WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

-- [ Страница 5 ] --

В целом на срезах регенератов в бластеме и соединительной ткани насчитывалось около 90 БрдУ+-клеток на 1 срез, причем параметры распределения этой величины, такие как среднее значение и стандартное отклонение, оказались практически одинаковыми в обеих группах на обеих стадиях регенерации. Оценка индекса мечения была проведена на срезах тех же регенератов, что использовались для анализа, как описано в разделе 5 главы «Материалы и методы». Плотность распределения меченых клеток в тканях регенерата также оказалась очень близкой в обеих группах и на обеих стадиях регенерации, и составляла в среднем 39 клеток/40000 мкм2.

Также была оценена площадь зоны регенерата, занимаемой бластемой и соединительной тканью. Через 7 дней п/оп площадь этой зоны составляла в среднем 4 мм2, а через 14 дней – 6 мм2. На основании этих данных был ориентировочно оценен индекс мечения: при однократном введении предшественника в среднем 2,2% в контроле и группе на субстрате через 7 дней п/оп и в среднем 1,6% через 14 дней п/оп. В литературе мы не обнаружили данных, содержащих какую-либо количественную оценку уровня пролиферации регенерирующего хвоста у тритонов. По этой причине полученные нами впервые количественные данные мы сравнили с таковыми для модели регенерации передней конечности Triturus cristatus и Ambystoma mexicanum (Smith, Crawley, 1977; Mescher et al., 2000). Последовательность стадий и темпы регенерации конечности отличаются от таковых хвоста, однако по гистологическому описанию развития бластемы и раневого эпидермиса (Smith, Crawley, 1977), можно сопоставить регенераты хвоста через 7 дней п/оп в нашем эксперименте с регенератами конечности через 10–14 дней п/оп (стадия “small cone”), а регенераты хвоста через 14 дней п/оп – с регенератами конечности через 12–16 дней п/оп (стадия “large cone”). Приблизительная оценка индекса мечения, произведенная нами, оказалась близка к таковой, приведенной в работе Мэшера с соавторами (Mescher et al., 2000). В этой работе митотический индекс (МИ) в бластеме через 11 дней п/оп (что соответствует 7 дням п/оп для регенератов хвоста) достиг 0,9%. Учитывая, что оценка уровня пролиферации, полученная методом подсчета БрдУ-меченых клеток, всегда дает более высокие значения по сравнению с подсчетом МИ, можно сказать, что полученные нами данные хорошо согласуются с его оценкой. К сожалению, литературных данных о том, как меняется значение МИ в бластеме на более поздних стадиях регенерации, найдено не было, поэтому невозможно сказать, насколько закономерно полученное нами понижение индекса мечения с 7 до 14 дней п/оп.

Таким образом, использованный в работе метод может рассматриваться только как метод первичной оценки пролиферации в регенерате, свидетельствующий о ее наличии и локализации пролиферирующих клеток. Несмотря на это, на основании полученных первых данных можно предположить, что региональные отличия пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста в случае изменений его морфогенеза не составляют больших величин.

3.3 Изучение локализации апоптоза в регенерирующих тканях Для изучения локализации апоптоза в регенерирующих тканях мы использовали метод TUNEL с включением флуоресцентной метки в погибающие клетки. Окрашенные TUNEL срезы регенератов анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фотокамерой, и на полученных изображениях оценивали распределение меченых клеток. Специфическое мечение имело ядерную локализацию, достаточно высокую интенсивность свечения в зеленом канале и слабую, не превышавшую фоновый уровень, в красном (контроль специфичности флуоресценции). Наряду с этим, имела место и неспецифическая флуоресценция (секрет кожных желез, мышечные волокна и волокна соединительной ткани, а также цитоплазма клеток эпидермиса). Ядра отдельных клеток также обладали неспецифической флуоресценцией в зеленом канале, однако их можно было отличить от специфически меченых ядер по интенсивному свечению в красном канале. По всей видимости, это связано с особенностями процедуры, предполагающей двукратную дофиксацию срезов формалином.

Метод TUNEL позволил обнаружить одиночные меченые клетки в эпидермисе хвоста интактного контроля (рис. 17А). Через 24 часа п/оп меченые клетки находились в эпидермисе, подлежащих тканях (рис. 17Б), дистальной части хряща, спинном мозге и его оболочке (рис. 17В). Характерно, что под раневым эпидермисом были как единичные меченые клетки, так и группы TUNEL-позитивных клеток. Это, по всей видимости, отражает участие апоптоза, наравне с некрозом, в очистке зоны повреждения в первые сутки после ампутации. На модели регенерации конечности тритона Notophthalmus viridescens также было показано присутствие меченых TUNEL клеток в эпидермисе, дерме, периостеуме и дегенерирующих мышцах через 24 часа п/оп (Vlaskalin et al., 2004).

Необходимость апоптоза в период с 12 до 48 часов п/оп для успешного прохождения регенерации была показана на модели регенерации хвоста головастика Xenopus laevis (Tseng et al., 2007).

Через 7 дней п/оп меченые клетки обнаруживаются в основном в соединительной ткани культи и, в меньшей степени, в эпидермисе и бластеме. В бластеме под эпидермисом меченые клетки расположены редко, но равномерно, а в более глубоких слоях, в зонах дедифференцировки тканей, формируют кластеры с достаточно плотным мечением (рис. 17Г). Через 14 дней п/оп меченые клетки в эпидермисе и подлежащей бластеме практически не встречаются, хотя группы меченых клеток в области дедифференцировки остаются (рис. 17Д). Локализация меченых TUNEL клеток на срезах регенератов через 7 и 14 дней п/оп совпадает с локализацией пикнотических ядер на гистологических срезах. Хотя количественную оценку интенсивности мечения с использованием данного метода получить не удалось, присутствие клеток, идентифицирующихся как апоптотические, не только в тканях культи, но и в раневом эпидермисе и бластеме, указывает на участие апоптоза в изучаемых процессах и необходимость комплексной оценки баланса пролиферации и гибели клеток для изучения измененного морфогенеза.

Приведенные результаты по локализации меченых TUNEL клеток в регенератах хвоста согласуются с данными литературы, полученными тем же методом для регенератов конечности Ambystoma mexicanum и Notophthalmus viridescens (Mescher et al., 2000;

Vlaskalin et al., 2004). В этих исследованиях клетки, претерпевающие апоптоз, через 7 дней после ампутации конечности обнаруживались в дистальной части культи, во всех дедифференцирующихся тканях и раневом эпидермисе, составляя около 1–2% клеток. По Мэшеру (Mescher et al., 2000), общий уровень мечения оставался на уровне около 1% клеток через 11 дней п/оп. Власкалин и коллеги (Vlaskalin et al., 2004) указывают на отсутствие мечения в бластеме и эпидермисе регенерата через 2 недели п/оп. По всей видимости, через 14 дней после ампутации конечности, меченые клетки локализованы только в тканях культи, так же, как это показано нами для хвоста, где через 14 дней п/оп меченые клетки в эпидермисе и подлежащей бластеме практически не встречаются, хотя группы меченых клеток в области дедифференцировки все еще можно обнаружить (рис.

17Д).

Рис. 17. Выявление апоптоза в тканях регенерата хвоста методом TUNEL; наложение изображений, полученных в красном и зеленом канале. Зеленая флуоресценция ядер, не завуалированная красным свечением, указывает на специфическое мечение (стрелками показаны примеры меченых апоптотических клеток). А – интактный контроль, метка в эпидермисе; Б, Г – 24 часа и 7 дней п/оп, метка в соединительной ткани; В – 24 часа п/оп, метка в спинном мозге и его оболочках; Д – 14 дней п/оп, метка на границе регенерата и культи.

Таким образом, проведенный впервые анализ локализации и динамики апоптоза при регенерации хвоста у тритона показал участие программируемой клеточной гибели в процессах не только дегенерации ткани культи, но и формирования бластемы в течение первых 7 дней после ампутации. Несмотря на то, что количественную оценку апоптоза данный метод не позволяет, однако, регистрация наличия клеточной гибели не только в тканях культи, но и в раневом эпидермисе и бластеме, указывает на несомненное участие апоптоза в регенерации хвоста у тритонов.

Таким образом, исследование участия региональных особенностей пролиферации и апоптоза (а также соотношений этих двух процессов) в изменении формы регенерата хвоста у животных, содержащихся на субстрате при сравнении с аквариальным контролем, не дало однозначного, ожидаемого результата. Это, в свою очередь позволило предположить, что основные клеточные механизмы изучаемого феномена реализуются внутри осевых структур – спинного мозга и позвоночника, а также сопровождающих их мышц и соединительной ткани, что подробно описано в разделе «морфология».

При этом имеет место не столько различная динамика пролиферации и апоптоза на дорсальной и вентральной сторонах, сколько коллективная конденсация и миграция клеток. В то же время было показано, что пролиферативная активность клеток апикального эпидермиса увеличивается на субстрате, что на гистологическом уровне отражается в его утолщении.

Эпидермис, находясь на границе с внешней средой, может играть важную роль в передаче внешних воздействий нижележащим тканям. Изучению молекулярной регуляции этих процессов посвящены последующие разделы работы.

Хочется подчеркнуть также, что иммунохимическое системное изучение пролиферации и апоптоза на модели регенерации хвоста у тритона проведено впервые, а выявленное сходство по этим параметрам с регенерацией конечности, говорит о существовании закономерностей этих процессов при восстановлении хвоста и конечностей у амфибий.

4 Исследование роли сигнального пути Shh в изменении морфогенеза хвоста В представленных выше разделах работы предложенная нами модель была проверена на воспроизводимость в нескольких экспериментах и описана в терминах морфометрии и гистологии; также была предпринята попытка оценить уровень пролиферации и апоптоза в тканях регенерирующего хвоста животных, экспонированных в разных условиях – в аквариуме и на субстрате. Эти этапы работы были необходимы в силу новизны модели и отсутствия в литературе сопоставимых систем для изучаемого явления – изменения морфогенеза под действием внешних факторов. Однако наибольший интерес для нас, представляла расшифровка молекулярных механизмов, опосредующих восприятие внешнего сигнала клетками и изменения их поведения, результатом которого является формирование регенератов измененной формы. В связи с отсутствием геномных и скудностью транскриптомных данных для тритона Pleurodeles waltl многие подходы первичного этапа отбора потенциально важных для развития какого-либо эффекта молекул (такие как метод ДНК-микрочипов или полногеномное РНК-секвенирование) в данной работе были недоступны. В связи с этим в выборе молекул-кандидатов мы руководствовались литературными данными по механизмам морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в норме.

Давно было показано, что спинной мозг играет важнейшую роль в становлении правильной дорсо-вентральной организации эпендимной трубки и окружающих тканей (хрящевой, мышечной) при регенерации хвоста тритона (Holtzer, 1956). Одним из важнейших морфогенетических механизмов в развитии спинного мозга позвоночных вообще и регенерации хвоста тритона в частности является сигнальный путь Shh. Shh – диффундирующая внеклеточная сигнальная молекула, которая в развитии позвоночных синтезируется в хорде и основании спинного мозга и дозозависимым образом определяет дифференцировку нескольких типов нейронов (Wilson, Maden, 2005), а также обладает митогенным действием в отношении разных типов клеток спинного мозга и способствует выживанию предшественников нейронов (Ulloa, Briscoe, 2007). Кроме того, Shh у позвоночных регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток мезодермального происхождения: склеротома (Chiang et al., 1996), миотома (Gustafsson et al., 2002), сомитной мезодермы (Fan et al., 1995; Marcelle et al., 1999). Показано, что в ходе регенерации хвоста у аксолотля Shh, диффундирующий из вентральной части спинного мозга культи, выполняет схожие функции: устанавливает зоны экспрессии маркерных белков различных типов нейронов в эпендимной трубке, запускает экспрессию ранних белков маркеров хондрогенной дифференцировки в бластеме и обладает выраженным митогенным эффектом в отношении бластемных клеток (Schnapp et al, 2005). В новой работе на головастиках Xenopus laevis также было показано, что ингибирование Shh тормозит регенерацию в целом, угнетает дифференцировку хорды и формирование мышечных волокон (Taniguchi et al., 2014). В свете всех перечисленных данных мы попытались определить роль сигнального пути в развитии изучаемого Shh морфогенетического эффекта путем его фармакологического ингибирования циклопамином.

Действие циклопамина в ходе регенерации хвоста тритона P. waltl не изучалось ранее, и поэтому в ходе экспериментов мы определяли влияние ингибитора как на нормальную регенерацию хвоста в аквариуме, так и на формирование загнутых регенератов на субстрате. Основываясь на приведенных выше данных по введению циклопамина амфибиям с момента ампутации хвоста до стадии, примерно соответствующей стадии III для тритона, мы ожидали замедления регенерации в целом и угнетение формирования хряща и мышц при отсутствии заметных морфологических отклонений в аквариуме. Поскольку нас интересовала роль Shh в дифференцировке эпендимной трубки и окружающих тканей, а угнетение пролиферации бластемы было нежелательным, было решено вводить ингибитор в регенераты с уже образованной бластемой, перед началом формирования осевых структур. Что же касается группы на субстрате, то в случае участия сигнального пути Shh в формировании загнутых регенератов мы ожидали увидеть в присутствии ингибитора отклонения от стабильно проявляющейся формы либо изменения степени выраженности загиба хвоста.

В ходе работы требовалось найти оптимальный способ доставки ингибитора в регенерирующие ткани. В цитированных выше работах, использовавших в качестве объекта исследования амфибий, использовался метод введения действующих веществ непосредственно в воду, в которой содержались животные. На первом этапе эксперимента мы применили такой же метод введения впервые для нашей модели измененного морфогенеза (см. подраздел 7.1 главы «Материалы и методы»). В данном эксперименте темпы регенерации не отличались в аквариальном контроле и группе на субстрате; кроме того, в обеих группах на них не оказало влияния введение циклопамина или томатидина.

Таким образом, в нашем эксперименте мы не выявили ингибирующего действия циклопамина на ход регенерации в целом, описанного в более ранних работах, что могло быть следствием его применения на более поздних стадиях, либо отражать недостаточный уровень присутствия ингибитора в регенерате. Что же касается формы хвоста, в данном эксперименте не было показано влияния циклопамина на форму хвоста (угол загиба хвоста и коэффициент К) ни в аквариальном контроле, ни в группе на субстрате. Это может быть следствием неадекватности широко распространенного типа введения фармакологических агентов в воду в применении к нашей модели: возможно, результирующие концентрации веществ в регенерате оказались слишком малы для развития эффекта. Нельзя исключить также вероятности того, что импульсная обработка не позволяет создать стабильный фон действия ингибитора. Наконец, в ходе эксперимента имело место резкое значительное похолодание. Как мы покажем далее, отклонение температуры среды от физиологической нормы само по себе обладает выраженным влиянием на морфогенез регенерирующего хвоста. Возможно именно в результате изменения температуры мы обнаружили в данном эксперименте не встречавшиеся ранее загнутые регенераты в аквариальном контроле (как в отрицательном, так и в группах с введением томатидина и циклопамина).

Учитывая все возможные причины неоднозначности полученных результатов, мы провели второй эксперимент с ингибированием сигнального пути Shh, применив в нем внутрибрюшинный способ доставки действующих веществ. Мы не нашли в литературе данных об использовании внутрибрюшинной доставки циклопамина для амфибий, а данные по млекопитающим не могут быть использованы для расчетов в силу отличий в обмене веществ животных и в характере экспериментов (в случае млекопитающих это зачастую острые эксперименты для изучения противоопухолевых свойств циклопамина).

В случае добавления агента в среду расчетное количество вещества составляло около 30 нмоль на одного тритона, однако ясно, что лишь малая часть из этого попадала в ткани.

При внутрибрюшинном введении циклопамина количество вещества составляло 12 нмоль на одного тритона; учитывая более частое введение, отсутствие потерь и высокую концентрацию веществ, введенных таким способом, в плазме крови и периферических тканях, эти условия должны были обеспечить более высокую дозу циклопамина в формирующемся регенерате.

Как и в первом эксперименте, темпы регенерации не были затронуты ни условиями содержания (аквариум и субстрат), ни введением веществ (томатидин и циклопамин).

Длина регенерата не отличалась в аквариальном контроле и группе на субстрате. В обеих группах ни к началу введения веществ, ни далее отрицательный контроль не отличался от томатидинового, и оба они – от группы с циклопамином (рис. 18А, Б). Форма полученных регенератов соответствовала ожидаемой для условий содержания: симметричной в аквариуме и загнутой на субстрате. Угол загиба хвоста в группе на субстрате был достоверно ниже, чем в аквариальном контроле, через 35–49 дней п/оп. Как в аквариальном контроле, так и в группе на субстрате значения УЗХ в контроле с томатидином не отличались от таковых в отрицательном контроле. В условиях аквариума УЗХ в группе с циклопамином был несколько выше (недостоверно), чем в контроле, к началу введения вещества; после начала введения циклопамина (через 35 дней п/оп) эта разница стала достоверной, однако позднее отличий обнаружено не было (рис. 18В). Что касается субстратной группы, введение циклопамина не отклонило УЗХ от контрольных значений (рис. 18Г). Коэффициент К, как более строгий и менее чувствительный показатель изменения формы регенерата, достоверно отличался в группе на субстрате и в аквариальном контроле лишь через 49 дней п/оп. В обеих группах отрицательный контроль не отличался от томатидинового. Как и в случае УЗХ, коэффициент К оказался достоверно выше в группе с циклопамином, чем в контроле, в начале эксперимента при содержании в аквариуме, однако к началу введения циклопамина это различие нивелировалось и далее не проявлялось (рис. 18Д). На субстрате, как и в случае с УЗХ, показать влияние циклопамина на значения К не удалось (рис. 18Е).

Рис. 18. Средние значения морфогенетических характеристик регенератов (длина, А и Б;

угол загиба хвоста, В и Г; коэффициент К, Д и Е) в аквариуме и на субстрате в ходе эксперимента по ингибированию сигнального пути Shh циклопамином. На горизонтальной оси отмечен срок начала введения циклопамина, после которого введение осуществлялось каждые 2 дня. Планки погрешности построены по величине стандартного отклонения. На графиках приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни; уровни значимости менее 0,050 выделены красным цветом.

Таким образом, в двух проведенных экспериментах, использовавших разные подходы к доставке ингибирующего агента в ткани, не было показано морфогенетического эффекта ингибирования сигнального пути Shh. Кроме того, отмечавшийся ранее ингибирующий эффект циклопамина на ход регенерации в целом не был отмечен в нашем эксперименте. Последнее может быть следствием более позднего применения ингибитора в нашем эксперименте: только после накопления массы бластемы, до появления внешних признаков дифференцировки осевых структур. Как было показано ранее в ходе эксперимента по центрифугированию, а также в ходе эксперимента по обратимости морфогенетического эффекта, изменение формы регенерата не требует действия фактора на более ранних стадиях, а определяется стабильно действующих фактором в ходе дальнейшей дифференцировки. Таким образом, сроки введения циклопамина были подобраны оптимальным образом для реализации его предполагаемого морфогенетического потенциала. На основании наших данных нельзя исключить, что доза ингибитора оказалась слишком мала, а само введение осуществлялось слишком редко даже во втором эксперименте с внутрибрюшинными инъекциями. С другой стороны, отсутствие эффекта может быть истолковано в пользу независимости его проявления от центральных морфогенетических механизмов регенерирующего хвоста, включающих сигнальный путь Shh.

Это вполне согласуется с полученными ранее данными об обратимости морфогенетического эффекта при изменении условий, а также об изменении уровня пролиферации в эпидермисе. Возможно, внешнее воздействие распознается в первую очередь клетками эпидермиса и меняет какие-либо аспекты их поведения, в том числе увеличивает количество делящихся клеток. В свою очередь, это оказывает влияние на поведение бластемных клеток, тесно связанных с эпидермальными посредством нескольких сигнальных путей, в т.ч. FGF. Такой механизм развития морфогенетического эффекта является локальным, не должен затрагиваться изменением экспрессии морфогенов спинного мозга и предполагает необходимость постоянного воздействия фактора.

5 Морфогенетический эффект теплового шока при регенерации хвоста Обнаруженный нами феномен изменения формы регенерата хвоста у тритона в условиях гравитационной нагрузки можно рассматривать не только как удобную модель для исследований гравитационной биологии. Эта модель позволяет также найти ответ на более широкий вопрос – вопрос о механизмах биологического действия неспецифических физических факторов на морфогенез при тканевой и органной регенерации. В этой связи нам представлялось интересным найти, какие еще внешние воздействия могут затрагивать морфогенез регенерирующего хвоста. В случае если разные воздействия будут приводить к сходным результатам, мы не только сможем заключить, что опосредующие их механизмы имеют универсальный характер, но и будем располагать подсказками по поиску конкретных молекул, задействованных в этих механизмах.

В исследованиях влияния измененного гравитационного вектора на живые объекты особое внимание всегда уделялось роли регуляторных молекул, ассоциированных со стрессом, в частности белков теплового шока (Minois et al., 1999; Carlsson et al., 2003;

Shagimardanova et al., 2010). Кроме этого, тепловой шок является хорошо изученным стрессовым фактором, прост для моделирования в эксперименте, а температурный режим оказывает влияние на ход регенерации (Schauble, 1972; Turner, Tipton, 1973 – цит. по Conelly, 1977; собственные наблюдения). По этим причинам этот вид воздействия был выбран нами для изучения индукции и регуляции потенциальных морфогенетических эффектов.

Предварительные эксперименты показали, что однократное воздействие теплового шока перед ампутацией не оказывает заметного эффекта на ход регенерации и форму регенерата. Поскольку тепловой шок является стрессовым воздействием, для первого эксперимента было решено ограничиться еженедельным применением на протяжении всего хода регенерации. Для эксперимента было взято 20 тритонов, 4 из которых содержались после ампутации хвоста в аквариуме в качестве контроля, 4 составляли группу на субстрате, а 12 тритонов регенерировали в аквариуме и один раз в неделю подвергались действию теплового шока по протоколу, описанному в подразделе 1.3 главы «Материалы и методы». Регенераты фотографировали еженедельно и проводили морфометрический анализ полученных изображений, как описано в разделе 2 главы «Материалы и методы». Эксперимент длился в течение 49 суток, видимые различия между группой на субстрате и аквариальным контролем наблюдались на 42 и 49 сутки п/оп. Для сравнения формы регенератов использовали коэффициент загиба хвоста К, в качестве статистического критерия для сравнения групп был выбран критерий КраскелаУоллиса для множественных сравнений в сочетании с post hoc критерием Данна.

Для исключения возможных ошибок при оценке морфогенетического эффекта, в связи с изменением темпов регенерации при температурном воздействии, в первую очередь мы оценили скорость регенерации в трех группах. Средние значения стадий, достигнутых регенератами в каждой группе, не отличались ни на одном сроке регенерации, кроме 42 дней п/оп, когда все регенераты из аквариального контроля и группы теплового шока достигли стадии IV, в то время как два регенерата из группы на субстрате находились на стадии III или в переходном состоянии между III и IV стадиями.

Средняя скорость смены стадий регенерации составила 0,100 ст/день в аквариальном контроле, 0,088 ст/день в группе на субстрате и 0,099 ст/день в группе теплового шока.

Статистическая значимость существования различий между тремя группами по критерию Краскела-Уоллиса составила p = 0,0148 на 42 день п/оп и p = 0,0441 при сравнении скорости смена стадий регенерации, однако множественные попарные сравнения групп по критерию Данна не выявили достоверных различий между какими-либо двумя группами.

Таким образом, в группе на субстрате имело место незначительное замедление регенерации на 42 день п/оп, в то время как еженедельное воздействие теплового шока не оказало никакого влияния на темпы регенерации.

По окончании эксперимента в аквариальном контроле и группе на субстрате сформировались типичные для этих групп регенераты: ланцетовидные в первом и загнутые книзу – во втором случае. В группе теплового шока присутствовали как загнутые книзу регенераты, так и регенераты нормальной формы и даже несколько загнутые кверху. На рисунке 19 представлены типичные регенераты из аквариального контроля и группы на субстрате, а также три регенерата из группы теплового шока, отражающие весь спектр произошедших в ней изменений формы.

Рис. 19. Изображения типичных регенератов из аквариального контроля (А) и группы на субстрате (Б), а также трех регенератов из группы теплового шока (В, Г, Д), отражающие весь спектр произошедших у животных этой группы изменений формы регенерирующего хвоста, 49дней п/оп.

Поскольку в данном случае в группе, подвергнутой тепловому шоку, имел место загиб хвоста как книзу, так и кверху, для морфометрического анализа использовали величину К. Для каждого конкретного образца на определенном сроке регенерации К рассчитывали как модуль разности между значением К для этого образца и средним значением К для аквариального контроля на данном сроке. На рисунке 20 видно, что для аквариального контроля характерен небольшой разброс значений коэффициента загиба хвоста в течение всей регенерации. В группе на субстрате с 21 до 49 дней регенерации нарастает величина отклонения К от среднего в аквариуме, и через 49 суток различие между группой на субстрате и аквариальным контролем признается статистически значимым по критерию Данна. В группе, подвергнутой тепловому шоку, величина К также нарастает с ходом регенерации; через 49 суток после ампутации она не отличается достоверно от К в группе на субстрате и с невысоким уровнем значимости отличается от К в аквариальном контроле (рис. 20).

Рис. 20. Медианные значения величины отклонения формы хвоста К в трех группах.

Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графиках приведены уровни значимости отличий между группами по критерию Данна.

Таким образом, было показано, что не только содержание на субстрате при действии увеличенной гравитационной нагрузки, но и воздействие теплового шока в ходе регенерации может приводить к изменению формы регенерата хвоста. Тот факт, что совершенно разные внешние воздействия оказывают сходный морфогенетический эффект указывает на универсальность клеточных и молекулярных механизмов, данный эффект опосредующих.

В ходе работы с тритонами в лаборатории мы наблюдали слабый загиб хвоста у животных, содержавшихся после ампутации в аквариуме и в других условиях – при длительном снижении температуры в помещении, при регенерации после двух ампутаций, совершенных с интервалом в несколько дней. Эти наблюдения были сделаны на животных, вышедших из эксперимента после фиксации регенерата, и потому не сопровождались постановкой контролей и не были обсчитаны. Тем не менее, они подкрепляют предположение о том, что разные по природе стрессовые факторы могут вызывать морфогенетические изменения в нашей модели, и делают целесообразным проведение дальнейших экспериментов с целью проверки этой гипотезы. Не исключено, что загнутый регенерат, зарисованный Спалланцани (Dinsmore, 1991, стр. 82), и крючкообразные хвосты некоторых интактных животных, обнаруженные нами за годы работы, сформировались при действии каких-либо стресс-индуцирующих факторов во время регенерации или развития.

Нужно отметить, однако, что в случае теплового шока морфогенетический эффект не проявляется с такой высокой степенью воспроизводимости, как в случае содержания на субстрате. При содержании на субстрате загиб хвоста является обратимым, и можно предположить, что за неделю, проходящую от одного теплового воздействия до другого, начавшиеся изменения также могут быть частично или полностью сглажены, а результат зависит от индивидуальных особенностей регенерации и чувствительности к тепловому шоку. Широкий спектр форм, получаемых при тепловом шоке, можно рассматривать и в другом ключе. Это может быть свидетельством того, что в данном случае имеет место общая дестабилизация морфогенеза, и результат объясняется суммой векторов действия случайных факторов (в то время как на субстрате имеется направленный фактор значительной силы – гравитационная нагрузка, не свойственная водной среде обитания тритона). При этом нужно заметить, что в других условиях мы наблюдали слабый загиб регенерата книзу, но не наоборот, и в самом эксперименте по тепловому шоку количество загнутых книзу регенератов и степень отдаления их формы от нормальной были значительно выше, чем для загнутых кверху. Возможно, это определяется тем, что даже в условиях физиологической невесомости в аквариуме действие силы тяжести зачастую превосходит по силе и постоянству действие других факторов.

Так или иначе, сходство эффектов теплового шока и гравитационной нагрузки позволяет выдвинуть гипотезу об общности опосредующих морфогенетические изменения механизмов, и даже более – об участии в этих процессах белков теплового шока. Будучи универсальными защитными молекулами, консервативными для множества организмов и выполняющими разнообразные внутриклеточные функции, как в норме, так и при действии широкого ряда стрессовых факторов, они являются подходящими кандидатами на роль промежуточного звена между воздействием и морфогенетическим ответом. Особенно интересно, что в нескольких работах на других моделях (эмбрионы Xenopus laevis, Rizzo et al., 2002; остеобласты мыши, Kumei et al., 2003; развивающийся хрусталик Danio rerio, Shimada, Moorman, 2006; ячмень Hordeum vulgare, Shagimardanova et al., 2010) была показана возможность модуляции экспрессии генов теплового шока при изменении гравитационной нагрузки. В разделе 7 мы приводим данные по экспрессии в тканях хвоста двух генов теплового шока, изученных нами в интактной сетчатке тритона того же вида ранее (Авдонин и др., 2013).

6 Ингибирование белков теплового шока В предыдущем разделе было показано, что воздействие теплового шока приводит к изменению формы регенерата хвоста. Эти результаты можно трактовать как пример морфогенетического эффекта искусственной активации белков теплового шока в регенерате. Для того, чтобы проверить данную гипотезу, был проведен обратный эксперимент – искусственное ингибирование белков теплового шока в ходе регенерации хвоста. Предварительный этап эксперимента состоял в выборе дозы и способа введения ингибитора белков теплового шока, которые позволили бы эффективно снизить уровень стресс-индуцируемой экспрессии генов теплового шока. На рисунке 21 приведены данные ПЦР в реальном времени по относительной экспрессии мРНК Hsp70 после теплового шока, проведенного на интактных, не обработанных и обработанных KNK437 тритонах.

Все три способа введения показали свою эффективность в снижении уровня индуцированной тепловым шоком экспрессии Hsp70; внутримышечное введение было эффективнее внутрибрюшинного при одинаковой дозе ингибитора, в то время как наружное нанесение позволило достичь такого же эффекта, что и внутримышечное, при десятикратном уменьшении дозы.

Рис. 21. Количество кДНК Hsp70 в пробах, измеренное относительно количества кДНК Ef1- c помощью ПЦР в реальном времени, измеренное в программе Expression Suite по алгоритму Ct; среднее значение в контроле (0 мкг + ТШ) принято за 1. Во всех группах по 3 образца; эксперимент выполнен трижды, в каждом эксперименте каждая проба представлена в трех повторах. Планки погрешности построены по значениям RQ min и RQ max.

После выяснения оптимальной дозы и способа введения ингибитора мы перешли к основному этапу эксперимента, направленному на сравнение регенерации хвоста в присутствии ингибитора и без него как в аквариуме, так и на субстрате (см. п.8 раздела «Материалы и методы»). При этом, как и в описанных ранее экспериментах, мы наблюдали изменение формы регенерата хвоста в группе на субстрате по сравнению с животными в аквариуме. На рисунке 22 приведены средние значения К для животных в аквариуме и на субстрате, не подвергавшихся воздействию ингибитора. Можно видеть, что с 21 суток п/оп величина К увеличивается в группе на субстрате, но не меняется для группы в аквариуме; различия между группами становятся статистически достоверными на 42-е сутки п/оп. Как для группы в аквариуме, так и для группы на субстрате было показано отсутствие различий в величине К между животными отрицательного контроля (не подвергавшимся никаким манипуляциям после ампутации хвоста) и контроля специфичности (получавшим носитель без ингибитора тем же способом, что и опытная группа) на всех сроках регенерации. Таким образом, сами манипуляции с животными, необходимые для внесения ингибитора, не оказывали влияния на форму регенерата, а значит, отличия между контролем и опытной группой должны быть обусловлены действием вносимого вещества.

Рис. 22. Медианные значения величины отклонения формы хвоста К в двух группах.

Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графиках приведены уровни значимости отличий между группами по критерию Манна-Уитни.

Для животных, содержавшихся в аквариуме, было отмечено увеличение разброса значений К в опытной группе по сравнению с отрицательным контролем, однако средние значения К в двух группах не отличались (см. график на рисунке 23). Таким образом, можно говорить об отсутствии нарушений формы регенерата при введении KNK437 в обычных внешних условиях – условиях аквариума; данное вещество также не препятствует ходу регенерации хвоста в тех же условиях. Для животных, содержавшихся на субстрате, значения К в опытной группе оказались достоверно меньше, чем в отрицательном контроле. В то время как регенераты, не подверженные экспериментальным воздействиям, демонстрировали на субстрате развитие загиба и, соответственно, рост К с ходом регенерации, регенераты, обработанные ингибитором, оставались симметричными, а величина у них К не менялась на протяжении эксперимента. Таким образом, можно констатировать, что введение ингибитора KNK437 препятствует развитию изменений формы хвоста при содержании животных на субстрате, где формируются регенераты загнутой формы.

Рис. 23. Медианные значения величины отклонения формы хвоста К в аквариальном контроле в присутствии ингибитора и без него. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей.

Обобщая данные, полученные в экспериментах по регенерации, во-первых, при тепловом шоке и, во-вторых, при ингибировании белков теплового шока, можно обнаружить следующую закономерность. Избыточная активация HSP приводит к увеличению отклонения формы регенерата хвоста от нормы, в то время как ингибирование HSP, наоборот, препятствует развитию этих отклонений в тех условиях, где они происходят. Эти результаты подкрепляют выдвинутую нами гипотезу об участии белков теплового шока в каскаде реакций, опосредующих при регенерации морфогенетический ответ на внешние воздействия. Избыточная активация белков теплового шока, по-видимому, способна менять клеточное поведение (например, пространственно-временной паттерн пролиферации и апоптоза), вызывая отклонения от нормальной схемы роста частей регенерата, приводящие к видимому искажению формы.

Рис. 24. Медианные значения величины отклонения формы хвоста К в группе на субстрате в присутствии ингибитора и без него. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графике приведен уровень значимости отличий между группами по критерию Манна-Уитни.

Поскольку, как было показано нами выше, и тепловой шок, и KNK437 влияют на уровень экспрессии гена Hsp70, следует предполагать, что именно его белок обладает такими эффектами. Тем не менее, весьма вероятно, что он не является единственным, а только находится в системе взаимодействий с другими морфогенетическими регуляторами. Нельзя также исключить, что набор белков теплового шока, участвующих в морфогенетических изменениях регенерата, также меняется в зависимости от внешнего воздействия. Уточнение этого вопроса остается в перспективе дальнейших исследований.

7 Изучение экспрессии генов теплового шока и локализации соответствующих белков в тканях

7.1 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦР Первым этапом проверки предположения об участии белков теплового шока в становлении морфогенетического эффекта внешних воздействий со стороны условий содержания (разные «дозы» гравитации, тепловой шок) было изучение регуляции экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 на уровне транскрипции. Для этого использовали методы ПЦР и ПЦР в реальном времени. Выделение РНК и синтез кДНК-библиотек провели для тканей интактного хвоста (4 образца), хвоста после теплового шока (4 образца) и регенератов из аквариального контроля и группы на субстрате через 2 дня п/оп, на стадии II (28 дней п/оп) и на стадии IV (49 дней п/оп) (по 3 образца в каждой группе на стадию).

На рисунке 25 представлены электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученных с использованием праймеров для генов Ef1-, Gapdh, -Actin, Hsp70, Hsp90. Для первых трех генов из списка, рассматриваемых в качестве генов «домашнего хозяйства» и используемых в связи с этим в качестве внутреннего контроля в ПЦР, во всех пробах наблюдали полосы ожидаемого размера приблизительно одинаковой интенсивности.

Таким образом, в данных тканях экспрессия этих генов может рассматриваться как достаточно стабильная, а качество проб в разных группах – как сравнимое. Таким образом, заметные отличия в интенсивности полос ПЦР-продуктов, соответствующих мРНК Hsp70, Hsp90 можно рассматривать как свидетельство изменения экспрессии соответствующих генов.

Полосы ПЦР-продукта, соответствующего мРНК Hsp70, имели ожидаемую длину, наблюдались во всех образцах интактного контроля и обладали невысокой интенсивностью окрашивания; имело место небольшое количество побочного продукта меньшей длины. В группе теплового шока интенсивность свечения полос ПЦР продукта была заметно выше, а побочный продукт отсутствовал. Через 2 дня п/оп наблюдалось снижение яркости полос ПЦР продукта в аквариальном контроле и исчезновение как основного, так и побочного продукта в группе на субстрате. На стадиях II и IV полосы ПЦР продукта соответствовали описанию для интактного контроля в обеих группах. Это позволило заключить, что уровень экспрессии гена Hsp70 значительно увеличивается после теплового шока, что было ожидаемо. Неожиданным явилось снижение экспрессии Hsp70 после ампутации. При этом имеется расхождение данных ПЦР-РВ и качественной ПЦР в отношении образцов, взятых через 2 дня п/оп. По всей видимости, кажущееся снижение экспрессии Hsp70, наблюдаемое методом качественной ПЦР, обусловлено общим более низким уровнем транскрипции на этой стадии. Отсутствие видимого снижения экспрессии Ef1- может объясняться намного более высоким уровнем его экспрессии по сравнению с Hsp70, и выходом на плато на ранних циклах ПЦР, что исключит заметные различия к 40-му циклу, на котором проводили анализ ПЦРпродуктов.

Полосы ПЦР-продукта ожидаемой длины с мРНК Hsp90 наблюдали во всех образцах; побочные продукты отсутствовали. Тепловой шок не увеличивал яркость полос ПЦР-продукта, однако увеличение интенсивности свечения наблюдалось с ходом регенерации; так, наибольшую толщину и яркость имели полосы из аквариального контроля на стадии IV. По всей видимости, экспрессия гена Hsp90 не индуцируется стрессовыми факторами, но возрастает в ходе регенерации.

Рис. 25. Электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученные на матрице кДНК из тканей интактного хвоста (4 образца), хвоста после теплового шока (4 образца), через 2 дня п/оп и из регенератов на II и IV стадиях (отдельно для аквариального контроля и группы на субстрате – по 3 образца в группе на стадию) с использованием праймеров, сконструированных по нуклеотидным последовательностям мРНК генов Ef1-, Gapdh, Actin, Hsp70, Hsp90 тритона. Визуализация ПЦР-продуктов с помощью интеркалирующего красителя бромистого этидия при УФ освещении.

7.2 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦРРВ Для проверки описанных закономерностей и количественной оценки уровня экспрессии мРНК изучаемых генов был использован метод ПЦР в реальном времени. Все эксперименты проводили в использованием тех же кДНК-библиотек и тех же праймеров, что и эксперименты по качественной ПЦР; в качестве внутреннего контроля использовался ген Ef1-. Причины, обусловившие выбор данного гена, описаны в разделе

9.3 главы «Материалы и методы».

С помощью ПЦР в реальном времени было показано, что аннотированный в базе данных GenBank ген Hsp70 тритона является индуцируемым: после теплового шока количество мРНК увеличивалось в пробах примерно в 950 раз (рис. 26). Менее значительное, но статистически достоверное увеличение количества мРНК Hsp70 было отмечено также через 2 дня п/оп – в 15 раз в аквариальном контроле и в 8 раз в группе на субстрате. На стадиях регенерации II и IV наблюдалась тенденция к повышению уровня экспрессии Hsp70 в 2–7 раз по сравнению с интактным контролем, в некоторых группах почти достигавшая уровня статистической значимости (например, в аквариальном контроле на стадии IV; p = 0,063). В работе, посвященной анализу экспрессии Hsp70 в развивающихся и регенерирующих конечностях Ambystoma mexicanum, показали наличие экспрессии данного гена в интактных тканях и ее увеличение в 1,5–2,0 раза через 24 часа п/оп и в 2,5 раза на стадии лопатки (примерно соответствует стадии II при регенерации хвоста) (Levesque et al., 2005). Эти значения соответствуют наблюдаемым нами тенденциям и подкрепляют возможность того, что за ними стоят отличия, не признанные нами статистически значимыми в силу высокого разброса значений. Ни на одной стадии регенерации, однако, нами не было выявлено статистически достоверных отличий уровня экспрессии Hsp70 в аквариальном контроле и группе на субстрате. Необходимо отметить существенные вариации значений, полученных для каждой группы; они намного превышают уровень чувствительности метода ПЦР-РВ, поэтому возможно, что уменьшение этих вариаций путем увеличения выборок и количества проведенных экспериментов может позволить обнаружить более тонкие отличия между группами.

Таким образом, при изучении экспрессии гена Hsp70 с помощью количественной ПЦР выявлена тенденция увеличения экспрессии через 2 дня после операции относительно интактного контроля, прослеживающаяся и в дальнейшем в ходе регенерации. Увеличение при этом не было столь значительным, как при тепловом шоке, и существенно варьировало от образца к образцу. На этом фоне детектировать различия между группами животных, содержащихся в аквариуме и на субстрате при стандартных одинаковых температурах, оказалось затруднительным. Тем не менее, результаты данного раздела исследования впервые выявили экспрессию гена Hsp70 при регенерации хвоста у тритона P. waltl вне теплового шока.

Для аннотированной последовательности гена Hsp90 тритона была показана высокая стабильность экспрессии после теплового шока и в ходе регенерации. Это дает основания считать, что данный ген кодирует конститутивную форму белка HSP90. К сожалению, в настоящее время для тритона недоступны последовательности, кодирующие другие формы белка HSP90, кроме использованной нами для синтеза праймеров. Этот факт затрудняет анализ экспрессии индуцируемой формы Hsp90 у тритона.

Рис. 26. Количество кДНК Hsp70 (А) и Hsp90 (Б) в пробах, измеренное относительно количества кДНК Ef1- c помощью ПЦР в реальном времени по алгоритму DART-PCR;

среднее значения в интактном контроле принято за 1. В интактном контроле и в группе теплового шока по 4 образца, в аквариальном контроле и группе на субстрате – по 3 образца на каждый срок регенерации. Планки погрешности построены по значениям стандартного отклонения. Приведены уровни значимости отличий каждой группы от интактного контроля по критерию Данна (статистически достоверные отличия отмечены звездочкой).

В совокупности данные ПЦР анализа позволили впервые обнаружить экспрессию генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 в интактных и регенерирующих тканях хвоста тритона P. waltl., а также получить первые сведения о динамике работы в ходе регенерации. Эти данные свидетельствуют предварительно о доминировании Hsp70 в регуляции процесса регенерации над Hsp90, в большей мере поддерживающего клеточную «защиту» как в норме, так и при регенерации. На этом фоне не выявлена взаимозависимость между динамикой экспрессии белков теплового шока и условий содержания животных (при физиологически нормальной температуре). Здесь возможны два объяснения: 1) невозможность детекции отличий в выбранных экспериментальных условиях (невысокий уровень экспрессии, недостаточное количество материала, индивидуальные особенности животных и т.д.) и 2) регуляция морфогенеза посредством белков теплового шока осуществляется по иным законам, не предусматривающим значительные количественные отличия в объеме продуктов генов теплового шока. В этой связи было решено изучить локализацию белков HSP70 и HSP90 в тканях нормального и регенерирующего хвоста тритона в различных условиях содержания животных.

7.3 Изучение локализации белков теплового шока HSP70 и HSP90 Локализацию белков теплового шока изучали на материале интактного хвоста и хвоста после теплового шока, через 2 дня п/оп и с II и IV стадий регенерации в аквариальном контроле и группе на субстрате, фиксированном с помощью PAGA и окрашенном иммуногистохимически по оптимизированному нами протоколу, как описано в разделе 9 главы «Материалы и методы». Специфическое мечение имело ядерную локализацию и ярко-зеленый цвет в каналах I3 и L5 (см. характеристики наборов фильтров в таблице 2, раздел 9 главы «Материалы и методы»). Интенсивность специфической флуоресценции в канале L5 была выше, чем в канале I3, в то время как в канале N2.1 специфическое свечение не детектировалось. Наряду с этим, имела место неспецифическая флуоресценция самого препарата, присутствовавшая как на иммуногистохимически окрашенных срезах, так и на контрольных срезах, прошедших лишь отмывку от заливочной среды в солевом буфере. Неспецифическое свечение имело желтоватую окраску в канале I3, характеризовалось более низкой интенсивностью свечения в канале L5 и обнаруживалось в канале N2.1. Исходя из этих отличий между специфической и неспецифической флуоресценцией, на срезах определяли участки, содержащие специфическую метку. Поскольку на большинстве участков уверенно выделить специфическую флуоресценцию можно было лишь по совокупности признаков, эти участки фотографировали во всех каналах и затем обрабатывали в программе Image J для получения единого изображения. На рисунке 27 приведены исходные фотографии, сделанные в каналах I3 (А), L5 (Б), N2.1 (В) и последовательные этапы их обработки. На этих фотографиях изображен окрашенный не специфически участок эпидермиса со случайно «осевшими» вторичными антителами. Вначале производили вычитание изображений L5 - I3 (рис. 27Г): в итоге зеленая флуоресценция сохранялась только в специфически меченых участках, т.к. специфическое мечение обладает в канале L5 большей яркостью, чем в канале I3, а автофлуоресценция препарата – наоборот. На втором этапе проводили усреднение изображений I3 и N2.1, в результате чего автофлуоресценция препарата приобретала более выраженный желтый цвет (рис. 27Д).

Наконец, изображения, полученные на первом и втором этапе обработки, суммировали с получением итогового изображения, удобного для демонстрации локализации меченых участков (рис. 27Е).

Рис. 27. Изображение неспецифически меченого участка эпидермиса и конгломерата вторичных антител, снятое с использованием разных наборов фильтров (А – I3, Б – L5, В – N2.1), а также этапы его обработки в программе Image J (Г – вычитание изображения в I3 из изображения в L5, Д – усреднение изображений в I3 и N2.1, Е – суммирование изображений Г и Д). Увеличение 200.

На срезах неоперированного хвоста, окрашенных антителами против HSP70, мы обнаруживали многочисленные круглые, овальные ядра клеток соединительной ткани в пространстве между эпидермисом, мышцами и кожными железами (рис. 28А, Б). Помимо этого наблюдали HSP70-положительные, отдельные вытянутые ядра между пучками мышечных волокон (рис. 28В) и редкие мелкие вытянутые ядра в соединительно-тканных оболочках спинного мозга и вокруг позвоночника (рис. 28Г, Д). Интересно, что после теплового шока в данной локализации удавалось обнаружить только единичные ядра с очень слабой флуоресценцией, однако появлялось яркое специфическое свечение в эпидермисе (рис. 28Е).



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |
 

Похожие работы:

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.