. Это приводит к избыточному связыванию конъюгированных с G белком углеродных наночастиц с поверхностью тестполоски, либо, напротив, к экранированию сайтов специфического связывания и снижению аналитического сигнала. Для ее решения проблемы неспецифических взаимодействий в процедуру анализа вводят этап блокирования, оптимизируют режимы промывок, подбирают концентрации компонентов и режимы инкубации.

Процедура блокирования заключается в заполнении свободных сайтов связывания на твердой фазе молекулами инертного белка и детергентов [83]. В качестве инертных белков чаще всего используют БСА, человеческий сывороточный альбумин, казеин, сухое молоко, нормальную сыворотку кролика или лошади, желатин, сыворотку плода коровы. Наиболее популярными детергентами в иммуноанализе являются Твин-20, Твин-80, Тритон Х-100, додецилсульфат натрия [60]. Кроме того, для снижения интенсивности неспецифических взаимодействий используют растворы полимеров, такие как поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль [83].

Ранее в нашей лаборатории уже проводились работы по подбору блокирующих реагентов в различных дот-иммуноаналитических системах с использованием углеродных наночастиц, в частности Наибольшую [3].

эффективность демонстрировал блокирующий буфер, представлявший собой 0,1%-ный раствор Твина-20 в ЗФР. Применение этого раствора не требовало добавления дополнительных белковых блокаторов, наиболее эффективным из которых был БСА. Стоит, однако заметить, что подбор блокирующего реагента – процедура сугубо индивидуальная для каждой тест-системы, что обусловлено потенциальной возможностью неспецифического взаимодействия диагностикума с новым анти-лигандом, либо наличием сходных эпитопов у лиганда и одного из анти-линандов. Использование для сенсибилизации твердой фазы цельных клеток коклюшного микроба, весьма сложного по своей структуре реагента, обязывало нас провести подбор оптимального блокатора. Тестирование блокирующих реагентов проводили отдельно для каждого из анти-лигандов с целью выбрать компромиссный вариант. В качестве источника антител в анализе использовали высокотитражные сыворотки вакцинированных детей, содержащие столбнячный и дифтерийный анатоксин в концентрации более 1 МЕ/мл, а также имеющие титр более 1:640 в реакции агглютинации.

На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны сорбировали в дублях столбнячный анатоксин (0,1 мг/мл), дифтерийный анатоксин (0,1 мг/мл), суспензию коклюшных микробов (10 МОЕ), разведенные в ЗФР. Объем наносимых анти-лигандов составлял 3,5 мкл. Тест-полоски высушивали в течении двух часов при комнатной температуре и помещали в лунки 48-луночного планшета из ABSпластика. В лунки вносили блокирующий раствор в объеме 150 мкл на 60 мин.

Тестировали следующие блокаторы:

1. ЗФРТ+1% БСА

2. ЗФРТ+1% казеин

3. ЗФРТ+1% сухое молоко Далее тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и вносили в лунки на 30 мин по 150 мкл сывороток крови, разведенных 1:10 и 1:100 в соответствующем блокирующем растворе. По окончании инкубации с сыворотками тест-полоски вновь промывали и производили часовую детекцию антител при помощи 150 мкл углеродного диагностикума, разведенного в ЗФРТ до рабочего титра. Спустя час диски промывали ЗФРТ, высушивали и производили учет результатов.

Блокаторы оценивали по двум критериям: уровень сигнал/фон (по оптической плотности точек) и однородность фонового сигнала (отсутствие различий между окрашиванием фона в пределах как одной тест-полоски, так и различных тест-полосок). Для сравнения соотношения сигнал/фон суммировали оптические плотности точек и сравнивали полученные суммы для каждого блокатора. Однородность сигнала оценивали, рассчитывая коэффициенты вариации для фонового сигнала тест-полосок. Равномерность фонового сигнала, отсутствие пятен, разводов имеет немалое значение для удобства измерений, а также получение корректных и воспроизводимых результатов. При этом КВ для тест-полосок, которые инкубировали с разведениями сывороток 1:10 и 1:100 вычисляли отдельно.

На гистограмме суммированы данные по оптическим плотностям для каждого из блокаторов. В каждом случае наибольшее соотношение сигнал/фон было достигнуто при использовании БСА в качестве блокатора (Рисунок 13).

Применение БСА также позволило добиться наибольшей однородности фонового сигнала: коэффициенты вариации были наименьшими как при разведении сывороток 1:10, так и 1:100, кроме единственного случая: детекции антител к коклюшному антигену в сыворотках крови, разведенных 1:10. В целом, стоит отметить, что при большем разведении сывороток крови разброс значений фонового сигнала снижался для БСА и сухого молока. Для казеина четкой закономерности выявлено не было (Рисунок 14).

Рисунок 13 – Влияние блокаторов на оптическую плотность точек для каждого из анти-лигандов. ОП – суммарная оптическая плотность всех точек Рисунок 14 – Сравнение коэффициентов вариации значений интенсивности фонового сигнала для блокаторов при инкубации тест-полосок с сыворотками, разведенными 1:10 и 1:100. КВ – коэффициент вариации После того, как БСА был выбран для дальнейшего использования в качестве белкового блокатора, мы проверили, будет ли эффективным увеличить концентрацию белка в блокирующем буфере. Мы повторили эксперимент, но на этот раз сравнивали между собой блокирующие растворы, содержащие 1, 2 и 4% БСА. Какого-либо эффекта от изменения концентрации белка нами выявлено не было. В последующих экспериментах в качестве блокирующего буфера использовали ЗФРТ, содержащий 1% БСА.

8.3. Подбор оптимальных концентраций анти-лигандов и длительности инкубации с сыворотками крови Концентрации анти-лигандов подбирали методом шахматного титрования и последующего сравнения полученных калибровочных кривых. Форму калибровочной кривой выбирали, исходя из того, что диагностически значимые точки должны находится на крутых участках калибровочных кривых, абсолютная разница в оптической плотности между ними должна быть как можно более велика, но при этом они должны попадать в диапазон максимально высоких оптических плотностей для улучшения воспроизводимости результатов. При этом следует учитывать тот факт, что в анализе желательно использовать большое разведение сыворотки крови для снижения влияния сывороточных белков на результаты теста.

Кроме того, время инкубации с образцом должно быть одинаковым для каждого аналита, следовательно, конечный выбор будет представлять не идеальный, а компромиссный вариант, который позволит добиться приемлемых аналитических характеристик тест-системы в детекции каждого из аналитов.

Для проведения процедуры калибровки использовали международные стандарты столбнячного и дифтерийного антитоксинов с изначальными концентрациями 120 и 2 МЕ/мл соответственно. Стандарты представляют собой лиофильно высушенные препараты фракции полученные из пула IgG, человеческих сывороток. Данные стандарты используются при конструировании серологических тест-систем на дифтерию и столбняк.

Получение калибровочных кривых детекции коклюшных антител проводили при помощи пулов сывороток крови детей, вакцинированных цельноклеточной противококлюшной вакциной. Всего использовали 4 пула сывороток с титрами антител в реакции агглютинации 1:10, 1:40, 1:160 и 1:640. Каждый пул включал в себя по 200 мкл сыворотки от 10 детей с соответствующим титром противококлюшных антител. Полученные пулы были тщательно перемешаны и в каждый из них внесли по 1 мкл концентрированного раствора азида натрия в ЗФР.

Конечная концентрация азида натрия составила 0,01%. Анализ на антитела к коклюшу мы планировали выполнить в качественном варианте (протективный титр 1:160: да/нет). Предварительные испытания, а также опыт предыдущих исследований свидетельствовали о том, что чувствительность детекции антител будет достаточна для работы с сыворотками крови в титрах не более 1:40-1:80.

Именно поэтому подбор условий для детекции противококлюшных антител производили в пределах этих разведений.

8.4. Оптимизация условий детекции противококлюшных антител На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны в дублях сорбировали суспензию клеток коклюшного микроба в концентрациях 20, 10, 5 и 2,5 МОЕ. Суспензию разводили в ЗФР, объем наносимой на подложку суспензии составлял 3,5 мкл.

Стрипы высушивали при комнатной температуре в течение двух часов и помещали в лунки планшета, изготовленного из ABS-пластика. После часового блокирования 150 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали со 150 мкл пулированных сывороток крови, разведенных в блокирующем растворе 1:20, 1:40 и 1:80 в течение 15, 30 и 60 мин. По окончании инкубации стрипы трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и производили детекцию 150 мкл углеродного диагностикума в течение часа. Затем тест-полоски вновь промывали, высушивали и производили учет результатов (Рисунок 17).

При подборе наилучшей калибровочной кривой учитывали ее форму в диапазоне титров 1:40 – 1:160 – 1:640. Оптимальными условиями считали такие, при которых будет наблюдаться наибольшая разница абсолютных значений оптических плотностей для точек 1:40 и 1:640, а кривая будет наиболее равномерной. Степень равномерности оценивали по формуле Р=|(ОП 1:640-ОП 1:160)-(ОП 1:160-ОП 1:40)|, чем меньше полученное число, тем более равномерный наклон кривой в целевом диапазоне. Значение обоих параметров иллюстрирует рисунок 15.

Рисунок 15 – Различная форма графиков, показывающих зависимость оптической плотности от концентрации антител. ОП – оптическая плотность Оба графика 1 и 2 прирастают практически на одинаковую величину, однако кривая 1 имеет одинаковый наклон на всем протяжении (показатель Р=6,2), график 2 на первом отрезке пологий, а на втором круто возрастает (показатель Р=47,1).

Наличие пологих участков приводит к низкой разрешающей способности анализа, поскольку разница в значениях оптической плотности между соседними точка становится сравнима с вариацией значений оптической плотности для отдельной точки.

Наилучшие результаты был получены при получасовой инкубации твердой фазы, на которую сорбирована суспензия клеток коклюшного микроба в концентрации 20 МОЕ, с сывороткой крови в разведении 1:40 (Рисунок 16).

Рисунок 16 – Зависимость формы калибровочной кривой детекции антител к коклюшному микробу от концентрации анти-лиганда, длительности инкубации с сывороткой крови и ее титра. ОП – оптическая плотность. Концентрации анти-лиганда: А – 20 МОЕ, Б – 10 МОЕ, В – 5 МОЕ, Г – 2,5 МОЕ

8.5. Подбор оптимальных условий детекции столбнячных и дифтерийных антител На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны сорбировали в дублях столбнячный и дифтерийный анатоксины, разведенные в ЗФР до концентраций 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,012 и 0,006 мг/мл. Объем наносимого на подложку анти-лиганда составлял 3,5 мкл. После этого стрипы высушивали в течение двух часов при комнатной температуре и помещали в лунки планшетов из ABS-пластика.

После часового блокирования 150 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ тестполоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали со 150 мкл стандартов дифтерийного и столбнячного антитоксинов в восьми концентрациях, кратных двум, начиная с 0,1 МЕ/мл в течение 15, 30 и 60 мин. По окончании инкубации стрипы трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и производили детекцию 150 мкл углеродного диагностикума в течение часа. Затем тест-полоски вновь промывали, высушивали и производили учет результатов.

Кривые зависимости ОП от концентрации антител представлены на рисунках. Детекцию дифтерийного и столбнячного антитоксинов необходимо осуществлять в диапазонах от 0,01 до 0,1 МЕ/мл, что соответствует шести серийным двукратным разведениям. Оптимальная калибровочная кривая должна давать наибольшую разницу значений ОП в диапазоне любых шести серийных разведений, при этом минимальная ОП должна быть как можно более высокой, вследствие снижения воспроизводимости результатов при низких значениях ОП.

Кроме того, предпочтение отдавалось снижению длительности анализа и возможности увеличить разведение исследуемого образа сыворотки.

Учитывая перечисленные факторы, а также результаты подбора условий для выявления коклюшных антител, оптимальными для сенсибилизации твердой фазы концентрациями дифтерийного и столбнячного анатоксинов являются 0,1 мг/мл и 0,05 мг/мл соответственно (Рисунки 17 и 18). Оптимальное время инкубации образца составляет 30 минут. Такие условия анализа позволяют детектировать антитела в сыворотке крови, разведенной 1:40.

Рисунок 17 – Зависимость формы калибровочной кривой детекции антител к столбнячному анатоксину от концентрации анти-лиганда и длительности инкубации с сывороткой крови. ОП – оптическая плотность Рисунок 18 – Зависимость формы калибровочной кривой детекции антител к дифтерийному анатоксину от концентрации анти-лиганда и длительности инкубации с сывороткой крови. ОП – оптическая плотность

Материалы данной главы представлены в следующих публикациях:

Храмцов, П. В. Конструирование и оптимизация интерпретации 1.

результатов неинструментального столбнячного серологического теста / П.В.

Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т.9 (18). – №2 (1). – С.172–174.

Храмцов, П.В. Диагностическая система для комплексной 2.

персонализированной оценки эффективности вакцинации / Храмцов П.В. // Российский иммунологический журнал. – 2014. – Т.8(17). – №3. – С.926-929.

Храмцов, П.В. Система индивидуальной оценки напряженности 3.

иммунитета к коклюшу / П.В. Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Цитокины и воспаление. – 2014. – Т.13. – №1. – С.128.

Глава 9. Определение аналитических характеристик тест-системы

В настоящее время нет единого набора точных требований, предъявляемых к аналитическим характеристикам полуколичественных серологических тестсистем, в том числе тех, которые предполагают использование в качестве метки окрашенных частицы. В настоящей работе в качестве основы для определения набора аналитических параметров тест-системы и способа их определения были взяты принципы валидации количественных иммуноферментных тестов.

Причиной такого решения является то, что принципы стандартизации и валидации количественных ИФА разработаны наиболее полно.

9.1. Воспроизводимость детекции антител к коклюшу, дифтерии и столбняку, профиль точности анализа Одной из основных характеристик тест-системы является ее воспроизводимость, определяющая степень разброса результатов серии одинаковых анализов. Наличие воспроизводимости оценивают по величине коэффициента вариации, для ИФА-тестов приемлемой считается величина КВ15% [60]. Существенной характеристикой аналитического метода является профиль точности анализа: зависимость величины коэффициента вариации диагностического сигнала от концентрации аналита. Профиль точности анализа может служить инструментом для определения минимального предела рабочего диапазона тест-системы, который равен в таком случае минимальной концентрации аналита, при которой КВ имеет величину менее 15% [158].

На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны в 8-ми повторностях сорбировали суспензию клеток B. pertussis в концентрации 20 МОЕ. Суспензию разводили в ЗФР, объем наносимой на подложку суспензии составлял 3,5 мкл.

Стрипы высушивали при комнатной температуре в течение двух часов и помещали в лунки планшета, изготовленного из ABS-пластика. После часового блокирования 150 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали со 150 мкл пулированных сывороток крови в разведении 1:40. Далее стрипы промывали и производили детекцию 150 мкл углеродного диагностикума, разведенного в 45 раз в ЗФРТ в течение часа. По окончании детекции тест-полоски промывали, высушивали и производили учет результатов.

Профиль зависимости коэффициентов вариации оптических плотностей от титра коклюшных антител представлен на графике (Рисунок 19). Для всех контрольных точек КВ был менее 15%.

Рисунок 19 – Профиль точности детекции противококлюшных антител.

КВ – коэффициент вариации Аналогичным образом тестирование проводили для столбняка и дифтерии.

На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны в 8-ми повторностях сорбировали столбнячный и дифтерийный анатоксины в концентрациях 0,05 и 0,1 мг/мл соответственно. Анатоксины разводили в ЗФР, объем растворов наносимых на подложку анти-лигандов составлял 3,5 мкл. Стрипы высушивали при комнатной температуре в течение двух часов и помещали в лунки планшета, изготовленного из ABS-пластика. После часового блокирования 150 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали с восемью двукратными разведениями стандартов антитоксинов. Для разведения стандартов использовали блокирующий буфер, стартовая концентрация антитоксинов составляла 0,1 МЕ/мл. Длительность инкубации составляла 30 мин, по ее окончании иммуносорбент промывали и производили часовую детекцию антител углеродным диагностикумом, разведенным в ЗФРТ в 45 раз. Далее диски промывали, высушивали и производили учет результатов.

На основании данных оптических плотностей строили калибровочную кривую, которую описывали при помощи уравнения логистической функции с пятью параметрами. Выбор функции обусловлен ассимметричной S-образной формой калибровочных кривых. Подбор значения параметров логистической функции проводили при помощи специализированного интернет-сервиса www.elisaanalysis.com.

Рисунок 20 – Профили точности детекции антител к дифтерии и столбняку. КВ – коэффициент вариации При помощи полученной калибровочной кривой оптические плотности переводили в концентрации антитоксина и рассчитывали для них КВ. Профили точности детекции антитоксинов приведены на рисунке 20. Согласно полученным результатам коэффициент вариации лежит в пределах 15% вплоть до концентрации 1,6 мМЕ/мл. Таким образом, воспроизводимость тест-системы является удовлетворительной на протяжении рабочего диапазона значений концентраций антител.

9.2. Параллелизм В ходе разработки метода серологической диагностики оценка параллелизма проводится для демонстрации того, что калибровочные кривые полученные для референсного образца (стандарта), содержащего аналит, могут быть использованы для точного определения концентрация того же аналита в сыворотке крови. Это выражается в наличии или отсутствии параллельности между калибровочной кривой стандарта и кривой «доза-сигнал» образца сыворотки крови [140].

Причина отсутствия параллелизма кроется в различиях между референсом и исследуемым образцом. В первую очередь это так называемый «эффект матрицы».

Под «эффектом матрицы» понимается наличие в исследуемом образце соединений, которые могут неспецифически повлиять на результат анализа, например, за счет неспецифического связывания с анти-лигандом и диагностикумом (что может привести к завышенному уровню сигнала) либо за счет препятствования связыванию целевых антител (что приводит к заниженному сигналу) [146]. К факторам сыворотки крови, влияющим на точность анализа и определяющим «эффект матрицы» относятся: альбумин, гемоглобин, компоненты IgG, комплемента, фибрин, билирубин, ревматоидный фактор и т.д. [155].

Другим фактором, потенциально являющимся причиной различий между калибровочной кривой стандартного образца является различная аффинность антител калибратора и образца. Пробы с высокоаффинными антителами будут демонстрировать завышенные результаты анализа, образцы сыворотки крови с низкоаффинными антитела – наоборот Оптимальным считается [155].

использование калибраторов, содержащих репрезентативный по своей аффинности набор антител. В настоящей работе в качестве референсов были использованы стандартные образцы столбнячного (TE-3, 1-й Международный стандарт ВОЗ) и дифтерийного (10/262, 1-й Международный стандарт ВОЗ) антитоксинов, отвечающие требованию репрезентативности по спектру аффинности антител.

Для определения наличия параллелизма использовали метод, описанный в работе Plikaytis [119]. Он состоит в оценке коэффициента вариации для значений концентрации антител в тестируемых кратных разведениях сывороток, рассчитанных относительно калибровочной стандартного образца антител (англ.

Back-calculated titers).

Основная причина применения именно такого подхода обрисована самими авторами упомянутой статьи. Наиболее популярным методом определения параллелизма между кривыми «доза-ответ» стандарта и образца является применение дисперсионного анализа. Однако зачастую этот метод является слишком чувствительными, и, как показывает автор, может давать противоположные результаты для практически идентичных пар кривых [119]. В публикациях Callahan с соавт. и Novick с соавт. была продемонстрирована некорректность классического подхода, основанного на введении нулевой гипотезы о равенстве угловых коэффициентов калибровочных кривых и предложен метод сравнения эквивалентности угловых коэффициентов [51, 112]. Позже этот способ был адаптирован для кривых, описываемых логистическим уравнением [86]. Однако и тест на эквивалентность также не оказался оптимальным решением [161].

Тест на параллелизм проводили в соответствии с пошаговым алгоритмом, приведенным в работе [119]:

1. Построить калибровочную кривую для стандарта антител, используя желаемую математическую модель (коэффициент детерминации должен быть более 0,95);

2. Отбросить те разведения образца, для которых оптические плотности лежат за границами верхнего и нижнего пределов детекции (в нашем случае это оптические плотности, соответствующие нижнему пределу детекции стандартов антитоксинов 1,6 мМЕ/мл );

3. Рассчитать КВ для оптических плотностей каждого из разведений сыворотки, приступить к следующему шагу, если КВ15%;

4. Рассчитать концентрации антител для всех повторностей каждого разведения, использую полученную калибровочную кривую и вычислить КВ для концентраций антител в каждом из разведений;

5. Если полученные КВ20%, то можно утверждать о наличии параллелизма.

На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны сорбировали столбнячный анатоксин в концентрации 0,05 мг/мл, разведенный в ЗФР по 3,5 мкл на точку.

Стрипы высушивали в течение двух часов при комнатной температуре и помещали в лунки планшетов из ABS-пластика. Блокирование осуществляли в течение 60 мин 150 мкл 1%-ного раствора БСА в ЗФРТ. Далее тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали с восемью двукратными разведениями стандарта столбнячного антитоксина в блокирующем буфере, начиная с концентрации 0,1 МЕ/мл. Часть тест-полосок инкубировали с двукратными разведениями трех сывороток, содержащих антитела к столбнячному анатоксину в концентрации более 1 МЕ/мл. Для сывороток крови стартовое разведение составляло 1:40.

Тестирование для каждой концентрации стандарта и сыворотки проводили в шести повторностях. Длительность инкубации с образцами 30 мин, а объем образцов – 150 мкл. После окончания инкубации стрипы промывали и производили детекцию углеродным диагностикумом, разведенным в ЗФРТ 1:45, в течение часа, после чего тест-полоски вновь промывали, высушивали и проводили учет результатов.

Наличие параллелизма при детекции дифтерийного антитоксина осуществляли аналогичным образом, за исключением концентрации анти-лиганда:

она составляла 0,1 мг/мл.

На основании полученных данных «доза-ответ» были построены калибровочные кривые, для описания которых использовали уравнение логистической кривой с пятью параметрами.

Калибровочная кривая для стандарта столбнячного антитоксина описывалась уравнением со следующими параметрами: a=202,105, b= -0,944, c= 0,031, d= -6,254, g= 0,73 (R2=0,979), для дифтерийного анатоксина: a=163,485, b= -2,346, c= 0,038, d=

-5,572, g= 0,25 (R2=0,995).

Значения коэффициента вариации концентраций столбнячного и дифтерийного антитоксинов для каждого из разведений сывороток были менее 20%, что свидетельствует о наличии параллелизма.

Материалы данной главы представлены в следующих публикациях:

Храмцов, П. В. Конструирование и оптимизация интерпретации 1.

результатов неинструментального столбнячного серологического теста / П.В.

Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т.9 (18). – №2 (1). – С.172–174.

Храмцов, П.В. Диагностическая система для комплексной 2.

персонализированной оценки эффективности вакцинации / Храмцов П.В. // Российский иммунологический журнал. – 2014. – Т.8(17). – №3. – С.926-929.

Храмцов, П.В. Система индивидуальной оценки напряженности 3.

иммунитета к коклюшу / П.В. Храмцов, М.С. Бочкова, М.Б. Раев // Цитокины и воспаление. – 2014. – Т.13. – №1. – С.128.

Глава 10. Исследование сывороток крови при помощи референсных тестсистем

10.1. Содержание антител к коклюшу у детей различных возрастных групп

Все дети, участвующие в эксперименте, были разбиты на 6 возрастных групп:

2 недели – 3 месяца (группа не вакцинированных детей, «БВ»), 6 – 18 месяцев (3 дозы вакцины, «В»), 18 мес. – 3,5 года (1-2 года после ревакцинации, «РВ-1»), 6,5 лет (5-6 лет после ревакцинации, «РВ-5»), 11,5 -12,5 лет (10-11 лет после ревакцинации, «РВ-10»), 16 – 17 лет (15-16 лет после ревакцинации, «РВ-15»).



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 

Похожие работы:

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.