WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

-- [ Страница 4 ] --

9.3 Количественная ПЦР в реальном времени Количественную оценку экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 проводили методом ПЦР в реальном времени на матрице кДНК; в качестве внутреннего контроля был выбран ген Ef1-. Алгоритмы выбора контрольных генов – geNorm (Vandesompele et al., 2002), NormFinder (Andersen et al., 2004) и BestKeeper (Pfaffl et al., 2004) для многих организмов продемонстрировали высокую стабильность экспрессии Ef1- в разных тканях по сравнению с другими «генами домашнего хозяйства», такими как Gapdh, 18S rRNA, Actin, -Tubulin (Olsvik et al.

, 2005; McCurley, Callard, 2008; Ponton et al., 2011; Leelatanawit et al., 2012). Полученные с помощью алгоритма DART-PCR значения относительной экспрессии изучаемого гена к экспрессии Ef1- для каждого образца нормировались по отношению к среднему значению в интактном контроле в соответствующем эксперименте. Полученные нормированные значения с нескольких экспериментов сводились в единую таблицу и обрабатывались статистически с помощью критерия Краскела-Уоллиса для множественных сравнений в сочетании с post hoc критерием Данна.

Для ПЦР в реальном времени были использованы те же праймеры, что и для полуколичественной ПЦР – метода, описанного в подразделе 9.2 (табл. 1). Для увеличения специфичности реакции праймеры использовали вместе с линейными разрушаемыми пробами. Последовательность проб, а также использованные в их структуре флуорофоры и гасители указаны в таблице 3. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали 2,5 реакционную смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ROX (Синтол, Россия) и амплификатор Step One Plus™ (Applied Biosystems, США).

Концентрация прямого и обратного праймеров в реакционной смеси составляла по 0,4 мкМ, концентрация проб – 0,2 мкМ. Температура отжига для всех праймеров составляла 63°С (см. подраздел 9.2) при 40 циклах амплификации. Исходные данные по амплификации в виде величин Rn (прирост флуоресценции репортера, нормализованной по флуоресценции референсного красителя, в данном цикле амплификации) в каждой лунке в каждом цикле амплификации переносили в программу Microsoft Office Excel 2007 и обрабатывали с использованием адаптированного для нее алгоритма анализа ПЦР в реальном времени DART-PCR (Peirson et al., 2003). Все эксперименты проводили в трех повторениях; каждое сочетание «образец-праймеры» дублировалось в пределах одного эксперимента трижды. Во все эксперименты включали четыре образца интактного контроля, для каждой экспериментальной группы итоговое относительное количество РНК изучаемого гена, нормированное по количеству РНК гена Ef1-, выражали через среднее значение в интактном контроле.

Таблица 1. Характеристики и источники специфических праймеров и проб.

–  –  –

10 Иммуногистохимическое определение экспрессии белков HSP70 и HSP90 в тканях регенерирующего хвоста Формировали две группы животных – субстратную и аквариальный контроль – по 9 животных в каждой группе, оперировали и рассаживали животных. Материал (по 3 образца из каждой группы) фиксировали через двое суток после ампутации, на стадии регенерации II (28 дней п/оп) и стадии регенерации IV (42 дня п/оп). Дополнительно фиксировали ампутированную треть хвоста, служившую интактным контролем (три образца). В качестве положительного контроля (3 образца) использовали материал интактного хвоста, подвергнутого тепловому шоку, как описано в подразделе 1.3 (время от окончания стационарной фазы теплового шока до фиксации материала составляло 2 часа 30 мин). В качестве отрицательного контроля часть срезов обрабатывали по тому же протоколу, но в отсутствие первичных антител, замещенных фосфатным буфером (PBS, pH = 7,4).

В ходе экспериментов был разработан оптимальный протокол фиксации, проводки и окрашивания срезов. В первых экспериментах для фиксации использовали 4% охлажденный до +4°С раствор формалина на PBS. Образцы регенератов проводили по растворам PBS c сахарозой в возрастающей концентрации (5%, 10% и 20% по 30 мин, 20% при 4°С в течение ночи), замораживали в среде Tissue-Tek® O.C.T. Compound (Sakura Finetek Europe, Нидерланды) при -20°С и с помощью криотома получали сагиттальные замороженные срезы (10 мкм). Затем срезы отмывали в PBS (pH = 7,4, 3 5 мин), проводили реакцию пермеабилизации с раствором 0,25% Triton X-100 (Promega, США) на 0,1% растворе Tween 20 (Promega, США), приготовленном на PBS (30 мин). Затем срезы вновь отмывали в PBS и блокировали неспецифическое связывание антител раствором 3% BSA (Sigma-Aldrich, США) в 0,1 % Tween 20 на PBS (30 мин).

После трехкратного отмывания в буфере срезы инкубировали с первичными антителами (табл. 2) в растворе 3% BSA и 0,1 % Tween 20 на PBS (90 мин, 37°С), отмывали и инкубировали в растворе, приготовленном на PBS и содержащем вторичные антитела (табл. 2) (90 мин, tкомн). После очередного отмывания проводили контрастирование ядер с помощью Hoechst 33342 (1 мкл: 1 мл PBS, 2 мин). Срезы отмывали и заключали под покровные стекла в смесь глицерина с PBS (9:1) с добавлением DABCO. Окраску проводили во влажной камере без доступа света. Окрашенные срезы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRXA2, оснащенного фотокамерой Olympus DP70 с использованием четырех наборов фильтров, характеристики которых приведены в таблице 3. Изображения регистрировали с помощью программ DPController и DPManager.

В результате было обнаружено, что полученные с использованием данного протокола срезы характеризуются высоким уровнем желто-зеленой автофлуоресценции, маскирующей специфическое мечение. В связи с этим были применены различные процедуры демаскирования антигенов (в т.ч. обработка 0,05% раствором трипсина при 37°С и подогревание в микроволновой печи в цитратном буфере (pH = 6,0) или ТрисЭДТА буфере (pH = 9,0)), также меняли концентрацию антител и время инкубации с ними. Поскольку все эти меры оказались неэффективными, было произведен сравнительный анализ трех различных фиксаторов – использованного ранее 4% раствора формальдегида на PBS, коммерческого фиксатора Formalin Free Fixative, Accustain™ (Sigma-Aldrich, США) и смешанного спиртового фиксатора PAGA (Zanini et al., 2012). Для анализа использовали срезы хвоста после теплового шока (положительный контроль).

Часть срезов проходила окраску без инкубации с первичными антителами для отрицательного контроля. Условия фиксации и отмывки для каждого фиксатора приведены в таблице 4. После отмывки окрашивание проводили в соответствии с описанным выше протоколом. В результате было показано, что использование как коммерческого, так и смешанного фиксатора снижает уровень аутофлуоресценции образцов и сдвигает ее спектр в длинноволновую область, что способствует более легкому определению зеленого свечения специфической метки на препарате. При этом частота и яркость специфического мечения на срезах, фиксированных PAGA, были значительно выше, чем на срезах, фиксированных Accustain™. В связи с этим в дальнейшем мы использовали фиксатор PAGA; параметры фиксации указаны в таблице 4, а протокол окрашивания описан выше.

–  –  –

Результаты и их обсуждение При изложении результатов мы придерживаемся той последовательности, в которой проводилось изучение предлагаемой модели, служащей в конечном итоге для объяснения молекулярных механизмов морфогенеза при регенерации у животных.

Поскольку модель является новой, то вначале потребовались твердые доказательства изменений морфогенеза регенерирующего хвоста в разных условиях содержания животных (в аквариуме и на субстрате). Для этого были использованы морфометрические исследования, демонстрирующие как собственно эффект, так и его устойчивое воспроизведение.

1 Морфометрические исследования регенератов хвоста в двух группах

1.1 Воспроизведение эффекта измененного морфогенеза при содержании на субстрате В первую очередь в ходе работы была проведена проверка наблюдений, сделанных ранее в экспериментах в космосе на биоспутниках Фотон М2 и М3 и в соответствующих контролях. В ходе этих экспериментов было обнаружено, что в группе синхронного контроля, содержавшейся в лаборатории на субстрате, имеет место загиб формирующихся регенератов хвоста. Для воспроизведения обнаруженного эффекта и его изучения провели дополнительные лабораторные тесты. Для этого прооперировали 20 тритонов, по 10 для аквариального контроля и группы на субстрате. На протяжении эксперимента регенераты хвоста каждого из 20 тритонов фотографировали 8 раз, 1 раз в неделю.

На рисунке 1А отражен прогресс регенерации в двух группах на примере типичных регенератов. Видно, что регенераты из аквариального контроля и группы на субстрате начали различаться по форме, начиная с 21-го дня регенерации: осевые структуры в регенератах из группы на субстрате формировались под углом к переднезадней оси хвоста. По мере дальнейшего формирования осевых структур отличия становились более очевидными и загиб регенерата в большей или меньшей степени проявился у всех животных из группы на субстрате, за исключением единственного случая, в котором регенерат имел нестандартную форму (рис. 1Б) и был исключен из дальнейшего анализа. Таким образом, в лабораторных условиях впервые был воспроизведен эффект, отмеченный в экспериментах по регенерации у тритонов того же вида, экспонированных в условиях измененного (сниженного) влияния гравитации на борту космических аппаратов Фотон М2 и М3 и в синхронном контроле на субстрате при 1g (Grigoryan et al., 2008).

Устойчивое воспроизведение в условиях лаборатории направленных изменений морфогенеза при регенерации хвоста позволило провести детальный морфометрический анализ.

Рис. 1. А. Прогресс регенерации в течение 49 дней п/оп на примере типичных образцов из аквариального контроля (верхний ряд) и группы на субстрате (нижний ряд). Б. 49дневный регенерат аномальной формы, образовавшийся в группе на субстрате.

Полученные изображения формирующихся регенератов были обработаны с помощью компьютера (см. раздел 2 главы «Материалы и методы»): были измерены значения длины регенерата и угла загиба хвоста (УЗХ). В силу того, что в некоторых случаях наблюдалось отклонение распределения этих величин от нормального, сравнение аквариального контроля и группы на субстрате проводили непараметрическими методами, используя критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова для сравнения двух независимых выборок. На рисунках 2А, Б отражены изменения медианных значений указанных величин в ходе регенерации.

Рис. 2. А. Изменение медианных значений угла загиба хвоста (УЗХ) в двух группах в ходе регенерации. Б. Изменение медианных значений длины регенерата в двух группах в ходе регенерации. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей.

На графиках приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

Важно, что кривые изменения медианных значений УЗХ для контрольной группы и группы на субстрате начинают расходиться с 14 дня после ампутации. Оба использованных критерия для сравнения двух независимых выборок показали статистическую достоверность этих отличий на всех сроках регенерации, кроме 7-го дня п/оп. Кривые изменения медианных значений длины регенерата в двух группах несколько расходятся в период с 14 до 28 дней п/оп, однако статистически значимыми отличия длины регенерата на основании использованных критериев можно признать лишь через 7 и 14 дней п/оп. Тем не менее, нельзя исключить, что несколько большая длина регенератов в группе на субстрате в первые 28 дней п/оп оказала влияние на значения УЗХ в этот период, в то время как истинные отличия, связанные только c изменением формы регенерата, по-видимому, в полной мере проявляются через 28 дней после ампутации, вместе с морфогенезом осевых структур.

Чтобы избежать искажений, связанных с вариациями длины регенерата, было решено использовать для оценки формы регенерата коэффициент К, указывающий положение проекции кончика хвоста на основание регенерата (см. раздел 2 главы «Материалы и методы»). Так же, как и исследованные ранее величины, значения К в двух группах сравнивали с помощью критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова.

Рисунок 3 показывает изменение медианных значений коэффициента К в ходе регенерации.

Рис. 3. Изменение медианных значений коэффициента К в двух группах в ходе регенерации. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей.

На графике приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

Видно, что значение коэффициента К подвержено более значительным вариациям в обеих группах, нежели значения длины регенерата или УЗХ; в результате отличия между группами признаются достоверными лишь на более поздних стадиях регенерации (в данном случае, лишь через 49 дней п\оп), когда определяющие их структуры сформировались. Оценка по коэффициенту К является дополнительной и позволяет с большой уверенностью констатировать наличие или отсутствие отличий в конце эксперимента.

На рисунке 3 видно, что график изменения коэффициента К в ходе регенерации является двухфазным: в первой фазе (в данном случае между 7 и 28 днями п/оп) имеет место равномерное уменьшение К, идущее одинаковыми темпами в аквариальном контроле и в группе на субстрате; во второй фазе (между 28 и 49 днями п/оп) значение К в группе аквариального контроля выходит на плато, в то время как в группе на субстрате продолжает уменьшаться. Такой характер изменения К хорошо согласуется с характером протекания регенерационных процессов. Так, первой фазе графика изменения К соответствуют стадии II и III регенерации, когда происходит рост бластемы и начало дифференцировки в ее проксимальной части тканей и органов хвоста. При этом дистальный конец регенерата, изначально определяющийся как наиболее выступающая точка округлой бластемы (и потому находящийся посередине дорсо-вентральной проекции хвоста), начинает определяться положением дистальной части осевых структур, и, соответственно, смещается в вентральную сторону. Второй фазе графика соответствуют стадии IV и V, т.е. стадии дальнейшей дифференцировки тканей в проксимо-дистальном направлении, рост и созревание всех структур. Стабилизация К в аквариальном контроле отражает рост осевых структур в горизонтальной плоскости; а продолжающееся уменьшение К в группе на субстрате связано с отклонением от нее, все более явно проявляющимся по мере увеличения длины регенерата. По всей видимости, в группе на субстрате на границе двух фаз (в данном случае, около 4 недель п/оп) происходит либо закладка регенерирующих структур под углом к интактным структурам, либо изменение исходно регулярной формы раннего регенерата.

Таким образом, полученные результаты с одной стороны доказывали устойчивое проявление эффекта изменения формы регенерата в зависимости от условий содержания (предположительно, гравитационной нагрузки), с другой стороны требовали уточнений скорости роста регенератов, вносящих коррективы и необходимых для объективной оценки эффекта.

1.2 Изучение темпов регенерации при содержании в аквариуме и на субстрате Что же касается хода регенерации в целом, в нашем эксперименте обнаружилось его замедление по сравнению с данными литературы (Iten, Bryant, 1976a). Отметив этот факт, мы провели сравнение времени достижения последовательных стадий регенерации животными из аквариального контроля в пяти экспериментах, проведенных в разное время. Сравнение вели по стадиям регенерации, достигнутым регенератами в каждом эксперименте на определенный день с 7 по 49-й дни после ампутации (рис. 4А).

Поскольку на стадии V происходит рост дифференцировавшихся на предыдущей стадии структур, достоверно отличить стадии IV и V по внешнему виду было затруднительно, и регенераты, достигшие стадии IV, отмечали как находящиеся на ней вплоть до конца эксперимента. Средняя скорость смены стадий регенерации была оценена в единицах «стадия/день» путем деления номера стадии (4 или менее, если по окончании эксперимента не была достигнута стадия IV) на день достижения этой стадии регенератом (рис. 4Б). На рисунке 4 видно, что достижение последовательных стадий регенерации в разных экспериментах шло разными темпами, но везде медленнее, чем в описании Iten, Bryant (1976а). Видно также, что в экспериментах, проводившихся во второй половине зимы, весной и летом темпы регенерации были сходны (0,126–0,133 ст/день), в то время как в экспериментах, проходивших осенью, темпы регенерации были ниже (0,081 и 0,100 ст/день).

По всей видимости, в данном случае имело место тормозящее влияние пониженных температур на скорость регенерации, давно известное по другим экспериментам (Schauble, 1972; Turner, Tipton, 1973 – цит. по Conelly, 1977). Хотя различия в темпах регенерации между разными экспериментами были статистически значимыми на 21–35 дни регенерации (по критерию Краскела-Уоллиса для множественных сравнений), на 42 и 49 дни регенерации они исчезали, и к 49-му дню регенерации во всех случаях были получены дифференцированные регенераты окончательной формы.

Рис. 4. А. Стадии регенерации, достигнутые регенератами в каждом из пяти экспериментов на 7–49 дни после ампутации. На основании внешнего вида регенератов не различали стадии IV и V; все регенераты, достигшие стадии IV, отмечали как находящиеся на ней вплоть до конца эксперимента. Б. Средняя скорость смены стадий регенерации в этих экспериментах в единицах «стадия/день». Для сравнения приведены данные по темпам регенерации в эксперименте Iten, Bryant (1976а).

Нас интересовало, влияют ли условия содержания животных из группы на субстрате на темпы регенерации. Для этого темпы регенерации сравнивали в четырех экспериментах, включавших обе группы животных. Выяснилось, что темпы регенерации в группе на субстрате могут как замедляться, так и ускоряться по сравнению с аквариальным контролем (рис. 5). В двух экспериментах из четырех темпы регенерации совпадали в аквариальном контроле и группе на субстрате, в одном эксперименте регенерация шла достоверно быстрее на субстрате, в другом эксперименте, наоборот, наблюдалось ее замедление на субстрате. При сравнении всех значений аквариального контроля со всеми значениями на субстрате статистически достоверных различий в темпах регенерации между группами выявлено не было. Таким образом, можно заключить, что хотя в отдельных случаях темпы регенерации на субстрате могут отличаться от контрольных, сам факт содержания животных в этих условиях не оказывает определенного тормозящего или ускоряющего эффекта на ход регенерации.

Наблюдавшиеся различия можно объяснить разной чувствительностью групп к изменению внешних факторов: так, резкие перепады температуры нивелируются большим объемом воды в аквариуме, но оказывают существенное влияние на животных на субстрате; высокая температура воздуха может приводить к подсыханию на субстрате, но не в аквариуме.

Рис. 5. Средняя скорость смены стадий регенерации в четырех экспериментах в единицах «стадия/день» в группе на субстрате по сравнению с аквариальным контролем. Планки погрешности построены по значениям стандратного отклонения. На графике приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

Таким образом, оценка скорости регенерации наряду с изучением проявления морфогенетического эффекта показала, что здесь не существует прямой зависимости. Это позволило еще раз убедиться в том, что основная причина морфогенетических изменений обусловлена «дозой» гравитационной нагрузки – условной низкой гравитационной нагрузкой в воде и нагрузкой при содержании на субстрате. Наряду с этим возникал существенный вопрос: в какой мере обнаруженный морфогенетический эффект устойчив при смене условий и является ли он обратимым?

1.3 Проверка обратимости изменения формы регенерата при содержании на субстрате В подразделе 1.1 было отмечено, что отклонение УЗХ и коэффициента К в группе на субстрате от контрольных значений начинается вместе с дифференцировкой осевых структур регенерата. В связи с этим возникает вопрос о том, достаточно ли экспериментального воздействия на этой стадии для того, чтобы обеспечить формирование загнутого регенерата, либо же загиб хвоста образуется только при постоянном нахождении на субстрате? В первом случае можно считать, что экспериментальное воздействие затрагивает некие ключевые механизмы морфогенеза, вызывая его необратимые изменения, в то время как во втором случае воздействию подвергаются локальные механизмы тканевой дифференцировки и отмена воздействия должна приводить к остановке или компенсации отклонения от нормальной формы.

Для выяснения данного вопроса был проведен эксперимент с отменой экспериментального воздействия после того, как было зафиксировано появление эффекта.

Эксперимент проводили, как описано в разделе 3 главы «Материалы и методы». Всего было прооперировано 20 тритонов (5 в аквариальном контроле, 15 в группе на субстрате);

один тритон из группы на субстрате был выведен из эксперимента через 25 дней в связи с повреждением регенерата. Для сравнения формы регенератов хвоста в двух группах использовали коэффициент К, указывающий положение проекции кончика хвоста на основание регенерата (см. раздел 2 главы «Материалы и методы»). В связи в малым объемом выборок значения К в двух группах сравнивались с помощью критериев МаннаУитни и Колмогорова-Смирнова. После отделения третьей группы (тритоны, возвращенные в аквариум после начала возникновения загиба хвоста на субстрате) для статистической оценки различий между группами использовали непараметрический критерий Краскела-Уоллиса для множественных сравнений в сочетании с post hoc критерием Данна.

На рисунке 6А представлена динамика изменения медианных значений коэффициента К в ходе регенерации. Видно, что общий вид кривых на графике для аквариального контроля и группы на субстрате соответствует таковому на рисунке 3. В данном случае первая фаза длится 21 день п/оп, после чего динамика изменения К существенно разнится в двух группах. Через 28 дней п/оп с помощью обоих использованных критериев была выявлена тенденция к снижению К на субстрате по сравнению с аквариальным контролем. Через 32 дня п/оп было проведено повторное измерение регенератов и морфометрический анализ; различия между группами на этом этапе были признаны статистически достоверными по результатам применения обоих критериев. В этот же день восемь тритонов из группы на субстрате были перемещены в отдельный аквариум (группа «Суб–Акв»). Таблица 1 показывает (день 0), что отбор был проведен без привнесения исходных различий между этими животными и животными, оставшимися на субстрате.

На рисунке 6Б более подробно показана динамика изменения К во всех группах после отсаживания части животных обратно в аквариум (день 0 соответствует 32 дням п/оп). Видно, что через неделю после отсаживания медианное значение К в группе на субстрате снижается с 0,30 до 0,23, в то время как медианное значение К в группе, перенесенной в аквариум, сохраняется на исходном уровне. В результате этого достоверность различия между данной группой и аквариальным контролем утрачивается, как показано в таблице 1. Через 10 дней после переноса в аквариум медианное значение К в группе перенесенных животных увеличивается до 0,34, сближаясь с медианным значением в аквариальном контроле (0,38) и отдаляясь от значения в группе на субстрате (0,22), что находит отражение также и в изменении уровней значимости сравнения соответствующих групп.

Рис. 6. А. Изменение медианных значений коэффициента К во всех группах в ходе эксперимента. До 28 суток представлены данные по двум группам – аквариальному контролю и группе на субстрате; голубая пунктирная линия отмечает перенос части животных из группы на субстрате в аквариум (группа Суб–Акв) на 32-й день, после чего данные представлены по трем группам. На графике приведены уровни значимости отличий между аквариальным контролем и группой на субстрате через 28 и 32 суток п/оп (по критерию Манна-Уитни). Б. Изменение медианных значений коэффициента К в трех группах после возврата части особей с субстрата в аквариум. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей.

Таблица 1. Уровни значимости отличий между группами согласно критерию Данна (красным цветом выделены значения, указывающие на статистически достоверные отличия).

–  –  –

Таким образом, можно заключить, что эффект изменения формы регенерата при содержании на субстрате, проявившись и достигнув уровня статистической достоверности, может быть обращен отменой действия экспериментального фактора – влияния содержания на субстрате.

Это согласуется с результатами изучения морфологии эмбрионов амфибий, кратковременно подвергнутых в начале развития действию невесомости. Такие эмбрионы демонстрировали морфологические аномалии, однако после возвращения в обычные условия аномалии быстро компенсировались, и на последующих стадиях животные не отличались от контрольных (Neff et al., 1993;Gualandris-Parisot et al., 2001; Maziere et al., 1996). Это позволяет предполагать, что механизмы, опосредующие действие подобных системных факторов на морфогенез хвоста, работают на локальном уровне и не затрагивают основы регуляции морфогенеза, например пространственный характер экспрессии ключевых морфогенов.

2 Проявление эффекта загиба хвоста при регенерации с перегрузкой 2g Итак, лабораторные эксперименты убедительно показали, что изменение условий содержания тритонов во время регенерации хвоста приводит к изменению формы регенерата. Наиболее интересными в связи с этими результатами являются два вопроса:

во-первых, какой именно фактор среды является ключевым для развития эффекта, и, вовторых, какие клеточные и молекулярные механизмы опосредуют его действие на морфогенез регенерирующего хвоста. Поиск ответа на первый вопрос затрудняется комплексным характером отличий между двумя средами обитания (водной в аквариальном контроле, наземной в субстратной группе). При этом многие условия были стандартизированы и не отличались в двух средах: так, температурный и световой режим, характер корма, частота и объем кормлений, режим уборки контейнеров и манипуляции с животными были одинаковы в обеих группах. Количество жидкости в контейнерах для содержания на субстрате было подобрано таким образом, чтобы кожа животных оставалась увлажненной, что исключало возникновение отличий, например, по доступности кислорода. В качестве рабочей гипотезы было высказано предположение, что ключевым фактором в развитии морфогенетического эффекта является увеличение гравитационной нагрузки, испытываемое животными на субстрате по сравнению с привычной для них физиологической невесомостью в аквариуме.

Проверка данной гипотезы оказалась возможной во время эксперимента, проведенного лабораторией проблем регенерации ИБР РАН совместно с Эймским исследовательским центром НАСА (NASA Ames Research Center) в 2010 г. Ход регенерации хвоста исследовали в трех группах: в аквариальном контроле (пять особей), в группе на субстрате (12 особей) и в группе, подвергавшейся центрифугированию с перегрузкой 2g (12 особей). Разделение животных на группы проводили через 7 дней после ампутации хвоста, а через 21 день после ампутации регенераты фотографировали и фиксировали. Изображения были обсчитаны, как описано в разделе 2 главы «Материалы и методы», для сравнения групп использовали коэффициент загиба хвоста К. Для статистической оценки различий между группами использовали непараметрический критерий Краскела-Уоллиса для множественных сравнений в сочетании с post hoc критерием Данна.

На рисунке 7 отражены медианные значения коэффициента К в трех группах в финале эксперимента (21 день п/оп). Применение критерия Краскела-Уоллиса для множественных сравнений указывает на неравенство этих значений в трех группах (p = 0,006). Post hoc критерий Данна позволяет продемонстрировать, что медианное значение К в аквариальном контроле достоверно выше, чем в группе на субстрате (p = 0,004) и в группе центрифугирования (p = 0,040), в то время в двух последних группах достоверно не отличается (p = 1,000). Таким образом, как в группе на субстрате, так и в группе центрифугирования за 14 дней в соответствующих экспериментальных условиях формируются загнутые регенераты, неотличимые друг от друга, но значимо отличающиеся от нормальных регенератов, получаемых к аквариальном контроле.

Рис. 7. Медианные значения коэффициента К в трех группах в финале эксперимента.

Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графике приведены уровни значимости отличий между группами по критерию Данна.

Таким образом, данный эксперимент подтвердил наше предположение о гравитационной природе действующего фактора и позволил с уверенностью констатировать: имеет место изменение формы хвоста (загиб книзу) при действии увеличенной гравитационной нагрузки (как перегрузки в 2g, так и нагрузки в 1g в нехарактерных для этих животных условиях на субстрате). Уместно вспомнить, что в экспериментах по действию невесомости на эмбрионы X. laevis со стадии хвостовой почки был выявлен сходный эффект: загиб хвостовой части эмбриона кверху (Horn, Gabriel, 2011).

При сравнении данных этого эксперимента с описанными выше видно, что в данном случае регенерация в целом идет существенно быстрее: морфометрические показатели регенератов на 21 день п/оп сходны с теми, что описаны на 35–42 день п/оп;

можно также отметить небольшое ускорение темпов регенерации в группе на субстрате по сравнению с аквариальным контролем. Тем не менее, в целом, эти данные полностью согласуются с приведенными выше и дополняют их. Особенно интересен тот факт, что морфометрические показатели регенератов в группе на субстрате и группе центрифугирования фактически не отличаются. Это, свидетельствует о пороговом характере действия перегрузки, испытываемой животными по сравнению с условиями в глубокой воде. Другой пример порогового действия гипергравитации можно найти у Shimada, Moorman (2006), описавших действие микро- и гипергравитации (2g, 3g) на развитие глаза и экспрессию некоторых генов теплового шока у Danio rerio. В этих экспериментах было выявлено влияние перегрузки на уровень экспрессии генов Hsp70 и A-crystallin, а также на уровень апоптоза, причем во всех случаях результат влияния 2g и 3g оказался сходным. Таким образом, имеющиеся крайне немногочисленные данные литературы говорят в пользу того, что влияние гипергравитации может приводить к активации клеточного стресса, а также изменению уровня экспрессии генов, контролирующих морфогенез. Эти явления могут рассматриваться как наиболее вероятная причина изменений морфогенеза хвоста в изучаемой нами модельной системе.

Однако, перейти к молекулярно-генетическому исследованию можно было только при условии изучения нашей новой модели на тканевом и клеточном уровнях. Это необходимо для понимания того, что стоит на этих уровнях за наблюдаемым макроскопическим эффектом изменения формы регенерирующего хвоста.

3 Изучение тканевых и клеточных аспектов измененного морфогенеза регенерирующего хвоста на субстрате

3.1 Морфологическое изучение регенератов хвоста в аквариуме и на субстрате Для изучения гистологического строения регенераты хвостов тритонов разных групп забирали через 14, 28 и 49 дней после ампутации. По внешнему виду 14-дневные зачатки хвоста находились на стадии II регенерации хвоста (Iten, Bryant, 1976a); 28дневные – на стадиях III–IV; 49-дневные регенераты были уже на стадиях IV–V, то есть приближались к завершению формообразования (рис. 1). Материал был обработан при использовании стандартных методов гистологии, описанных в разделе «Материал и методы», и проанализирован с разными разрешениями микроскопической техники.

Для получения полной гистологической картины целого регенерата хвоста, вначале полученные сагиттальные срезы фотографировали при помощи бинокулярной насадки – камеры Webbers MYscope300M при увеличении 24. На рисунках 8, 9, 10 представлены изображения срезов и их морфологические описания.

Через 14 дней п/оп (рис. 8) в регенератах обеих групп имеет место разрушение дистального отдела позвоночника, образование бластемы, замыкание терминального эпендимного пузырька, дегенерация мышц в дистальной части культи. Другими словами, морфологическое строение регенератов, как и их внешний вид, соответствовали стадии II по Iten, Bryant (1976a). Бластема регенератов из группы на субстрате занимает больший объем, чем в аквариальном контроле, под раневым эпидермисом меньше клеточного детрита. Таким образом, через 14 дней регенерации на макроскопическом уровне в опыте и контроле выявляются некоторые морфологические отличия, свидетельствующие о большем прогрессе клеточного роста в регенерационной бластеме в группе на субстрате.

Рис. 8. Морфологическое строение регенератов хвоста в аквариальном контроле (А) и группе на субстрате (Б) на 14-й день п/оп. Увеличение 24. Б – бластема, ДМ – дегенерирующие мышцы, НМ – нормальные мышцы, П – позвоночник, РСТ – рыхлая соединительная ткань, РЭ – раневой эпидермис, СМ – спинной мозг. Стрелки указывают на уровень ампутации.

Через 28 дней п/оп (рис. 9) регенераты обеих групп демонстрируют развитую бластему, однослойную эпендимную трубку, развитый хрящевой тяж и прохрящевую конденсацию (апикальное уплотнение клеток бластемы). Таким образом, регенераты к концу месяца восстановления достигают стадии III (Iten, Bryant, 1976a). В регенератах группы на субстрате, по сравнению с аквариальным контролем, уже намечена точка перегиба хрящевого тяжа и эпендимной трубки, прохрящевая конденсация образуется под углом к переднезадней оси регенерата, дорсальнее точки перегиба хрящевого тяжа. В апикальной части бластемы наблюдается «направленная» конденсация бластемных клеток. Таким образом, на стадии III имеют место отчетливые морфогенетические изменения формирующихся регенератов из группы на субстрате, обуславливающие изменение их морфометрических параметров.

Рис. 9. Морфологическое строение регенератов хвоста в аквариальном контроле (А) и группе на субстрате (Б) на 28-й день п/оп. Увеличение 24. Б – бластема, ЗМ – зона миграции клеток, П – позвоночник, ПХК – прохрящевая конденсация, СМ – спинной мозг, ХТ – хрящевой тяж, ЭТ – эпендимная трубка. Стрелки – уровень ампутации.

Через 49 дней п/оп (рис. 10) в регенератах обеих групп наблюдается проксимальный миогенез, начало дифференцировки хрящевого тяжа, васкуляризация регенерата; бластема сохраняется лишь в апикальной части регенерата. Таким образом, достигается стадия IV. В группе на субстрате по сравнению с контролем становится очевиден изгиб осевых структур в вентральном направлении и соответствующее этому изменение окружающих тканей. Больший прогресс клеточного роста в регенерационной бластеме в группе на субстрате, отмеченный еще на стадии II, сохраняется и наблюдается в эпендимной трубке, хрящевом тяже и окружающих тканях.

Рис. 10. Морфологическое строение регенератов хвоста в аквариальном контроле (А) и группе на субстрате (Б) на 49-й день п/оп. Увеличение 24. ПХК – прохрящевая конденсация, ТЗ – точка загиба, ХТ – хрящевой тяж, ЭТ – эпендимная трубка.

На морфологическом уровне был отмечен более интенсивный клеточный рост и более высокие темпы дифференцировки тканей в группе на субстрате по сравнению с аквариальным контролем. Это согласуется с данными по увеличению темпа регенерации в группе на субстрате, полученными на основании визуальной характеристики регенератов.

Тем не менее, как было показано в подразделе 1.2, ускорение регенерации, отмеченное в данном эксперименте, отсутствует в других экспериментах: группа на субстрате может отставать от аквариального контроля, и в среднем темпы регенерации в двух группах не отличаются.

При рассмотрении феномена измененного морфогенеза мы можем опираться лишь на немногочисленные косвенные данные литературы. Ранее были получены результаты, свидетельствующие о возможном влиянии гравитации на клеточную миграцию (Grinfeld et al., 1996) и пролиферативную активность и апоптоз (Grigoryan et al., 2008). Учитывая их в совокупности с данными о контролирующем влиянии эпендимной трубки (Schnapp et al., 2005) и эпидермиса (Tassava et al., 1986), на клеточном уровне мы можем предположить участие в формировании изучаемого морфогенетического феномена изменений в поведении (миграция, пролиферация, апоптоз) клеток эпендимы и эпидермиса.

Это предположение могло быть проверено более детальным анализом процессов регенерации на срезах. Во всех случаях в регенератах хвоста у животных группы на субстрате отмечался достаточно резкий загиб хрящевого тяжа. Эпендимная трубка в дистальной части регенерата также меняла направление роста и располагалась всякий раз параллельно хрящевому тяжу. Кроме того, бластема регенератов из группы на субстрате не была однородной, как это наблюдалось в аквариальном контроле. Дорсальнее эпендимной трубки наблюдалась отчетливая конденсация бластемных клеток, начинающаяся на уровне загиба осевых структур и доходящая до кончика регенерата хвоста. Клетки в зоне конденсации образовывали плотные «трэки», позволяющие предположить, что в этой зоне имеет место интенсивная миграция клеток с дорсальной стороны бластемы к апексу. На рисунке 11 приведены фотографии центральной зоны регенератов в аквариальном контроле и группе на субстрате на 49-е сутки регенерации (на стадии, когда эффект наиболее ярко выражен). Таким образом, мы впервые обнаружили, что в процесс изменения формы регенерата включена дифференциальная конденсация и изменение путей миграции клеток бластемы.

Рис. 11. Морфология апикальной области регенерата хвоста P. waltl в контроле и опыте на 49-й день регенерации; увеличение 40. А – аквариальный контроль; Б – группа на субстрате. Толстая стрелка указывает на точку загиба хрящевого тяжа; тонкими стрелками обозначено ориентированное уплотнение в дорсальной бластеме.

При морфологическом анализе срезов мы обращали также внимание на процессы, связанные с регенерацией мышц – их дегенерацию, дедифференцировку и формирование новых мышечных волокон. Однако заметных отличий по этим процессам в контроле и группе на субстрате найдено не было. Это может быть связано с недостаточным прогрессом регенерации за время эксперимента.

На гистологических срезах регенератов всех стадий, включая регенераты, сформированные к 49-му дню п/оп, когда дифференцировка новых тканей близка к завершению, можно было наблюдать многочисленные митотические фигуры и пикнотические ядра как в эпидермисе, так и во внутренней области бластемы, в том числе и хрящевой ткани (рис. 12). Это говорит об активной перестройке тканей, сопровождающей все стадии регенерации. При этом, подчеркнем, основной причиной загиба регенерата хвоста, является выявленное нами на тканевом уровне изменение направления роста осевых закладок – проспективных позвоночника и спинного мозга.

Баланс процессов пролиферации и клеточной гибели (в том числе апоптоза) является принципиальным для морфогенеза, поэтому оценки этого баланса в норме (в аквариуме) и при изменении морфогенеза на субстрате способствуют понимаю механизмов явления. Ранее (Grigoryan et al., 2008) было сделано наблюдение, что в регенератах группы на субстрате имеет место разрастание эпидермиса на дорсальной и апикальной сторонах. На полученных нами гистологических срезах также можно было увидеть утолщение раневого эпидермиса в этих зонах уже у 14-ти дневных регенератов (7–8 рядов клеток на дорсальной стороне по сравнению с 5–6 на вентральной). На более поздних стадиях эти отличия сохранялись. Это может отражать повышение уровня пролиферативной активности клеток на дорсальной стороне в группе, содержащейся на субстрате.

Рис. 12. Митотические фигуры в эпидермисе (А), бластеме (Б), хрящевой ткани (В) и пикнотические ядра в соединительной ткани в районе осевых структур (Г). А, Б – 14 дней п/оп, В, Г – 49 дней п/оп. Увеличение 400.

3.2 Изучение пролиферативной активности клеток регенерата Для проверки предположения о том, что изменение формы регенерата в группе на субстрате обусловлено региональными изменениями пролиферативной активности клеток, использовали метод иммуногистохимического определения включения в клетки предшественника синтеза ДНК – БрдУ. На срезах регенератов подсчитывали абсолютное число меченых клеток в эпидермисе (отдельно в вентральной, апикальной и дорсальной его частях) и в подлежащих тканях (отдельно в области вентральнее хорды и области дорсальнее спинного мозга).

Распределение делящихся клеток в регенерате оценивали по соотношению их количества на его вентральной и дорсальной сторонах (V/D). Следует заметить, что общее число меченых клеток несколько отличается от регенерата к регенерату в зависимости от эффективности доставки предшественника в ткани. Эту особенность в исследованиях регенерации у тритонов отмечали и в других экспериментах с внутрибрюшинным введением веществ (личное сообщение Е.И. Домарацкой и Э.

Альмейда). Существует предположение, что это обусловлено неодинаковой васкуляризацией регенератов, а также техническими особенностями процедуры окраски.

Тем не менее, эти отличия, как правило, не сказывались на соотношении V/D для каждого анализируемого среза. Учитывая малое число регенератов в каждой группе, все сравнения проводили с помощью непараметрических критериев Колмогорова-Смирнова и МаннаУитни; приведенные в тексте уровни значимости отличий даны по результатам U-теста Манна-Уитни.

В результате иммуногистохимической обработки на срезах обнаруживалось специфическое мечение БрдУ, характеризующееся ядерной локализацией и интенсивной ржаво-коричневой окраской, характер которой отражал гетерогенность хроматина и позволял отличить БрдУ+ клетки от неспецифически меченых клеток, например, слущивающегося слоя эпидермиса, внеклеточного матрикса в составе хряща, стенок сосудов, а также секрета кожных желез (рис. 13).

Рис. 13. Иммуногистохимическое определение включения БрдУ. Примеры специфического мечения в эпидермисе (А), рыхлой соединительной ткани (Б, В, Д) и мышцах (Г), а также иллюстрации неспецифического мечения кожных желез (Е), клеток крови (Ж, З). Увеличение 200.

В интактном контроле и культях через 24 часа п/оп наблюдали единичные БрдУ+ клетки в эпидермисе и толще соединительной ткани, что, по-видимому, отражает нормальный процесс обновления тканей при изнашивании. Подсчет клеток на этих сроках не проводили. Через 7 и 14 дней п/оп на срезах обнаруживались многочисленные меченые клетки в эпидермисе, бластеме, соединительной ткани дистальной части культи, в том числе в оболочках осевых структур, а также отдельные клетки в толще мышечных волокон. Локализация и распределение БрдУ+ клеток на срезах хорошо согласовывались с таковыми для митотических фигур, выявленных на гистологических срезах. В эпидермисе культи встречались одиночные меченые клетки.

Плотность мечения существенно увеличивалась по мере перехода к раневому эпидермису, а в апикальной части эпидермиса (от уровня хрящевого тяжа до уровня спинного мозга) она была наиболее высокой. В этой зоне, составляющей лишь около 10% раневого эпидермиса, обнаруживалось около 20% всех меченых эпидермальных клеток (рис. 14). Эти величины не отличались достоверно через 7 и 14 дней п/оп ни в аквариальном контроле (p = 0,800), ни в группе на субстрате (p = 0,700), ни при сравнении величин в обеих группах вместе (p = 0,792). При этом в группе на субстрате процент меченых БрдУ+ клеток в апикальной зоне на обоих сроках был выше, чем в аквариальном контроле. В силу малого количества значений в каждой группе это отличие не достигло уровня статистической значимости при проведении сравнения для каждого срока отдельно (p = 0,200 для 7 и 14 дней п/оп). Однако при сравнении общих данных по каждой группе, суммировавших значения на 7 и 14 дней п/оп, увеличение процента меченых БрдУ+ клеток в апикальной зоне в группе на субстрате оказалось статистически значимым (p = 0,009).

Рис. 14. Среднее количество БрдУ-меченых клеток в апикальной зоне регенератов из аквариального контроля и группы на субстрате в процентах от общего числа меченых клеток эпидермиса на 7–14 дни п/оп. Планки погрешности построены по величине стандартного отклонения. На графике приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

Соотношение V/D варьировало в широких пределах в обеих группах как через 7, так и через 14 дней п/оп, и в среднем находилось на уровне 1,0–1,5 (рис.

15). Эти результаты свидетельствуют о том, что в среднем на вентральной стороне регенератов уровень пролиферативной активности клеток несколько выше, чем на дорсальной. В эпидермисе соотношение V/D не отличалось в аквариальном контроле и группе на субстрате как через 7, так и 14 дней п/оп (рис. 15А). Таким образом, регенераты из группы на субстрате демонстрировали повышенный уровень пролиферативной активности в апикальной зоне по сравнению с аквариальным контролем, однако распределение пролиферирующих клеток не менялось, и их количество было в среднем несколько выше на вентральной стороне регенерата.

Рис. 15. Соотношение количества БрдУ-меченых клеток на вентральной и дорсальной сторонах в регенератах группы аквариального контроля и группы на субстрате на двух стадиях регенерации (V/D). А – эпидермис, 7 дней п/оп; Б – подлежащие ткани (бластема и соединительная ткань). На диаграммах указаны средние значения по выборкам, планки погрешности построены по величинам стандартного отклонения.

Через 7 дней п/оп наиболее интенсивное мечение в бластеме наблюдали в области ткани толщиной около 200 мкм под раневым эпидермисом. Через 14 дней п/оп в бластеме регенерата и соединительной ткани культи регистрировались проксимодистальные отличия уровня мечения с максимумом в апикальной части регенерата. Среди глубоко лежащих мышечных волокон культи обнаруживали единичные меченые клетки; в соединительной ткани, расположенной ближе к эпидермису культи, наблюдали равномерное, но не плотное мечение; в зоне под раневым эпидермисом имела место полоса меченых бластемных клеток. На срезах регенератов из обеих групп часто можно было наблюдать большие группы, плотно меченых клеток, расположенных под слоем раневого эпидермиса на вентральной и дорсальной сторонах, вблизи перехода от регенерата к культе (рис. 16). Через 7 дней п/оп эти группы встречались чаще, чем через

14. Если в аквариальном контроле размер групп и плотность мечения в группах визуально не отличались на вентральной и дорсальной сторонах регенерата, то в группе на субстрате часто обнаруживали более интенсивное мечение на вентральной стороне. Иногда меченые клетки в группах формировали некое подобие розеток, которые, по всей видимости, дают начало кожным железам регенерата (на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином Эрлиха, формирующиеся железы располагаются в этой же зоне). Эти результаты можно объяснить значительным увеличением содержания ДНК в связи с политенией. Ранее этот феномен, обеспечивающий эффективный синтез секрета покровов этих животных, был специально изучен (Антон и др., 1993). В работе, выполненной на регенератах конечности на стадии формирования бластемы, был выявлен проксимодистальный градиент уровня мечения Н-тимидином после импульсного введения предшественника (Smith, Crawley, 1977). Хотя в нашем случае в регенератах хвоста отчетливый градиент мечения не наблюдался, преобладание пролиферации в дистальной зоне культи, по-видимому, является общей характеристикой роста бластемы при регенерации конечности и хвоста.

Что же касается дорсо-вентрального распределения пролиферирующих клеток, в бластеме и соединительной ткани была выявлена тенденция к увеличению D/V в группе на субстрате по сравнению с аквариальным контролем, однако эти отличия на основании критериев Колмоговора-Смирнова и Манна-Уитни были признаны статистически незначимыми (рис. 15Б).

Рис. 16. Области более интенсивного мечения в бластеме вблизи перехода к культе. А, Б – аквариальный контроль, 7 дней п/оп; В, Г – группа на субстрате, 7 дней п/оп; Д, Е – аквариальный контроль, 14 дней п/оп; Ж, З – группа на субстрате, 14 дней п/оп. А, В, Д, Ж

– дорсальная сторона; Б, Г, Е, З – вентральная сторона.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.